Nghiên cứu khả năng khai thác một số dược liệu thuộc chi citrus trồng ở việt nam

Ngoài các thành phần dinh dưỡng như glucid, vitamin C, acid citric, quả Citrus còn chứa gần 200 chất có tác dụng sinh học, có thể bảo vệ cơ thể trong phòng chống bệnh tật.. GST là 1 enz

MỞ ĐẦU

Chi Citrus bao gồm phần lớn là những cây ăn quả, được trồng phổ biến ở nhiều

nước trên thế giới Sản lượng lên đến hàng trăm triệu tấn mỗi năm [71] Ngoài

các thành phần dinh dưỡng như glucid, vitamin C, acid citric, quả Citrus còn

chứa gần 200 chất có tác dụng sinh học, có thể bảo vệ cơ thể trong phòng chống

bệnh tật Thật vậy, hơn 60 flavonoid trong Citrus có 1 phạm vi tác dụng khá

rộng bao gồm tác dụng kháng viêm, chống khối u, chống virus, chống cao huyết áp, chống đông máu và đặc biệt là tác dụng chống oxy hoá khá mạnh [61]

Flavonoid của Citrus còn có tác dụng làm giảm nguy cơ của bệnh mạch vành,

một bệnh có tỉ lệ tử vong khá cao ở người cao tuổi hiện nay [76] Tangeretin và nobiletin được biết là những flavonoid ức chế mạnh sự phát triển của tế bào khối u và có khả năng hoạt hoá khả năng khử độc của hệ thống enzym P-450 [42,86] Ngoài ra, có khoảng 40 limonoid với limonin và nomilin là những chất chính Những chất này có hàm lượng cao trong bưởi và cam, là một trong những

tác nhân gây đắng của dịch quả Citrus Các limonoid ức chế sự tạo khối u bằng

cách kích thích enzym glutathion S-transferase (GST) GST là 1 enzym khử độc hoạt động bằng cách xúc tác phản ứng của glutathion với các chất ái điện tử độc hại để tạo thành các chất ít độc, dễ tan trong nước để có thể được bài tiết ra

khỏi cơ thể 1 cách dễ dàng [71] Tinh dầu Citrus chứa một lượng đáng kể

limonene, 1 monoterpen có tác dụng kháng ung thư [62] Đặc biệt, các alcaloid

của Citrus có cấu trúc khá gần adrenalin và tác dụng theo kiểu β-adrenergic,

làm gia tăng sự chuyển hoá cơ bản nên được sử dụng để làm thuốc giảm cân ở các cá thể bị béo phì, nguy cơ của đái đường type 2, cao huyết áp, bệnh động mạch vành, thặng dư lipid, ung thư vú và ung thư đại tràng ở giai đoạn sau mãn kinh [21]

Ở nước ta, từ lâu các cây thuốc thuộc chi Citrus được sử dụng chủ yếu trong y

học cổ truyền với các tên quen thuộc như chỉ thực, chỉ xác, trần bì, thanh bì để làm thuốc ho, tiêu thực, trừ đờm, đặc biệt hạt được dùng để chữa các chứng thoát

vị rất có hiệu quả [76] Tuy nhiên tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu và các chế phẩm từ các nguyên liệu này hiện vẫn còn thả nổi, chưa được ổn định làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng điều trị [theo Hội nghị Dược liệu toàn quốc

- 2003] Mặt khác, trong đời sống lượng vỏ Citrus thải ra ngày càng nhiều nhưng

cho đến nay vẫn bị xem như một dạng phế thải, chưa được tận dụng Trong khi

đó ở Pháp người ta đã tận dụng bã vỏ thứ phẩm của các Citrus sau công nghệ

nước giải khát, sản xuất ra hàng trăm tấn citroflavonoid mỗi năm và xuất khẩu chế phẩm đi các nước [65] Hàng năm nước ta vẫn phải nhập các loại thuốc này (Daflon, Diosmin, Flebosmil, Cemaflavon, Circularine,…) với một giá khá đắt, khó có thể đáp ứng được nhu cầu của đa số người có thu nhập thấp

Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng khai thác một số dược liệu thuộc chi Citrus trồng ở Việt Nam ” nhằm vào các mục tiêu sau:

1 Thăm dò phương pháp chiết xuất các flavonoid và alcaloid chính từ vỏ quả

của 5 loài Citrus (Quít, Bưởi, Cam, Chanh và Tắc) để chọn ra phương

pháp mang tính khả thi nhất trong điều kiện nước ta hiện nay nhằm mục đích tạo nguồn nguyên liệu

2 Phân lập, tinh chế các flavonoid và alcaloid để làm chất đối chiếu dùng trong kiểm nghiệm dược liệu và chế phẩm

3 Xây dựng các phương pháp định lượng các flavonoid chính cho các dược liệu trên

Chúng tôi mong muốn với đề tài này sẽ góp phần tạo nguồn nguyên liệu làm

thuốc tại chỗ để thay thế một phần thuốc nhập nội hiện nay và bổ sung một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu cho Dược điển Việt Nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 THỰC VẬT HỌC CHI CITRUS VÀ CÁC LOÀI KHẢO SÁT (CAM,

CHANH, QUÍT, BƯỞI, TẮC

1.1.1 Vị trí chi Citrus và các loài khảo sát trong hệ thống phân loại

Chi Citrus, là một chi lớn nằm trong họ Rutaceae Họ này có 150 chi và 2000

loài [1,5,7,89,92] phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở nước ta hiện biết được 23 chi, 105 loài, trong đó có một số loài được dùng làm thuốc, cho tinh dầu, chất nhuộm và một số loài làm cây cảnh [5]

Vị trí của các loài khảo sát (Cam, Chanh, Quít, Bưởi, Tắc) trong hệ phân loại của Takhtajan có thể được tóm tắt trong sơ đồ 1 sau đây :

Liên bộ cam (Rutanae)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Phân lớp hoa hồng (Rosidae)

Bộ cam (Rutales)

Họ cam (Rutaceae)

Chi Citrus Chi Fortunella

Loài bưởi Loài cam Loài chanh

Sơ đồ 1.1 Vị trí các loài khảo sát trong hệ thống phân loại của Takhtajan

1.1.2 Chi Citrus

Chi này bao gồm các cây nhỏ có gai ở nách lá; các cành già thường không có gai Tất cả các bộ phận thường có mùi thơm khi vò hoặc nghiền nát Lá đơn mọc cách, thường mỏng hoặc dai; cuống lá thường có cánh, có đốt ở đáy phiến lá; phiến lá nguyên hoặc có răng cưa với một ít gân phụ Hoa mọc đơn hoặc mọc thành chùm ở nách lá; đài có 4-5 thùy; cánh hoa 4-8, dầy, thẳng; nhị nhiều gấp nhiều lần số cánh hoa (20-60); đĩa mật hình tròn ngắn; bầu noãn có dạng gần như hình cầu có 8-18 lá noãn; vòi nhụy hình trụ, đầu nhụy dạng hình cầu Quả mọng kiểu cam quít Vỏ quả ngoài chứa nhiều túi tiết tinh dầu, thường có màu vàng hoặc cam; vỏ quả giữa trắng, xốp; vỏ quả trong có những lông mọng nước chua hay ngọt mà ta thường gọi là tép Hạt có nhiều phôi, nhưng về sau chỉ có một phôi phát triển thành cây trưởng thành, còn các phôi khác tiêu giảm đi Quả nhiều loài ăn được [1,5,81]

Về mặt phân loại, chi này khá phức tạp vì có quá nhiều cá thể lai Engler phân biệt 9 loài, Swingle phân biệt 16 loài và Tanaka phân biệt 166 loài Ngoài ra còn rất nhiều dạng lai tự nhiên và dạng lai nhân tạo khác [25,81,89,92]

Sau đây là 16 loài thuộc chi Citrus theo phân biệt của Swingle :

Bảng 1.1 16 loài thuộc chi Citrus theo phân biệt của Swingle

Loài Năm xác định Tên tiếng Anh Nguồn gốc

Citrus latipes Tan 1928 Khasi papeda Assam

Citrus macrocarpa Mont 1860 Melanesian papeda Đông nam Á

1.1.2.1 Loài Quít : Citrus reticulata Blanco

Đồng danh : Citrus deliciosa Tenore, Citrus nobilis Andrews et auct., non Lour

Thực vật học :

Trong nông nghiệp cũng như trong thương mại, người ta thường phân chia tất cả các giống quít (kể cả các giống lai ) vào các nhóm theo cách sắp xếp của Swingle

 Nhóm quít thông thường (C reticulata Blanco)

Cây có nhiều gai nhỏ, nhiều cành non mảnh; lá hình mác hay hình elip rộng hoặc hẹp, nhọn cả ở phía đỉnh cũng như ở phía gốc Hoa mọc đơn độc hay thành từng cụm nhỏ ở nách lá Quả mọng có dạng gần hình cầu, đáy quả lõm, vỏ mỏng, xốp, khi chín có màu vàng da cam nhạt hoặc da cam đỏ tươi, múi dễ tách Hạt nhỏ, nhọn ở đầu, phôi có màu xanh Nhóm này gồm nhiều thứ, rất đa dạng Thường gặp các thứ trong trồng trọt: Beauty, Clementine, Dancy, Campeona, Emperor, Ponkan, Mandalina, Naartje, Kinokuni, Murcott Hầu hết các thứ này đều phát triển tốt ở vùng nhiệt đới Ở nước ta có các giống quít trồng nổi tiếng thuộc nhóm này như Quít đường, Quít tiều, Quít Bắc sơn, Quít hồng, Quít vàng, Quít Chu sa và Quít ta

 Nhóm quít “ King” (C nobilis Loureiro) còn gọi là quít Sành (Tangors) Đây

là nhóm quít phổ biến ở Đông Dương, đôi khi còn có tên gọi là “Kunenbo” (ở Nhật) Nhóm này chịu lạnh kém hơn nhóm trên Cây có nhiều gai mọc thẳng đứng hoặc không có gai; lá hình mác rộng, cuống lá dài trung bình, gốc lá có cánh hẹp, quả to, vỏ dày, hạt ít hoặc nhiều, trung bình mỗi quả có từ 12-14 múi Ở miền Nam nước ta, có giống quít trồng khá phổ biến, thường gọi

nhầm là “Cam Sành”, lai giữa C reticulata Blanco và C sinensis (L.) Osbeck

và ở miền Bắc có giống “Cam Bố hạ”, lai giữa C reticulata Blanco và C maxima (Burm.) Merr

 Nhóm quít “ Satsuma” (C unshiu Marcovitch) có nguồn gốc ở Nhật Bản Cây

chịu lạnh khoẻ, nhưng cũng có thể sinh trưởng, phát triển tốt ở vùng nhiệt đới Cây thường phân nhánh nhiều và rủ xuống, hầu như không có gai Lá hình mác, cuống lá dài, gốc lá có cánh Hoa có hạt phấn bất thụ Quả cỡ trung bình, khi chín có màu vàng da cam, không hạt, có 10-12 múi Ở Nhật, người ta còn xác định 5 nhóm quít trồng : Wase, Zairai, Owari, Ikeda và Ikiriki

 Nhóm quít Địa Trung Hải (C deliciosa Tenore), còn gọi là quít lá liễu, thích

hợp với khí hậu Địa Trung Hải Quả chỉ bảo quản được trong thời gian ngắn Cây có cành rủ xuống, ít hay nhiều gai, lá có dạng hình mác hẹp Quả cỡ trung bình có 10-12 múi, hạt nhiều Nhóm này không quan trọng với các nước nhiệt đới

Hầu hết các giống quít đều có thể tự thụ phấn hoặc thụ phấn chéo và hiện tượng nở hoa kết quả cách năm ( 2 năm một lần) khá phổ biến [81,89,92,]

1.1.2.2 Loài Bưởi

 Bưởi thường: Citrus grandis (L.) Osbeck

Đồng danh : Citrus maxima (Burm.) Merr., Citrus decumana L

Thực vật học :

Cây cao từ 5-15 m, cành rủ thấp, có gai ở cây trồng bằng hạt hoặc không gai ở cây trồng bằng giâm cành, gai dài khoảng 5 cm; các bộ phận còn non thường có lông tơ Lá có hình trứng hoặc bầu dục, 5-10 (-20) cm x 2-5 (-12) cm, đáy tròn hoặc hình tim, mép lá nguyên hoặc xẻ thùy nông, lấm tấm nhiều túi tinh dầu; cuống lá có cánh hình tim ngược, rộng cỡ 7 cm Hoa mọc đơn độc ở nách lá hoặc thành từng chùm vài bông hoa; hoa mẫu năm, khi nở có kích thước từ 3-5 cm; cánh hoa trắng, nhị 20-35; bầu noãn có 11-16 lá noãn Quả mọng có dạng gần như hình cầu hoặc hình quả lê, đường kính 10-30 cm, màu vàng xanh với nhiều túi tiết tinh dầu; vỏ dầy 1-4 cm; các múi to với các tép màu hồng hay vàng nhạt Hạt thường ít, to, thẳng, vàng nhạt và có một phôi

Ngoài ra còn loài bưởi C paradisi Macf có mối liên hệ khá gần với loài bưởi C grandis (L.) Osbeck, có thể phân biệt nhờ vào các đặc điểm sau : quả thường nhỏ hơn C grandis (L.) Osbeck, có dạng gần như hình cầu ( C grandis (L.) Osbeck thường có dạng quả lê); các tép bưởi dính nhau khá chắc và có nhiều dịch hơn ( ở C grandis (L.) Osbeck các tép dễ tróc và ít dịch quả hơn); cuống lá có cánh rộng nhưng không có dạng hình tim như ở C grandis (L.) Osbeck; hạt màu trắng và có nhiều phôi (ở C grandis (L.) Osbeck hạt màu vàng nhạt và chỉ có

một phôi)

Ở nước ta, theo số liệu của tổ chức FAO thì diện tích trồng bưởi là 8170 ha, sản lượng 50.000 tấn / năm [95] với nhiều loại bưởi quý nổi tiếng như “Đoan Hùng” (Phú Thọ), “Phúc Trạch” (Hà Tĩnh), “Biên Hòa” (Đồng Nai), “Năm roi” (Mỹ

Tho, Cần Thơ), “Da xanh” (Bến Tre), “Thanh trà”ø (Huế), [81,89,92]

 Bưởi đắng: Citrus paradisi Macf

Đồng danh: Citrus decumana L var racemosa Roem., Citrus grandis (L.)

Osbeck var racemosa (Roem.) B.C Stone

Thực vật học :

Cây có tán dầy, rộng, cao 10-15m Lá nhỏ hơn lá của C grandis (L.) Osbeck

nhưng lớn hơn lá cam, gần như không có lông; cuống lá có cánh rộng nhưng kém

hơn ở C Grandis (L.) Osbeck và có dạng hình mác hoặc hình trứng ; phiến lá

hình trứng , 7-15 cm x 4-8 cm, thường có thùy Hoa đơn độc hoặc mọc thành chùm nhỏ ở nách lá; hoa mẫu 5, đường kính 4-5 cm; cánh hoa màu trắng, nhỏ

hơn cánh hoa của C grandis (L.) Osbeck nhưng lớn hơn cánh hoa cam ngọt; nhị

20-25; bầu noãn 12-14 lá noãn Quả mọng, hình cầu, đường kính 8-15 cm, màu vàng xanh nhạt; các múi bưởi khó tách, quả nhỏ nhưng chứa nhiều dịch quả hơn

C Grandis (L.) Osbeck Hạt màu trắng, phẳng, thường đa phôi

Tên khoa học chính xác của bưởi đắng cho đến nay vẫn chưa được thống nhất

Một số tác giả cho rằng nó là cây lai của C grandis (L.) Osbeck và dùng tên (Citrus x paradisi) để chỉ nguồn gốc lai này Các tác giả khác lại cho rằng nó là

một loài độc lập hoàn toàn [81]

Hiện có hai dạng cây trồng: một dạng có cùi trắng và một dạng có cùi màu hồng; cả hai dạng đều có thể trồng bằng hạt hoặc không dùng hạt Dạng trồng bằng hạt cần 8 tháng để trưởng thành ở vùng ấm, dạng giâm cành cần ít nhất khoảng hơn một tháng Các giống bưởi trồng nổi tiếng bao gồm : Marsh (không hạt, cùi trắng), Duncan (có hạt, cùi trắng), Thompson (dạng biến dị của Marsh, cùi hồng) và Ruby (không hạt, vỏ hơi đỏ) Giống lai giữa quít (mandarin) và bưởi (grapefruit) được gọi là Tangelos, tiêu biểu có Minneola và Ugli (Jamaica) Giống Chironja lai giữa cam ngọt và bưởi (grapefruit), được gọi là Orangelo; nó có dạng quả lê, vị ngon và cũng phát tốt ở vùng nhiệt đới [81,89,92]

1.1.2.3 Loài Cam:

 Cam ngọt: Citrus sinensis (L.) Osbeck

Đồng danh: Citrus aurantium L var sinensis L

Thực vật học:

Cây gỗ nhỏ có dáng khoẻ, đều; thân không gai hay có ít gai Lá mọc so le, phiến lá dai, màu xanh đậm, hình trái xoan, dài (5-10 cm), rộng (2,5-5 cm), mép có răng thưa; cuống hơi có cánh, rộng (4-10 mm) Chùm hoa ngắn ở nách lá, đơn độc hay nhóm 2-6 hoa thành chùm; đài hoa hình chén, không lông; cánh hoa trắng dài 1.5-2 cm; nhị 20-30 dính nhau thành 4-5 bó Quả gần hình cầu, đường kính 5-8 cm, màu vàng da cam tới đỏ da cam; lõi đặc, vỏ quả dày (3-5 mm), khó bóc; cơm quả vàng, vị ngọt chua; hạt có màu trắng

Người ta đã xếp loài cam ngọt Citrus sinensis (L.) Osbeck đang được trồng trọt

vào 3 nhóm: nhóm cam thường; nhóm cam đỏ máu có múi và tép màu đỏ hoặc có vân đỏ và nhóm thứ ba với 1 dãy các lá noãn thứ cấp mở ở chóp của quả tạo thành rốn quả Đặc điểm “đỏ” không xuất hiện ở các giống cam trồng tại những nơi thấp trong vùng nhiệt đới vì chúng chỉ được tạo ra ở nhiệt độ dưới 17 oC vào ban đêm Giống cam trồng quan trọng nhất, được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và lên tới độ cao 1600m là giống “ Valencia” Đây là giống cho thu hoạch muộn, vì từ lúc nở hoa cho đến khi quả chín cần tới 8-9 tháng (ở vùng cao nguyên còn có thể lâu hơn nữa) Quả cỡ vừa phải, hình cầu hoặc hơi thuôn, ít hạt (hoặc không hạt), nhiều nước và hương vị ngon Cam ở nước ta có thể thuộc nhóm “ Valencia” Ở miền Nam gọi là “Cam tiều”, “Cam đường”, ở miền Bắc gọi là “Cam mật”, “Cam Xã đoài”

Hiện nay, giống cam trồng nổi tiếng nhất là “Washington” (còn gọi là “Bahia”), không hạt, dễ bóc vỏ, tép nhiều nước, ngọt, thơm ngon Giống này quả to, vỏ dày, chín sớm (6 tháng) Tại vùng nhiệt đới, nó thường được trồng ở độ cao từ 1000-2000m [81,89,92]

Ngoài ra còn nhiều giống cam lai như Tangors (cam x quít); Citranges (Cam x

Poncirus trifoliata); Citrangors (Cam x citrange); Citrangequats (Citrange x kumquat)

 Cam chua: Citrus aurantium L

Thực vật học:

Cây gỗ cao 4-5 m hay hơn, phân nhánh nhiều, cành có gai dài và nhọn Lá hình trái xoan nhọn, nguyên, hơi dai, bóng, phiến dài 5-10 cm, rộng 2,5-5 cm, có đốt trên cuống, nở thành 1 cánh rộng hay hẹp tùy thứ Hoa màu trắng họp thành xim

ở nách lá Quả hình cầu, đường kính trung bình 6-8 cm, khi chín màu da cam, mặt ngoài sù sì [4]

Người ta thường lẫn lộn giữa Citrus sinensis (L.) Osbeck (Cam ngọt) và Citrus aurantium L (Cam chua), nhưng giữa 2 loài này rất dễ phân biệt: quả Cam ngọt

có lõi đặc còn quả Cam chua có lõi rỗng; cuống lá Cam ngọt có cánh nhỏ, hẹp còn ở loài kia thì có cánh rộng; mùi thơm của tinh dầu lá và hoa ở loài trên cũng rất khác nhau [81]

1.1.2.4 Loài Chanh: Citrus aurantifolia (Christm & Panzer) Swingle

Đồng danh: Limonia aurantifolia Christm & Panzer, Citrus javanica Blume, Citrus notissima Blanco

Thực vật học:

Cây gỗ nhỏ, cao 3-6m; thân có nhiều cành; gai ở cành thẳng, rất nhọn, dài 1 cm; còn gai ở thân dài 2-3 cm Lá nhỏ, hình bầu dục, mép nguyên, hơi dai và màu lục bóng, dài 4-6 cm, rộng 2-4 cm, có nhiều tuyến nhỏ; cuống lá có đốt, dài 1

cm, có cánh hẹp Hoa nhỏ, trắng, ở nách lá, tập họp thành nhóm 3-10 cái Quả hình cầu hay hình trứng, đường kính 3-6 cm, màu lục hoặc vàng khi chín, vỏ mỏng, nhẵn bóng, dính vào múi; cơm quả chưá nhiều nước, rất chua

Chanh Citrus aurantifolia Swingle có thể lai với các loài Citrus khác để cho các giống lai như: Lemonimes (Citrus aurantifolia Swingle x lemon); Limequats (Citrus aurantifolia Swingle x kumquat); Persian lime (Citrus aurantifolia

Swingle x citron), quả hơi dài, vị chua nhưng mùi vị kém hơn chanh thường, không hạt Các giống chanh lai rất khó phân biệt được, thường chỉ dựa vào hình dạng quả để xác định như trường hợp của giống “Kai” và “Paan” ở Thái Lan

[81,89,92] Ở nước ta, chanh ở miền Nam là Chanh ta (Citrus aurantifolia

Swingle), chanh ở miền Bắc là Chanh kiên (Citrus limonia Osbeck)

1.1.2.5 Loài Quất (Tắc): Fortunella spp.(Kumquats)

Theo như phân loại trước đây thì Quất được xếp vào chi Citrus với tên là Citrus japonica (Thunb.), về sau được chuyển vào 1 chi riêng và được đặt tên theo tên

của nhà thực vật học Robert Fortune, người đã du nhập cây Quất vào châu Aâu Quất thuộc dạng cây bụi hay cây nhỏ, cao từ (2,4-4,5m), có nguồn gốc từ miền nam Trung Quốc nhưng cũng có thể mọc khắp nơi trên thế giới ở các vùng bán nhiệt đới Lá đơn, mọc so le, màu lục sẫm bóng; phiến hình trái xoan hay thuôn, cuống có cánh rất nhỏ, dày và cứng Chùm hoa ngắn ở nách lá hay ở ngọn Hoa trắng, cánh hoa dài (7-9 mm); nhị 15-20 Quả nhỏ hình cầu hoặc hình bầu dục, đường kính (1,5-3,5 cm), màu vàng da cam bóng Quả Quất chỉ có 3-6 múi là

điểm đặc trưng so với các quả Citrus khác, vỏ của Quất thường ngọt hơn múi

quả và có thể ăn được Hạt có màu xanh Ngoài ra cây còn được dùng làm kiểng, trang trí nhà cửa Quất được trồng nhiều ở Trung Quốc và Nhật Chúng

chứa nhiều calcium, kali, vitamin A và C như các Citrus khác

Các loài sau đây đã được Swingle và Tanaka xác định [81,89,91,92]:

- Fortunella crassifolia Swingle = Fortunella japonica (Thunb.) x Fortunella margarita Swingle, quả tròn, vỏ dầy, màu vàng cam

- Fortunella hindsii (Champ Ex Benth.) Swingle, “Hong Kong” hoặc “Hong

Kong Wild”, quả màu cam, khi chín có màu đỏ, nhiều hạt

- Fortunella japonica (Thunb.) Swingle, “Marumi”, quả tròn, vỏ mỏng, màu

vàng đến vàng sẫm, chịu được khí hậu lạnh

- Fortunella margarita (Lour.) Swingle, “Nagami”, quả hình bầu dục dài, vỏ

quả mỏng, màu vàng cam

- Fortunella obovata hort ex Tanaka, Fortunella polyandra (Ridl.) Tanaka, Fortunella swinglei Tanaka

1.2 HOÁ HỌC CHI CITRUS

Tính đến nay, thành phần hóa thực vật đã biết của chi Citrus bao gồm những nhóm sau: tinh dầu, flavonoid, coumarin, alcaloid, limonoid, carotenoid, pectin,

acid hữu cơ, steroid và triterpenoid

1.2.1 Tinh dầu Citrus

Tinh dầu Citrus được chứa trong túi tiết của phần vỏ quả ngoài Tinh dầu vỏ quả Citrus ép lạnh trên thị trường thu được bằng cách phá vỡ các túi tiết khi ép Có 5 loại tinh dầu vỏ quả Citrus thu được từ 5 nhóm: Bưởi (grapefruit), Cam (orange),

Quít (tangerine), Chanh núm (lemon) và Chanh thường (lime) tương ứng Một lượng nhỏ tinh dầu cũng được tìm thấy trong dịch múi quả, thành phần có hơi

khác một ít so với tinh dầu vỏ quả Một loại tinh dầu Citrus thu được bằng cách chưng cất nước quả tươi của Citrus, thành phần giống như thành phần ở tinh dầu

ép lạnh và mùi cũng tương tự như mùi của tinh dầu ép lạnh

Tinh dầu Citrus được cấu tạo bởi các hydrocarbon terpenic và các dẫn chất của

nó như các alcol, aldehyd, ester, ceton và một số acid hữu cơ Trong số các thành phần này, limonen luôn chiếm hàm lượng cao từ 88 - 95%, do đó các thành phần còn lại thường chiếm 1 tỷ lệ không đáng kể Dưới đây là thành phần tinh dầu

Citrus đã được chúng tôi thu thập và liệt kê lại [35, 66, 76]:

Các acid: acetic; citronellic; decanoic; dodecanoic; formic; heptanoic; hexanoic;

nonanoic; octanoic; undecanoic

Các alcol: tert – amyl alcol; benzyl alcol; borneol; cis – carveol; trans – carveol;

citronellol; decanol; dodecanol; elemol; farnesol; geraniol; heptanol; ol; hexanol; 3-hexen-1-ol; linalool; 1,8-p-menthadien-1-ol; cis-2,8-p- menthadien-1-ol; 8-p-menthen-1,2-diol; 1-p- menthen-9-ol; methanol; 2-methyl-

3-hepten-1-3-buten-2-ol; methylheptenol; nerol; nerolidol; l-nonanol, octanol;

O-phenylphenol; iso-pulegol; sabinen hydrat; terpinen-4-ol; α-terpineol; terpineol; tetrahydrogeraniol; thymol; α,α,p-trimethyl-benzyl alcol; undecanol

β-Các aldehyd: acetaldehyd; citral; citronellal; decanal; 2-decenal; dodecanal; 2-

dodecanal; furfural; geranial; heptadecanal; heptanal; α-heptyl-β-heptyl arolein; α-heptyl-β-nonyl arolein; hexadecanal; hexanal; α-hexyl-β-heptyl acrolein; α- hexyl-β-nonyl acrolein; α-hexyl-β-octyl acrolein; neral; nonanal; octanal; α- octyl-β-heptyl arolein; α-octyl-β-octyl arolein; pentadecanal; perillaldehyd; α- sinensal; β-sinensal; tetradecanal; tridecanal; undecanal

Các ester: bornyl acetat; trans-carvyl acetat; citronellyl acetat; decyl acetat;

ethyl iso-pentanoat; geranyl acetat; geranyl butyrat; geranyl format; linalyl

acetat; linalyl propionat; 1,8-p-menthadien-2-yl-acetat;

1,8-p-menthadien-9-yl-acetat; menthyl anthranilat; methyl 2-ethyl hexanoat; methyl N-methyl anthranilat; neryl acetat; nonyl acetat; octyl acetat; octyl butyrat; perillyl acetat; terpinyl acetat; terpinyl propionat

Các hydrocarbon: benzen; α-bergamoten; β-bisabolen; cadinen; camphen; Δ3

-caren; α-caryophyllen; caryophyllen; α-copaen; copaen; α-cubeben; cubeben; p-cymen; α-elemen; β-elemen; Δ-elemen; farnesen; guaien; α- humulen; β-humulen; isopren; limonen; longifolen; 2,4-p-menthadien; 3-methyl- 1-buten; p-methyl-iso-propenyl-benzen; myrcen; nonan; nootkaten; pentadecan;

β-α-phellandren; β-phellandren; α-pinen; β-pinen; sabinen; α-selinen;

epi-selinen; γ-epi-selinen; terpinen; β-terpinen; γ-terpinen; terpinolen; tetradecan;

1.2.2 Thành phần flavonoid của Citrus

Trong chi Citrus có 3 nhóm flavonoid: flavanon (bao gồm 3-hydroxyflavanon

hoặc flavanonol), flavon (bao gồm 3-hydroxyflavon hay flavonol) và anthocyanin Flavanon là nhóm trội nhất trong quả của hầu hết các loài thuộc chi

Citrus Anthocyanin là sắc tố ít quan trọng ở chi Citrus và hiện chỉ thấy có trong

quả cam đỏ Cấu trúc và cách đánh số của flavanon, flavon và anthocyanin (dẫn chất glycosid của cation 3-hydroxyflavylium) được minh hoạ dưới đây [35,41,51,52,93]

O

O

3 5

6

7

8

3' 4' 1'

2'

5' 6'

O

O

4'

5' 6' 1' 2'

3 5

6 7 8

3'

O

OH

1' 2'

5' 6'

4 +

5 6 7 8

3' 4'

3

1.2.2.1 Flavanon

Các flavanon chính của Citrus thường không ở dạng aglycon mà thường gắn với

đường thông qua nhóm hydroxy ở C-7, đường có thể là -neohesperidose

(2-O--L-rhamnopyranosyl--D-glucopyranose) hoặc â-rutinose (6-O--L rhamnopyranosyl --D -glucopyranose) Các flavanon neohesperidosid được phân biệt với các flavanon rutinosid nhờ vào vị của chúng: các neohesperidosid có vị đắng còn các rutinosid thì không có vị đắng [35] Ngoài ra, -neohesperidosid thì bền với kiềm nóng trong khi -rutinosid thì không Tác dụng duy nhất của kiềm nóng trên flavanon 7--neohesperidosid là cắt vòng C để cho phloracetophenon 4’- neohesperidosid (H.1.6) Đây là 1 sản phẩm phân hủy có giá trị, có thể được sử dụng trong tổng hợp các hợp chất flavonoid khác Một trong những tác động của kiềm nóng trên flavanon 7--rutinosid là cắt cầu nối giữa đường và aglycon; không tìm thấy phloracetophenon 4’- - rutinosid từ

-sản phẩm phân hủy [35]

Những flavanon glycosid khác là các dẫn chất trisaccharid của naringin 4’-glucosid và naringenin 7--rutinosid 4’--D-glucosid, cả 2 chất này được phân lập từ quả Bưởi với hàm lượng thấp

H2OH

OH

O O

OH OH

OH

CH3

OH

COCH3OH

 Neo O

H.1.4 β-Neohesperidose H.1.5 β-Rutinose H.1.6 Phloracetophenon 4’- β-

neohesperidosid Cho đến nay, người ta chỉ mới tìm thấy 2 aglycon flavanon tự do là citromitin và 5-O-desmethylcitromitin, cả 2 chất này được tìm thấy ở loài calamodin

Một khía cạnh được nghiên cứu nhiều về cấu trúc flavanon là hoá lập thể của chúng [29] Carbon số 2 của flavanon là 1 trung tâm bất đối xứng có thể có cấu hình S hoặc R Người ta thấy rằng hầu hết các flavanon glycosid đều tồn tại ở dạng 2S như minh hoạ ở cấu trúc của hesperidin dưới đây (H.1.7)

O

OH

O OH

sinh tổng hợp của naringin được dự đoán là naringin chalcon Enzym đồng phân hoá flavanon chalcon là enzym chịu trách nhiệm chuyển chalcon thành 2S-naringin đã biến mất hoặc bị vô hoạt hoá khi quả chín Do vậy từ đó về sau bất cứ chalcon nào được tạo ra cũng sẽ trải qua sự đóng vòng mà không có tác động của enzym để cho 1 hỗn hợp của 2R- và 2S- naringin Hỗn hợp này được xem là

ở trạng thái cân bằng với chalcon trong 1 tiến trình không có enzym (H.1.8)[35, 52]

H.1.8 Sự chuyển naringin-chalcon thành naringin

1.2.2.2 Flavon

Các flavon dạng aglycon, các flavon dạng glycosid và các dẫn chất C-glycosyl

có số lượng nhiều hơn các flavanon trong Citrus nhưng thường ở nồng độ thấp và

rất khó tinh khiết hoá Một số flavon thông thường như apigenin, acacetin, luteolin được tìm thấy dưới dạng glycosid và đường thường là -rutinose hoặc -neohesperidose gắn vào aglycon thông qua nhóm hydroxy ở C-7 Ở flavonol, đường thường gắn vào OH của C3 như trong công thức quercetin

Các C-glycosylflavon, là những thành phần có hàm lượng thấp thường gây khó khăn trong quá trình kết tinh và tinh khiết hoá Các chất tiêu biểu là 6-C--D-glucosyldiosmetin (H.1.9) và 8-C--D-glucosyldiosmetin (H.1.10) từ quả Chanh Ngược lại, margariten và isomargariten, là dẫn chất C-neohesperidosyl phân lập từ quả Quất, thì lại có thể kết tinh dễ dàng [35,52]

O

OH

O OH O

O

O

O O

OH

OMe

H.1.9 6-C--D-glucosyldiosmetin H.1.10 8-C--D-glucosyldiosmetin

Các flavon dạng aglycon là thành phần đặc trưng nhất của Citrus mặc dù thỉnh

thoảng chúng cũng được tìm thấy trong các cây khác Nói chung chúng là những hợp chất được thế ở mức độ cao, đặc biệt là ở vòng A với nhiều nhóm methoxy và một vài nhóm hydroxy Các chất này rất dễ kết tinh và tinh khiết hoá

1.2.2.3 Anthocyanin

Sắc tố của Cam đỏ (Blood orange) là các anthocyanin, sắc tố flavonoid duy nhất

có trong chi Citrus, các sắc tố đỏ khác thuộc về nhóm carotenoid Chandler

(1958) đã xác định cyanidin-3-glucosid là anthocyanin chiếm ưu thế trong thứ Moro của cam đỏ, 1 sắc tố thứ 2 ở dạng vết được sơ bộ xác định là delphinidin-3-glucosid Sự khảo sát 3 thứ khác là Tarocco, Florida và Ruby cho thấy không có sự khác nhau về sắc tố anthocyanin [52]

Sau đây 65 flavonoid của Citrus mà chúng tôi đã thu thập và liệt kê lại

[[35,41,51,52,93]:

Các flavanon dạng glycosid Naringin (5,7,4’-trihydroxyflavanon 7-β-neohesperidosid);

naringenin 7- β-rutinosid (5,7,4’-trihydroxyflavanon 7-β-rutinosid); naringin D-glucosid (5,7,4’-trihydroxyflavanon 7-β-neohesperidosid 4’-β-D-glucosid); naringenin 7-β-rutinosid 4’-β-D-glucosid (5,7,4’-trihydroxyflavanon 7-β-rutinosid 4’-β-D-glucosid); naringin 6’’-malonat [naringenin 7-(2’’-O-α-L-rhamnosyl)-β- D-glucosid 6’’-malonat]; poncirin (5,7-dihydroxy-4’-methoxyflavanon 7-β- neohesperidosid); isosakuranetin 7-β-rutinosid (5,7-dihydroxy-4’-methoxyflavanon 7-β-rutinosid); neoeriocitrin (5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavanon 7-β-

4’-β-neohesperidosid); eriocitrin (5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavanon 7-β-rutinosid);

neohesperidin (5,7,3’-trihydroxy-4’-methoxyflavanon 7-β-neohesperidosid);

hesperidin (5,7,3’-trihydroxy-4’-methoxyflavanon 7-β-rutinosid);

dihydrokaempferol glycosid (3,5,7,4’-tetrahydroxyflavanon glycosid)

Các flavanon dạng aglycon Citromitin (5,6,7,8,3’,4’-hexamethoxyflavanon); O-desmethylcitromitin (5-hydroxy-6,7,8,3’,4’-pentamethoxyflavanon)

5-Các flavon dạng glycosid Rhoifolin (5,7,4’-trihydroxyflavon 7-β-neohesperidosid);

apigenin 7-β-rutinosid (5,7,4’-trihydroxyflavon 7-β-rutinosid); fortunellin dihydroxy-4’-methoxyflavon 7-β-neohesperidosid); luteolin 7-β-neohesperidosid

(5,7-(5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavon 7-β-neohesperidosid); luteolin 7-β-rutinosid (5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavon 7-β-rutinosid); neodiosmin (5,7,3’-trihydroxy-4’-

methoxyflavon 7-β-neohesperidosid); diosmin

(5,7,3’-trihydroxy-4’-methoxyflavon 7-β-rutinosid); chrysoeriol glycosid

(5,7,4’-trihydroxy-3’-methoxyflavon glycosid); kaempferol glycosid (3,5,7,4’-tetrahydroxyflavon

glycosid); rutin (3,5,7,3’,4’-pentahydroxyflavon rutinosid; quercetin

3-β-rutinosid); isorhamnetin glycosid (3,5,7,4’-tetrahydroxy-3’-methoxyflavon

glycosid); limocitrin 3-β-D- glucosid (3,5,7,4’-tetrahydroxy-8,3’-dimethoxyflavon 3-β-D- glucosid); limocitrol 3-β-D- glucosid (3,5,7,4’-tetrahydroxy-6,8,3’- trimethoxyflavon 3-β-D- glucosid); isolimocitrol 3-β-D- glucosid (3,5,7,3’-

tetrahydroxy-6,8,4’-trimethoxyflavon 3-β-D- glucosid)

Các C-glycosylflavon 6,8-Di-C- β-D-glucosylapigenin

(5,7,4’-trihydroxy-6,8-di-C-β-D-glucosylflavon; vicenin-2); 2’’-O- β-D-xylosylvitexin [5,7,4’-trihydroxy-8 (2’’-O- β-D-xylosyl-C- β-D-glucosyl) flavon]; isomargariten (5,7-dihydroxy-4’- methoxy-6-C- β-neohesperidosylflavon); margariten (5,7-dihydroxy-4’-methoxy- 8-C- β-neohesperidosylflavon); 6-C- β-D-glucosyldiosmetin (5,7,3’-trihydroxy- 4’-methoxy-6-C -β-D-glucosylflavon); 8-C- β-D-glucosyldiosmetin (5,7,3’- trihydroxy-4’-methoxy-8-C -β-D-glucosylflavon); 6,8-di-C-glycosyldiosmetin

(5,7,3’-trihydroxy-4’-methoxy-6,8-di-C-glycosylflavon)

Các flavon dạng aglycon Tetra-O-methylscutellarein (5,6,7,4’-tetramethoxyflavon);

Tetra-O-methylisoscutellarein (5,7,8,4’-tetramethoxyflavon); sinensetin (5,6,7,3’,4’-pentamethoxyflavon); isosinensetin (5,7,8,3’,4’- pentamethoxyflavon); 5-hydroxy-7,8,3’,4’- tetramethoxyflavon; auranetin (3,6,7,8,4’-pentamethoxyflavon); tangeretin (5,6,7,8,4’- pentamethoxyflavon); 5-O-desmethyltangeretin (5-hydroxy-6,7,8,4’- tetramethoxyflavon); xanthomicrol (5,4’-dihydroxy-6,7,8-trimethoxyflavon); 3’-demethoxysudachitin (5,7,4’-trihydroxy-6,8-dimethoxyflavon); nobiletin (5,6,7,8,3’,4’-hexamethoxyflavon); 5-O-desmethylnobiletin (5-hydroxy-6,7,8,3’,4’- pentamethoxyflavon); 5,4’-dihydroxy-6,7,8,3’- tetramethoxyflavon; sudachitin (5,7,4’-trihydroxy-6,8,3’-trimethoxyflavon); 5-hydroxyauranetin (5-hydroxy-3,6,7,8,4’- pentamethoxyflavon); hexa-O-methylquercetagenin (3,5,6,7,3’,4’- hexamethoxyflavon); 3-hydroxy-5,6,7,3’,4’- pentamethoxyflavon); hexa-O-methylgossypetin (3,5,7,8,3’,4’- hexamethoxyflavon); 5-hydroxy-3,7,8,3’,4’- pentamethoxyflavon; 3,5,6,7,8,3’,4’-heptamethoxyflavon; 5-hydroxy-3,6,7,8,3’,4’- hexamethoxyflavon); natsudaidain (3-hydroxy-5,6,7,8,3’,4’- hexamethoxyflavon); 7-hy droxy -3 ,5,6,3’,4’ - p en tame tho xyflavo n; 7-

hy droxy -3 ,5,6,8 ,3 ’,4 ’- hexamethoxyflavon

Các anthocyanin Cyanidin 3-β-D-glucosid (3,5,7,3’,4’-pentahydroxyflavylium

3-β-D-glucosid); cyanidin 3,5-di-β-D-glucosid

(3,5,7,3’,4’-pentahydroxyflavylium 3,5-di-β-D-glucosid); peonidin 5-β-D-glucosid tetrahydroxy-3’-methoxyflavylium 5-β-D-glucosid); delphinidin 3-β-D-glucosid (3,5,7,3’,4’,5’-hexahydroxyflavylium 3-β-D-glucosid); petunidin 3-β-D-glucosid

Limonoid Citrus là những dẫn chất triterpenoid thoái giáng 4 vòng có mức độ oxy hóa cao và có 1 vòng furan gắn ở vị trí C-17, được tìm thấy ở chi Citrus, họ Rutaceae và 1 số chi thuộc họ Meliaceae lân cận Limonoid Citrus là tác nhân chính gây đắng trong dịch quả Citrus Limonin (C26H30O8, M.470) là limonoid

đầu tiên được phân lập từ dịch quả Citrus (Navel orange) từ năm 1841 và sau

hơn 120 năm (1960) cấu trúc mới được xác định

Limonoid Citrus hiện diện trong tự nhiên dưới dạng aglycon và dạng glycosid Limonoid dạng aglycon bị glucosid hóa thành dẫn chất 17β-D-glucopyranosid

không đắng trong quá trình quả chín Tiến trình này được gọi là tiến trình khử đắng tự nhiên và được xúc tác bởi enzym UDP-D-glucose (H.1.11) [72] Các enzym này không có trong mô quả và hạt còn non Limonin 17-D-glucopyranosid, 1 glucosid limonoid quan trọng, đã được tích tụ trong quả và hạt theo con đường này

O

OH

O

O O COOH O

O

O

O

O O COOH O

O

O D Glucose

UDP

Limonoat A-ring lacton Limonin 17-beta-D-glucopyranosid

H.1.11 Sự glucosid hóa của aglycon limonoid

Ở các quả còn nguyên vẹn, bình thường không chứa chất đắng limonin mà chứa

1 tiền chất của limonin là limonoat có vòng lacton A (không đắng) Tiền chất này được chuyển dần thành limonin do sự đĩng vịng lacton D sau khi dịch quả được chiết ra Quá trình này xảy ra dưới điều kiện pH < 6,5 và có sự xúc tác của enzym limonoid D-ring lacton hydrolase (H.1.12) Enzym này được phân lập

từ Citrus và là 1 enzym có khả năng chịu được nhiệt độ khá cao

OH

O

O O COOH O

O

O

O

O O

O O

O

O

17 17

B B

C

pH acid Limonoid D-ring lacton hydrolase

(Khơng đắng) (Đắng)

H.1.12 Cơ chế của quá trình làm đắng dịch chiết

1.2.3.2 Phân loại

Có 36 limonoid dạng aglycon phân lập từ chi Citrus và các chi lân cận Citrus đã

được xếp thành 4 nhóm: limonin, calamin, ichangensin và 7-acetat limonoid (Bảng 1.2) và 17 limonoid dạng glucosid (Bảng 1.3) Đường sinh tổng hợp của mỗi nhóm đều đã được xác định

Các aglycon limonoid

Các aglycon limonoid có thể ở dưới dạng dilacton trung tính (cả 2 vòng A và D đều đóng), acid monocarboxylic (vòng A hoặc D đóng) và dicarboxylic (cả 2 vòng A và D đều mở) Tất cả được xếp thành 4 nhóm: limonin, calamin, ichangensin và 7-acetat limonoid (Bảng 1.2) [71,72]

Bảng 1.2 Sự phân loại các aglycon limonoid trong chi Citrus và các chi lân cận Nhĩm limonin

Limonin, nomilin, obacunone, deacetylnomilin, ichangin, deoxylimonin, citrusin,

limonol, 7α-obacunol, deoxylimonol, nomilinic acid, deacetylnomilinic acid, obacunoic acid, deoxylimonic acid, isoobacunoic acid, epi- isoobacunoic acid,

isolimonic acid, 19-hydroxydeacetylnomilinic acid, isoobacunoic acid diosphenol

và 17-dehydrolimonoic acid A-ring lactone

Nhĩm calamin

Calamin, retrocalamin, cyclocalamin, isocyclocalamin, methyl isoobacunoate

diosphenol, 6-keto-7β-deacetylnomilol, methyl deacetylnomilinate, calaminic

acid, retrocalaminic acid và cyclocalaminic acid

Nhĩm ichangensin: ichangensin

Nhĩm 7α-Acetate limonoid

Limonyl acetate, 7α-obacunyl acetate, 1-(10-19)abeo-obacun-9(11)-en-7α-yl acetate và 1-(10-19)abeo-7α-acetoxy-10β-hydroxyisoobacunoic acid 3,10-lactone

Các glucosid limonoid

Các glucosid limonoid có tính phân cực, tan nhiều trong dịch quả và cho phản ứng dương tính với thuốc thử Erhlich Bốn glucosid trong hạt Bưởi đã được xác định là 17â-D-glucopyranosid của limonin, nomilin, deacetylnomilin và obacunon (Bảng 1.3) Tính đến nay đã có tất cả 17 glucosid limonoid được phân

lập từ chi Citrus và các chi liên hệ Mỗi chất đều có 1 phân tử D-glucose gắn ở

vị trí C-17 theo kiểu đường nối β-glucosid chẵng hạn như limonin 17â glucopyranosid [71,72]

-D-Bảng 1.3 Các glucosid limonoid trong chi Citrus và các chi lân cận

8 6-Keto-7β-deacetylnomilol 17 Acid 19-hydroxydeacetylnomilinic

9 Methyl deacetylnomilinate

1.2.4 Alcaloid của Citrus

Alcaloid của Citrus là các protoalcaloid Ở Citrus, ngoài synephrine và

octopamine, các tác giả còn tìm thấy tyramine, N-metyltyramine, hordenine, và feruloylputrescine [84] (H.1.13) Synephrine và octopamine là các amin chính

của Citrus, thuộc nhóm giao cảm, là sản phẩm chuyển hoá trước đây chỉ tìm

thấy ở động vật Hàm lượng của các thành phần này thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào loại cây trồng Bằng kỹ thuật dùng C-14 đánh dấu thực hiện ở cam

“Cleopatra”, các tác giả đã chứng minh rằng có ít nhất 3 bước để chuyển 1 acid amin thơm thành synephrine: decarboxy hoá, N-methyl hoá và -hydroxy hoá Trong tiến trình này, tyramine là tiền chất chính [84]

O

O H

OH

NH O

OH NH

CH3

N O

H

CH3

CH3

N O

dihydroxy-bergamottin, oxypeucedanin hydrat, bergaptol, imperatorin, geranoxy-psoralen, isopimpinellin, phellopterin, byakangelicin, 5-geranoxy-8-methoxy-psoralen [66,76]

R5

R7 R8 1 2 3 4 5 6

7 8

Coumarin

R5

O R8

1 2 3 4 5

Carotenoid là các sắc tố có màu từ vàng đến đỏ cam được tìm thấy ở vỏ quả

ngoài và trong dịch quả Citrus Hầu hết các carotenoid phân lập từ quả Citrus

đều là các dẫn xuất của -carotene; -carotene chẳng hạn như cryptoxanthin, luteoxanthin, mutatochrome, auroxanthin và zeaxanthin; một số là dẫn xuất của

- carotene; phytoene và phytofluene; một số là hợp chất polyene như sintaxanthin và -apo-10’-carotenal Trong đó, cryptoxanthin là sắc tố carotene

chính của Citrus (Hình 1.15) [40,76]

O H

1.2.7 Các acid hữu cơ

Acid hữu cơ là 1 thành phần rất phổ biến của quả Citrus và đóng 1 vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phát triển của các sản phẩm Citrus, trong đó lượng

acid toàn phần cùng với đường được xem là 1 trong các tiêu chí quyết định sự

chấp nhận của người tiêu thụ Từ dịch quả và vỏ quả Citrus, các acid sau đây đã

được xác định: acid citric, l-malic, oxalic, succinic, malonic, l-quinic, lactic, adipic, benzoic, 2-ketoglutaric, isocitric, acotinic [20]

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG CHI CITRUS

1.3.1 Tác dụng và công dụng của flavonoid

- Tác dụng chống oxy hoá

Thực tế cho thấy các flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như 1O2, .OH, ROO. và khả năng dập tắt mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu trúc của flavonoid Có 3 nhóm cấu trúc quan trọng để xác định khả năng bẫy gốc tự do và

khả năng chống oxy hoá của flavonoid (H.1.16): (a), cấu trúc ortho-dihydroxy ở

vòng B kiểu catechol; (b), có nối đôi ở vị trí C2-C3 kết hợp với nhóm oxo ở C-4, chịu trách nhiệm cho sự di chuyển điện tử từ vòng B; và (c), có sự hiện diện của cả 2 nhóm hydroxyl ở C-3 và C-5, cho khả năng bẩy gốc tự do mạnh nhất Cả 2 nhóm hydroxyl này được xem là tương đương nhau và cùng có liên kết hydrogen với nhóm ceto ở C-4 [61, 67]

O H

O H

.

H.1.16 Các nhóm chức ở flavonoid với khả năng chống oxy hoá cao

Thực nghiệm cho thấy khả năng dập tắt oxygen đơn bội của các flavonoid

Citrus tăng theo thứ tự: naringenin < tangeretin < kaempferol < luteolin ≤

eriodictyol ≤ quercetin Thứ tự này tương ứng với sự gia tăng của cấu trúc (c) OH) < (c) (3-OH) < (b) << (a) Như vậy các flavonoid với cấu trúc vòng B kiểu catechol là những chất dập tắt gốc oxygen đơn bội tốt nhất [41,61] Đối với gốc anion superoxid, sự hiện diện của 3-OH và nối đôi ở C2-C3 làm cho hoạt tính của flavonoid tăng lên Vì lý do này mà apigenin có khả năng bẫy trung bình trong khi naringenin về mặt thực tiễn không có tác dụng Tuy nhiên, các thử nghiệm mới đây trên mô hình cho thấy naringin kết hợp với vitamin C có khả năng ức chế amyloid beta protein và acetylcholinesterase Do đó, hỗn hợp này có thể được sử dụng như 1 tác nhân chống thoái hoá thần kinh trong bệnh Alzheimer [30,31,88]

(5 Tác dụng chống ung thư

Trên thử nghiệm in vitro, nhiều flavonoid cho thấy tác dụng chống sinh sản trên nhiều dòng tế bào ung thư người khác nhau, ví dụ, tế bào ung thư bạch cầu lymphoid và myeloid, tế bào ung thư dạ dày [87], tế bào ung thư buồng trứng, tế bào ung thư tuyến tiền liệt và các tế bào ung thư squamous [45] Các

polymethoxyflavon của Citrus (nobiletin và tangeretin) ức chế sự tăng trưởng

của tế bào ung thư squamous tùy theo liều: ở liều 8µg/ml, 2 flavonoid này làm

chết tế bào khi quá trình nuôi cấy được kéo dài [41,45] Các cơ chế liên quan đến tác dụng chống sinh sản hãy còn ít được biết Các flavonoid ảnh hưởng đến tế bào theo nhiều cách, hoặc là ở mức độ màng tế bào hoặc là trên các enzym trong tế bào Trên màng tế bào, bao gồm sự ức chế glycolysis, là hướng mà nhiều người quan tâm vì thường rất hiệu quả trên tế bào khối u [55] Trên enzym, các flavonoid có thể ảnh hưởng đến hoạt động của nhiều enzym liên quan đến quá trình chuyển gen lúc phân chia tế bào (kinase, phospholipase, phosphodiesterase) và điều hoà các enzym cần thiết cho sự tăng trưởng và sinh

sản của tế bào Kết quả sàng lọc tác dụng của 27 flavonoid Citrus trên các dòng

tế bào thường và tế bào khối u đã thu được 7 flavonoid có tác dụng chống sinh sản mạnh trên tế bào khối u và tác dụng yếu trên tế bào thường theo thứ tự sau: luteolin, natsudaidain, quercetin, tangeretin, eriodictyol, nobiletin và 3,3’,4’,5,6,7,8-heptamethoxyflavone Mối tương quan giữa cấu trúc và tác dụng ở các chất này cho thấy cấu trúc kiểu catechol ở vòng B và nối đôi ở C2-C3 là yếu tố rất quan trọng cho tác dụng chống sinh sản Đối với các polymethoxyflavon, C3-OH và C8- methoxy cần cho 1 tác dụng mạnh [48]

Các flavonoid Citrus cũng có thể hỗ trợ cho các thuốc chữa trị ung thư khác, ví

dụ, quercetin làm gia tăng tác dụng ức chế tăng trưởng của adriamycine (ADR) trên tế bào ung thư vú đề kháng MCF-7 ADR và tế bào đại tràng MCT-15 [61]

Ở giai đoạn di căn, các thử nghiệm cho thấy các flavonoid Citrus có thể ức chế

sự tấn công của tế bào khối u ác tính (MO4) của chuột theo cơ chế ức chế sự di chuyển của tế bào [15]

- Tác dụng của flavonoid trên tim mạch

Tác dụng trên mao mạch Tác dụng của flavonoid trên sự xuất huyết và tính bền

mao mạch đã được công bố lần đầu tiên vào 1938 bởi Szent-Gyorgyi với sự phân

lập từ nước chanh 1 chất gọi là “ Citrin’’, thực ra đây là 1 hỗn hợp của hesperidin và eriodictyol glucosid, có tác dụng làm bền thành mạch ở các bệnh nhân với các bệnh lý liên quan đến sức bền thành mạch kém và đặt tên là vitamin P Các flavonoid này cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzym oxy hoa ù- khử [6] Cơ chế tác động là ức chế enzym hyaluronidase, enzym có tác dụng làm tăng tính thấm mao mạch, khi thừa sẽ gây hiện tượng xuất huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P Trên thực tế, các chế phẩm chứa các flavonoid, chủ yếu là các dẫn xuất từ hesperidin, diosmin và rutin như “ Daflon”, “ Diosmin”, “Flebosmin”, đã được sử dụng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, thiểu năng tĩnh mạch trong tiểu đường, giãn tĩnh mạch, trĩ, sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc,… [90,36]

Tác dụng trên sự ngưng tập tiểu cầu Các flavonoid Citrus cho thấy có tác động

chống sự dính kết và chống sự ngưng tập tiểu cầu Các flavonoid bị methoxy hoá (nobiletin, tangeretin, sinensetin) có hoạt tính mạnh hơn các flavonoid hydroxy hoá và tác động này có thể xem tương tự với tác động của acetylsalicylic, một chất đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự ngưng tập tiểu cầu [61] Mới đây, một số nghiên cứu đã chứng minh rằng cả nobiletin và tangeretin đều ức chế sự ngưng tập tiểu cầu ở nồng độ 30 M đối với sự ngưng tập gây ra bởi ADP và collagen Mức độ ức chế phụ thuộc vào loại tác nhân gây ra ngưng tập, cấu trúc của flavonoid [55] và có thể có nhiều cơ chế liên quan Ví dụ, sự ức chế enzym phosphodiesterase, enzym có tác động trên cyclic adenosine monophosphat (cAMP) và cyclic guanosine monophosphat (cGMP); sự ức chế enzym cycloxygenase dẫn đến sự giảm sinh tổng hợp thromboxane A2 hoặc sự ức chế di chuyển của Ca2+ nội bào đi ngang qua màng huyết tương cũng có thể

đóng một vai trò [79]

Tác dụng trên bệnh mạch vành Các khảo sát dịch tễ học cho thấy việc đưa

flavonoid vào khẩu phần ăn thường làm giảm bớt các tỉ lệ tử vong do bệnh tim mạch vành và các tai biến do nhồi máu cơ tim [32,41] Có bằng chứng cho thấy sự oxy hoá lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) sẽ dẫn đến sự xơ hoá thành mạch

máu Trên thử nghiệm in vitro, các flavonoid Citrus ức chế sự oxy hoá LDL bởi

các đại thực bào, chủ yếu bằng ức chế sự sản sinh của hydroperoxid và bảo vệ

α-tocopherol có mặt trong sự oxy hoá lipoprotein Do vậy, các flavonoid có khả

năng ức chế sự phát triển xơ hoá thành mạch máu Mặt khác, các flavonoid

Citrus còn có khả năng điều hoà sự ngưng tập hồng cầu và nồng độ hồng cầu,

hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ nhớt và sự tuần hoàn máu Các flavonoid methoxy hoá như tangeretin và nobiletin cho thấy có tác động chống dính kết hồng cầu và ức chế sự lắng hồng cầu khá mạnh; các hydroxy glycosid thì có tác dụng kém hơn [68] Ở các bệnh nhân mạch vành, các chỉ số huyết học về cholesterol, nồng độ hồng cầu và tốc độ lắng hồng cầu đều cao hơn rõ rệt Ở các bệnh nhân như thế thì việc đưa các flavonoid methoxy hoá vào điều trị thường đạt được nhiều kết quả mong muốn

- Tác dụng kháng viêm, kháng dị ứng và giảm đau

Các flavonoid Citrus tác dụng theo cơ chế ức chế sự giải phóng acid arachidonic

ở các tế bào bị tổn thương, dẫn đến sự giảm lượng endoperoxid, prostaglandin, prostacycline, thromboxane, acid hydroxyeicosatrienoic và leukotriene Tác động như thế đã làm giảm sự phóng thích histamin, chất hoạt động trong giai đoạn đầu của tiến trình gây viêm [59] Diosmin là 1 tác nhân kháng viêm mạnh, làm giảm phù nề và ức chế sinh tổng hợp prostaglandin E2 (78,5%), prostaglandin F2 (45,2%) và thromboxane (59,5%) Diosmin tiêm tĩnh mạch còn

có tác dụng hạ đường huyết ở chuột được tiêm alloxan [39] Nobiletin từ Citrus

có tác dụng kháng viêm trên mô hình theo cơ chế ức chế prostaglandin E2 gần giống như cơ chế kháng viêm của steroid [54]

Một tác dụng khác của flavonoid có liên hệ đến sự phóng thích histamine là tác dụng kháng dị ứng Các thử nghiệm cho thấy hesperidin không có tác dụng ức chế sự phóng thích histamine từ tế bào RBL-2H3 gây bởi IgE nhưng hesperetin, sản phẩm thủy phân từ hesperidin do vi khuẩn ở ruột, thì lại có tác dụng [53]

- Tác dụng chống loét dạ dày

Một trong những phản ứng phụ quan trọng nhất của các thuốc kháng viêm truyền thống là tác dụng gây loét dạ dày của chúng Ngược lại, flavonoid được đánh giá là những hợp chất kháng viêm tốt và cũng có thể bảo vệ màng nhày dạ dày chống lại nhiều tác nhân gây loét Cơ chế chống loét được giải thích là do sự gia tăng hàm lượng glycoprotein và độ nhớt của lớp gel màng nhày dạ dày [56] Kết quả cho thấy quercetin, rutin và kaempferol làm giảm sự hủy hoại dạ dày ở liều 25-50mg/kg trong khi ở naringin là 200-400mg/kg, còn flavon thì không có tác dụng

Các khảo sát cũng cho thấy các flavon, flavanon và quercetin đều có tác dụng ức

chế sự tăng trưởng của Helicobacter pylori và sự tiết acid của thành tế bào khi

đáp ứng kích thích của histamin và dibutyryl cyclic AMP [12] Tác động trên sự tạo prostaglandin E2 thì có khác: flavon và flavanon làm gia tăng sự phóng thích prostaglandin E2 trong khi quercetin thì không có tác dụng

- Tác dụng chống vi sinh vật

Một trong những tác dụng sinh lý được quan tâm nhiều của flavonoid là tác dụng kháng virus Tác dụng kháng virus của flavonoid đã được biết từ những năm

1940 và tác dụng này có liên quan đến cấu trúc của flavonoid [47] Mới đây chất 4’,5-dihydroxy 3,3’,7-trimethoxyflavon đã được phân lập từ 1 cây thuốc Trung

Quốc Agastache folium và đã phát hiện tác dụng kháng nhóm picornavirus với

gía trị IC50 từ 0.09-1.45M [69] Các nghiên cứu về mối liên hệ giữa cấu trúc và tác dụng cho thấy rằng sự hiện diện của nhóm 3-methoxy, nhóm 4-carbonyl, cầu nối đôi C2-C3 thì cần cho tác động chống virus Nếu có thêm nhiều nhóm thế ở vòng A thì tác dụng sẽ mạnh thêm

Suzuki et al (2005), đã khảo sát tác dụng của vỏ quít Citrus unshiu và hoạt chất

của cây là nobiletin trên virus hepatitis C (HCV) Kết quả cho thấy dịch chiết EtOAc, phân đoạn 7 và hoạt chất nobiletin đều ức chế sự nhiễm HCV ở tế bào MOLT-4 (1 dòng tế bào bạch cầu người) [74]

- Sự tương tác giữa nước bưởi và một số dược phẩm khác

Những khảo sát gần đây cho thấy tính khả dụng sinh học của một số thuốc có thể được tăng lên nếu thuốc đó được dùng chung với nước bưởi Tác dụng này là

do nước bưởi ức chế cytochrome P450-3A4 (CYP3A4), yếu tố chịu trách nhiệm trong chuyển hoá thuốc dùng qua đường ruột Hậu quả là làm giảm tốc độ chuyển hoá của thuốc hay nói cách khác là làm tăng nồng độ thuốc trong máu trong 1 khoảng thời gian dài hơn bình thường và dễ đưa đến nguy cơ quá liều cho lần dùng kế tiếp Thành phần chính của nước bưởi có tác dụng ức chế CYP3A4 được gán cho naringin, gần đây được gán cho 1 furanocoumarin chính của bưởi là 6’,7’-dihydroxybergamottin và khảo sát vẫn còn trong quá trình tiếp tục [16] Các thuốc tương tác với nước bưởi bao gồm các thuốc chữa tim nhóm chẹn kênh calcium cấu trúc kiểu dihydropyridine như nimodipin, nifedipine, amlodipine và nisoldipine cũng như nhóm phenylalkylamine như verapamil; các thuốc an thần như diazepam, carbamazepine, trazolam, midazolam và

clomipramine; lovastatin và chất chuyển hoá của nó là acid lovastatin; cyclosporine A, clarithromycine và14-hydroxy clarithromycine; quinidine – ức chế hấp thu và chuyển hoá quinidine thành 3-hydroxyquinidine [16,24,26,33,44,46,82,85]

- Tác dụng chống loãng xương

Nhiều tài liệu khảo sát cho thấy flavonoid cũng đóng một vai trò quan trọng trong phòng ngừa loãng xương Chiba et al (2003), đã thử nghiệm tác dụng chống loãng xương trên mô hình chuột đã bị cắt buồng trứng, kết quả cho thấy hesperidin có tác dụng chống loãng xương khi trộn vào khẩu phần ăn ở tỉ lệ 0,5% Ngoài ra, hesperidin còn cho thấy có tác dụng hạ lipid huyết thanh và lipid

gan [21] Các thử nghiệm trên các dịch quả Citrus khác cũng cho những kết quả

tương tự

- Tác dụng chống sỏi niệu

Các khảo sát cho thấy, các bệnh nhân bị sỏi calcium thường có hàm lượng citrat trong nước tiểu thấp, nguyên nhân có thể là do chế độ ăn thiếu citrat Nguồn kali

và citrat thường có sẵn trong nước chanh Citrus aurantifolia (55,6g citrat/kg quả), các quả Citrus khác cũng có citrat nhưng với hàm lượng thấp hơn, ví dụ, chanh

tây (48,6g/kg quả), cam (39,6g/kg quả) và quít (5,4g/kg quả) Việc uống thường xuyên nước chanh có thể làm tăng pH, tăng hàm lượng citrat, kali và thể tích nước tiểu nhưng không làm tăng hàm lượng muối calcium [64] Các kết quả nghiên cứu cũng đã xác định vai trò của citrat là ức chế sự thành lập các tinh thể muối calcium trong bệnh sỏi niệu Việc điều trị sỏi niệu bằng nước chanh khá đơn giản và cũng tương tự như việc điều trị bằng viên kali citrat nhưng có giá thành thấp hơn Dịch quả cam và bưởi cũng có tác dụng tương tự nhưng ở mức độ thấp hơn [17,34]

- Tác dụng hạ đường huyết

Flavonoid đã được xác định là các hợp chất có tác dụng chống tiểu đường trong một số bài thuốc y học cổ truyền Mô hình thử nghiệm trên chuột cho thấy hesperidin và naringin có tác dụng cải thiện sự chuyển hoá lipid bằng cách làm thay đổi các tác động của enzym chuyển hoá lipid ở gan Ngoài ra, các hợp chất này còn làm hạ nồng độ glucose huyết theo hướng điều chỉnh enzym glucokinase gan, peroxisome proliferators-activated receptor và glucose transporter 4 Như vậy hesperidin và naringin đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hoà sự chuyển hoá glucose và lipid Cả 2 hợp chất này có khả năng chống tiểu đường và một số rối loạn do tiểu đường có liên quan đến chứng cao lipid máu [13,80]

1.3.2 Tác dụng và công dụng của limonoid

Các limonoid Citrus có 1 vòng furan gắn ở vị trí C-17, gần giống như vòng furan

của kahweol và cafesterol chiết từ hạt càfê xanh, có tác dụng kích hoạt enzym glutathion S-transferase (GST) ức chế ung thư dạ dày, ruột non, ruột già, phối và

da trên súc vật thử nghiệm; ức chế sự sinh sản của các tế bào ung thư vú trong môi trường nuôi cấy và gây chán ăn chống sự phá hoại của côn trùng GST là 1 enzym khử độc, xúc tác phản ứng của glutathione với các tác nhân gây ung thư để tạo thành các hợp chất ít độc, tan nhiều trong nước và có thể được bài tiết dễ dàng ra khỏi cơ thể [71,86,77]

Tác dụng gây chán ăn của limonoid Citrus chống lại côn trùng sống trên khoai

tây, bắp, thuốc lá được công bố lần đầu tiên vào 1982 Limonin và ichangesin có tác dụng rất mạnh trên loại côn trùng sống trên khoai tây Limonoid glucosid thì lại không có tác dụng gây chán ăn trên côn trùng [71] Limonin, nomilin và

obacunone từ Citrus reticulata Blanco có tác dụng ức chế ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus [38]

1.3.3 Tác dụng và công dụng của alcaloid

Alcaloid của Citrus bao gồm synephrine, octopamine, tyramine,

N-metyltyramine, hordenine và feruloylputrescine [84] Trong đó, synephrine là alcaloid chính Về mặt tác dụng sinh lý, do có cấu trúc rất gần với adrenalin nên

synephrine cũng được xếp vào nhóm giao cảm gián tiếp, tác dụng theo kiểu

βâ-adrenergic, kích thích sự phóng thích epinephrine và dopamine ở hạch giao cảm, làm tăng sự chuyển hoá cơ bản Do đó có thể được sử dụng để làm thuốc giảm cân ở các cá thể bị béo phì Về mặt dược động học, synephrine kém thân dầu hơn ephedrine nên khó qua được hàng rào máu-não Do vậy ít gây phản ứng phụ hơn ephedrine [21,43]

1.3.4 Tác dụng và công dụng của Citrus trong y học cổ truyền

Y học cổ truyền sử dụng dược liệu Citrus trong các trường hợp sau:

- Vỏ quả Bưởi được dùng chữa ho, đờm tích đọng ở họng và phế quản, đau bụng, ăn không tiêu Khi phối hợp với một vài dược liệu khác (Mộc thông, Bồ hóng, Diêm tiêu, Cỏ bấc) còn có tác dụng chữa phù thũng [2,4,8}

- Vỏ quả Cam có tác dụng tiêu đờm, thông ứ trệ, giúp tiêu hóa tốt Dịch quả có tác dụng giải nhiệt và giải độc Chỉ thực (quả Cam non) và chỉ xác (quả Cam còn xanh) có tác dụng trừ đờm, tiêu thực được dùng làm thuốc trợ tiêu hoá, ăn không tiêu, đầy hơi, ho đờm, lợi tiểu [2,4,8}

- Trần bì (vỏ Quít chín) dùng chữa ho, tức ngực, nhiều đờm, nôn mữa, đầy bụng, tinh hoàn sưng đau Thanh bì (vỏ Quít non) dùng chữa đau gan, tức ngực, đau mạng sườn, sốt rét Hạt Quít (Quất hạch) dùng chữa sa ruột, bìu sưng đau, viêm tuyến vú, tắc tia sữa [2,4,8}

- Quả Chanh dùng làm thuốc giải nhiệt, cảm sốt, chữa bệnh scorbut, trợ tiêu hoá, chữa ho nhiều đờm, nôn, thấp khớp, cao huyết áp Rễ Chanh, hạt Chanh dùng chữa rắn cắn và tẩy giun [2,4,8}

- Quả Quất chín dùng để giải khát, chữa ho, tiêu hoá kém, gan uất kết Hạt dùng để cầm máu, chống nôn [2,4]

1.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT FLAVONOID VÀ ALCALOID CITRUS 1.4.1 Chiết xuất hesperidin và naringin

Hesperidin (từ vỏ Quít, Cam, Chanh) và naringin (từ vỏ quả Bưởi) có thể được chiết bằng cồn (ethanol, methanol, propanol, isopropanol, …), aceton, ethylacetat hoặc dung dịch kiềm

Chiết xuất hesperidin bằng cồn

Bột vỏ quít được chiết bằng ethanol 30% (1 dược liệu / 10 dung môi) ở 60 OC trong 5 giờ Dịch chiết được lọc qua vải, cô giảm áp đến dạng cao lỏng, để kết tinh Hiệu suất chiết là 1% [14] Hesperidin cũng có thể được chiết bằng cồn 70% nóng [6] hoặc methanol nóng sau khi đã loại tạp dược liệu bằng ether dầu hoả và kết tinh hesperidin từ cao chiết bằng acid acetic loãng hoặc trong hỗn hợp dimethylformamid - acid acetic 0,5% (1:1) [37]

Chiết xuất hesperidin bằng dung dịch kiềm

Bột vỏ quít được chiết bằng cách ngâm trong dung dịch Ca(OH)2 0,5% (1 dược liệu / 10 dung môi ×2 lần) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và có kèm khuấy trộn Lọc, ép lấy dịch chiết qua vải, chỉnh pH dung dịch đến 4,5 – 6,8 bằng dung dịch HCl 1N Các dịch lọc này được để ở 5 OC trong 24 giờ để kết tủa hesperidin Hiệu suất chiết là 1,9% với độ tinh khiết của hesperidin từ 64% - 65% Trong cùng điều kiện trên, nếu thay dung dịch Ca(OH)2 bằng dung dịch NaOH 0,5% thì hiệu suất chiết là 4,7%, độ tinh khiết hesperidin đạt từ 20% - 31% [14]

Từ vỏ cam tươi, bằng phương pháp dùng dung dịch Ca(OH)2 ở pH 11, tỉ lệ dược liệu / dung môi (1:3), tác giả El-Nawawi đã chiết được hesperidin với hiệu suất chiết 15,5 g / 2000 g vỏ tươi (# 0,75% theo vỏ tươi), độ tinh khiết hesperidin đạt từ 40% - 65% [27]

Phương pháp phân lập hesperidin bằng nhựa trao đổi ion

Phương pháp này bao gồm các bước sau: ngâm bã vỏ quả cam trong dung dịch bảo hoà Ca(OH)2 (~10 g/l), pH 12; lọc bỏ bã; acid hoá dịch chiết đến pH 6; nạp dịch chiết lên 1 cột chứa nhựa không phân cực Styrene-Divinylbenzen (đã xử lý trước với ethanol 30% và nước cất) để hấp phụ hesperidin; phản hấp phụ hesperidin bằng các dung dịch NaOH có hoặc không có chứa ethanol; acid hoá dịch phản hấp phụ ở pH 3,5; lọc, rửa hesperidin; rửa nhựa bằng nước cất cho đến

pH 6 Sau mỗi 5 lần chiết, nhựa phải được phục hồi lại bằng cách cho chảy qua cột 5 thể tích của 1 hỗn hợp gồm NaOH 2N – ethanol 95% (50:50) và tiếp theo là 5 thể tích nước cất

Trong điều kiện cụ thể: vỏ cam (200 g); dung dịch Ca(OH)2 (10 g/l, 1000 ml),

pH 12; nhựa Styrene-Divinylbenzen (50 ml); rửa giải hesperidin bằng dung dịch NaOH 0,5N có chứa 10% ethanol; hiệu suất hesperidin trung bình là 2% (trên vỏ khô), độ tinh khiết đạt 93% [58] Phương pháp này cũng có thể được sử dụng để

thu hồi hesperidin từ nước thải trong quá trình sản xuất nước quả Citrus [57]

Chiết xuất naringin bằng nước nóng

Vỏ bưởi cắt nhỏ(1 phần) được đun với nước (4 phần) ở 90 OC trong 5 phút Lọc lấy dịch chiết Bã có thể được chiết tiếp lần 2 ở 80 OC Gộp các dịch chiết, đun với 1% Celite, lọc và cô giảm áp đến khi còn khoảng 1/ 9 thể tích ban đầu Dịch chiết này được để kết tinh lạnh sẽ thu được naringin ngậm 8 phân tử nước (điểm chảy 83 OC) Naringin thô có thể được tinh chế bằng cách đun với isopropanol, lọc nóng, để nguội sẽ thu được naringin ngậm 2 phân tử nước (điểm chảy 171 OC) [37]

Chiết xuất naringin bằng cồn

Naringin từ vỏ Bưởi có thể được chiết bằng ngấm kiệt với cồn 90% (1 dược liệu / 5 dung môi) Dịch ngấm kiệt được thu hồi dung môi đến cắn sệt, rửa loại tạp

bằng ether vài lần, hoà cắn trong nước nóng, chỉnh đến pH 1-2, để kết tinh lạnh vài ngày Lọc, rửa tủa bằng nước lạnh cho đến hết acid Có thể tinh chế lại bằng cách đun naringin thô trong cồn nóng, tẩy màu bằng than hoạt và để kết tinh lạnh Hiệu suất đạt 2,5% với độ tinh khiết 84% [1],[6]

Chiết xuất naringin bằng dung dịch kiềm

Trong phương pháp này, vỏ Bưởi tươi được ngâm trong dung dịch Ca(OH)2 (1 dược liệu / 1,5 dung môi), pH 8,8 - 9,0 và để trong 1 giờ Sau đó pH được chỉnh về 7,5 – 8 bằng HCl để làm giảm bớt độ nhớt của dịch chiết trước khi tiến hành lọc ép Dịch ép được chỉnh đến pH 4 và để kết tinh lạnh Hiệu suất chiết đạt khoảng 12 g naringin / 2000 g vỏ Bưởi tươi (0,6% theo dược liệu tươi) với độ tinh khiết 46% [27] Cùng phương pháp này, TS Nguyễn Thị Chung đã thực hiện trong điều kiện: CaO, 66 g cho 1 kg nguyên liệu (độ mịn 0,8 mm); thời gian ngâm, 7 giờ; kết tủa naringin ở pH 2-3 Kết quả, naringin đạt độ tinh khiết 80% sau khi đã tinh chế lại trong cồn [6]

1.4.2 Chiết xuất alcaloid từ Citrus

Synephrine, alcaloid chính của Citrus, có thể được chiết từ vỏ quả, lá hoặc dịch quả Citrus Từ lá quít, l-synephrine được chiết bằng ethanol 80% hoặc methanol

(methanol thường thích hợp hơn) Dịch chiết được chỉnh đến pH 8,5 bằng dung dịch NH4OH và cho chảy qua 1 cột chứa nhựa trao đổi ion Dowex 50-X4 (đã được xử lý trước bằng cách cho chảy qua cột lần lượt NaOH 1N, acid HCl 4%, NaOH 1N và cuối cùng là nước cất cho đến khi dịch rửa có pH 8-9) Sau khi toàn bộ dịch chiết đã qua cột, tiếp tục rửa cột với nước và methanol Phản hấp phụ l-synephrine bằng dung dịch NH4OH 2N trong methanol và cô giảm áp ở 50 OC cho đến cắn khô L-synephrine có thể được tinh chế bằng cách hoà tan trong 1 lượng tối thiểu methanol nóng và để kết tinh ở 4 OC L- synephrine cũng có thể được kết tinh lại trong nước hoặc trong hỗn hợp aceton – nước (80:20) L-

synephrine tinh chế có  25D(HCl 0,5N) = -55,60 O [73]

1.5 ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CITRUS

Nhiều phương pháp có thể được dùng để định lượng các flavonoid Citrus:

Phương pháp đo quang phổ UV-Vis, sắc ký chế hoá trên bản polyamid và chính xác nhất để định lượng các flavonoid chuyên biệt là phương pháp HPLC hoặc điện di mao quản

1.5.1 Phương pháp đo quang phổ UV-Vis

Phương pháp David

Phương pháp David (1947), là một trong số những phương pháp xưa nhất và hiện vẫn được sử dụng để định lượng flavanon toàn phần trong trong Bưởi và Cam Trong phương pháp này, dịch quả (0,5 ml) hoặc dịch chiết cồn vỏ quả (0,5 ml) được trộn với dung dịch NaOH 4N (0,5 ml) và diethylene glycol 90% (24 ml) Lắc kỹ, để trong 10 phút đối với naringin và 30 phút đối với hesperidin Đo độ hấp thu ở 420 nm Tiến hành song song với 1 mẫu trắng là nước cất (0,5 ml) Các mẫu đậm đặc cần được pha loãng trước khi phân tích

Hàm lượng flavonoid toàn phần theo naringin được tính thông qua 1 đường cong chuẩn xây dựng bởi 1 dãy dung dịch naringin chuẩn có nồng độ 20, 40, 60, 80 và

100 mg / 100 ml nước Phương pháp này được biết là không chuyên biệt nhưng đơn giản, nhanh chóng, ít tốn kém và vẫn cho được 1 giá trị gần đúng của flavonoid toàn phần [78]

Horowitz và Gentili (1959), Vanderrcook (1982) đã chứng minh phương pháp David không thích hợp để định lượng hesperidin trong quả cam vì hesperidin chalcon hấp thu yếu ở 420 nm, thời gian phản ứng quá dài Nếu vẫn muốn dùng phương pháp này thì các mẫu hesperidin phải được hoà tan trong 1 ml NaOH 4N trước khi pha loãng thành 100 ml với nước

Phương pháp định lượng naringin và hesperidin bằng đo phổ UV (Hendrickson

et al., 1958,1959)

Trong phương pháp này, dịch quả Bưởi (50 ml) được trộn với dung dịch đồng sulfat 10% (0,4 ml), chỉnh đến pH 3,5 ± 0,1 bằng NaOH hoặc HCl và sục khí trong 1 giờ để phá hủy vitamin C, tránh gây nhiễu quá trình định lượng Pha loãng mẫu định lượng với isopropanol 99% (1:20) Lắc kỹ và để lắng trong 2 giờ Lọc bỏ tủa và đo độ hấp thu của dịch lọc ở 290 và 295 nm Nồng độ của naringin từ dịch quả được tính thông qua đường cong chuẩn, xây dựng bởi 1 giai mẫu naringin từ 2-10 mg / 100 ml isopropanol [78]

Đối với dịch quả Cam, cách tiến hành cũng tương tự như ở dịch quả Bưởi, chỉ khác ở một vài điểm như pH chỉnh ở 3,8 ± 0,1; độ hấp thu của dịch lọc đo ở 290 và 300 nm (có sự chênh lệch khoảng 1/10 độ hấp thu giữa 2 bước sóng này); hesperidin chuẩn được pha trong nước (5 mg / 100 ml), là điểm khó khăn nhất của phương pháp vì hesperidin vô cùng kém tan trong nước ngay cả khi đun nóng

1.5.2 Định lượng các flavonoid Citrus bằng HPLC

Do các flavonoid có tính phân cực, nên các cột phân lập thường dùng là cột pha đảo C18 hoặc C8 Pha động thường là sự phối hợp của acetonitrile với nước hoặc methanol với nước, đôi khi có thêm acid formic hoặc dung dịch đệm để cải thiện

sự phân lập Sau đây là một số ví dụ tiêu biểu:

- Cột C18; pha động, acetonitrile – nước (80 : 20); UV detector, 280 nm; tốc dộ dòng; 1,5 ml / phút; chế độ chạy, isocratic; lượng mẫu bơm, 10 – 15 µl; thời gian lưu là 12 - 16 phút đối với naringin và 16 – 18 phút đối với hesperidin, thời gian này có thể thay đổi tùy theo loại cột sử dụng [78]

- Cột Lichrospher 100 RP-18 (12,5 cm; 5μm); pha động, nước – acetonitrile – acid acetic (78:20:2, v/v/v); UV detector, 283 nm; tốc dộ dòng: 0,7 ml /