Phương pháp đơn giản để chiết xuất và tinh chế resveratrol từ polygonum cuspidatum

Phương pháp đơn giản để chiết xuất và tinh chế resveratrol từ polygonum cuspidatum

Trường đại học Dược Hà Nội

Bộ môn Dược liệu

Báo cáo khoa học

Nhóm 2 tổ 3 lớp A4 – K68

Dong-Geng Wang a , Wen-Ying Liu b , Guang-Tong Chen a , b ,✕

aMedical School, Nan Tong University, Nan Tong 226001, China

bDepartment of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China

Received 31 May 2012; accepted 5 December 2012

Available online 10 December 2012

Phương pháp đơn giản để chiết xuất và tinh chế Resveratrol từ Polygonum

cuspidatum.

Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Pharmaceutical Analysis

www.elsevier.com/locate/jpa www.sciencedirect.com

1.Mục tiêu nghiên cứu: Tìm một phương pháp đơn giản để chiết xuất

và tinh chế Resveratrol từ Polygonum cuspidatum.

2,Tính cấp thiết của nghiên cứu:

I,Đặt vấn đề

Hình 1: trans- resveratrol (A), Trans- polydatin( B)

• Resveratrol là hợp chất không flavonoid polyphenol của công thức C14H12O3, hòa tan trong ether, chloroform, methanol, ethanol, acetone, acid acetic, ethyl ester và các dung môi hữu cơ khác

• Nhiệt độ: nóng chảy 253-255 , thăng hoa là ℃

261 ℃

Trans – resveratrol có hoạt tính sinh học mạnh hơn, nhưng hàm lượng lại thấp hơn so với dạng muối glycoside của nó => Thủy phân Trans-

polydatin để tăng hàm lượng resveratrol.

Các phương pháp truyền thống đã dùng:

 Sử dụng nhiệt và một lượng lớn ethanol cho lọc, cô đặc và tinh chế.

 Sử dụng phân tích polymer được đánh dấu có thời gian tương tác đặc hiệu với resveratrol để tinh chế.

 Chiết xuất lỏng siêu tới hạn( SFE).

 Thủy phân bằng emzym.

 Chạy sắc kí ngược hiệu năng cao.

Nhược điểm:tốn dung môi, ô nhiễm môi trường, chi phí cao.

=> Xây dựng một phương pháp đơn giản hơn để chiết xuất và tinh chế resveratrol, cải thiện các nhược điểm trên cũng như nâng cao năng suất chiết Resveratrol từ cây

P cuspidatum

II, Phương pháp tiến hành,

1,Quy trình chiết xuất Resveratrol từ P cuspidatum

Hình 2: Quy trình chiết xuất resveratrol

2, Chạy sắc kí bằng HPLC kết hợp với máy phân tích khối phổ

•Dịch resveratrol sau khi được chiết được tiến hành chấm và chạy sắc kí thu được các vết

•Sau đó được phân tích thông qua hệ thống phân tích khối phổ để xác định chính xác chất thu được là resveratrol.

Sau khi resveratrol được xác định bằng hệ thống HPLC thì được nhúng trong dung môi base pH =8 -9 để loại

bỏ những tạp chất ảnh hưởng đến kết quả chiết xuất của Resveratrol như các acid mạnh, những hợp chất tan trong nước

•Rửa kết thúc khi màu của pha nước thay đổi từ đỏ sang không màu.

• Nồng độ của resveratrol xác định bằng HPLC và được tính theo công thức 2

% resveratrol = (VoCo/ViCi).100% (2)

Với Vo, Co là thể tích và nồng độ của resveratrol sau khi chiết ở pha dung môi hữu cơ Vi, Ci là thể tích và nồng độ resvertrol trước khi chiết xuất bằng dung môi

• Xét ảnh hưởng tỉ lệ thể tích dịch chiết:nước

Thủy phân

• So sánh sự thủy phân giữa H2SO4 và HCl

• Tìm ra điều kiện thủy phân phù hợp

Chiết lỏng – lỏng

• So sánh khả năng chiết của các dung môi khác nhau

• Tìm dung môi chiết phù hợp

1, Chiết xuất resveratrol từ cây P cuspidatum.

Cắn sau khi lọc Dung dịch nước sau khi lọc Dịch chiết sau thủy phân

a, Vai trò của lọc

• Loại bỏ những hợp chất không phân cực hoặc ít phân cực như physion, chysophanol, emodin… và những mảnh vụn dược liệu khỏi dịch chiết ethanol 95% => tiến hành lọc và so sánh hai phương pháp lọc khác nhau

• Ưu điểm: hầu hết tạp bị tủa lại

vì thế dễ bị loại bỏ khi lọc Khắc phục được nhược điểm của phương pháp 1.

b, Hiệu quả của tỷ lệ dịch chiết : nước trong chiết xuất

Resveratrol

•Tỉ lệ dịch chiết: nước (khối lượng/thể tích, g/ml) là yếu

tố quan trọng trong chiết xuất resveratrol

Hình 4: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch

chiết và nước trong chiết xuất resveratrol.

•Resveratrol là 1 polyphenol, thủy phân từ polydatin cho hiệu quả chiết xuất tăng lên đáng kể.

=> Tiến hành thủy phân bằng dung dịch HCl 0,1 M để thu được resveratrol

•Tiến hành thủy phân bằng 2 điều kiện là:

• H2SO4 pH= 1,

• Nhược điểm: cả

resveratrol và polydatin

đều bị oxy hóa nên

không thu được

resveratrol

• HCl, pH= 1

• Cả resveratrol và

polydatin không bị oxy hóa mà xảy ra phản ứng thủy phân

•Kết quả thực nghiệm: Sau 8h polydatin bị thủy phân hoàn toàn.

•Kết quả chạy sắc kí:

Hình 3D sắc kí đồ của dịch chiết khi thủy phân

4 Chiết xuất lỏng- lỏng.

a, Lựa chọn dung môi chiết.

• Sự có mặt của bất cứ thành phần nào một trong 2 pha đều chịu ảnh hưởng bởi Rf, To và tỉ lệ V giữa 2 pha => lựa chọn đóng vai trò vô cùng quan trọng

•Tiến hành thử các dung môi và kết quả thu hồi resveratrol thu được như bảng sau:

• Mỗi dung môi được tiến hành làm 3 lần và lấy kết

quả trung bình

• Dung môi methyl tert- butyl ether cho hiệu suất

chiết là cao nhất Vì vậy chúng tôi lựa chọn methyl tert- butyl ether làm dung môi chiết

b, Sắc kí đồ sau khi chiết lỏng – lỏng:

Hình 5:Sắc kí đồ của mẫu sau khi chiết lỏng – lỏng.

Hình A: sắc kí đồ trong pha hữu cơ.

Hình B: Sắc kí đồ trong pha nước.

•5 Tẩy rửa.

Hình 6 : Ảnh hưởng của pH đến hiệu

xuất chiết Resveratrol.

Resveratrol là acid yếu: trong vùng pH nhất định nó sẽ tồn tại dạng phân tử không phân cực Khi rửa giải với dung dịch có:

 pH<9 resveratrol vẫn còn trong pha hữu cơ.

 pH >10 nó tồn tại dạng ion và được chuyển hoàn toàn sang pha nước.

Như vậy điều kiện được khảo sát để chiết xuất resveratrol là 8<pH<9

b, Đánh giá kết quả tẩy rửa:

Hình 7: Sắc kí đồ của các chất sau khi tẩy rửa.

Hình A: sắc kí đồ trong pha nước.

Hình B: sắc kí đồ trong pha hữu cơ.

- Sắc ký ngược dòng tốc độ cao và chiết xuất lỏng siêu tới hạn

và những phương pháp tiên tiến khác yêu cầu thiết bị đắt tiền.

• Vì thế, trong phương pháp này chúng tôi sử dụng acid HCl và dung dịch base để tẩy rửa, không dùng thiết bị phức tạp và dung môi hữu cơ.

• Không cần cột đóng gói như nhựa macroporous hay gel silica

• Tốn ít dung môi hữu cơ

• Không cần các thiết bị đắt tiền

• Hàm lượng resveratrol tăng lên 4 lần bằng cách thủy phân dạng muối glycoside của nó

73,8%