Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy để đánh giá tồn lưu tế bào ác tính trong bệnh bạch cầu cấp

UUĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trên thế giới, việc nhận diện các dấu ấn miễn dịch tế bào trên tế bào bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy, hay còn được gọi là kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào DAMDTB đã

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY ĐỂ ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU TẾ BÀO ÁC TÍNH

TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP

Chuyên ngành: Huyết học Mã số: 62.72.25.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Nguyễn Tấn Bỉnh

2 PGS Bửu Mật

TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận án

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN

Mục lục

Trang Danh mục chữ viết tắt và nghĩa tiếng Việt iii Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các biểu đồ

Danh mục các sơ đồ

v viii

ix

x

1.2 Giới thiệu kỹ thuật tế bào dòng chảy và dấu ấn miễn dịch

1.3 Chẩn đoán và phân loại dưới nhóm bệnh bạch cầu cấp bằng

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

3.2 Khảo sát sự xuất hiện các kiểu hình DAMD bất thường 59

4.2 Khảo sát sự xuất hiện các kiểu hình DAMD bất thường 90

4.7 Ưu điểm và hạn chế của nghiên cứu 123

Danh mục các công trình nghiên cứu của tác giả

Phụ lục 3: Tóm tắt các phác đồ điều trị tấn công bệnh bạch cầu cấp Phụ lục 4: Một số hình ảnh minh họa kết quả Phụ lục 5: Một số hình ảnh minh họa trang thiết bị

Danh mục chữ viết tắt và dịch nghĩa tiếng Việt

AML Acute myeloid leukemia (Bạch cầu cấp dòng tủy)

AML – M0 AML minimally differentiated leukemia

AML – M1 AML without maturation

AML – M2 AML with maturation

AML – M3 Acute promyelocyte leukemia

AML – M4 Acute myelomonocytic leukemia

AML – M5 Acute monoblastic/monocytic leukemia

AML – M6 Acute erythroblast leukemia

AML – M7 Acute megakaryoblast leukemia

BCC Bạch cầu cấp

BCĐNTT Bạch cầu đa nhân trung tính

BI-AL Biphenotyping leukemia (BCC “biphenotype”)

CD Cluster differetiation

Cy Cytoplasm (thuộc tế bào chất)

DAMDTB Dấu ấn miễn dịch tế bào

EGIL European Group for the Immunological Characterization of

Leukemia

FAB French – American – Bristish

FISH Fluorescent in situ hybridization

FITC Fluorescein Isothiocyanate

FSC Forward scatter (tia phát tán chiều dọc)

Ig Immunoglobulin (globulin miễn dịch)

Per CP Peridin chlorophyl

SJCRH St.Jude Children’s Reaseach Hospital

Sm Surface membrane (trên bề mặt màng tế bào)

SSC Sideward scatter (tia phát tán bên)

T-ALL T Acute lymphoblastic leukemia (Bạch cầu cấp dòng lympho

dòng lympho T)

TLTBAT Tồn lưu tế bào ác tính

TCR T cell recepter (thụ thể tế bào T)

TdT Terminal deoxynucleotidyl transferase

TMHH Truyền Máu Huyết Học

TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh

WHO World Health Organization

Danh mục các bảng

1.1 Bảng tổng hợp những kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán bệnh

bạch cầu và lymphoma

10

1.2 Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho B dựa vào DAMD 13

1.3 Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho T dựa vào DAMD 15

1.4 Tiêu chuẩn chẩn đoán BCC dòng tủy dựa vào DAMD 19

1.5 Thang điểm EGIL để xác định BCC “biphenotype” 20

1.6 So sánh tần xuất hiện diện các kiểu hình DAMD bất thường

trong bệnh BCC dòng tủy

31

3.1 Phân bố các nhóm bệnh theo tuổi (ở giai đoạn 1) 55

3.2 Đặc điểm sinh học của quần thể nghiên cứu (GĐ.1) 56

3.3 So sánh kết quả phân biệt dòng giữa DAMD và tủy đồ (GĐ.1) 57

3.4 Đối chiếu phân dưới nhóm BCC dòng tủy DAMD và tủy đồ

(GĐ.1)

58

3.5 Tần suất các phương pháp đánh giá khác nhau (GĐ.1) 59

3.6 So sánh quần thể blast và quần thể blast mang kiểu hình bất

thường

60

3.7 Tỷ lệ của các quần thể tế bào blast sau hóa trị 61

3.8 So sánh tỷ lệ blast giữa tủy đồ và DAMDTB 62

3.9 Tần suất các phương thức đánh giá kiểu hình bất thường (GĐ.2) 63

3.11 Mật độ dương tính của các dấu ấn non trong bệnh BCC dòng

3.13 Tần suất các phương thức đánh giá trên BCC dòng lympho B 69

3.14 Tế bào blast có CD45âm yếu trên các phân nhóm BCC dòng

lympho B

70

3.15 Những kiểu hình KN không đồng bộ trên BCC dòng lympho B 70

3.16 Những kiểu hình có KN tăng cao nồng độ trên BCC dòng

lympho B

71

3.17 Mức độ TBTLAT và tỉ lệ tái phát trên nhóm bệnh BCC dòng

lympho B sau hóa trị

72

3.18 So sánh các phương thức đánh giá TBTLAT trước và sau hóa trị

BCC dòng lympho B

73

3.19 Mật độ dương tính các dấu ấn non trên tế bào blast dòng tủy 75

3.20 Mật độ dương tính của các dấu ấn đặc trưng dòng tủy 76 3.21 Mật độ dương tính của 5 dấu ấn chẩn đoán dòng mono 76 3.22 Tỉ lệ xuất hiện các phương thức đánh giá trên BCC dòng tủy 77 3.23 Các mức độ TBTLAT trên nhóm BCC dòng tủy sau hóa trị 79 3.24 So sánh các phương thức đánh giá trước và sau hóa trị BCC dòng

BCC dòng lympho T

85

Danh mục các hình

1.1 Sơ đồ hóa mối liên kết kháng nguyên - kháng thể - chất

huỳnh quang

7

1.2 Minh họa sự chuyển đổi tín hiệu analog thành những chấm

trên biểu đồ

8

1.3 Minh họa ý nghĩa hai thông số FSC và SSC 7

1.4 Vị trí các quần thể tế bào non ác tính trên biểu đồ

SSC-CD45

11

1.5 Sơ đồ phát triển DAMD bình thường của tế bào dòng

lympho B bình thường trong tủy xương

12

1.6 Sơ đồ phát triển DAMD bình thường của dòng lympho T 14

1.7 Sơ đồ phát triển DAMD của tế bào dòng hạt bình thường 16

1.8 Sơ đồ phát triển DAMD tế bào dòng mono bình thường 17

1.9 Sơ đồ phát triển của hồng cầu bình thường 18

1.10 Sơ đồ mô tả “vùng trống” trong bệnh BCC dòng lympho B

theo BIOMED - 1

26

1.11 Minh họa một trường hợp phát hiện TBTLAT trên bệnh

nhân BCC dòng lympho T, so sánh với một mẫu tủy bình

Hình Nội dung Trang

1.13 Minh họa quá trình theo dõi TBTLAT liên tục bằng

CD117/CD15 hoặc CD34/CD7 từ mẫu tủy xương của hai

3.3 Giới thiệu kết quả phân tích một trường hợp BCC

“biphenotype” (dòng tủy và dòng lympho B)

86

4.2 Sơ đồ phát triển các DAMD trên tế bào lympho bình thường 105

4.3 Sơ đồ mô tả mật độ các dấu ấn dòng hạt trên tế bào hạt 116

Danh mục các biểu đồ

1.1 So sánh tỉ lệ tái phát giữa 4 mức độ nguy cơ trên bệnh BCC

Biểu đồ Nội dung Trang

3.1 Phân bố tuổi theo các nhóm bệnh BCC theo tuổi (ở giai

đoạn 1)

55

3.2 Số lượng kiểu hình DAMD bất thường trên từng bệnh nhân 60 3.3 Biểu đồ Kaplan Meier theo dõi thời gian tái phát 64 3.4 Phân loại dưới nhóm bệnh nhân BCC dòng lympho B 66 3.5 Những KN khác dòng trên bệnh BCC dòng lympho B 69 3.6 Phân loại dưới nhóm của bệnh nhân BCC dòng tủy 74 3.7 Phân bố MPO trong tế bào blast BCC dòng tủy 75 3.8 Những KN khác dòng trên BCC dòng tủy 77 3.9 So sánh nồng độ CD45 giữa 2 nhóm bệnh BCC dòng tủy và

BCC dòng lympho B

78

3.10 So sánh sự hiện diện của cyCD3 và smCD3 80 3.11 Phân bố nồng độ CD45 trong bệnh BCC dòng lympho T 81

Danh mục các sơ đồ

3.2 Các thành phần tế bào khác nhau trên cùng một quần thể 61

UUĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay trên thế giới, việc nhận diện các dấu ấn miễn dịch tế bào trên tế bào bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy, hay còn được gọi là kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào (DAMDTB) đã trở thành xét nghiệm thường qui nhằm hỗ trợ xác định chính xác dòng tế bào ác tính và phân loại dưới nhóm của bệnh bạch cầu cấp (BCC), góp phần định hướng điều trị và tiên lượng bệnh trước điều trị

Bệnh BCC thường được đánh giá lui bệnh khi quần thể tế bào non dưới 5% tế bào bạch cầu (BC) trong tuỷ xương (là giới hạn thấp nhất để phát hiện bằng hình thái học tế bào) Tuy nhiên, bệnh nhân BCC có khoảng 1012 tế bào BC ác tính lúc chẩn đoán, thì vào giai đoạn lui bệnh theo tiêu chuẩn hình thái học vẫn còn hơn 1010 tế bào BC ác tính không phát hiện được, là tiềm năng gây tái phát bệnh, nên còn được gọi là tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT).[29],[103] Hiện nay, các xét nghiệm như FISH, PCR và tế bào dòng chảy đều có khả năng phát hiện TLTBAT với độ nhạy cao hơn, cho phép đánh giá tốt hơn về khối lượng tế bào

BC ác tính, giúp chọn lựa phương thức điều trị thích hợp.[31],[32]

Ứng dụng của kỹ thuật tế bào dòng chảy trong việc phát hiện TLTBAT ở bệnh nhân BCC đã đạt lui bệnh về hình thái là dựa vào việc xác định những kiểu DAMDTB bất thường chỉ hiện diện trên tế bào BC ác tính và không hiện diện hoặc hiện diện không thường xuyên trên tế bào tạo máu bình thường Kỹ thuật này cho phép phát hiện 1 tế bào BC ác tính/10.000 tế bào tuỷ xương bình thường, có thể ứng dụng cho tối thiểu 2/3 số bệnh nhân bệnh BCC Nhiều nghiên cứu tiến cứu trên bệnh nhân BCC đã chỉ ra rằng có sự tương quan mạnh giữa mức độ TLTBAT bằng DAMDTB trong thời kỳ lui bệnh lâm sàng và kết quả điều trị.[32]

Mục tiêu của những nghiên cứu TLTBAT nhằm cải thiện khả năng đánh giá sự hiện diện của tế bào BC ác tính còn sót lại trong suốt thời kỳ lui bệnh sau điều trị, là chỉ điểm cho sự tiến triển và đánh giá độ nhạy của thuốc đối với bệnh nhân, giúp chọn lựa phương thức điều trị thích hợp tiếp theo Lợi ích của việc đánh giá TLTBAT trong điều trị bao gồm: xác định sớm những bệnh nhân có nguy cơ tái phát và phát hiện tình trạng tái phát sắp xảy ra Ngoài ra có thể sử

dụng để so sánh hiệu quả điều trị của các phác đồ hóa trị liệu khác nhau

Ở Việt Nam, xác định DAMDTB bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy chỉ mới triển khai khoảng 15 năm tại một số trung tâm lớn như Viện Truyền Máu Huyết Học Trung Ương, bệnh viện Truyền Máu Huyết Học (TMHH), bệnh viện Nhi Trung Ương, bệnh viện quân đội 108 Đa phần các đơn vị sử dụng kỹ thuật này để phân loại bệnh BCC, tuy nhiên chưa có những ứng dụng sâu hơn Và hiện nay chưa có số liệu báo cáo về tỉ lệ TLTBAT sau hóa trị ở bệnh BCC bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy tại Việt nam

Tại bệnh viện TMHH (TP.HCM), chúng tôi bắt đầu áp dụng kỹ thuật xác định DAMDTB trong chẩn đoán và phân loại bệnh BCC vào năm 1995 Từ năm

2005, chúng tôi sử dụng kỹ thuật này thường qui với bộ kháng thể đơn dòng 19 dấu ấn kết hợp với kiểu nhuộm 3 màu nhằm phát hiện các kháng nguyên trên màng tế bào

Hiện tại, với nghiên cứu này, chúng tôi mong muốn triển khai kỹ thuật nhuộm 4-5 màu và bổ sung bước làm tăng tính thấm màng tế bào để phát hiện các kháng nguyên (KN) đặc trưng của từng dòng nằm trong bào tương hoặc trong nhân, giúp hiểu rõ hơn về sự hiện diện của các DAMDTB trong bệnh BCC, góp phần làm tăng độ chính xác trong chẩn đoán Từ đó, tiến tới chọn lựa và xác định

những kiểu hình DAMDTB bất thường thích hợp nhằm mục đích theo dõi TLTBAT sau điều trị

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu tổng quát như sau: “Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác định DAMDTB trong chẩn đoán, phân loại bệnh BCC, từ đó chọn lựa các phương thức và kiểu hình DAMDTB phù hợp để đánh giá TLTBAT bằng dàn kháng thể đơn dòng hiện có tại bệnh viện TMHH”

Để đạt được kết quả trên cần phải thực hiện các mục tiêu sau:

1 Xác định tỉ lệ các phân nhóm bệnh BCC bằng DAMDTB

2 Xác định tỉ lệ các kiểu hình DAMDTB bất thường để đánh giá TLTBAT

3 Xác định tỉ lệ TLTBAT trong các bệnh BCC sau điều trị tấn công

Chương 1: TỔNG QUAN Y VĂN

1.1 LỊCH SỬ

 Thế giới

Trước năm 1976, việc chẩn đoán và phân loại bệnh bạch cầu cấp hoàn toàn dựa trên hình thái học và hoá học tế bào theo tiêu chuẩn phân loại của FAB (French - American - British).[21]

Từ 1976 đến 1986, các nhà khoa học đã miệt mài nghiên cứu, tìm hiểu sơ đồ phát triển DAMDTB bình thường cũng như bất thường của các tế bào trong cơ thể nói chung và đặc biệt là các tế bào thuộc hệ tạo máu bằng những thế hệ máy đầu tiên của công nghệ tế bào dòng chảy

Năm 1986, Foon và Todd chính thức công bố trên tạp chí Blood bài báo

“Phân loại miễn dịch học trong bệnh Bạch cầu và Lymphoma”.[46] Khoảng 10 năm sau, năm 1995, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công nhận DAMDTB là một tiêu chuẩn chẩn đoán bắt buộc, hỗ trợ phân loại chính xác các bệnh lý tăng sinh ác tính có liên quan đến tế bào tạo máu.[42]

Tiếp đến vào năm 1997, Foon và Jenning tiếp tục giới thiệu một ứng dụng khá quan trọng của kỹ thuật DAMDTB là việc phát hiện TLTBAT Như vậy, hơn

30 năm qua kỹ thuật tế bào dòng chảy đã tự khẳng định là một phương tiện không thể thiếu trong chẩn đoán và theo dõi các bệnh lý huyết học ác tính.[59],

Sự cải tiến không ngừng của kỹ thuật tế bào dòng chảy từ phương pháp nhuộm một màu đến nhiều màu, sự phát hiện ngày càng nhiều các kháng nguyên trên màng tế bào, trong bào tương hoặc trong nhân đã góp phần hoàn thiện sự

hiểu biết sơ đồ phát triển DAMDTB bình thường của tế bào tạo máu, làm nền tảng vững chắc cho việc chẩn đoán và phân loại dưới nhóm bệnh bạch cầu cấp (như BCC dòng lympho B, dòng lympho T, dòng tủy,…) đặc biệt là những trường hợp không biệt hóa, kém biệt hóa, hỗn hợp nhiều dòng Bên cạnh đó còn giúp chẩn đoán phân biệt với nhiều bệnh lý khác: tăng sinh bạch cầu mạn tính, lymphoma, đa u tủy,…

Suốt 3 thập kỷ qua, kỹ thuật tế bào dòng chảy đã phát triển không ngừng với nhiều ứng dụng khác nhau phục vụ cho nhiều chuyên khoa, mà đặc biệt là huyết học và ung thư học Đánh giá TLTBAT bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy là một trong những kỹ thuật đang được các chuyên gia ung thư học quan tâm nghiên cứu để giúp tiên lượng sớm và chính xác hơn khả năng tái phát bệnh Có nhiều cơ sở lý thuyết để đánh giá TLTBAT như: xác định dấu ấn miễn dịch bất thường, phân tích chất lượng DNA, đánh giá khả năng tế bào tự chết,… Nhưng kỹ thuật xác định kiểu hình DAMDTB bất thường là phương pháp đang được nhiều nơi trên thế giới ứng dụng rộng rãi

 Trong nước

Từ những năm 1992, các chuyên gia Việt nam đã biết đến kỹ thuật tế bào dòng chảy, nhưng chỉ được tiếp cận thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang bằng kính hiển vi để phân biệt BCC dòng lympho B và T, kế đến là xác định dòng tủy tại Viện Truyền máu Huyết học Trung ương, bệnh viện Nhi Trung ương,… Năm 1995, bệnh viện Truyền máu Huyết học (TP.HCM) là bệnh viện đầu tiên được trang bị máy FASC Calibur (3 màu) để phân biệt các dòng tế bào tạo máu khác nhau trong bệnh lý BCC và thực hiện đếm tế bào CD4 cho bệnh nhân HIV Những năm sau đó, nhiều trung tâm nghiên cứu trong cả nước đã quan tâm đầu tư máy móc thiết bị mở rộng các lãnh vực nghiên cứu Viện các bệnh

truyền nhiễm Trung ương (năm 1998) và Viện Pasteur TP.HCM (năm 2000) là những đơn vị kế tiếp sử dụng máy tế bào dòng chảy 3-4 màu trong lĩnh vực nghiên cứu về CD3/CD4/CD8 ở bệnh nhân HIV Nhu cầu đếm CD4 lan rộng trên cả nước và thế giới nên có những dòng máy đơn giản và rẻ tiền hơn thay thế Từ đó, trào lưu sử dụng máy tế bào dòng chảy trong nghiên cứu tế bào đã được quan tâm rộng rãi từ Bắc chí Nam, trên nhiều lĩnh vực khác nhau như: DAMDTB trong bệnh BCC, bệnh lymphoma, đếm tế bào gốc CD34, xác định CD55/CD59 ở bệnh tiểu huyết sắt tố kịch phát về đêm,… (bệnh viện TMHH TP.HCM, bệnh viện 108, Đại học Y Dược TP.HCM, Viện Nhi Trung ương, Viện Huyết học Truyền máu Trung ương,…); nghiên cứu về tế bào và cytokin trong các bệnh virus như Dengue, sốt rét, HIV (trung tâm Welcome Trust TP.HCM, bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Oxfort Hà nội); những năm 2005 trở lại đây, kỹ thuật tế bào dòng chảy đã đóng một vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về tế bào gốc máu cuống rốn, đặc biệt là tế bào trung mô (Đại học Y khoa Hà nội, Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM,…) Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, công nghệ ngày càng được đổi mới tiên tiến hơn với những dòng máy có từ 4, 6 hoặc 8 màu đã ra đời và được các đơn vị nghiên cứu quan tâm đầu tư để tăng thêm độ chính xác, giúp nghiên cứu những quần thể tế bào rất nhỏ (bệnh viện TMHH TP.HCM năm

2009 đã có thêm máy 6 màu, Viện Hải dương học Nha trang,…)

Riêng đối với lãnh vực huyết học, trọng tâm nghiên cứu là khảo sát DAMDTB, định danh các dòng tế bào tạo máu trong tủy xương hoặc máu ngoại

vi, kế đến là đếm tế bào gốc tạo máu CD34+ là một bước quan trọng trong quá trình ghép tế bào gốc tạo máu điều trị bệnh huyết học ác tính Gần đây là những ứng dụng liên quan đến đánh giá sự tồn lưu của tế bào ác tính sau hóa trị các bệnh ác tính (mà đi đầu là bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM)

1.2 GIỚI THIỆU KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY VÀ DAMDTB

1.2.1 Sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể - chất phát huỳnh quang

Hình 1.1: Sơ đồ hóa mối liên kết kháng nguyên - kháng thể - chất huỳnh

quang (Nguồn: Tác giả

Nguyễn Phương Liên)

Kỹ thuật tế bào dòng chảy nhận diện DAMDTB, là các kháng nguyên của tế bào, gián tiếp thông qua mật độ các chất huỳnh quang gắn với các kháng thể đặc trưng tương ứng với từng loại kháng nguyên Kháng nguyên cần khảo sát có thể là một protein, immunoglobulin, cytokine,… nằm trên màng tế bào, trong bào tương, hoặc thậm chí trong nhân tế bào.[118]

1.2.2 Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy

Máy tế bào dòng chảy hoạt động bằng cách sử dụng thủy lực để buộc các tế bào đã được nhuộm huỳnh quang di chuyển thành hàng một trong dòng chảy,

đi ngang qua một tia sáng tới, thông thường được phát ra từ một nguồn sáng laser Sau khi tương tác với tia laser, tế bào sẽ phát xạ trở lại Những hạt photon của tia sáng phát xạ từ tế bào sẽ được phân tích ra thành những bước sóng nhỏ hơn nhờ vào rất nhiều gương lọc và gương phản chiếu Những tia sáng đã được phân chia này sẽ chạm vào những bộ phận nhận sóng và phát ra xung điện (hay những tín hiệu analog), tỉ lệ thuận với số lượng tia sáng tới đập vào bộ phận dò sóng Mỗi một tín hiệu analog được chuyển thành tín hiệu digital và được tích lũy trong bảng phân bố tần suất hoặc biểu đồ Vì vậy, số lượng tín hiệu digital tổng hợp sẽ

tỉ lệ thuận với số lượng tia sáng phát ra từ các tế bào riêng lẻ (Hình 1.2).[75]

Hình 1.2: Minh họa sự chuyển đổi tín hiệu

analog thành những chấm trên biểu đồ.[75]

(Nguồn: Hector Nolla, Đại học California, Berkeley, Mỹ)

Hình 1.3: Minh họa ý nghĩa hai thông số FSC và SSC.[75] (Nguồn: Hector Nolla, Đại học California, Berkeley, Mỹ)

1.2.3 Các yếu tố nội tại

Bản thân một tế bào không được nhuộm với các kháng thể có gắn huỳnh quang cũng có thể phát ra những tia phản xạ, được các bộ phận nhận sóng ghi nhận, từ đó phản ánh hai thông số: SSC và FSC, còn gọi là hai yếu tố nội tại của tế bào (Hình 1.3) Các gương (G.1) ở vị trí trước nguồn sáng laser sẽ đón nhận những tia sáng thẳng tới từ tế bào (nên được ký hiệu FSC), phản ánh kích thước tế bào Hàng loạt các gương nằm ở các ví trí khác (Gn) đón nhận những tia phản xạ từ tế bào (nên được ký hiệu SSC), sẽ phản ánh tính chất phức tạp của tế bào như: sự nhấp nhô của màng tế bào, bản chất không hạt, ít hạt hay nhiều hạt của bào tương,… [75],[118]

1.2.4 Kỹ thuật xử lý mẫu

Yêu cầu về mẫu xét nghiệm: là các loại mẫu tươi, được giữ ở dạng huyền phù bằng thuốc chống đông, tốt nhất là EDTA Mẫu được nhuộm càng sớm càng tốt để tránh tế bào bị chết quá nhiều làm ảnh hưởng đến kết quả Hiện nay, phương pháp nhuộm với nhiều màu huỳnh quang được đánh giá cao vì cho phép

phát hiện đồng thời nhiều DAMDTB cùng lúc và phản ánh mối quan hệ mật thiết giữa các dấu ấn đó

Thông thường để quan sát các kháng nguyên trên bề mặt tế bào, chỉ cần ủ mẫu tủy hoặc mẫu máu với kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang khoảng 10-

15 phút Vì chẩn đoán bệnh BCC chủ yếu tập trung vào nghiên cứu tế bào có nhân, nên phải sử dụng ammonium chloride hoặc các dung dịch có tác dụng tương tự để loại bỏ hồng cầu trưởng thành (hồng cầu không nhân) Lưu ý: các tế bào thuộc dòng hồng cầu chưa trưởng thành có nhân sẽ không bị phá hủy vì đề kháng với ammonium chloride

Khi cần khảo sát thêm những dấu ấn nằm trong bào tương hay trong nhân tế bào, người ta cần làm tăng tính thấm bề mặt tế bào để đưa kháng thể xuyên qua màng tế bào đến gắn với kháng nguyên đích bên trong tế bào Các kháng nguyên bên trong tế bào thông dụng là: TdT, chuỗi nhẹ hoặc chuỗi nặng, cyCD3, cyCD22, cyCD79a, MPO, bcl-2, cyclin-D1, ZAP-70.[17]

1.2.5 Các kháng thể đơn dòng

Ngày nay, đa phần các kháng thể gắn huỳnh quang có sẵn trên thị trường Việc chọn lựa các kháng thể vào danh mục sử dụng thường qui phải dựa vào nhu cầu thực tế của từng phòng thí nghiệm (mục đích chẩn đoán, số lượng mẫu, giá thành) Do đó không có sự thống nhất về danh mục kháng thể Tuy nhiên nên thiết kế bộ kháng thể cần dùng theo phương pháp bậc thang: bắt đầu bằng một số kháng thể có thể gợi ý đến dòng tế bào nào đó; từ những kết quả ban đầu, tiếp tục nhuộm thêm những kháng thể cần thiết;… Bằng cách này có thể tiết kiệm chi phí thuốc thử, song kéo dài thời gian hơn Dưới đây chúng tôi giới thiệu một số kháng thể đơn dòng cho nhiều thông tin hữu ích trong chẩn đoán bệnh BCC và

Bảng 1.1: Bảng tổng hợp những kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán bệnh bạch cầu và lymphoma[17],[59],[64],[84],[109]

Các dấu ấn non

CD34, CD38, CD117 (dòng tủy), TdT và CD10 (dòng lympho), HLA.DR (dòng hạt và lympho T) Dòng lympho B CD19, cyCD22, smCD22, cyCD79a, CD79b, CD20,

CD5, HLA.DR, CD38, CD138, CD23, CD24, CD25, CD103, Igκ/λ, IgM, CD43, FMC-7

CD4, CD5, CD7, CD8, CD1a Tế bào giết tự nhiên (NK cell) CD56, CD57, CD16, CD2, CD7, CD8

Dòng mono tương tự dòng hạt và đặc trưng riêng:

CD14, CD36, CD64, CD4, HLA.DR

Dòng mẫu tiểu cầu CD61, CD41, CD42

Tóm lại, để đạt được kết quả chính xác và khách quan, cần áp dụng một dàn kháng thể đơn dòng đủ lớn và bao quát để có thể phân biệt được các dòng tế bào với nhau, đồng thời đánh giá được giai đoạn trưởng thành của từng dòng

1.3 CHẨN ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI DƯỚI NHÓM BỆNH BẠCH CẦU CẤP BẰNG DAMDTB

1.3.1 DAMDTB đặc trưng cho các loại tế bào non

Điều quan trọng trong chẩn đoán bệnh BCC là xác định quần thể tế bào non (còn gọi là tế bào blast) Các dấu ấn non không phụ thuộc dòng tế bào gồm: CD34, CD38, TdT.Tuy nhiên, mỗi dòng tế bào sẽ có thêm những dấu ấn non khác nhau

Đa số các tế bào non có nguồn gốc từ dòng tủy (như myeloblast, monoblast, erythroblast, megakaryoblast) đều có chung một số đặc điểm về DAMDTB như: CD34, HLA.DR và CD38, CD117 rất cao Đặc biệt là CD117 ngày nay được xem là có ý nghĩa hơn cả phức hợp CD13/CD33 trong việc xác định myelo/monoblast vì luôn hiện diện với mật độ ổn định trong các tế bào tiền thân dòng tủy TdT có thể gặp trong một số ít BCC dòng tủy.[17],[83],[84]

Đối với dòng lympho, các dấu ấn non bao gồm: CD34, CD38, TdT, CD10 Ngoài các dấu ấn kể trên còn có thể thấy sự hiện diện của HLA.DR và CD1a trên tế bào non dòng lympho T Lưu ý: HLA.DR không phải là một dấu ấn non đối với dòng mono và lympho B, bởi vì trong quá trình phát triển bình thường HLA.DR xuất hiện tăng dần từ đầu dòng đến cuối dòng.[17],[84],[109]

Hình 1.4: Vị trí các quần thể tế bào non ác tính trên biểu đồ SSC-CD45

(quần thể tế bào non màu đỏ - P1, bên trái là 1 ca bệnh BCC dòng lympho, ở giữa và bên

Quan sát trên biểu đồ SSC-CD45 có thể thấy lymphoblast có nồng độ CD45 thay đổi từ âm tính đến trung bình, trong khi SSC luôn giữ ở mức thấp; myeloblast có đặc tính SSC thay đổi từ thấp đến cao và CD45 thường mạnh hơn lymphoblast (Hình 1.4)

1.3.2 Đặc điểm DAMDTB của bệnh BCC dòng lympho B

Trên sơ đồ phát triển bình thường của các tế bào lympho B (Hình 1.8), chúng ta nhận thấy DAMDTB trên tế bào lympho B thay đổi qua năm giai đoạn khác nhau (Hình 1.8) Trong đó, các DAMDTB xuất hiện sớm và có nồng độ ổn định từ đầu dòng đến cuối dòng là cyCD79a, cyCD22, smCD22, CD19, HLA-DR Các dấu ấn trưởng thành hơn là CD20, cyIgM, smIgM, Igκ hoặc Igλ Tương bào là một giai đoạn đặc biệt của dòng B: không có CD22 và CD20; CD19 và CD45 rất yếu; thường đặc trưng bởi CD38 và CD138 với nồng độ cao. [17],[84],[109] Từ năm

1976, người ta đã đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán và phân loại dưới nhóm của bệnh BCC dòng lympho B dựa vào DAMDTB phải có sự hiện diện của các kháng nguyên liên quan đến dòng B bên cạnh các dấu ấn non, đồng thời không xuất hiện các dấu ấn đặc trưng của các dòng khác

Bảng 1.2: Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho B dựa vào DAMD [105]

B-ALL

Pre-B-ALL Transitional

Pre-B-ALL

Mature B-ALL

Ghi chú: − : <10%, ± : 10 – 25%, + : 25 – 75%, ++ : >75% quần thể tế bào non ác tính

Có rất nhiều tiêu chuẩn phân loại dưới nhóm đối với bệnh BCC dòng

lympho B bằng DAMDTB Tuy nhiên, thường được chia làm 4-5 nhóm như sau:

Pro B-ALL; Common ALL; Pre-B-ALL; Transitional pre-B-ALL; và một số tài

liệu có thêm Mature B-ALL.[56] Nhóm BCC dòng lympho B trưởng thành hiện

nay được sắp xếp vào nhóm Burkitt’s lymphoma.[105]

Tóm lại, tế bào non của bệnh BCC dòng lympho B có những đặc điểm sau

đây:có một hoặc nhiều dấu ấn non như TdT, CD34, CD10, CD38; không có chuỗi

nhẹ κ hoặc λ trên bề mặt, không có CyIgμ ở giai đoạn sớm; không có dấu ấn

CD79b trên bề mặt (SmCD79b), mà chỉ có dấu ấn CD79a trong bào tương

(CyCD79a); nồng độ CD45 có thể thay đổi từ âm tính đến trung bình. [17],[84],[109]

1.3.3 Đặc điểm DAMDTB của bệnh BCC dòng lympho T

Tế bào lympho T có 3 giai đoạn phát triển chính: [17],[84],[105]

- Giai đoạn sớm (hay trước tuyến ức): xảy ra ở tủy xương, tế bào được gọi là tiền tế bào T (Pro-T), hiện diện chủ yếu cyCD3 và CD7 Các dấu ấn khác như CD3, CD4, CD8,… chưa thấy xuất hiện

- Giai đoạn giữa: xảy ra ở vỏ tuyến ức, tế bào T được gọi là tế bào tuyến ức (T-thymocyte) Đặc trưng là sự xuất hiện của CD1a+, khi tế bào rời khỏi tuyến ức sẽ không còn CD1a Các dấu ấn khác lần lượt xuất hiện như: CD3yếu, CD4+, CD8+, CD2+, CD5+,… Ở giai đoạn này, sự phối hợp giữa CD4 và CD8 tạo ra nhiều kiểu hình khác nhau: CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-

- Giai đoạn trễ: bắt đầu xảy ra ở tủy ức, tế bào xuất hiện tương đối đầy đủ các DAMDTB của dòng lympho T Đồng thời dựa trên CD4 và CD8, có sự tách biệt thành 2 nhóm kiểu hình: CD4+CD8- và CD8+CD4- Các tế bào này rời khỏi tuyến ức đi vào tủy xương, biệt hóa thành 2 loại tế bào: T giúp đỡ (CD3+ CD4+CD8–) và T gây độc (CD3+ CD4–CD8+)

Hình 1.6: Sơ đồ phát triển DAMDTB bình thường của dòng lympho T[84]

Các tế bào non dòng lympho T trước hết phải mang dấu ấn đặc hiệu của

dòng lympho T là cyCD3; kế đến phải có một hoặc nhiều các dấu ấn dòng T khác

(CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8); và một hoặc nhiều các dấu ấn non (CD34,

TdT, HLA.DR, CD1a và CD10)

Bảng 1.3: Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho T dựa vào DAMD [105]

Immuture T-ALL Common Thymocytic

T-ALL Dấu ấn

Prothymocytic (pre T-ALL)

Immuture thymocytic

SmCD3 − SmCD3 +

Mature T-ALL

Ghi chú: − : <10%, ± : 10 – 25%, + : 25 – 75%, ++ : >75% quần thể tế bào non ác tính

Tuy nhiên những hiểu biết về các bệnh lý dòng lympho T chưa được rõ

ràng bằng dòng lympho B Vì thế hiện tại trong thực hành lâm sàng, việc phân

loại các bệnh lý dòng lympho T còn gặp nhiều khó khăn Nhiều bảng tiêu chuẩn

xây dựng dựa vào sự xuất hiện của các kiểu hình DAMDTB khác nhau (như bảng phân loại của EGIL năm 1995 [20], của SJCRH [17],…)

1.3.4 DAMDTB đặc trưng của BCC dòng tủy

Vì được tạo ra từ tủy xương bởi cùng các tế bào gốc vạn năng, nên các tế bào tiền thân của các dòng bạch cầu hạt, dòng mono, hồng cầu và mẫu tiểu cầu có một số dấu ấn chung: CD34, CD117, CD38, HLA-DR, CD13, CD33

Tiền tủy bào (promyelocyte) đặc trưng bởi sự mất CD34 và HLA-DR, nhưng vẫn tiếp tục hiện diện CD13, CD33, CD117, và bắt đầu xuất hiện CD15 Đầu giai đoạn tủy bào (myelocyte), CD11b bắt đầu xuất hiện và tăng dần cùng CD15 CD16 chỉ xuất hiện trên bề mặt tế bào vào giai đoạn hậu tủy bào (metamyelocyte) chuyển thành bạch cầu hạt chia múi (segment) Cuối cùng, khi chuyển sang chia múi CD64 giảm dần, và các kháng nguyên muộn khác sẽ xuất hiện như: CD10, CD24, CD32, CD35, CD65.[84],[109]

Hình 1.7: Sơ đồ phát triển DAMDTB của tế bào dòng hạt bình thường [84],[109]

Tế bào mono trưởng thành, ngoài đặc điểm chung của tế bào dòng tủy nêu trên, còn có những đặc điểm riêng giúp phân biệt với các giai đoạn trưởng thành khác nhau của dòng hạt Đó là sự đồng hiện diện của CD36, CD64, CD4, HLA-

DR và tăng dần nồng độ CD15, CD11b, CD14 trong các giai đoạn muộn Tế bào mono non không có CD14, nên cần khảo sát cặp đôi CD36/CD64 để phát hiện các trường hợp BCC dòng mono Khi tế bào càng trưởng thành, CD14 sẽ trở nên dày đặc, đồng thời có sự giảm nhẹ của CD15 Tế bào mono trưởng thành hoạt hóa, chuyển dạng thành đại thực bào, sẽ xuất hiện thêm các kháng nguyên như CD23, CD25, CD68, CD69 Tuy nhiên, DAMDTB không thể phân biệt được tế bào tiền thân của dòng mono và dòng hạt.[6], [7], [61],[84],[109]

Hình 1.8: Sơ đồ phát triển DAMDTB của tế bào

dòng mono bình thường [84],[109]

MPO là một dấu ấn quan trọng của dòng hạt và mono MPO là một loại peroxidase - chất bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm lấn của vi sinh vật, nằm trong các hạt có trong nguyên sinh chất của tế bào bạch cầu hạt đa nhân (neutrophil, basophil, eosinophil) và tế bào mono Tuy nhiên, tế bào hạt càng trưởng thành nồng độ MPO càng cao, trong khi MPO giảm rõ ở tế bào mono trưởng thành

Một quần thể tế bào tương đối hiếm gặp trong tủy bình thường là mẫu tiểu cầu (megakaryocyte) Các DAMDTB đặc trưng cho dòng tiểu cầu là CD41a, CD42 và CD61 Quần thể mẫu tiểu cầu trong mẫu tủy xương bình thường sẽ có CD45yếu, CD33−, CD11b−, MPO−, CD117+ giảm dần trong quá trình trưởng thành Tiểu cầu trưởng thành mất CD45

Nguyên tiền hồng cầu (proerythroblast) có CD34, CD38, CD71, CD117, và CD45yếu CD45 mất dần trong quá trình trưởng thành, do đó giai đoạn hồng

cầu lưới và hồng cầu trưởng thành có CD45− Glycophorin A (còn được ký hiệu là CD235a) xuất hiện bắt đầu từ giai đoạn nguyên hồng cầu (erythroblast) và giữ nguyên suốt quá trình phát triển tiếp theo của dòng hồng cầu Hồng cầu trưởng thành (không nhân) với đặc trưng CD235a+ CD45− CD71− (Hình 1.12) sẽ dễ dàng

bị phá hủy và loại bỏ khỏi mẫu máu hoặc mẫu tủy trong quá trình xử lý mẫu bằng ammonium chloride.[109]

Hình 1.9: Sơ đồ phát triển của hồng cầu bình thường [84],[109]

Do có chung nguồn gốc, từ tế bào gốc vạn năng biệt hóa thành nhiều dòng khác nhau, nên bệnh BCC dòng tủy rất đa dạng và phức tạp với nhiều phân nhóm nhỏ bao gồm cả dòng hạt, dòng mono, hồng cầu và mẫu tiểu cầu Trong chẩn đoán bệnh BCC dòng tủy, hình thái học có vai trò rất quan trọng Ngày nay, kỹ thuật DAMDTB cũng đã góp phần làm rõ một số trường hợp phức tạp, như cần phân biệt phân nhóm M0, M7 và BCC dòng lympho, BCC khó xác định (AUL), BCC “biphenotype”,

Tuy nhiên khi so sánh với phân loại hình thái của FAB, kỹ thuật DAMDTB vẫn cho kết quả tương tự (Bảng 1.4)ï

Bảng 1.4: Tiêu chuẩn chẩn đoán BCC dòng tủy dựa vào DAMDTB

Ghi chú: − : <10%, ± : 10 – 25%, + : 25 – 75%, ++ : >75% quần thể tế bào non ác tính

1.3.5 DAMDTB xác định BCC “biphenotype”

Nhóm bệnh này hiếm gặp (khoảng 5%) được phát hiện từ những năm

1980 Theo tiêu chuẩn FAB, hình thái học của các trường hợp này vừa giống

BCC dòng lympho vừa giống BCC dòng tủy, hay vừa giống BCC dòng lympho B

vừa giống BCC dòng lympho T Loại Bệnh BCC này có nhiều tên gọi khác nhau,

phổ biến nhất là cách gọi BCC “biphenotype”.[24]

Tuy nhiên không nên nhầm lẫn với những trường hợp có 2 quần thể tế bào

non thuộc 2 dòng khác nhau cùng hiện diện, thường được gọi là BCC “bilineal”

Cả hai trường hợp đều cho tiên lượng xấu và kém đáp ứng điều trị

Trên quan điểm của DAMDTB, nhóm bệnh BCC ”biphenotype” phải có

sự đồng hiện diện hai trong các KN nội bào đặc trưng cho các dòng (như cyCD3,

MPO, cyCD79 và/hoặc cyCD22), và một số kháng nguyên khác màng tế bào.[47],

[87] Kiểu hình thường gặp là sự đồng hiện diện của các kháng nguyên dòng

lympho B và dòng tủy, kế đến là dòng lympho T và dòng tủy Trường hợp đồng

hiện diện dòng B và T, hoặc cả 3 dòng rất hiếm gặp

Thang điểm EGIL xác định BCC “biphenotype” là một công cụ hỗ trợ

giúp chẩn đoán chính xác BCC “biphenotype” (Bảng 1.5) Những trường hợp

không thỏa mãn các tiêu chuẩn trong thang điểm này sẽ được xem xét như sự

đồng hiện diện kháng nguyên khác dòng.[74] Đặc điểm này rất thuận lợi cho việc

đánh giá TLTBAT về sau Ví dụ: BCC dòng lympho B có thêm các dấu ấn CD13,

CD33 của dòng tủy, hay BCC dòng tủy có các dấu ấn dòng lympho như CD22,

CD19,… Để xác định BCC “biphenotype” đòi hỏi phải có trên 2 điểm đối với mỗi

dòng tế bào Và mỗi dấu ấn được xem là dương tính khi có >20% tế bào mang

dấu ấn đó (theo Bene và Segeren), ngoại trừ MPO >3%.[17],[92]

Bảng 1.5: Thang điểm EGIL để xác định BCC “biphenotype” [1],[74],[105]

Mỗi dấu ấn dương tính

= 2 điểm

CD79a CyIgμ CyCD22 SmCD22

CyCD3 SmCD3 Anti - TCRαβ Anti - TCRλδ

Anti MPO (anti lysozyme)

Mỗi dấu ấn dương tính

= 1 điểm

CD10 CD20

CD5 CD8 CD10

CD13 CD33 CD65

Mỗi dấu ấn dương tính

= 0.5 điểm

TdT CD24

TdT CD7 CD1a

CD14 CD15 CD64 CD11b, CD11c

1.4 ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU ÁC TÍNH TRONG BỆNH LÝ BẠCH CẦU CẤP BẰNG DAMDTB

Sau hơn 20 năm nghiên cứu, người ta nhận thấy việc đánh giá TLTBAT trong bệnh BCC (đã đạt lui bệnh về hình thái) bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy là một xét nghiệm khả thi, cho kết quả mau chóng Bên cạnh đó, việc tách tế bào bằng hệ thống tế bào dòng chảy là bước hỗ trợ cho các kỹ thuật sinh học phân tử như FISH, PCR; hay phối hợp phân tích DAMDTB và DNA content bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy là những quan điểm khác về việc đánh giá TLTBAT

Kỹ thuật DAMDTB có khả năng phát hiện 1 tế bào BC ác tính/10.000 tế bào tuỷ xương bình thường, khoảng 2/3 bệnh nhân BCC có thể áp dụng kỹ thuật này để đánh giá TLTBAT Nhiều nghiên cứu tiến cứu với số mẫu khá lớn đã ghi nhận có sự tương quan mạnh giữa mức độ TLTBAT bằng DAMDTB và kết quả điều trị, cho thấy khả năng ứng dụng để đánh giá mức độ đáp ứng điều trị và tiên lượng tái phát sớm của kỹ thuật DAMDTB

1.4.1 Phương pháp luận về việc phát hiện TLTBAT bằng DAMDTB

Ban đầu, kỹ thuật đánh giá TLTBAT bằng miễn dịch học bị cản trở do số lượng các loại kháng thể phát hiện DAMDTB không nhiều, và chúng vừa được tìm thấy trên tế bào BC ác tính vừa xuất hiện trên tế bào bạch cầu tạo máu bình

thường Ví dụ: CD34, TdT và CD10 vừa hiện diện trên tế bào tiền thân lympho B bình thường vừa xuất hiện trên hầu hết tế bào BC ác tính dòng B; tế bào có CD10+/TdT+ đặc biệt rất nhiều trong tuỷ xương của trẻ nhỏ và của bệnh nhân sau hóa trị hoặc sau ghép, chúng có thể chiếm 10-20% tế bào đơn nhân;… Hiện tại, việc kết hợp nhiều loại kháng thể với kiểu nhuộm 4-6 màu huỳnh quang khác nhau cho thấy luôn có sự hằng định kiểu hình DAMDTB bất thường giữa lúc chẩn đoán và lúc tái phát.[38],[71]

Cho đến những năm cuối thế kỷ XX, các chuyên gia hàng đầu tại các trung tâm nghiên cứu về ung thư máu tại Mỹ và Châu Âu đã tập trung đánh giá TLTBAT căn cứ vào việc xác định những kiểu hình DAMDTB bất thường, về chất lượng và/hoặc số lượng, giữa tế bào BC ác tính và tế bào tiền thân bình thường:

- Sự khác biệt về chất lượng: dựa vào sự biểu hiện của những kiểu

DAMDTB bất thường chỉ hiện diện trên tế bào BC ác tính hoặc hiếm thấy (không thường xuyên) trên tế bào tạo máu bình thường Khái niệm “vùng trống” trên biểu đồ chấm được đưa ra để chỉ là những vùng bình thường không có tế bào tủy hiện diện Ngược lại, khi có tế bào xuất hiện ở những “vùng trống” thì đó chính là những tế bào BC ác tính với kiểu hình DAMDTB bất thường Ví dụ: các kiểu hình như CD34/CD19/CD21 trong bệnh BCC dòng lympho B; CD34/CD56 bệnh BCC dòng tủy; CD3/TdT biểu hiện trên đa số tế bào ác tính dòng tế bào T,…[32],[37],[82]

- Sự khác biệt về số lượng: được sử dụng để phân biệt quần thể tế bào BC

ác tính với quần thể tế bào bình thường có cùng kiểu hình DAMDTB Ví dụ: tế bào mang kiểu hình CD19/CD10/CD34 trong một số bệnh nhân BCC dòng lympho B có thể cao gấp 20 lần so với tế bào B non bình thường trong tủy; bình

thường rất hiếm gặp mẫu tiểu cầu, tuy nhiên sau hoá trị liệu BCC dòng tủy - M7 vẫn có thể thấy còn sót lại khoảng 1%,…[23],[70]

Ngày nay, với sự hiểu biết tương đối rõ về DAMDTB, nên có nhiều quan niệm khác nhau về việc xác định TLTBAT dựa vào những kiểu hình DAMDTB bất thường Tuy nhiên trong thực hành, các nhà phân tích thường phối hợp nhiều chiến lược đánh giá để xác định đầy đủ các kiểu hình bất thường có thể xảy ra trên mỗi bệnh nhân:

(1) KN khác dòng: là những kháng nguyên (KN) điển hình của dòng tủy xuất

hiện trên tế bào lympho, và ngược lại; hoặc KN điển hình của tế bào B hiện diện trên tế bào T, và ngược lại.[29],[43],[82],[89]

(2) Sự biểu hiện KN không đồng bộ: là sự xuất hiện đồng thời các

DAMDTB non và trưởng thành hơn trên cùng một tế bào mà trong sơ đồ phát triển bình thường chúng không bao giờ hiện diện cùng lúc Ví dụ: CD34 và CD15 trên các tế bào BC ác tính dòng tủy, hoặc CD34 và CD20 trên tế bào BC ác tính dòng lympho B.[29],[43],[56]

(3) Sự hiện diện quá mức: là sự xuất hiện của một dấu ấn nào đó với nồng độ

cao hơn bình thường, ví dụ: CD10+ trên tế bào lympho B có CD19+CD22+, hay CD117+ trên tế bào dòng tủy có CD13+CD33+,…[70],[108]

(4) Sự vắng mặt một KN đặc hiệu của dòng: ví dụ như vắng mặt CD33+

hoặc CD13+ trên các tế bào BC ác tính dòng tủy, hay vắng mặt CD19+ hoặc CD22+ trên tế bào BC ác tính lympho B,…[27],[29]

(5) KN lạc chỗ: Là sự biểu hiện của những KN đặc biệt mà bình thường

không gặp ở những tế bào tạo máu Ví dụ: phức hợp CD5+ TdT+ trên tế bào BC

ác tính dòng T mà bình thường chỉ phát hiện trên tế bào vỏ tuyến ức, và không xuất hiện ở những vị trí ngoài tuyến ức như là tủy xương và máu ngoại vi.[29],[30]

(6) Kiểu phát xạ bất thường: chẳng hạn như các tế bào non dòng lympho

nhưng lại trình bày đặc tính phát tán ánh sáng nội tại SSC và FSC cao tương ứng với vị trí của tế bào dòng tủy bình thường; hoặc ngược lại, tế bào ác tính dòng tủy lại có đặc tính SSC thấp và CD45 yếu như của tế bào non dòng lympho.[29],[30]

(7) Những protein đặc biệt được tạo ra từ những tổ hợp NST bất thường:

Ví dụ: những protein được mã hóa từ những phức hợp gien như BCR-ABL, PBX1, MLL-AF4 và TEL-AML1 trong bệnh lý ALL; AML-ET0 và PML-RARA trong bệnh lý AML,… đi cùng với các chuyển đoạn NST như t(9;22); t(1,19); t(4,11); t(8,21); t(15,17)… Những kháng thể đặc trưng với những protein của những chuyển đoạn này sẽ được sử dụng để theo dõi TLTBAT.[17],[30],[32],[104]

E2A-1.4.2 Đánh giá TLTBAT trong bệnh BCC dòng lympho B

Hiện tại trên thế giới người ta tập trung chủ yếu vào việc nghiên cứu đánh giá TLTBAT đối với những trường hợp BCC dòng lympho B ở trẻ em vì đây là nhóm bệnh thường gặp nhất và có tỉ lệ chữa khỏi cao nhất, số lượng mẫu nghiên cứu lớn, hình thái tế bào tương đối đồng nhất, nên đạt được sự nhất trí cao trong các quan điểm đánh giá TLTBAT Các trung tâm nghiên cứu khác nhau trên thế giới đã thiết kế những tiêu chí đánh giá của riêng mình dựa trên các quan điểm nhận định TLTBAT đã nêu ở phần trên Sau đây là một số phương thức được quan tâm nghiên cứu trên thế giới:

- Phương thức đánh giá TLTBAT dựïa vào sự biểu hiện KN khác dòng được đánh giá cao nhất vì có khả năng lặp lại giống nhau ở mọi phòng xét nghiệm Đó là trên tế bào non dòng lympho B (CD19+ hoặc CD22+) có sự biểu hiện của các

KN dòng tủy (như CD13, CD33, CD15, CD16, CD14, CD64, CD36, CD117…), hoặc các KN dòng lympho T (như CD3, CD4, CD2, CD7,…).[28],[29],[44],[53],[82],[89]

- Michel J Borowitz (1997, Mỹ) cho rằng có mối tương quan giữa nồng độ huỳnh quang (MESF) của CD45 và CD20 với kết quả điều trị: ở những bệnh nhân có EFS xấu là những người có CD45mạnh và CD20mạnh [24] Đồng thời liên quan đến chuyển đoạn t(4;11) Ngoài ra, quần thể tế bào non ác tính dòng lympho B có thể có CD45–, là đặc điểm bình thường của hồng cầu hoặc mảnh vụn, nên là chỉ điểm dễ dàng nhận ra khi cần đánh giá TLTBAT [18],[24],[34],[57] Ví dụ: sử dụng cách đánh dấu 3 màu CD45/CD10/CD19 và TdT/CD10/CD19 trên 1 trường hợp BCC dòng lympho B, kiểu hình DAMDTB bất thường lúc chẩn đoán là hình ảnh tăng quá mức CD10 kèm CD45− Trong mẫu tủy xương 4 năm sau chẩn đoán, người ta ghi nhận có kiểu hình CD10+CD45− chiếm khoảng 0.5% tế bào tủy xương và tương ứng 1,5% tế bào CD19+ Tại thời điểm này bệnh nhân đã lui bệnh hoàn toàn trên lâm sàng Tuy nhiên sau đó 9 tháng bệnh nhân này bị tái phát lại.[29]

- Ngay từ buổi đầu nghiên cứu TLTBAT, dựa vào sơ đồ phát triển bình thường của các tế bào dòng lympho B, Borowitz và các cộng sự đã đưa ra khái niệm sự xuất hiện không đồng bộ giữa các KN trong cùng dòng là một đặc điểm bất thường của các tế bào BC ác tính dòng[56] Ngày nay, người ta xác định được những kiểu hình không đồng bộ là trên các tế bào dòng B với CD19+/CD10+ (và/hoặc CD22+) có sự đồng biểu hiện của CD34+/CD20+; TdT+/CD20+; CD34+ hoặc TdT với các Immunoglobulin như Igμ, Igκ, Igλ.[59],[67],[109],[93]

- Tổ chức BIOMED-1 đã thực hiện một nghiên cứu đa trung tâm nhằm thống nhất một số kiểu hình DAMDTB bất thường dựa vào 5 kết hợp kháng thể tương ứng với các kiểu nhuộm 3 màu: (I) TdT/CD10/CD19; (II) CD10/CD20/CD19;

(III) CD34/CD38/CD19; (IV) CD34/CD22/CD19; (V) CD19/CD34/CD45 Thông qua việc quan sát những “vùng trống”, người ta cũng nhận ra những kiểu hình liên quan đến các phương thức đánh giá đã kể trên (Hình 1.13).[68]

Hình 1.10: Sơ đồ mô tả “vùng trống” trong bệnh BCC dòng lympho B theo BIOMED-1 [68]

+ Cột bên trái: Quần thể tế bào B bình thường là những tập hợp những chấm màu xám;

“vùng trống” đại diện cho những tế bào BC ác tính là những hình tròn hoặc oval được đánh dấu từ A đến F

+ Cột bên phải: là những ví dụ minh họa về sự phân bố quần thể tế bào lympho B ác tính (quần thể màu đỏ) tương ứng với những “vùng trống” bên trái, được sử dụng cùng phương pháp nhuộm như trên

- Các tác giả nhận thấy quá trình phát triển bệnh BCC làm rối loạn điều tiết sự biểu hiện của các gien, khiến một số phân tử nào đó bị tăng lên hoặc giảm xuống so với bình thường, hoặc xuất hiện những KN lạ, ví dụ như: “7.1” (sản phẩm của bất thường NST 11q23), “KOR-SA3544” (liên quan đến t(9;22)),

E2A-PBX1 (t(1;19))[29 ] Các nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu tìm kiếm những KN mới có sức thuyết phục cao hơn trong việc đánh giá TLTBAT, có khả năng bao trùm toàn bộ quần thể tế bào BC ác tính như: CD123[113]; CD58[33],[110], Creatine kinas B, Ninijurin 1, Ref1, Calpastatin, HDJ-2 và Annexin VI,… nhưng chưa phổ biến.[33]

Đánh giá TLTBAT bằng DAMDTB đòi hỏi phải có một dàn kháng thể khá lớn mới có thể tìm ra được một vài kiểu hình bất thường trên mỗi bệnh nhân do đó gây tốn một chi phí không nhỏ Điều quan trọng tiếp theo là thời điểm lấy mẫu theo dõi không thường xuyên có đủ để phát hiện TLTBAT không? Campana gợi ý rằng đối với bệnh nhân ALL tối thiểu phải lấy mẫu xét nghiệm vào 3 thời điểm như sau: (1) kết thúc điều trị tấn công đạt lui bệnh, đó là thời điểm tế bào đề kháng với thuốc xuất hiện (2) cuối của năm đầu, (3) trước khi ngưng thuốc, đó là lúc tế bào BC ác tính lờn thuốc.[28]

Tuy kỹ thuật có thể phát hiện 1 tế bào BC ác tính trong 10.000 tế bào tủy bình thường, nhưng không phải trường hợp nào có TLTBAT cũng bị tái phát Ngưỡng TLTBAT liên quan đến nguy cơ tái phát cao là mục tiêu nghiên cứu chính trong những năm gần đây, song vẫn chưa có sự nhất trí cao giữa các nhà nghiên cứu TLTBAT Tuy nhiên đa số đều có chung một nhận xét, mức TLTBAT

≥1% có khả năng tái phát không tránh khỏi Mức TLTBAT có nguy cơ thấp có thể là ≤0.1% theo Elaina Coustan-Smith, nhưng cũng có thể là < 0.5% theo Vidriales và cộng sự Và mức TLTBAT được xem là tương đối an toàn hay âm tính là <0.03% hoặc <0.01%.[37],[44],[112],[104]

1.4.3 Đánh giá TLTBAT trong bệnh BCC dòng lympho T

Ở người khỏe mạnh, phức hợp các KN dòng T và TdT+ thường được phát