Nghiên cứu xác lập các điều kiện thích hợp để cố định nấm men saccharoyces cerevisiae trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn nhằm ứng dụng lên men rượu vang nho

Phần 2: So sánh khả n ng lên men rượu vang của nấm men cố đ nh trong gel alginate, nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n và nấm men tự do thông qua khả n ng sinh trư ng, s d ng c chất

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ỜI C Đ N

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu

đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận án

T N N

TÓ TẮT N ÁN

Với m c đích so sánh khả n ng lên men của nấm men cố đ nh trong gel alginate và nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men chính sản xuất rượu vang nho, nội dung nghiên cứu của luận án gồm c bốn phần chính

Phần 1: ác đ nh các thông số thích hợp cho quá trình cố đ nh nấm men trong h t gel alginate và trên chất mang cellulose vi khu n b ng phư ng pháp quy ho ch thực nghiệm trực giao hai yếu tố, hàm m c tiêu là hiệu suất cố đ nh tế bào Nguyên liệu s

d ng đ làm chất mang đ u c nguồn gốc nội đ a

Phần 2: So sánh khả n ng lên men rượu vang của nấm men cố đ nh trong gel alginate, nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n và nấm men tự do thông qua khả

n ng sinh trư ng, s d ng c chất và sinh t ng hợp sản ph m

Phần 3: Nghiên cứu quá trình tái s d ng của các lo i nấm men cố đ nh đ lên men rượu vang Việc tái s d ng nấm men cố đ nh được tiến hành liên t c trong 1 chu kỳ lên men Động h c quá trình lên men một số chu kỳ đã được trình bày chi tiết Chúng tôi so sánh khả n ng tái s d ng của hai lo i nấm men cố đ nh trong gel alginate và trên cellulose vi khu n dựa trên th i gian lên men, tốc độ s d ng đư ng, tốc độ sinh t ng hợp ethanol, t lệ tế bào thoát kh i chất mang, độ b n của chất mang qua các chu kỳ tái s d ng

Phần : Thiết lập các phư ng trình cân b ng vật chất của quá trình lên men chính trong sản xuất rượu vang nho với nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n, nấm men

cố đ nh trong h t gel alginate và nấm men tự do

Kết quả nghiên cứu đã kh ng đ nh ưu thế của nấm men cố đ nh so với nấm men tự

do và sự n i trội của nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men vang Cả hai lo i nấm men cố đ nh đ u c th tái s d ng ít nhất 1 chu kỳ và ho t tính lên men của chúng luôn luôn cao h n so với ho t tính lên men của nấm men tự do

ABSTRACT

The objective of this research was to compare the fermentation performance of the immobilized yeast in alginate gel and the immobilized yeast on bacterial cellulose during the primary fermentation in wine-making The experimentation consisted of four sections

Section 1 – Determination of technological parameters for yeast immobilization in alginate gel and for yeast immobilization on bacterial cellulose by Face Centered Central Composite Design with two factors The dependent variable was yield of cell immobilization The supports like sodium alginate and bacterial cellulose used in this study were originated from our country

Section 2 – Comparison of fermentation ability in wine-making of the immobilized yeast

in alginate gel, the immobilized yeast on bacterial cellulose and the free yeast: Yeast growth, substrate uptake and metabolite production were evaluated and compared

Section 3 – Investigation of the reuse of immobilized yeast in wine fermentation: The fixed yeast in alginate gel and the fixed yeast on bacterial cellulose were reused for 10 cycles

in the repeated batch fermentation The fermentation kinetics of several cycles were presented

in detail The fermentation performance of the two immobilized yeasts was evaluated and compared by the fermentation time, sugar uptake rate, ethanol formation rate, level of number

of cells escaped from the support, stability of the support during the reuse

Section 4 – Establishment of stoichiometric equations of the primary fermentation in wine – making for the immobilized yeast in alginate gel, the immobilized yeast on bacterial cellulose and the free yeast

The experimental results showed that the fixed yeast always exhibited higher fermentation performance than the free yeast in wine-making; the fermentation activities of the immobilized yeast on bacterial cellulose were better than those of the immobilized yeast in alginate gel Both the two fixed yeasts could be reused at least for 10 cycles in the repeated batch fermentation and the fermentation activities of them were always higher than those of the free yeast

ỜI CÁ ƠN

Thực hiện và hoàn thành luận án trong một khoảng th i gian khá dài với nh ng

kh kh n chung và riêng, tôi ngh r ng mình s không bao gi làm được nếu như bên

c nh tôi không c nh ng quan tâm và giúp đ của thầy cô, gia đình và b n b Không

th nào k ra được hết nh ng gì mà tôi đã nhận được khi thực hiện luận án Tôi rất cảm kích và biết n vì tất cả nh ng đi u ấy

L i cảm n trân tr ng nhất xin g i đến PGS.TS Lê V n Việt Mẫn, thầy hướng dẫn luận án và c ng là chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Thực ph m Từ nh ng công sức mà thầy đã dành cho, tôi cảm nhận sâu s c câu không thầy đố mầy làm nên

in cảm n PGS.TS Nguy n Thúy Hư ng đã cho giống vi sinh vật c ng với cách chu n b chất mang cellulose vi khu n đ cố đ nh nấm men Nh ng kiến đ ng g p chân tình của cô đã giúp tôi rất nhi u trong quá trình nghiên cứu

in cảm n PGS.TS Ngô Đ ng Ngh a đã cung cấp chất mang alginate s d ng trong luận án

in cảm n các thầy cô, các b n đồng nghiệp t i bộ môn Công nghệ Thực ph m đã luôn động viên, g p kiến, h trợ và gánh bớt công việc đ tôi hoàn thành luận án

in cảm n sự giúp đ của các thầy cô Khoa K thuật H a h c, ph ng Đào t o Sau

Đ i h c, các đ n v h trợ phân tích: Trung tâm H a Dầu, Trung tâm s c k Hải Đ ng,

ph ng thí nghiệm Công nghệ cao, Viện Công nghệ H a h c

in cảm n sự giúp đ của các em sinh viên, h c viên trong việc thực hiện các thực nghiệm, x l số liệu kết quả thí nghiệm, công bố các bài báo

Cuối c ng, xin cảm n m và gia đình đã ủng hộ tinh thần và c ng là động lực cho tôi cố g ng Hoàn tất luận án, tr thành một TS, không ch là mong muốn của cá nhân

mà c ng là sự mong đợi và ni m tự hào của m tôi

Tôi s cất gi sự biết n này trong l ng mãi mãi

Nghiên cứu sinh

Tôn N N

M C L C

M Đ U 1

Chư ng 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Nấm men vang 3

1.1.1 Phân lo i nấm men vang 3

1.1.2 Quá trình lên men rượu vang 3

1.2 Các phư ng pháp cố đ nh tế bào nấm men vang 4

1.2.1 Chất mang trong k thuật cố đ nh tế bào 4

1.2.2 Các phư ng pháp cố đ nh tế bào nấm men vang 6

1.2.3 Nấm men vang cố đ nh 7

1.3 Cố đ nh nấm men vang trong gel aglinate 8

1.3.1 Alginate 8

1.3.2 Các phư ng pháp cố đ nh vi sinh vật trong gel alginate 9

1.3.3 Ưu nhược đi m của phư ng pháp cố đ nh nấm men trong gel alginate 11

1.4 Cố đ nh nấm men vang trên cellulose vi khu n 12

1.4.1 Cellulose vi khu n 12

1.4.2 Các phư ng pháp cố đ nh vi sinh vật trên chất mang cellulose vi khu n 13 1.4.3 Ưu nhược đi m của phư ng pháp cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n 14

1.5 nh hư ng của các yếu tố công nghệ đến quá trình lên men rượu vang 14

1.5.1 nh hư ng của hàm lượng đư ng 15

1.5.2 nh hư ng của pH 16

1.5.3 nh hư ng của hàm lượng SO2 16

1.5.4 nh hư ng của hàm lượng tannin 17

1.6 ng d ng nấm men cố đ nh trong quá trình lên men vang t nh nhi u chu kỳ 18 1.7 Nh ng ứng d ng khác của vi sinh vật cố đ nh trong sản xuất rượu vang 20

1.8 T ng hợp tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước v hướng đ tài 21

Chư ng 2 NGU N LI U V PHƯ NG PHÁP NGHI N C U 24

2.1 Nguyên liệu 24

2.1.1 Nấm men 24

2.1.2 Alginate 24

2.1.3 Cellulose vi khu n 25

2.1.4 Nho 25

2.1.5 Các lo i h a chất khác 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Phư ng pháp nghiên cứu thực nghiệm 26

2.3.1 Phư ng pháp c đi n 26

2.3.2 Phư ng pháp quy ho ch thực nghiệm trực giao hai yếu tố 26

2.4 S đồ thí nghiệm 27

2.5 Bố trí thí nghiệm 28

2.5.1 ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trong gel alginate28 2.5.2 ác đ nh đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n 30

2.5.3 Khảo sát và so sánh ho t động của nấm men tự do, nấm men cố đ nh trong gel alginate và trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men rượu vang 33 2.5.4 Khảo sát và so sánh khả n ng tái s d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate và trên cellulose vi khu n đ lên men rượu vang theo phư ng pháp t nh, nhi u chu kỳ 34

2.5.5 Thiết lập phư ng trình cân b ng vật chất của quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và nấm men tự do 36

2.6 Phư ng pháp phân tích 37

2.6.1 Phư ng pháp phân tích vi sinh 37

2.6.2 Phư ng pháp phân tích h a l 38

2.7 Phư ng pháp x l số liệu 39

2.8 Các công thức tính toán 39

2.8.1 Hiệu suất cố đ nh nấm men, H 39

2.8.2 Th i gian lên men,  39

2.8.3 Tốc độ sinh trư ng riêng cực đ i, max 40

2.8.4 Tốc độ s d ng đư ng trung bình, Ks 40

2.8.5 Tốc độ sinh t ng hợp ethanol trung bình, Kp 40

2.8.6 Hiệu suất sinh t ng hợp ethanol,  40

2.8.7 T lệ thành phần nguyên tố của nấm men, c chất, sản ph m lên men 40

Chư ng 3 KẾT QU V B N LUẬN 41

3.1 ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trong gel alginate 41

3.1.1 Khảo sát ảnh hư ng của các yếu tố trong quá trình cố đ nh nấm men trong gel alginate b ng quy ho ch c đi n 41

3.1.2 ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trong gel alginate b ng quy ho ch thực nghiệm 49

3.2 ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n51 3.2.1 Cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n theo phư ng pháp hấp ph 51

3.2.2 Cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n b ng phư ng pháp hấp ph –ủ

59

3.2.3 So sánh ho t tính lên men của nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n s

d ng hai phư ng pháp cố đ nh: hấp ph và hấp ph – ủ 60

3.3 Khảo sát và so sánh ho t động của nấm men tự do, nấm men cố đ nh trong gel alginate và trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men rượu vang 62

3.3.1 Khảo sát quá trình sinh trư ng của nấm men tự do và nấm men cố đ nh 62 3.3.2 Khảo sát quá trình chuy n h a c chất của nấm men tự do và nấm men cố đ nh 66

3.3.3 Khảo sát quá trình sinh t ng hợp sản ph m của nấm men tự do và nấm men cố đ nh 71

3.4 Khảo sát và so sánh khả n ng tái s d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate và trên cellulose vi khu n đ lên men vang theo phư ng pháp t nh, nhi u chu kỳ 78

3.4.1 Khảo sát hiệu quả của giải pháp ngâm h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh trong dung d ch CaCl2 trong quá trình tái s d ng 78

3.4.2 So sánh khả n ng tái s d ng của nấm men cố đ nh trong gel alginate và trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men vang theo phư ng pháp t nh, nhi u chu kỳ 85

3.5 Thiết lập phư ng trình cân b ng vật chất cho quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và nấm men tự do 94

Chư ng KẾT LUẬN V KIẾN NGHỊ 99

4.1 Kết luận 99

4.2 Kiến ngh 100

DANH M C C NG T NH Đ C NG BỐ 101

T I LI U THAM KH O 102

NH C BẢNG

Bảng 1.1 ng d ng của nấm men cố đ nh trong sản ph m thức uống chứa ethanol 4Bảng 1.2 Một số chất mang s d ng đ cố đ nh nấm men trong sản xuất rượu vang 5Bảng 1.3 Các ứng d ng của vi sinh vật cố đ nh trong sản xuất rượu vang 20Bảng 2.1 Thành phần của các d ch nho sau khi ép 25Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hư ng các yếu tố đến hiệu quả cố đ nh nấm men trong gel Ca alginate 28

Bảng 2.3 Các chất b sung vào d ch nho Red Cardinal đ thực hiện quá trình lên men

s d ng của nấm men cố đ nh trong gel Ca alginate 29Bảng 2 Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hư ng các yếu tố đến hiệu quả cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n 31Bảng 2 Bố trí thí nghiệm so sánh khả n ng lên men của nấm men tự do và cố đ nh trong quá trình lên men rượu vang 34Bảng 3.1 nh hư ng của nồng độ alginate tới độ cứng của h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh 42Bảng 3.2 nh hư ng của nồng độ alginate tới tốc độ sinh t ng hợp ethanol g L.h của nấm men cố đ nh trong chu kỳ lên men 42Bảng 3.3 nh hư ng của nồng độ alginate tới t lệ thoát bào so với số tế bào ban đầu trong h t gel trong chu kỳ lên men 42Bảng 3 nh hư ng của nồng độ alginate tới t lệ h t gel alginate b v so với số

h t ban đầu trong chu kỳ lên men 43Bảng 3 nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n ph giống tới độ cứng của h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh 45Bảng 3 nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n ph giống tới tốc độ sinh t ng hợp ethanol g L.h của nấm men cố đ nh trong chu kỳ lên men 45Bảng 3 nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n ph giống tới t lệ thoát bào

so với số tế bào ban đầu trong h t gel trong chu kỳ lên men 45Bảng 3 nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n ph giống tới t lệ h t gel alginate b v so với số h t ban đầu trong chu kỳ lên men 46Bảng 3 nh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới độ cứng của h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh 47Bảng 3.1 nh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới tốc độ sinh t ng hợp ethanol

g L.h của nấm men cố đ nh trong chu kỳ lên men 48Bảng 3.11 nh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới t lệ thoát bào so với số tế bào ban đầu trong h t gel trong chu kỳ lên men 48Bảng 3.12 nh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới t lệ h t gel alginate b v

so với số h t ban đầu trong chu kỳ lên men 48Bảng 3.13 Ma trận quy ho ch cấu trúc có tâm cấp hai và kết quả thực nghiệm 49Bảng 3.14 Các hệ số của phư ng trình hồi quy Y1 50Bảng 3.1 nh hư ng của mật độ tế bào ban đầu trong huy n phù giống đến mật độ tế bào và hiệu suất cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n 52Bảng 3.16 nh hư ng của kích thước chất mang đến mật độ tế bào và hiệu suất cố

đ nh trên chất mang cellulose vi khu n 52

Bảng 3.1 nh hư ng của khối lượng chất mang đến mật độ tế bào và hiệu suất cố

đ nh trên chất mang cellulose vi khu n 54

Bảng 3.1 nh hư ng của pH huy n ph giống đến mật độ tế bào và hiệu suất cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n 54

Bảng 3.1 nh hư ng của tốc độ l c đảo đến mật độ tế bào và hiệu suất cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n 55

Bảng 3.2 nh hư ng của th i gian hấp ph nấm men đến mật độ tế bào và hiệu suất cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n 56

Bảng 3.21 Ma trận quy ho ch cấu trúc có tâm cấp hai và kết quả thực nghiệm 57

Bảng 3.22 Các hệ số của phư ng trình hồi quy Y 58

Bảng 3.23 Biến đ i của mật độ tế bào nấm men cố đ nh theo th i gian ủ 59

Bảng 3.24 nh hư ng của mật độ tế bào cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n đến quá trình lên men vang 61

Bảng 3.25 Sự thay đ i tốc độ sinh trư ng riêng cực đ i của nấm men cố đ nh và tự do trong quá trình lên men vang khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i 64 Bảng 3.26 nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến th i gian lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và nấm men 67

Bảng 3.27 nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến tốc độ s d ng đư ng trung bình của nấm men cố đ nh và tự do trong quá trình lên men vang 68

Bảng 3.28 nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến hàm lượng ethanol trong vang non s d ng nấm men cố đ nh và tự do 72

Bảng 3.29 nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến tốc độ sinh t ng hợp ethanol trung bình trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do 73

Bảng 3.30 nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến hiệu suất sinh t ng hợp ethanol trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do 74

Bảng 3.31 nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến sự t o thành các hợp chất hư ng chính của rượu vang non sau quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do 77

Bảng 3.32 Th i gian lên men h của nấm men cố đ nh trong gel alginate trong quá trình tái s d ng 78

Bảng 3.33 Hàm lượng ethanol trong vang non v v sau m i chu kì lên men của nấm men cố đ nh trong gel alginate 83

Bảng 3.3 Hàm lượng các hợp chất hư ng trong vang non các chu kỳ 1,3, , ,1 94

Bảng 3.3 T lệ c chất đã được nấm men s d ng và hàm lượng sản ph m do nấm men sinh ra trong vang non khi lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và nấm men tự do 95

Bảng 3.36 Công thức phân t của các thành phần trong d ch lên men và vang non khi lên men vang s d ng nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n, trong gel alginate và nấm men tự do 95

Bảng 3.37 Số mol c chất hoặc sản ph m tính theo 1mol đư ng lên men trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và nấm men tự do 96

Bảng 3.38 Hiệu suất t ng hợp sinh khối và sản ph m tính theo đư ng lên men) trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và nấm men tự do 97

C C HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của alginate 9

Hình 1.2 Sự hình thành gel của alginate với ion Ca2+ 9

Hình 1.3 C chế t o gel của alginate từ bên ngoài (trái) từ bên trong (phải) 10

Hình 1.4 Cấu trúc cellulose vi khu n (trái) và cellulose thực vật (phải) 12

Hình 1.5 Cấu trúc cellulose vi khu n I trái và cấu trúc cellulose vi khu n II phải 12 Hình 3.1 Bi u đồ bi u di n ảnh hư ng của nồng độ dung d ch alginate tới hiệu suất cố đ nh nấm men trong gel alginate 41

Hình 3.2 Bi u đồ bi u di n ảnh hư ng của mật độ tế bào nấm men trong huy n ph giống tới hiệu suất cố đ nh nấm men trong gel alginate 44

Hình 3.3 Bi u đồ bi u di n ảnh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới hiệu suất cố đ nh nấm men trong gel alginate 48

Hình 3.4 nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n phù giống và nồng độ dung d ch alginate đến hiệu suất cố đ nh nấm men trong gel alginate 50

Hình 3.5 Hình ch p S M h t gel alginate sau khi cố đ nh tế bào nấm men 51

Hình 3.6 nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n phù giống và th i gian hấp ph đến hiệu suất cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n 58

Hình 3.7 Hình ch p SEM chất mang cellulose vi khu n sau khi cố đ nh b ng phư ng pháp hấp ph 60

Hình 3.8 Hình ch p SEM chất mang cellulose vi khu n sau khi cố đ nh b ng phư ng pháp hấp ph -ủ, th i gian ủ 2 ngày 60

Hình 3.9 Hình ch p SEM chất mang cellulose vi khu n cố đ nh b ng phư ng pháp hấp ph -ủ sau quá trình lên men vang th i gian ủ là 2 ngày 62

Hình 3.10 Sự thay đ i mật độ tế bào nấm men cố đ nh và tự do trong quá trình lên men vang khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i 63

Hình 3.11 Sự thay đ i tốc độ sinh trư ng riêng của nấm men cố đ nh và tự do trong quá trình lên men vang khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i 64

Hình 3.12 Sự thay đ i hàm lượng đư ng trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i 66

Hình 3.13 Sự thay đ i hàm lượng nit amin tự do trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i 69

Hình 3.14 Sự thay đ i hàm lượng nit ammonium trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i 71

Hình 3.15 Sự thay đ i hàm lượng ethanol trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i 72

Hình 3.16 Sự thay đ i hàm lượng acid t ng trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i 75

Hình 3.17 Sự thay đ i hàm lượng acid d bay h i trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i 76

Hình 3.18 T lệ nấm men thoát ra kh i h t gel alginate so với t ng số nấm men trong d ch lên men qua các chu kỳ tái s d ng 81

Hình 3.1 Hình ch p S M h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh trước khi lên men chu kỳ 1 81Hình 3.2 Hình ch p S M h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh trong trư ng hợp không ngâm h t trong dung d ch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7 82Hình 3.21 Hình ch p S M h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh trong trư ng hợp

c ngâm trong dung d ch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7 82Hình 3.22 Tốc độ sinh t ng hợp ethanol trung bình của nấm men cố đ nh trong gel alginate qua các chu kỳ tái s d ng 83Hình 3.23 Sự biến đ i pH của vang non khi tái s d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate 84Hình 3.2 Sự thay đ i mật độ tế bào trong canh trư ng s d ng nấm men cố đ nh các chu kỳ tái s d ng thứ 1, 3, , , 1 85Hình 3.25 T lệ tế bào nấm men thoát kh i chất mang so với t ng số nấm men trong

d ch lên men qua các chu kỳ tái s d ng 86Hình 3.26 Tốc độ sinh trư ng trung bình của nấm men cố đ nh các chu kỳ tái s

d ng thứ 1, 3, , , 1 87Hình 3.2 Hình ch p SEM b mặt h t gel alginate trái và miếng cellulose vi khu n phải trước khi lên men chu kỳ 1 88Hình 3.2 Hình ch p SEM b mặt h t gel alginate trái và miếng cellulose vi khu n phải trước khi lên men chu kỳ 7 88Hình 3.2 Hình ch p SEM mặt c t h t gel alginate trái và mặt c t miếng cellulose vi khu n phải trước khi lên men chu kỳ 7 88Hình 3.30 Sự thay đ i hàm lượng đư ng trong quá trình lên men vang của nấm men

cố đ nh các chu kỳ tái s d ng thứ 1,3, , ,1 89Hình 3.31 Th i gian lên men của nấm men cố đ nh các chu kỳ tái s d ng 90Hình 3.32 Tốc độ s d ng đư ng trung bình của nấm men cố đ nh qua các chu kỳ tái

s d ng 91Hình 3.33 Sự thay đ i hàm lượng ethanol trong quá trình lên men vang của nấm men

cố đ nh trong quá trình lên men vang các chu kỳ tái s d ng thứ 1,3, ,7,10 92Hình 3.3 Hàm lượng ethanol trong vang non sau quá trình lên men chính s d ng nấm men cố đ nh qua các chu kỳ tái s d ng 92Hình 3.35 Tốc độ sinh t ng hợp ethanol trung bình của nấm men cố đ nh trong quá trình lên men vang qua các chu kỳ tái s d ng 93Hình 3.3 Hiệu suất sinh t ng hợp ethanol trung bình của nấm men cố đ nh trong quá trình lên men vang qua các chu kỳ tái s d ng 93

NH C T TH T NG CH I T TẮT

ADH : Alcohol dehydrogenase

DCM : Delignin ied cellulose material, cellulose đã tách lignin

DEAE-cellulose : Diethylaminoethyl-cellulose

GAE : Gallic acid equivalents, hàm lượng được tính theo acid gallic

MLF : Malolactic fermentation, quá trình lên men malolactic

Nmcđ A : Nấm men cố đ nh trong gel alginate

Nmcđ Akn : Nấm men cố đ nh trong gel alginate không được ngâm trong dung

d ch CaCl2 sau m i chu kỳ tái s d ng Nmcđ An : Nấm men cố đ nh trong gel alginate được ngâm trong dung d ch

CaCl2 sau m i chu kỳ tái s d ng Nmcđ B : Nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n

SEM : Scaned electronic microscope, kính hi n vi điện t quét

Đ

ượu vang là một thức uống lên men từ d ch nho s d ng nấm men

Saccharomyces cerevisiae [1], [2] ượu vang được nhi u ngư i ưa thích do hư ng v

hết sức đặc trưng và nh ng tác d ng c lợi cho sức kh e [3], [4]

ếu tố quyết đ nh chất lượng của một sản ph m rượu vang, bên c nh nguyên liệu nho, là giống nấm men Giống nấm men được xem là mấu chốt công nghệ đ t o ra

nh ng lo i rượu vang c chất lượng khác nhau Nh ng chủng nấm men vang thuộc

loài Saccharomyces cerevisiae đã được phân lập từ nho trong quá trình lên men rượu

vang tự nhiên và được cấy chuy n lưu gi đ ph c v cho ngành công nghiệp rượu vang Hiện nay, hầu hết các nhà máy sản xuất rượu vang, bao gồm nh ng nhà máy

Việt Nam, vẫn s d ng nấm men Saccharomyces cerevisiae d ng tự do đ lên men

rượu vang Mặc d chất lượng sản ph m đã n đ nh h n so với rượu vang lên men tự nhiên, nhưng việc s d ng nấm men tự do đ lên men rượu vang vẫn c n khá nhi u nhược đi m Đặc biệt khi tiến hành lên men trong nh ng đi u kiện không thuận lợi thì

sự sinh trư ng c ng như khả n ng sinh t ng hợp sản ph m trao đ i chất của nấm men

tự do b ức chế r rệt [5], [6], [7]

Một trong nh ng giải pháp đ kh c ph c các nhược đi m trên là s d ng nấm men

cố đ nh Các nghiên cứu v s d ng nấm men cố đ nh trong sản xuất rượu vang đ u cho thấy nấm men cố đ nh c nhi u ưu đi m h n h n so với nấm men tự do [8], [9] Ngoài ra, khả n ng tái s d ng của nấm men cố đ nh c n đem l i nhi u lợi ích v mặt kinh tế vì chi phí sản xuất giảm

Đ cố đ nh nấm men lên men rượu vang, phư ng pháp keo t tế bào t ra không thích hợp vì nh ng tế bào n m t i v ng tâm của khối keo t kh tiếp xúc với c chất [10], [11] phư ng pháp nhốt tế bào b ng màng membrane hay vi bao c ng ít được s

d ng vì membrane d b t t ngh t b i các chất keo c trong d ch nho [12] Đối với phư ng pháp nhốt tế bào trong cấu trúc gel, nhi u lo i chất mang đã được s d ng như alginate [13], [14], agar [15], gelatin [16], -carrageenan [17], polyacrylamide [18], polystyrene [19] Alginate là vật liệu được s d ng ph biến nhất; h n các nghiên cứu v cố đ nh tế bào trên thế giới đã s d ng alginate Chế ph m nấm men cố đ nh

trong gel alginate đã được thư ng m i h a và được ứng d ng trong quy trình sản xuất rượu vang quy mô lớn

Nấm men cố đ nh b ng phư ng pháp hấp ph trên b mặt chất mang xốp như kissiris [20], [21], vải cotton [22], mẫu thủy tinh xốp [23], ceramic [24], [25], hay trên chất mang giàu cellulose như bã mía [26], miếng trái cây [27] c ng được ứng d ng

đ lên men rượu vang Trong vài n m gần đây, c hai công bố khoa h c v việc s

d ng cellulose vi khu n làm chất mang cố đ nh nấm men đ ứng d ng trong quá trình lên men sản xuất rượu vang và ethanol [28], [29] Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa c các nghiên cứu chuyên sâu v nấm men vang cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n Chất mang cellulose vi khu n và chế ph m tế bào cố đ nh trên cellulose vi khu n vẫn chưa được thư ng m i h a th trư ng trong và ngoài nước

Chúng tôi thực hiện đ tài: N

Saccharomyces cerevisiae

, với:

cải thiện hiệu quả kinh tế của quá trình lên men rượu vang b ng

giải pháp s d ng nấm men cố đ nh trên chất mang mới rút ng n th i gian lên men, tái s d ng nấm men và n đ nh chất lượng sản ph m)

: so sánh hiệu quả s d ng hai chế ph m nấm men vang

cố đ nh, trong đ c một chất mang đã được s d ng ph biến alginate và một chất mang mới cellulose vi khu n trong quá trình lên men chính rượu vang nho

chúng tôi s tìm đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men

trên hai lo i chất mang alginate và cellulose vi khu n, so sánh khả n ng lên men rượu vang của nấm men cố đ nh trên hai lo i chất mang c ng với nấm men tự do, so sánh khả n ng tái s d ng của nấm men cố đ nh và thiết lập phư ng trình cân b ng vật chất cho quá trình lên men chính rượu vang nho cho cả hai lo i nấm men cố đ nh và nấm men tự do

Kế thừa kết quả đã công bố của một số nhà khoa h c trong nước, trong nghiên cứu này, chúng tôi s d ng chất mang alginate và cellulose vi khu n c nguồn gốc t i Việt Nam

C 1 TỔNG QUAN

1.1 N m men

1.1.1 Nấm men ấ vang

Nấm men c th được chia thành hai nhóm là Saccharomyces và nấm men bản đ a

Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men chủ lực thực hiện quá trình lên men

ethanol trong sản xuất rượu vang Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae c n được

g i là nấm men vang [1], [2], [30]

ấ bao gồm một số giống nấm men khác trong d ch nho lên men

như Kloeckera, Metschnikowia, Torulaspora, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces,

Candida, Pichia, Cryptococcus Hầu hết các loài thuộc nấm men bản đ a không c khả

n ng tồn t i khi nồng độ ethanol cao h n v v, ngo i trừ Brettanomyces bruxellensis

c th phát tri n trong môi trư ng c nồng độ ethanol lên đến 12 Trước đây, nấm men bản đ a được xem là các vi sinh vật gây hư h ng rượu vang Tuy nhiên, nh ng nghiên cứu gần đây cho thấy r ng, một số loài nấm men bản đ a c lợi cho chất lượng sản ph m, làm đa d ng h a hư ng v của rượu vang [5], [31]

1.1.2 Q á ì l u vang

Lên men v ự là quá trình lên men vang xảy ra tự nhiên mà không

cần cấy giống Thư ng thì các giống nấm men bản đ a như Kloeckera, Hanseniaspora

và Candida chiếm t lệ cao trong giai đo n đầu của quá trình lên men giai đo n tiếp theo, Pichia và Metschnikowia chiếm ưu thế giai đo n lên men cuối c ng, ch c n

l i Saccharomyces cerevisiae tồn t i nh khả n ng ch u được nồng độ ethanol cao Các giống nấm men khác như Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces,

Zygosaccharomyces, Brettanomyces c ng c th sống s t trong quá trình lên men và là

nguyên nhân gây nên nh ng khuyết tật liên quan đến giá tr cảm quan của sản ph m [3], [7], [32]

Lên men vang ấ bao gồm quá trình x l d ch nho

b ng SO2 nh m h n chế sự phát tri n không mong muốn của một số loài nấm men bản

đ a, và chủ động cấy giống Saccharomyces cerevisiae đ kh i đầu quá trình lên men

Nh vậy, quá trình lên men vang di n ra nhanh h n, an toàn h n và c th t o ra rượu

vang với hư ng v đặc trưng n đ nh Tuy nhiên, một số ít phân xư ng sản xuất vang quy mô nh vẫn s d ng phư ng pháp lên men tự nhiên vì quy trình đ n giản mặc d chất lượng sản ph m kém n đ nh [6], [30]

1.2 C nh t bào n m men

K thuật cố đ nh tế bào nấm men được ứng d ng trong ngành công nghiệp thức uống lên men như rượu vang nho, vang táo, bia và nước trái cây lên men có nồng độ ethanol thấp M c đích chính của việc s d ng nấm men cố đ nh là đ rút ng n th i gian lên men, tái s d ng nấm men và n đ nh chất lượng sản ph m Bảng 1.1 t m t t

một số ứng d ng của nấm men cố đ nh trong sản xuất thức uống chứa ethanol

Bảng 1.1 ng d ng của nấm men cố đ nh trong sản ph m thức uống chứa ethanol

Vang nho S cerevisiea

S cerevisiea

DEAE-cellulose Khoáng kissiris

Lommi H et al., 1990 [33] Bakoyianis V et al., 1992 [20]

S bayanus Ca-alginate Busova K.et al., 1994 [34]

C stellata + S cerevisiae Ca-alginate Ferraro L et al., 2000 [35]

S cerevisiea Mảnh  -alumina Loukatos P.et al., 2000 [36]

S cerevisiea Miếng táo Kourkoutas Y et al., 2001 [27]

S cerevisiea Cellulose vi khu n Nguyen T.H et al., 2008 [28]

S cerevisiea H t lúa mì Kandylis P., 2010 [37]

S cerevisiea V nho, l i b p Genisheva Z., 2011 [38]

S cerevisiea Ca-alginate Kassim H.C, 2012 [39]

Vang táo S cerevisiea+L oenos Ca-alginate Cabranes C et al., 1998 [40]

S bayanus+L oenos Ca-alginate Nedovic V.A et al., 2000 [41]

Bia ngh o ethanol S cerevisiae DEAE-cellulose Van Iersel M., 1995 [43]

S cerevisiae

S cerevisiae

 -caraageenan Ca-alginate DEAE-cellulose

Smogrovicova D., 1999 [44] Patkova J., 2000 [45]

Kourkoutas Y et al., 2004 [46]

Bia nồng độ cao S cerevisiae Ca-alginate Tran Q H., et al., 2008 [47]

1.2.1 Chất mang trong kỹ thuật c nh tế bào

Chất mang vô cơ: chúng c độ b n c h c và h a h c cao Tuy nhiên sản ph m lên

men thu được thư ng b lẫn các t p chất c xuất xứ từ chất mang Chất mang vô c thư ng gặp là h t thủy tinh, ceramic d ng khối tr hay d ng h t, các kissiris khoáng, gamma-alumina

Chất mang hữu cơ: chúng không làm cho sản ph m lên men b lẫn t p chất, b n

nhiệt và tư ng đối n đ nh v mặt h a h c trong đi u kiện lên men Chất mang h u c

cố đ nh nấm men bao gồm các polymer t ng hợp như gel polyvinylalcohol, polyvinylchloride, màng polyethylene, các chất mang tự nhiên bản chất polysaccharide

như agar, alginate, chitosan, pectin, carrageenan, dẫn xuất diethylaminoethylen của cellulose (DEAE-cellulose), cellulose đã tách lignin (Delignified cellulose), cellulose

vi khu n Bacterial cellulose , h t lúa mì, lúa m ch, các miếng trái cây như miếng táo,

lê, mộc qua, quince, sung, nho một số lo i phế liệu như bã malt, bã mía, l i b p, v nho, bã nho ép, v dưa hấu và các chất mang tự nhiên bản chất protein như gelatin, viên gluten Bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số chất mang s d ng đ cố đ nh nấm men trong sản xuất rượu vang

Chất mang

vơ c

Montmorilonite, polygorskite Ageeva N.M et al., 1985 [48]

Kissiris Bakoyianis V et al., 1992,1997 [20], [21]; Argiriou T et

al.,1996 [50]; Loukatos P et al., 2003 [51]

 -alumina Bakoyianis V et al.,1997 [21]; Loukatos P et al., 2000 [36];

Galanakis M.C et al., 2012 [52]

Hydroxyapatite ceramics Rapoport A., et al.,2011 [25]

Chất mang

h u c  -carrageenan Nakanishi K et al.,1987 [53]; Gòdia F et al.,1991 [54]

Acid pectic, agar Nakanishi K et al.,1987 [53]

Alginate Mori S., 1987 [55];Fumi M.D et al.,1987,1988,1989 [56],

[57], [58];Rosini G et al.,1993 [59], Yokotsuka K et al.,1993,1997,2003 [60], [61], [62]; Busova K et al.,1994 [34]; Suzzi G et al.,1996 [63]; Bakoyianis V et al.,1997 [21]; Ferraro L et al.,2000 [35]; Silva S et al., 2002,2003 [64],

[65];Kassim H.C., 2012 [39]

Cellulose vi khu n Nguyen T.H et al., 2008 [28]; Yao W et al., 2011 [29]

Cellulose đã tách lignin Bardi E.P et al.,1996 [66]; Balli D et al., 2003 [67];

Loukatos P et al., 2003 [51]; Mallouchos A et al., 2003 [68]

Gluten Bardi E.P et al.,1996,1997 [66], [69]; Iconomopoulou M et

al., 2002 [70]; Plessas S et al., 2005 [71]

Polyvinyl alcohol Martynenko N.N et al., 2004 [72]

Polystyren Tran T.H.C et al., 2012 [19]

Miếng mộc qua Kourkoutas Y et al., 2002,2003,2005 [74], [75], [76]

Miếng táo Kourkoutas Y et al., 2001,2002,2006 [27], [77], [78]

H t lúa mì, h t lúa m ch Kandylis P et al., 2010, 2012 [37], [82]

Củ cải đư ng Vucurovic M.V et al., 2012 [83]

1.2.2 Cá ơ á nh tế bào nấm men

Cố định tế bào bằng cách gắn trên bề mặt chất mang rắn: Tế bào nấm men c th kết

dính trên b mặt chất mang r n nh nh ng tư ng tác vật l như lực mao quản, liên kết

t nh điện, liên kết ion, liên kết kỵ nước, hoặc liên kết cộng hóa tr Phư ng pháp này yêu cầu b mặt chất mang phải có cấu trúc xốp hoặc có chứa nhi u nhóm chức h a h c khác nhau như h t thủy tinh xốp, thanh ceramic, DEAE-cellulose, bã mía, h t gluten, miếng trái cây [23], [25], [26], [33], [70], [81]

Cố định tế bào bằng cách nhốt trong khung mạng xốp: Các tế bào được đưa vào bên

trong một khung m ng xốp đ ng n cản tế bào khuếch tán ra môi trư ng xung quanh nhưng vẫn cho phép tế bào hấp thu các chất dinh dư ng và trao đ i chất Chất mang thư ng là các lo i polysaccharide (alginate, -carrageenan, agar, chitosan, pectin), protein (gelatin, collagen), polymer t ng hợp (polyacrylamide, polyvinylalcohol, polyurethane, polyvinylchloride, polystyrene) Chất mang thư ng c cấu trúc khung

m ng gel (ion gel, covalent gel, non-covalent gel, cryogel) [39], [46], [72], [92], [93], [94]

Cố định tế bào bằng cách keo tụ: Các tế bào nấm men S cerevisiae có khả n ng tự

bám chặt với nhau và hình thành nên khối bao gồm hàng ngàn tế bào nh các tư ng tác vật lý hay hóa h c Có 2 ki u keo t tế bào: keo t tự nhiên không s d ng h a chất và keo t nhân t o s d ng h a chất đ t o liên kết gi a các tế bào Phư ng pháp cố đ nh này ít s d ng cho nấm men vì các tế bào bên trong khối nấm men khó tiếp xúc với các chất dinh dư ng c trong canh trư ng [46]

Cố định tế bào bằng cách nhốt bên trong một màng chắn: Sự khuếch tán của tế bào ra

môi trư ng bên ngoài được ng n chặn b ng cách bao b c chúng vào trong các membrane nhưng vẫn đảm bảo quá trình trao đ i chất gi a chúng với môi trư ng Chất mang là sợi thủy tinh, nylon và một số màng bán thấm khác như polyvinyl chloride, cellulose acetate, polyamide Phư ng pháp này ít được s d ng cho nấm men

d ng đ lên men vang vì màng membrane d b ngh t b i các hợp chất keo trong d ch

nho khi thực hiện quá trình lên men vang [29], [46], [95], [96], [97], [98], [99]

1.2.3 Nấm men á c nh

1.2.3.1 hững tha đổi về đặc điểm sinh học của nấm men cố định

Việc cố đ nh tế bào s làm thay đ i hình thái, sinh l và các ho t động trao đ i chất

của nấm men [46], [100]

K ă : Nấm men cố đ nh thư ng c khả n ng sinh trư ng kém

h n so với nấm men tự do vì khả n ng hấp thu oxygiảm Tế bào nấm men cố đ nh c hình d ng và kích thước không đồng đ u Nhi u nghiên cứu cho thấy nấm men cố đ nh sinh trư ng đến một giới h n nhất đ nh và gi nguyên lượng sinh khối cho đến khi kết

thúc quá trình lên men [101], [102], [103]

H ấ : Nấm men cố đ nh c tốc độ s d ng glucose, tốc độ sinh

t ng hợp ethanol và glycerol cao h n nhi u so với nấm men tự do vì nấm men khi được cố đ nh trên chất mang s c nh ng thay đ i v đặc tính sinh l , ho t tính

en yme và c pH nội bào thấp h n so với nấm men tự do [21], [100], [104], [105]

K ă l ế ấ l trong á ì lên men: Nấm

men cố đ nh c khả n ng ch u được sự ức chế của c chất và sản ph m trao đ i chất

cao h n nấm men tự do [106], [107], [108], [109] nh ng đi u kiện lên men cực

đoan thì nấm men cố đ nh c ng th hiện ưu thế do chất mang đã bảo vệ tế bào trước

các tác động bất lợi của d ch lên men [110], [111], [112], [113], [114], [115], [116], [117], [118], [119], [120], [121], [122]

ự ấ ơ So với nấm men tự do, nhìn chung nấm men cố

đ nh t o thành nhi u ester h n, t o thành ít diacetyl, acetaldehyde, methanol, acid d bay h i và rượu bậc cao h n Lo i chất mang, phư ng pháp cố đ nh c ng c ảnh

hư ng đến khả n ng t o thành hợp chất hư ng và các sản ph m ph khác [46], [85],

[123], [124], [125], [126], [127]

1.2.3.2 Ưu thế của nấm men cố định trong quá trình lên men vang

Việc s d ng tế bào nấm men cố đ nh đ lên men vang c nhi u thuận lợi Chất mang đ ng vai tr tác nhân bảo vệ tế bào trước nh ng tác động bất lợi từ môi trư ng lên men như sự thay đ i v nhiệt độ, pH, nồng độ c chất ban đầu và sản ph m cuối,

từ đ làm n đ nh và kéo dài ho t tính lên men Quá trình trao đ i chất của tế bào cố

đ nh biến đ i theo chi u hướng t ng hiệu quả s d ng c chất, sản ph m được t o ra

nhi u h n Mật độ tế bào nấm men cố đ nh trên một đ n v th tích canh trư ng cao nên làm giảm th i gian lên men [46], [109], [112], [122]

Khi s d ng nấm men cố đ nh đ lên men vang, quá trình l c, tách nấm men ra

kh i d ch lên men được thực hiện nhanh và d dàng, từ đ làm giảm chi phí cho việc

thu hồi và hoàn thiện sản ph m [81], [84]

Nấm men cố đ nh c th tái s d ng được nhi u chu kỳ và c nhi u khả n ng ứng

d ng trong quy trình lên men liên t c quy mô công nghiệp, từ đ mang l i hiệu quả kinh tế cao h n cho nhà sản xuất [21], [102]

Tuy vậy, s d ng nấm men cố đ nh c ng c n một số h n chế khi hiện tượng tế bào thoát ra kh i chất mang quá nhi u, cấu trúc chất mang b phá hủy trong quá trình s

d ng, sự khuếch tán c chất đến tế bào trung tâm của khối chất mang b h n chế [46], [128]

1.3 C nh n m men trong gel aglinate

1.3.1 Alginate

Alginate hay algin là tên g i thư ng được s d ng cho muối alginic acid Alginate

hiện diện trong thành tế bào của các loài rong nâu (Phaeophyceae), chiếm đến

khối lượng chất khô và thư ng d ng muối alginate của calcium, magnesium và sodium Mặc d c một vài nguồn gốc khác nhau, tuy nhiên tất cả các alginate thư ng

m i hiện nay đ u c nguồn gốc từ rong bi n và d ng Ca alginate là thích hợp nhất đ

t o khung m ng gel cố đ nh nấm men đ lên men rượu vang [129]

1.3.1.1 Đặc điểm cấu tạo của alginate

Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer mannuronic acid (M) và -L-guluronic acid G liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4-glycoside Các monomer này phân bố trong m ch alginate theo các block

-D-T lệ của mannuronic acid và guluronic acid M G của alginate từ rong bi n dao động trong một khoảng rộng t y theo loài rong và m a thu ho ch T lệ này ảnh

hư ng đến độ b n gel Ca alginate [129], [130], [131]

Hình 1.1 Cấu trúc của alginate [129]

(a-các monomer của alginate b-chu i alginate c-sự phân bố các block

1.3.1.2 Cơ chế tạo gel của alginate

Alginate c khả n ng kết hợp với các cation kim lo i h a tr cao đ t o gel Ái lực của alginate đối với các ion h a tr 2 giảm theo trình tự: Pb2+ - Cu2+ - Cd2+ - Ba2+ -

Sr2+ - Ca2+ - Co2+ - Ni2+ - Zn2+ - Mn2+ T y thuộc vào lo i ion liên kết và nguồn gốc alginate mà gel t o thành c tính chất khác nhau Thông thư ng, ngư i ta thư ng s

d ng Ca2+ đ làm ion t o gel [131], [132]

Hình 1.2 Sự hình thành gel của alginate với ion Ca2+ [129]

1.3.2 Cá ơ á v vậ l l

1.3.2.1 C c h ơng h tạ g alginate

C hai phư ng pháp t o gel alginate: t o gel từ ngoài và t o gel từ trong

Phư ng pháp t o gel từ ngoài ph biến h n vì t o gel nhanh và thao tác đ n giản Khi nh gi t dung d ch alginate vào dung d ch c chứa cation, thư ng là Ca2+, b mặt ngoài của h t alginate s lập tức b gel h a Sau đ , các cation tiếp t c khuếch tán vào bên trong h t làm cho các phân t alginate bên trong tiếp t c b gel h a [129], [133]

Phư ng pháp t o gel từ trong mang l i tính đồng nhất và đa d ng v hình thức cho cấu trúc gel Cho muối chứa Ca2+

d ng khơng tan như CaCO3, CaSO4, DTA-Ca, Ca citrate vào dung d ch alginate, sau đ thay đ i độ h a tan của muối b ng cách ch nh

pH dung d ch Ca2+ giải ph ng dần và t o gel với alginate [134], [135], [136]

Đa số các nghiên cứu v cố đ nh tế bào nấm men trong gel alginate đ u s d ng phư ng pháp t o gel từ ngồi Sinh khối nấm men s được thêm vào dung d ch alginate rồi nh gi t vào dung d ch CaCl2 Các h t gel chứa tế bào nấm men vừa t o thành s được tiếp t c ngâm trong dung d ch CaCl2 một th i gian đ n đ nh cấu trúc

trước khi được s d ng trong quá trình lên men [13], [14], [137]

Hạt gel Cacium Alginate

Alginate

Na-Ca

Ca

Ca

Ca Ca Ca

CaCl 2

Na-Alginate Lực đẩy

H 2 O

GDL H+

CO 2 HCO 3

CaCO 3 H+

Ca Ca

Ca Na-Alginate

Hình 1.3 C chế t o gel của alginate từ bên ngồi trái từ bên trong phải [129]

1.3.2.2 nh h ng của c c điều i n tạ g đến độ ền g v u t nh n m n

Khối ợng hân tử a ginat : khối lượng phân t alginate ảnh hư ng nhi u đến độ

b n gel M ch alginate càng dài thì cấu trúc gel càng b n, nhưng ít ảnh hư ng đến khả

n ng khuếch tán của glucose, tốc độ lên men và sự t o thành ethanol của nấm men cố

đ nh trong gel alginate [133], [138]

Tỷ M/G: là phần mol của D-mannuronic acid M so với L-guluronic acid (G)

Alginate c hàm lượng G nh h n 2 -2 s khơng t o gel được Alginate c hàm lượng G lớn s t o thành gel xốp, ch c, khơng biến d ng và gi được độ cứng trong một th i gian dài Alginate c hàm lượng M cao t o thành gel m m, ít xốp và d b rã

h n Gel alginate giàu G thích hợp đ cố đ nh nấm men h n vì gel này ít gây cản tr đến khả n ng khuếch tán của glucose và h n chế sự sinh trư ng của tế bào nấm men sau khi cố đ nh [130], [132], [138], [139]

ồng độ a ginat : nồng độ alginate khơng ảnh hư ng đến kích thước, hình d ng

h t gel nhưng ảnh hư ng đến độ b n của h t gel Khi t ng nồng độ dung d ch alginate

s t ng độ b n h t gel, khả n ng gi nước của gel c ng tốt h n nhưng tốc độ lên men

và sinh t ng hợp ethanol l i giảm đáng k Nồng độ alginate thích hợp đ cố đ nh nấm men thư ng là 2% [133], [140], [141]

H tạ g : Cấu trúc h t gel alginate không b ảnh hư ng b i pH trong khoảng từ

– 1 Khi pH nh h n , th tích của h t s giảm; khi pH cao h n 1 , th tích của h t

t ng; pH nh h n 2, các h t gel rất nh và không đàn hồi pH của dung d ch alginate thích hợp cho quá trình t o gel cố đ nh tế bào nấm men n m trong khoảng từ , đến , N m ngoài khoảng này, khả n ng khuếch tán của glucose và độ b n gel đ u giảm

C Trong

đi u kiện này, độ b n gel và khả n ng khuếch tán của glucose gần như không b ảnh

hư ng Các tính chất này s giảm nhanh khi nhiệt độ t o gel cao h n 2 oC [138], [142]

ồng độ cati n tạ g : khi t ng nồng độ cation t o gel thì gel t o thành s b n

ch c h n Bản chất của cation t o gel c ng ảnh hư ng đến độ b n gel Độ b n gel t o thành từ các cation kim lo i s t ng dần theo thứ tự: Co2+

- Ca2+ - Sr2+ - Ba2+ - Cd2+ -

Cu2+ Ion Ca2+ thư ng được s d ng đ t o gel cố đ nh tế bào nấm men Nồng độ CaCl2 thích hợp cho việc t o gel alginate thư ng là 2 Nếu giá tr này lớn h n 1

thì tốc độ t ng trư ng của Saccharomyces cerevisae b ức chế [132], [136].

Kích th ớc hạt g : kích thước h t gel ảnh hư ng đến sự truy n khối trong quá

trình lên men Các h t c đư ng kính n m trong khoảng , - , mm là thích hợp cho quá trình phát tri n của tế bào c ng như hiệu quả lên men [135]

Mật độ tế t ng hạt g : khi t ng mật độ tế bào ban đầu trong h t gel trong một

giới h n xác đ nh thì tốc độ lên men t ng lên nhưng hiệu suất sinh t ng hợp ethanol s

giảm đi [46]

1.3.3 Ư ểm c ơ á ấ l l

Nấm men cố đ nh trong gel alginate đã được nghiên cứu và s d ng rộng rãi trong các quy trình sản xuất rượu vang chu kỳ hay liên t c do quá trình cố đ nh d thực hiện, hiệu suất cố đ nh và mật độ tế bào trong h t gel cao, đi u kiện cố đ nh ôn h a, không phải x l nhiệt hay x l h a chất nên các tế bào cố đ nh không b mất ho t tính lên men Ngoài ra, alginate là chất mang tr v mặt h a h c, an toàn, độ xốp của m ng gel thuận lợi cho việc khuếch tán c chất và sản ph m, gel alginate khá b n khi lên men

nhiệt độ cao [46], [117]

Nhược đi m chính của phư ng pháp này là độ b n của h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh s giảm dần theo th i gian lên men do sự sinh trư ng của các tế bào và do

sự giải ph ng CO2 bên trong h t gel làm phá v cấu trúc của gel Giá tr pH cao và sự

c mặt của hợp chất phosphate, citrate và lactate trong môi trư ng lên men c ng làm

cho độ b n gel giảm dần [46], [142], [143]

Một số giải pháp đã được nghiên cứu đ t ng độ b n gel hoặc t ng ho t tính lên men của nấm men cố đ nh trong gel alginate như t o lớp gel kép [139] đồng cố đ nh nấm men trong alginate và pectin [144]

1.4 C nh n m men vang trên cellulose vi khu n

1.4.1 Cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khu n là polymer do các gốc đư ng glucose liên kết với nhau b ng liên kết -1,4-glycoside Các chu i glucan liên kết với nhau b ng liên kết Van der aals và liên kết hydro t o nên cấu trúc ti n sợi, rồi kết tinh thành sợi, b , dải Cellulose vi khu n được phân biệt với cellulose thực vật nh vào ch số kết tinh cao trên Độ tr ng hợp của cellulose vi khu n và cellulose thực vật lần lượt dao động trong khoảng 2 – và 13.000–1 Ngoài ra, đư ng kính của sợi cellulose vi khu n ch vào khoảng 1 1 đư ng kính của sợi cellulose thực vật [145], [146], [147]

Hình 1.4 Cấu trúc cellulose vi khu n trái và cellulose thực vật phải [148]

Hình 1.5 Cấu trúc cellulose vi khu n I trái và cấu trúc cellulose vi khu n II phải

[149]

C u s vi huẩn I thư ng xuất hiện trong môi trư ng nuôi cấy t nh, c d ng sợi

với đư ng kính , -0,1µm, kết l i thành màng dày trên b mặt môi trư ng Cellulose

vi khu n I có độ ch u lực cao, độ b n c h c cao, sức c ng lớn, khối lượng nh , kích thước n đ nh, thích hợp với việc cố đ nh tế bào vi sinh vật

C u s vi huẩn II là d ng sợi cellulose được t o thành trong môi trư ng nuôi

cấy b sâu Các sợi cellulose này thư ng uốn cong, đư ng kính 0,1-0,2µm, phân bố

kh p môi trư ng nuôi cấy hoặc kết hợp l i với nhau thành các h t d ng cầu hay hình sao Khi được s d ng làm chất mang cố đ nh tế bào vi sinh vật, cellulose vi khu n II tuy c độ ch u lực không cao b ng cellulose vi khu n I nhưng c ưu thế là độ trư ng

Trong quá trình cố đ nh, cellulose vi khu n s trư ng n hoàn toàn, t o đi u kiện hấp ph tế bào nấm men tốt h n so với nh ng chất mang cellulose thực vật Hiệu suất

cố đ nh khá cao, c khả n ng ứng d ng lên men nhiệt độ thấp Ngoài nh ng nhược

đi m của phư ng pháp hấp ph là th i gian cố đ nh dài, t lệ thoát bào cao, các nghiên cứu cho thấy mật độ tế bào bên trong cấu trúc miếng cellulose vi khu n nh h n rất nhi u lần so với mật độ tế bào hấp ph trên b mặt [10], [29], [149], [151]

1.4.2.2 Ph ơng h hấp phụ- ủ

Vi sinh vật cố đ nh trên cellulose vi khu n sau th i gian hấp ph c th s d ng chất dinh dư ng đã được khuếch tán vào trong cấu trúc của chất mang đ t ng sinh khối trong giai đo n ủ Quá trình cố đ nh gồm giai đo n hấp ph như đã n i trên, và giai đo n ủ, t ng mật độ vi sinh vật trong cấu trúc cellulose vi khu n Phư ng pháp hấp ph -ủ không nh ng đã làm t ng mật độ vi sinh vật trong chất mang lên nhi u lần,

mà còn n đ nh mật độ vi sinh vật cố đ nh trên chất mang trong một th i gian dài [149]

1.4.3 Ư ểm c a ơ á nh nấ ll l v ẩ

Nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n tuy ch mới được nghiên cứu trong th i gian gần đây nhưng c ng chứng t là c nhi u ưu đi m khi ứng d ng vào quá trình lên men vang Quá trình cố đ nh d thực hiện, đi u kiện cố đ nh ôn h a, không phải x l nhiệt hay x l h a chất nên các tế bào cố đ nh không b mất ho t tính lên men Phư ng pháp hấp ph – ủ c n t o đi u kiện cho nấm men cố đ nh trên miếng chất mang cellulose vi khu n t ng sinh khối, thích nghi với môi trư ng lên men nhanh h n Ngoài ra, do chất mang cellulose vi khu n có tính chất c l b n và n đ nh, độ trư ng

n tốt nên vi sinh vật cố đ nh trên cellulose vi khu n c khả n ng tái s d ng nhi u chu kỳ [28], [29], [145], [148], [149]

Nhược đi m chính của phư ng pháp này là hiệu suất cố đ nh và mật độ tế bào cố

đ nh trên cellulose vi khu n không cao b ng phư ng pháp cố đ nh b ng cách nhốt trong khung m ng xốp, đồng th i không th cố đ nh các vi sinh vật c ho t tính

cellulase trên cellulose vi khu n vì cấu trúc chất mang s b phá hủy [46], [149]

1.5 Ả ởng c a các y u t công ngh n quá trình lên men vang

Lên men rượu vang là một quá trình khá phức t p N bao gồm nhi u biến đ i sinh

h c, h a sinh, h a h c, h a l và vật l đ chuy n h a d ch nho thành rượu vang Ngoài hai sản ph m chính là ethanol và CO2, rượu vang c n chứa các sản ph m ph và các sản ph m trung gian từ quá trình trao đ i chất của nấm men vang như glycerol, rượu bậc cao propanol, butanol, iso amylic , acid h u c tartaric, malic, citric, acetic , hợp chất carbonyl aldehyde, diacetyl, acetoin , ester ethylacetate, isoamylacetate ) [4]

Khả n ng lên men rượu vang của nấm men Saccharomyces cerevisiae ph thuộc

vào rất nhi u yếu tố: đi u kiện lên men nhiệt độ, mật độ giống cấy ban đầu , thành phần của d ch lên men nồng độ đư ng, tannin, SO2, pH Khi ngoài giới h n thích hợp thì các yếu tố này c th ảnh hư ng bất lợi đến tiến trình lên men của nấm men vang [110], [153]

1.5.1 Ả ng c l ng

Đư ng là c chất chính trong d ch nho được nấm men s d ng đ sinh t ng hợp

n ng lượng cho tế bào đồng th i chuy n h a thành ethanol, CO2 c ng như các sản

ph m ph khác Khi lên men trong môi trư ng l ng, nấm men ch u tác động của áp lực

th m thấu t o ra do các chất h a tan, phần lớn là đư ng, lên màng tế bào Khi nồng độ chất h a tan trong môi trư ng quá cao, màng tế bào không th duy trì sự cân b ng áp lực th m thấu gi a bên trong và bên ngoài được n a Tế bào chất c th b co l i làm

ho t tính trao đ i chất của nấm men b giảm đi Đ sản xuất rượu vang nồng độ ethanol cao (13 – 1 v v , ngư i ta s d ng d ch nho cô đặc hay b sung đư ng vào môi trư ng lên men Nấm men trong trư ng hợp này phát tri n sinh khối chậm, kích thước nh , tốc độ lên men chậm, hàm lượng đư ng s t trong sản ph m cao [1], [2] Quá trình cố đ nh làm thay đ i ho t tính trao đ i chất của nấm men và làm t ng khả

n ng chống ch u của nấm men đối với áp suất th m thấu cao Chất mang c n gi vai

tr bảo vệ tế bào, áp lực th m thấu từ môi trư ng lên men không tác động tức th i đến

tế bào, vì vậy, nấm men cố đ nh vẫn c khả n ng lên men hàm lượng đư ng cao và hàm lượng đư ng s t khi quá trình lên men kết thúc luôn thấp h n so với nấm men tự

do Holcberg 1 1 đã nghiên cứu sự lên men của nấm men cố đ nh trong gel agar, alginate và nấm men tự do trong canh trư ng chứa đến đư ng glucose và thấy

r ng nồng độ đư ng này, nấm men tự do hầu như không th ho t động và chuy n

h a đư ng trong khi nấm men cố đ nh vẫn c th lên men và d ch lên men c hàm lượng ethanol là [106] Iconomopoulou 2 2 s d ng nấm men cố đ nh trong

viên gluten và nấm men tự do đ lên men d ch nho Rhotidis với hàm lượng đư ng là

3 g L kết quả cho thấy th i gian lên men của nấm men cố đ nh và nấm men tự do lần lượt là 1 và 2 h, tốc độ sinh t ng hợp ethanol lần lượt là , và ,3 g L.h [70]

1.5.2 Ả ng c a pH

Ki m soát pH và độ acid trong rượu vang là đi u rất quan tr ng đ duy trì chất lượng rượu vang trong suốt quá trình bảo quản pH thấp s làm t ng cư ng độ màu (màu đ ), độ sáng, độ tư i và t ng hư ng v trái cây pH cao làm giảm độ màu, giảm

độ b n sinh h c và h a h c trong suốt quá trình bảo quản sản ph m Ngoài ra, pH c n ảnh hư ng đến ho t động của nấm men Khi pH càng thấp, hàm lượng ion H+ trong

d ch lên men càng cao từ đ s t o ra sự chênh lệch lớn gi a nồng độ ion H+ bên trong và bên ngoài tế bào, làm cho nấm men mất khả n ng phát tri n và làm vô ho t

en yme nội bào [27] Nấm men cố đ nh c khả n ng chống ch u sự biến đ i của pH tốt

h n nấm men tự do [154], [155], [156], [157], [158] Theo Serra 2 , sự giảm pH

làm t ng n ng lượng ho t h a của tế bào, nên tế bào s sinh trư ng chậm và tốc độ sinh trư ng riêng cực đ i thấp h n [159] Ngoài ra, theo Arena 2 , pH thấp, tế bào d ng n ng lượng đ duy trì sự sống h n là đ sinh trư ng [160]

Szajani (1996) đã nghiên cứu hệ thống lên men liên t c với nấm men cố đ nh trong

h t cellulose được chế t o từ cellulose xanthogenate do hãng Hungarian Viscose actory cung cấp Kết quả cho thấy là trong khi ho t tính lên men của nấm men tự do

ch n đ nh pH thì nấm men cố đ nh c th ho t động trong khoảng pH từ 3, đến 6,25 [161] Jirku (1999) đã cố đ nh nấm men trong m ng polymer t o thành từ nhựa epoxy và diaminopolyethylene oxide và ứng d ng đ lên men dung d ch glucose c ng

đi đến kết luận là hiệu suất sinh t ng hợp ethanol của nấm men tự do đ t giá tr cao

pH 4,5, c n hiệu suất sinh t ng hợp ethanol của nấm men cố đ nh c th n đ nh trong một khoảng pH rộng, 3, -6,5 [162]

1.5.3 Ả ng c l ng SO 2

Sul ur dioxide được s d ng ph biến trong rượu vang và ngành công nghiệp thực

ph m như tác nhân chống oxy h a và diệt khu n Hàm lượng SO2 cho phép trong rượu vang theo quy đ nh của Hoa Kỳ là 3 mg L [29] SO2 c n là chất phá v cầu nối disul ide trong phân t en yme, làm ức chế quá trình h a nâu do en yme, đồng th i

c ng là tác nhân ch n l c các giống nấm men trong quá trình lên men vang truy n thống [30], [163]

Saccharomyces cerevisiae c khả n ng chống ch u SO2 tốt nhưng nếu hàm lượng

SO2 t ng quá cao s ức chế quá trình trao đ i chất và sinh t ng hợp ethanol của nấm men [4], [30], [164], [165] Ngoài ra, SO2 c n làm t ng sự tích l y một số hợp chất khác trong quá trình lên men như glycerol, aceltaldehyde, diacetyl, acetoin [163], [166], [167]

Phần lớn nh ng nghiên cứu v ảnh hư ng của SO2 đến quá trình lên men rượu vang tập trung khảo sát khả n ng ức chế các loài nấm men bản đ a của SO2 [165], [168] ảnh hư ng của SO2 đến sự t o thành các hợp chất hư ng và khả n ng chuy n

h a các lo i acid amin [169], [170] Egli (1998) đã khảo sát ảnh hư ng của lượng SO2 ban đầu đến tiến trình lên men vang s d ng tế bào tự do Khi hàm lượng SO2 cao h n 112ppm thì tốc độ lên men chậm l i, t o đi u kiện cho một số vi khu n c nguồn gốc

từ trái nho chuy n h a đư ng s t thành acid acetic [171] a ima 2 1 đã nghiên cứu lên men d ch nho Koshu, c b sung SO2với nồng độ lên đến 32 mg L, s d ng nấm men tự do và nấm men cố đ nh trong gel Ca alginate Kết quả là nấm men tự do và cố

đ nh b ức chế hoàn toàn hàm lượng SO2 1 mg L và 32 mg L d ch lên men Khi hàm lượng SO2 thấp h n, tốc độ lên men của nấm men cố đ nh luôn n đ nh và cao

Soto (1968) khi nghiên cứu v quá trình lên men rượu champagne đã nhận thấy

r ng mật độ tế bào nấm men giảm khoảng 3, 11, 22, và 2 , khi thêm tannin

với lượng , 1, 2, và ,1 g L vào d ch lên men đã chứa ,3g L tannin [176]

Haslam (1992) l i cho r ng tannin c khả n ng liên kết với thành phần protein và polysaccharide trong d ch lên men b ng liên kết hydro hay liên kết Van der aals t o

thành kết tủa hay phức chất [177] Khi s d ng nấm men tự do và nấm men cố đ nh

trên cellulose đã tách lignin đ lên men bia, Bardi 1 nhận thấy hàm lượng polyphenol trong bia được lên men b i nấm men cố đ nh thấp h n nấm men tự do Tác giả giải thích là do tannin c ng c khả n ng liên kết với polysaccharide nên một số chất mang c bản chất cellulose hay gel polysaccharide đã hấp ph một phần tannin c trong môi trư ng [151] a ima 2 1 khảo sát thành phần h a h c d ch nho Koshu

và nhận thấy r ng hàm lượng t ng các hợp chất phenolic trong d ch nho là mg Gallic Acid quivalent L GA L Tác giả này đã b sung các hợp chất phenolic c xuất xứ từ h t nho vào d ch nho Koshu đ nồng độ dao động trong khoảng –

21 mgGA L Kết quả cho thấy trong khoảng hàm lượng khảo sát, cả nấm men cố

đ nh trong gel alginate và nấm men tự do đ u vẫn lên men tốt, tuy nhiên,

21 mgGA L thì tốc độ sinh t ng hợp ethanol của nấm men tự do thấp h n và hàm

lượng ethanol cuối c ng thấp h n 1 v v [172] auter 2 1 c n cho r ng acid

tannic c th kết hợp với s t trung tâm e-S trong chu i hô hấp, dẫn đến hiện tượng

thiếu h t s t, từ đ làm giảm tốc độ sinh trư ng của nấm men [178], [179]

1.6 ng d ng n m men c

Đã c nhi u nghiên cứu ứng d ng nấm men cố đ nh trên nh ng chất mang khác nhau đ lên men sản xuất rượu vang Alginate là một chất mang được s d ng ph

biến nhất [13], [20], [21], [39], [58], [57] Nấm men cố đ nh trong gel alginate đã được

sản xuất dưới d ng chế ph m thư ng m i đ cung cấp cho các nhà máy sản xuất thức uống lên men Hãng Proenol-Industria Biotechnologica, Ltd Bồ Đào Nha đã thư ng

m i h a nấm men cố đ nh đ ứng d ng trong quá trình lên men quy mô công nghiệp, đặc biệt là đ giải quyết sự cố khi quá trình lên men b dừng l i d hàm lượng đư ng

s t c n rất cao

Việc s d ng nấm men cố đ nh trong phư ng pháp lên men t nh nhi u chu kỳ là hướng nghiên cứu được quan tâm trong th i gian gần đây vì c nhi u ưu đi m Nh tác động bảo vệ của chất mang, ho t tính nấm men cố đ nh s được duy trì lâu h n, do

đ c th tái s d ng nấm men cố đ nh nhi u chu kỳ trong khi nấm men tự do ch được

s d ng đ lên men một chu kỳ [21], [68], [76] Trong quá trình tái s d ng, th i gian lên men của nấm men cố đ nh được rút ng n đáng k so với nấm men tự do Với c ng một nhiệt độ lên men, th i gian lên men của nấm men cố đ nh chu kỳ sau thư ng

ng n h n chu kỳ trước [78], [86], [180] Do không c sự khác biệt lớn v hàm lượng

ethanol trong vang non nhưng th i gian lên men ng n h n, nên nấm men cố đ nh c tốc độ sinh t ng hợp ethanol cao h n h n nấm men tự do và tốc độ này t ng dần theo

số chu kỳ tái s d ng Ngoài ra, so với nấm men tự do thì nấm men cố đ nh qua các chu kỳ tái s d ng s t o ra rượu vang c hàm lượng acid d bay h i thư ng thấp h n hoặc tư ng đư ng, thành phần cấu t hư ng c ng ít thay đ i, hoặc thay đ i theo chi u hướng c lợi Vì vậy chất lượng sản ph m không thay đ i hoặc tốt h n so với rượu

vang sản xuất theo phư ng pháp truy n thống [68], [69], [78], [79], [81], [172]

Đối với gel alginate, Su i 1 6 đã lên men d ch nho tr ng Trebbiano b ng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố đ nh trong chất mang này Nghiên cứu khảo sát sự

t o thành các hợp chất hư ng và c so sánh với nấm men tự do khi tái s d ng nấm men cố đ nh trong 3 chu kỳ Kết quả cho thấy, chu kỳ 1, cả chủng nấm men cố

đ nh luôn t o hàm lượng acetaldehyde, rượu bậc cao thấp h n và hàm lượng ethylacetate cao h n nấm men tự do Sau 3 chu kỳ tái s d ng thì thành phần hợp chất

hư ng do nấm men cố đ nh và nấm men tự do sinh ra là tư ng đư ng [63]

Đối với cellulose vi khu n, Nguy n Thúy Hư ng 2 đã lên men d ch nho b ng

nấm men Saccharomyces cerevisiae N28 cố đ nh trên chất mang này và tái s d ng

chu kỳ Th i gian lên men là ngày, hàm lượng đư ng s t là , g L và hàm lượng ethanol trong vang non là , v v Các thông số này không khác biệt nhi u so với mẫu đối chứng s d ng nấm men tự do [28]

Kourkoutas 2 1, 2 s d ng các miếng trái cây làm chất mang cố đ nh nấm

men Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 đ lên men vang từ d ch nho đ Rhotidis Nấm

men cố đ nh trên miếng táo được tái s d ng 3 chu kỳ, cứ sau chu kỳ l i h thấp nhiệt độ lên men từ 2 oC các chu kỳ đầu tiên và xuống c n 1oC các chu kỳ cuối Kết quả là trong suốt 3 chu kỳ, các thông số lên men đ u n đ nh, hàm lượng đư ng

s t dưới 3 g L, hàm lượng ethanol trong vang non là 12 v v, hàm lượng acid d bay

h i là ,3g acetic acid L Th i gian lên men c ng n đ nh và dưới h trong 2 chu kỳ đầu [27], [78] Tác giả trên c n s d ng miếng mộc qua đ làm chất mang cố đ nh nấm men trong nghiên cứu n m 2 3, tái s d ng chu kỳ, th i gian lên men dưới 1 h

và n đ nh trong 3 chu kỳ đầu với nhiệt độ lên men 1 oC [75]

Tsakiris 2 s d ng chất mang là miếng nho Sultanina đã sấy khô đ cố đ nh nấm men Saccharomyces cerevisiae Uvaferme 299 đ lên men vang tr ng từ d ch nho

Saint Denis Nấm men cố đ nh được tái s d ng trong 12 chu kỳ Nho khô t ra là một

lo i chất mang tốt cho nấm men khi lên men nhiệt độ 1 -25oC Th i gian lên men

ng n 3- ngày , hiệu suất chuy n h a đư ng là 1 , hàm lượng acid d bay h i,

methanol và acetaldehyde trong d ch lên men thấp [79]

Ngoài ra, Mallios 2 đã tái s d ng nấm men cố đ nh trên miếng lê 2 chu kỳ [73]; Reddy 2 , 2 đã tái s d ng nấm men cố đ nh trên miếng i và c i dưa hấu 12 chu kỳ [81], [86]; Kandylis (2008, 2010, 2 12 đã tái s d ng nấm men cố đ nh trên chất mang khoai tây 3 chu kỳ nấm men cố đ nh trên chất mang h t lúa mì và h t lúa m ch cho 3 chu kỳ lên men vang [37], [82], [181]

1.7 N ng d ng khác c a vi sinh v t c nh trong sản xu u vang

Nấm men cố đ nh ngoài nh ng ưu đi m v khả n ng lên men c n c nh ng ưu thế trong việc t chức sản xuất như chi phí vận hành thấp, n ng suất và chất lượng sản

ph m cao Vì vậy, c khá nhi u các nghiên cứu ứng d ng phư ng pháp lên men liên

t c s d ng nấm men cố đ nh trong sản xuất rượu vang Nấm men cố đ nh c ng được

s d ng trong công nghệ sản xuất các lo i rượu vang ng t hay rượu vang c gas lên men hai lần theo phư ng pháp Champenoise nh m dừng quá trình lên men theo muốn, t ng độ trong của sản ph m và rút ng n th i gian lên men

Các lo i nấm men bản đ a cố đ nh c ng được s d ng kết hợp với nấm men

Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men vang đ chuy n h a acid malic,

ng n chặn sự lên men kéo dài hoặc cải thiện hư ng v cho sản ph m rượu vang Ngoài

ra, vi khu n Oenococcus oeni cố đ nh c ng được ứng d ng đ tiến hành quá trình lên

men malolactic trong các quy trình sản xuất rượu vang Bảng 1.3 trình bày một số nghiên cứu ứng d ng đã nêu ra trên

Bảng 1.3 Các ứng d ng của vi sinh vật cố đ nh trong sản xuất rượu vang

Lên men liên t c Lên men d ch nho đ Rhotidis với chủng nấm men S cerevisiae

Visanto cố đ nh trên kissiris,  -alumina và Ca-alginate Lưu lượng nhập liệu là mL ngày Hiệu suất sinh t ng hợp ethanol cao h n 3-1 lần so với nấm men tự do và quá trình lên men trong suốt ngày không h b nhi m

S d ng nấm men S cerevisiae cố đ nh trong gel alginate đ sản

xuất rượu vang đ quy mô công nghiệp Dung tích hệ thống lên men là 12 hL Th i gian thu sản ph m rút ng n c n 3 ngày, chất lượng rượu vang thu được là tư ng đư ng với trư ng hợp lên men

t nh truy n thống

Kassim (2012) [39]

ượu vang ng t S d ng nấm men S cerevisiae W-3 cố đ nh trong gel alginate đ

dừng quá trình lên men theo muốn ượu vang c độ trong cao

và rất d l c

Yokotsuka (2003) [62]

ượu vang c gas S d ng nấm men S cerevisiae và bayanus cố đ nh trong h t gel

alginate đ lên men lần hai với môi trư ng là rượu vang n n từ

giống nho Pinot Nấm men cố đ nh hầu như không làm thay đ i

chất lượng của rượu vang c gas so với nấm men tự do, k cả các thành phần hợp chất hư ng

Fumi (1988) [57] Ciani (1991) [182]

Chuy n h a acid

malic thành

ethanol

S d ng Schizosaccharomyces pombe cố đ nh trong gel alginate đ

lên men d ch nho đ c hàm lượng acid malic 11g L Sau 50h, lượng acid malic được chuy n h a là 100%, trong khi đ , nấm men

tự do cần đến 60h

Magyar (1989) [13] Yokotsuka (1993) [60] Silva (2003) [65]

Ng n chặn hiện

tượng th i gian

lên men b kéo

dài

S d ng nấm men S cerevisiae cố đ nh trong gel alginate đ x l

hiện tượng kéo dài th i gian lên men trong sản xuất rượu vang Pháp và Bồ Đào Nha Tốc độ chuy n h a đư ng kh đ t tới

2, g L.ngày, không làm t ng hàm lượng acid d bay h i

Silva (2002) [64]

Cải thiện hư ng

v rượu vang Kết hợp lên men d ch nho đ Pinot b ng Candida stellata và S cerevisiae cố đ nh trong gel alginate Phư ng pháp này đã làm cho

lượng đư ng s t trong rượu vang ch c n ,3g L so với 1 , g L khi

ch lên men với S cerevisiae

Ciani (2006) [183]

Lên men

malolactic

S d ng vi khu n thuộc loài Oenococcus oeni cố đ nh trên chất

mang cellulose vi khu n b ng phư ng pháp hấp ph - ủ đ lên men malolactic

Nguy n Thúy Hư ng (2007) [184]

tb/mL; nồng độ alginate trong gel là 2, w v và nồng độ dung d ch CaCl2 là 1%w/v đ lên men d ch nha 12oPt sản suất bia [185], [186] Trần Quốc Hi n 2 đã xác đ nh l i các đi u kiện k thuật đ cố đ nh nấm men trong gel alginate và ứng d ng lên men d ch nha 2 oPt đ sản xuất bia nồng độ cao [47]

Bên c nh ứng d ng trong sản xuất bia, các nghiên cứu trong nước tập trung khảo sát ứng d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate đ lên men sản xuất ethanol Ngô

Đ ng Ngh a 1 , 1 đã chiết xuất alginate từ nguồn rong m của Việt Nam và

th nghiệm lên men ethanol trên môi trư ng d ch đư ng glucose [187], [188] Đến

n m 2 , Bùi Thanh Huy n đã thay đ i nồng độ glucose 1 -2 g L trong môi trư ng t ng hợp và nhận thấy nấm men cố đ nh luôn c tốc độ lên men cao h n khoảng 1,3-2, lần và nồng độ ethanol trong d ch dấm chín cao h n khoảng 1, -2,2 lần

so với nấm men tự do [189] Ph m Tr ng Khoa (2003) đã s d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate đ lên men sản xuất ethanol theo phư ng pháp liên t c trong khoảng

th i gian 3 - ngày với tốc độ pha loãng là , 12 h-1 Sản ph m t o thành có hàm lượng ethanol dao động trong khoảng , -7,4 % (v/v) [190]

Đến nay, chúng tôi chưa tìm thấy công bố của các nhà khoa h c trong nước v ứng

d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate đ lên men rượu vang nho

Ngoài nước, đã c khá nhi u công trình nghiên cứu v s d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate đ lên men rượu vang, s d ng phư ng pháp lên men t nh tái s

d ng nấm men nhi u chu kỳ và phư ng pháp lên men liên t c Đ là nh ng nghiên cứu của Fumi (1988) [57], Suzzi (1996) [63], Bakoyianis (1997) [21], Yajima (2001) [172], Silva (2002) [64], Ciani (2006) [183], Kassim (2012) [39]

Tuy nhiên, c một số vấn đ mà nh ng công bố trên thế giới chưa đ cập đến:

i c định c c điều i n thích hợ ch u t nh cố định tế nấm m n t ng hạt

gel alginate bằng h ơng h u h ạch thực nghi m: Nh ng nghiên cứu trước

đây đã xác đ nh các thông số của quá trình cố đ nh tế bào nấm men trong gel alginate b ng phư ng pháp thực nghiệm c đi n chưa c công bố s d ng phư ng pháp quy ho ch thực nghiệm đ tìm các đi u kiện thích hợp cho quá trình cố đ nh

tế bào nấm men trong gel alginate

ii Kh s t u t nh n m n ợu vang hi t i sử ụng nấm m n cố định t ng g

a ginat ua c c chu : Các nghiên cứu trước đây thư ng quan tâm đến hiệu quả

tái s d ng nấm men cố đ nh như số chu kỳ tái s d ng, th i gian lên men của m i chu kỳ, hiệu suất sinh t ng hợp ethanol, chất lượng rượu vang thu được qua các chu kỳ Tuy nhiên, các nghiên cứu chưa khảo sát khả n ng sinh trư ng, s d ng c chất và sinh t ng hợp ethanol khi tái s d ng nấm men cố đ nh Ngoài ra, chưa c công bố khoa h c nào đ cập đến giải pháp ngâm h t gel alginate trong dung d ch CaCl2 sau m i chu kì lên men đ làm b n h t Đối với phư ng pháp lên men liên

t c, đã c một nghiên cứu của Baykoyanis 1 v việc b sung muối CaCl2 trực tiếp vào d ch nho trước khi châm vào thiết b lên men đ làm b n h t gel alginate

tuy nhiên giải pháp này làm cho nồng độ Ca2+ trong rượu vang t ng cao và không

n đ nh [21]

iii Thiết ậ h ơng t nh cân ằng vật chất ch u t nh n m n ợu vang sử ụng

nấm m n cố định t ng g a ginat : Chưa c công bố khoa h c nào trước đây đ

cập đến vấn đ này

Trong nước, nghiên cứu của Nguy n Thúy Hư ng 2003, 2006 v việc cố đ nh

Oenococcus oeni trên cellulose vi khu n b ng phư ng pháp hấp ph -ủ đã là ti n đ đ

chúng tôi ho ch đ nh các nghiên cứu cố đ nh nấm men trên chất mang cellulose vi khu n [145], [149] Nguy n Thúy Hư ng 2 c ng c một công bố khoa h c v cố

đ nh nấm men trên cellulose vi khu n Tác giả đã so sánh khả n ng cố đ nh tế bào nấm men trên hai lo i cellulose vi khu n d ng màng và d ng h t đồng th i tiến hành tái s

d ng nấm men cố đ nh qua chu kỳ lên men [28] Tuy nhiên trong nghiên cứu này, các tác giả đã xác đ nh nh ng thông số của quá trình cố đ nh tế bào theo phư ng pháp

c đi n, không s d ng phư ng pháp quy ho ch thực nghiệm Ngoài ra, động h c quá trình lên men các chu kỳ tái s d ng chưa được công bố

Ngoài nước, đã c khá nhi u công trình khoa h c v việc s d ng chất mang giàu cellulose từ thực vật đ cố đ nh nấm men Tuy nhiên chúng tôi ch mới tìm thấy một báo cáo của ao 2 11 s d ng cellulose vi khu n làm màng membrane cố đ nh nấm men và ứng d ng trong sản xuất ethanol Khi đ , hàm lượng ethanol thu được t ng 21,2 và tốc độ sinh t ng hợp ethanol t ng 31,3 so với nấm men tự do đối chứng [29]

C 2 NG N I HƯƠNG HÁ NGHI N C U

2.1 Nguyên li u

2.1.1 ấ

Nấm men Saccharomyces cerevisiae TSV09 được cung cấp b i ph ng thí nghiệm

Vi sinh thực ph m, bộ môn Công nghệ Thực ph m, trư ng Đ i h c Bách Khoa

Đặc điểm h nh th i

- Tế bào hình cầu

- Sinh sản vô tính b ng cách nảy chồi, hoặc b ng bào t

- Bào t hình tr n hoặc ellipse

Kh n ng lên men t ng điều i n hông c

D-Glucose + D-Galatose + Maltose +

Sucrose + α,α-Trehalose + Melibose +

Raffinose + Lactose - Cellobiose -

Inulin - Starch - D-Xylose -

myo-Inositol -

D-Gluconate - D-Glucuronate - D-Galacturonate - DL-Lactate - Succinate -

Citrate - Methanol - Ethanol - Propane 1,2 diol - Butane 2,3 diol - Nitrate - Nitrite - Ethylamine - L-Lysine - Creatine - Creatinine - Glucosamine - Imidazole - w/o vitamins +

w/o myo-Inositol -

w/o Biotin + w/o Thiamin + w/o Biotin/Thiamin + w/o Pyridoxine + w/o Niacin +

c thể sinh t ng - hông thể sinh t ng

2.1.2 Alginate

Chất mang alginate được tách chiết từ rong m , thuộc giống Sargassummeclurei,

do Viện Công nghệ Sinh h c trư ng Đ i h c Nha Trang cung cấp Chế ph m alginate

s d ng trong luận án c d ng v y r n, màu nâu nh t, độ m 2 , , độ nhớt của dung

d ch alginate 2 2 oC là 3 Cp, t lệ M G là 1,2 [188]

2.1.3 C ll l v ẩ

Cellulose vi khu n được thu nhận từ quá trình lên men nước dừa già theo phư ng

pháp lên men b mặt, s d ng vi khu n Acetobacter xylinum BC12 do bộ môn Công

nghệ Sinh h c, trư ng Đ i h c Bách Khoa cung cấp Quy trình thu nhận chất mang được trình bày ph l c 1.1 Chất mang cellulose vi khu n c d ng tấm màu tr ng ngà, độ m 3 , độ dày mm, được c t thành nh ng khối hình hộp ch nhật c kích thước khác nhau theo ho ch đ nh thí nghiệm

2.1.4 Nho

Nho Shiraz và Red Cardinal được mua từ các vư n nho Ninh Thuận Nho được

đem ép lấy d ch rồi tr đông -40oC đ d ng trong suốt quá trình thí nghiệm Quy trình thu nhận d ch nho được trình bày trong ph l c 1.2 Thành phần của các d ch nho sau khi ép được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Thành phần của các d ch nho sau khi ép

Đư ng glucose, (NH4)2HPO4, Na2S2O5, tannic acid, tartaric acid đ b sung vào

d ch lên men là các lo i h a chất tinh khiết c xuất xứ từ công ty Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd và Guangdong Xilong Chemical Co., Ltd, Trung Quốc

2.1.5.2 H a chất hân tích

Các h a chất d ng đ thực hiện phân tích đ nh lượng c xuất xứ từ hãng Merck Co., Inc, Đức và Sigma Chemical Co., Hoa Kỳ

 Khảo sát quá trình lên men rượu vang qua các chu kỳ tái s d ng và so sánh khả

n ng tái s d ng của nấm men cố đ nh trong gel alginate và nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n

 ác đ nh phư ng trình cân b ng vật chất của quá trình lên men chính trong sản xuất rượu vang nho cho nấm men cố đ nh trong gel alginate, nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n và nấm men tự do, từ đ so sánh một cách toàn diện v hiệu suất sinh t ng hợp các sản ph m lên men của chúng

2.3

2.3.1 ơ á ể

Chúng tôi thay đ i giá tr một thông số cần khảo sát, cố đ nh giá tr các thông số

c n l i, từ đ xác đ nh quy luật biến đ i của hàm m c tiêu theo thông số khảo sát