Miễn dịch đáp ứng nhận dạng mầm bệnh dựa vào chọn lọc một vùng cụ thể nhờ vô số các tế bào lymphocyte mang rất nhiều thụ thể đặc hiệu kháng nguyên mà cho phép hệ thống miễn dịch có thể n
Trang 1ghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của Wedelolaction từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin - 1 : Luận văn ThS Sinh học: 60 42 30 / Thân Văn Minh ; ghd : TS Trịnh Tất Cường
Nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng là hội chứng lâm sàng đặc trưng bởi
viêm hệ thống do nhiễm trùng Ngay cả điều trị tối ưu, tỉ lệ tử vong do nhiễm
trùng nặng và choáng nhiễm trùng gần 40% Tần suất của nhiễm trùng nặng và
choáng nhiễm trùng gia tăng 15 năm gần đây Tại Mỹ: 750.000 ca/năm; là 1 trong
10 nguyên nhân tử vong thường gặp Mặc dù, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm
trùng đã được phát hiện từ 30 năm trước, nhưng các bệnh nhân mắc căn bệnh này
vẫn có khả năng tử vong rất cao Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp và tá dược
chữa bệnh là một vấn đề cần thiết và cấp bách để điều trị hiệu quả quá trình viêm
hệ thống, và sẽ hỗ trợ cải thiện được khả năng điều trị của bệnh nhân bị nhiễm
trùng nặng và choáng nhiễm trùng
Cây nhọ nồi (có tên khoa học là Eclipta prostrata hoặc Eclipta alba) là thực
vật thuộc họ cúc (Asteraceae) và mọc ở những vùng Nm như một loại cỏ ở khắp
thế giới Cây nhọ nồi mọc nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Việt N am [2]
Các hoạt tính dược học của Wedelolactone từ nhọ nồi đã được chứng minh ở in
vitro và in vivo [31]
Cho đến nay, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng vẫn là một trong các
nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt
(ICU) Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp trên thế giới.Tại Việt
N am, trong nghiên cứu chiết xuất tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của
Wedelolactone từ cây nhọ nồi Việt N am đã được tiến hành tại Phòng thí nghiệm
Trang 2Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà
N ội Bước đầu đã cho thấy tác dụng của chất này trong quá trình chống viêm Với hoạt tính phòng chống viêm đầy tiêm năng của Wedelolactone, chúng tôi muốn nghiên cứu sâu hơn nữa các đặc tính, cơ chế chống viêm và khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở mức độ in vitro và in vivo tạo
cơ sở cho các nghiên cứu khoa học thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm đi đến đích cuối cùng làm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị các bệnh viêm nhiễm và đặc biệt là bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng Xuất phát từ cơ sơ khoa học thực
tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: “ghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng
viêm của Wedelolacton từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin – 1”
Trang 3Chương 1: TỔG QUA TÀI LIỆU
1 VAI TRÒ CỦA HỆ THỐG MIỄ DNCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ
Miễn dịch bNm sinh và miễn dịch đáp ứng là hai loại đáp ứng miễn dịch bảo vệ quan trọng đối với các động vật có xương sống Miễn dịch đáp ứng bNm sinh có vai trò như hàng rào bảo vệ đầu tiên nhưng lại không có khả năng nhận dạng lập lại các mầm bệnh và trợ giúp đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch đáp ứng nhận dạng mầm bệnh dựa vào chọn lọc một vùng cụ thể nhờ vô số các tế bào lymphocyte mang rất nhiều thụ thể đặc hiệu kháng nguyên mà cho phép hệ thống miễn dịch có thể nhận dạng bất kỳ kháng nguyên bên ngoài xâm nhập vào cơ thể
Hệ thống miễn dịch bNm sinh sử dụng vô số các thụ thể để nhận dạng và đáp ứng tới những mầm bệnh trong giai đoạn ban đầu của cơ thể Quá trình nhận dạng mầm bệnh của các thụ thể có một vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu tới những đáp ứng viêm, sản xuất những tế bào hiệu quả mới tham gia vào quá trình viêm cục bộ và bắt đầu những đáp ứng của quá trình miễn dịch đáp ứng Vô số các thụ thể nhận dạng mầm bệnh mẫu (PRR) bao gồm thụ thể Toll-like (TLR), lectin, Dectin-1 và các thụ thể scavenger quyết định tới khả năng sống xót của vật chủ bằng quá trình nhận dạng những mẫu phân tử ở trên mầm bệnh như vi khuNn, virut, nấm có cấu trúc giống như trên các thụ thể riêng biệt được gọi là PAMP (pathogenic associated molecules pattern) Quá trình nhận dạng mầm bệnh bằng quá trình thực bào kích thích thực bào hóa, sinh ra cytokine,
Trang 4chemokine tiền viêm, và thậm trí là kích thích quá trình ban đầu của miễn dịch đáp ứng
2 KHÁI IỆM VIÊM
Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với các vị trí bị tổn thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh hay là những tế bào bị hỏng Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa chữa những vị trí kích thích bị thương và bị lỗi Khi phản ứng viêm xảy ra, nhiều loại tế bào sẽ được hoạt hóa và tập trung đến ổ viêm như các loại tế bào di chuyển (migrating cells) gồm: bạch cầu đơn nhân, đa nhân, các tế bào lympho, tiểu cầu, tế bào nội mạc… Các tế bào này giải phóng ra hàng loạt các chất trung gian, phần lớn là các chất prostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu và interleukin-1 Các chất này lại tiếp tục hoạt hóa các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loạt các enzyme “dọn dẹp” chủ yếu phân giải protein như các proteinase, các interleukin, yếu tố ngoại tử khối u (TN F-α), các superoxide, H+, hydroperoxide gây ra tổn thương mô, qua đó khép kín quá trình viêm mạn tính Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm tăng dòng chảy của máu tới những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tượng bị đỏ, nóng Một vài chất tiết ra làm hẹp dòng chảy của máu dẫn tới bị sưng Khi quá trình viêm kéo dài sẽ dẫn tới hiệu quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do quá trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục
bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [23]
3 HIỄM TRÙG ẶG VÀ CHOÁG HIỄM TRÙG
N hiễm trùng có thể được định nghĩa như một phổ của những điều kiện lâm sàng gây ra bởi đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân tới quá trình nhiễm trùng mà được đặc trưng bởi viêm hệ thống và quá trình đông tụ [6,7,8] Các bệnh nhân mắc
Trang 5nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trải qua hai giai đoạn đáp ứng miễn dịch [7] Thời kỳ đầu sẽ biểu hiện những đáp ứng viêm ồ ạt tới quá trình nhiễm trùng Hầu hết, đó là các cytokine tiền viêm như TN F, interleukine (IL)-1, IL-6, IL-12,
và interferon gamma (IFN gamma) Sau đó, cơ thể sẽ điều hòa những đáp ứng này bằng sản xuất những cytokine kháng viêm (IL-10), các chất ức chế của thụ thể
TN F, thụ thể IL-1 loại II, và IL-1RA (một dạng bất hoạt của IL-1) [12] Các lớp đáp ứng viêm hệ thống của vật chủ được bắt đầu bằng một số sản phNm vi khuNn
N hững sản phNm vi khuNn (vi khuNn gram âm bao gồm nội độc tố: lipopolysaccharide (LPS), formyl peptides, ngoại độc tố và proteases; các vi khuNn gram dương như ngoại độc tố, các siêu kháng nguyên, ngoại độc tố A của streptococcal pyrogenic (SpeA), peptidoglycan, axít lipotechoic) và một số chất
của vỏ tế bào nấm (zymosan được phân tách từ Saccharomyces cerevisiae) liên kết
các thụ thể trên macrophage của vật chủ và kích hoạt những protein điều hòa (yếu
tố nhân Kappa B (N FқB)) [12] Chẳng hạn, thụ thể Toll like 4 (TLR4) nhận dạng LPS, còn thụ thể Dectin-1 nhận dạng đối với zymosan [8,15] Sau đó, các thụ thể chuyển tín hiệu vào tế bào Hiệu quả tích lũy của những lớp viêm hệ thống này dẫn tới trạng thái mất cân bằng, cùng với quá trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [23]
4 MIỄ DNCH BẨM SIH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨG QUÁ TRÌH
HIỄM VI KHUẨ
Hệ thống miễn dịch bNm sinh bao gồm vô số các thành phần khác nhau để chống lại quá trình xâm nhập của vi sinh vật Thứ nhất, các chức năng của hàng rào biểu bì của cơ thể có thể cản trở quá trình gây viêm nhiễm của mầm bệnh Thứ hai, các tế bào và các phân tử kiểm soát hoặc phá hủy các mầm bệnh mà có thể trốn thoát khỏi lớp hàng rào bảo vệ biểu bì để xâm nhập tiếp vào bên trong Thứ
Trang 6ba cũng là hàng rào quan trọng nhất của hệ thống bảo vệ miễn dịch bNm sinh đó các mô của tế bào macrophage truyền tin hiệu bảo vệ tế bào ở các vùng ngoại biên
và hệ thống bổ thể của protein truyền tín hiệu của hệ thống miễn dịch bNm sinh dưới dạng dịch nằm giữa khoảng không của mô và máu Quá trình nhận dạng bằng
hệ thống miễn dịch sẽ loại bỏ các mầm bệnh xâm nhập thông qua vô số cơ chế hiệu quả khác nhau Hệ thống miễn dịch bNm sinh có thể xem như có vai trò quan trọng nhất trong quá trình viêm nhiễm
4.1 Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs)
Thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR, pathogen recognition receptor) được chia làm ba nhóm chính bắt nguồn từ vị trí trong tế bào đó là: thụ thể huyết thanh hoặc phần dịch của mô; màng tế bào hay cytoplasm; hay nằm trên màng hoặc trong dịch tế bào được xem là thụ thể nhận dạng mầm bệnh [19] Mỗi nhóm thụ thể PRR có các phối tử đặc hiệu của chính mình để có thể nhận dạng một loại vi sinh vật nhất định [19] Các thụ thể này có thể nhận dạng mầm bệnh một cách trực tiếp (không thông qua opsonin) hoặc gián tiếp (thông qua oposonin) [19] Đối với
In vivo, nhiều thụ thể có thể tham gia để nhận dạng vi khuNn thông qua đa phản
ứng ở đa vị trí Các phần có nguồn gốc từ nấm hay mấm lớn được nhận bằng PRR giống như thụ thể TLR, thụ thể mannose, bổ thể 3 (CR3), và dectin-1 [20] Quá trình nhận dạng mầm bệnh của PRR kích thích quá trình sản xuất cytokine và chemokine dẫn tới quá trình hoạt động và sinh ra các tế bào khác tham gia tới vị trí đang trong quá trình bị viêm nhiễm Từ đây, dẫn tới những phản ứng của miễn dịch đáp ứng [12]
Fungi TLR2 TLR6
Mannose receptor
Dectin-1
CD11b CD18
CR3 Fungi Fungi
Trang 7Hình 1: Các thụ thể RRP đối với nấm có thể nhận dạng ra phần cacsbon Thụ thể Mannose nhận dạng thành phần mannan; TLR2 và TLR6, CR3, dectin-1
nhận dạng β-glucans
4.2 Thụ thể Toll- like (TLR)
Thụ thể Toll- like (TLR) là một protein màng mà nhận dạng ra các phân tử
có sẵn ở trên mầm bệnh (PAMP) [20] Trong động vật có vú, họ thụ thể TLR bào gồm ít nhất 10 loại khác nhau Chúng có một vai trò cơ bản tới nhận dạng các phối
tử có nguồn gốc từ mầm bệnh [20] TLR2 có thể nhận dạng lipoproteins các gốc đường có gắn lipid-(lipoarabinomannan) từ thành tế bào của vi khuNn và nấm [13] TLR4 nhận dạng lipopolysaccharide (LPS) từ thành tế bào của vi khuNn gram âm [15] TLR9 có thể nhận dạng deoxycytidylate-phosphate-deoxyguanylate (CpG)
có trong deoxyribonucleic acid (DN A) của vi khuNn [13] Một vi sinh vật có thể được nhận bởi rất nhiều TLR Thực tế, tổ hợp của TLR có thể tham gia vào các đáp ứng viêm do macrophage hoặc tế bào dendritic sinh ra trong quá trình cơ thể
bị nhiễm mầm bệnh [20] TLR bao gồm một đoạn nằm bên trong tế bào được gọi
là thụ thể Toll/IL-1 (TIR) Đoạn này sẽ tường với các đoạn TIR khác N hững đoạn TIR có chứa các phân tử tiếp nối giống như giống như yếu tố phân chia tế bào 88 (MyD88), protein nối tiếp có đoạn TIR (TIRAP), mộ đoạn TIR có chứa phần interferon-β (TRIF), và phân tử tiếp nối với TRIF (TRAM) [20] Quá trình nhận dạng mầm bệnh của TLR2 sẽ kích thích quá trình hoạt động của yếu tố hoạt động nhân tế bào là N F-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), và sản xuất ra các cytokine tiền viêm như tumor necrosis factor, TN F-α thông qua đoạn TIRAP và đoạn MyD88, nhưng quá trình nhận dạng của TLR4 lại kích thích hoạt động của N F-κB thông qua TIRAP, MyD88 và kích thích hoạt động của đoạn phiễn mã của interferon (IFN ) giống như quá trình sản xuất IFN kiểu 1 [27]
Trang 84.3.Thụ thể Dectin- 1
Quá trình nhiễm nấm đã kích hoạt quá trình hoạt động ban đầu của các đáp ứng miễn dịch bNm sinh trong động vật có vú thông qua các cơ quan cảm ứng đối với quá trình nhiễm trùng [16] Chất β-glucan là một thành phần quan trọng trong
vỏ của tế bào của nấm Tế bào có thể nhận ra được thành phần này khi xâm nhập
đó là nhờ vao sự hoạt động của thụ thể Dectin-1 Thụ thể này nằm trên màng tế bào có một đoạn kiểu C lectin gắn với loại màng kiểu II và có một đoạn bên trong cytoplasma của tế bào cùng với một phần hoạt động dựa vào thụ thể miễn dịch tyrosine [8]
Dectin-1 được biểu hiện trên các dòng tế bào myeloid, monocyte, đại thực bào, tế bào trung tính và tế bào tua [16] Cho đến nay thụ thể Dectin-1 đã được hiểu rất rõ là một thụ thể biểu hiện mạnh nhất trên đại thực bào trong quá trình thực bào của nấm Đặc biệt thụ thể này có thể nhận dạng đặc hiệu đối với β-glucan hoặc zymosan (một chất có chứa một hàm lượng lớn β-glucan và được tách chiết
từ Sacchomyces) Các đáp ứng thực bào đối với quá trình nhận dạng vi sinh vật sẽ sản xuất ra các cytokine, chemokine, quá trình thực bào hóa, giết mầm bệnh bằng sản xuất ra các peptide kháng vi sinh vật, phản ứng oxy hóa (ROS) và RN S [16]
4.4 Thụ thể Dectin-1 hoạt động cùng với TLR2 để nhận dạng các phối tử có nguồn gốc từ vi sinh vật
Zymosan là một hợp chất mà lượng β-glucan trong thành tế bào của
Saccharomyces cerevisiae chiếm phần chính [8,16] Thành phần của zymosan có
β-glucan, mannan, và chitin Thành phần này được nhận dạng bằng một số thụ thể chẳng hạn như TLR2, TLR6, Dectin-1, thụ thể mannose, và CR3 [16] Chất này đã
được chứng minh là kích thích quá trình đại thực bào và quá trình viêm cả ở in vivo và in vitro [16]
Dectin-1 hoạt động cùng với một số TLR để nhận dạng ra nấm [16] Thụ
thể này cùng với TLR2, Dectin-1 nhận dạng ra zymosan hoặc nấm Candida
Trang 9albicans truyền tín hiệu điều hòa hoạt động của yếu tố nhân kích hoạt tế bào T
(N FAT) và quá trình sản xuất interleukin (IL)-2, IL-10, và IL-12 p70 trong tế bào
dendritic [16, 26] Dectin-1 cũng tham gia vào quá trình thực bào, hoạt động của
yếu tố tự phân bào (ERK)1/2 (extracellular signal-regulated kinase), và quá trình
sản xuất các cytokine tiền viêm cùng với TLR2 để nhận dạng ra Mycobacterium abscessus [16] Hơn nữa, Dectin-1 tham gia cùng với TLR2 và TLR4 trong đáp ứng miễn dịch bNm sinh tới nhận Mycobacterium ulcerans để kích thích sinh ra
gốc oxy hóa (ROS) và sản xuất ra chemokines và IL-37 trong kerainocyte của người Do vậy, Dectin-1 thực hiện một vai trò hoạt động giống như một thụ thể
chính nhận dạng ra quá trình nhiễm nấm và mycobacterium [16]
Hình 2: Tín hiệu Dectin-1 hợp tác cùng TLR để nhận dạng nấm
Trang 10Dectin-1 nhận dạng ra nấm để sinh ra quá trình enzyme kinsase của tyrosine ở lách (Syk) và một đoạn protein caspase 9 (CARD)9 CARD9 tác động cùng với B-cell lymphoma-10 (Bcl-10) và vùng phiên mã gen 1 của lympho (MALT1) để kích thích tạo ra ROS và quá trình hoạt động của <F-κB Quá trình biểu hiện của Dectin-1 expression tăng cường quá trình sản xuất cytokine trong sự có mặt của TLR2 và TLR6
4.5 Glucocorticoid
Glucocorticoid đã được sử dụng như một chất chống viêm cùng với rất nhiều cơ chế trong quá trình hoạt động của nó [17] Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh glucocorticoid có thể điều hòa được chức năng của các tế bào viêm, đặc biệt là quá trình phiên mã của các gen sinh cytokine [11] Hơn nữa, glucocorticoid có thể ức chế quá trình sản xuất các cytokine tiền viêm như TN F-α, IL-6, IL-1, và làm giảm quá trình tiết gốc nito và quá trình hoạt hóa các yếu tố mô trong tế bào macrophage [22] Do vậy, glucocorticoid đã được sử dụng trong điều trị một số bệnh viêm nhiễm và các bệnh mẫn cảm miễn dịch N hưng hơn nữa, chúng có tiềm năng vô cùng to lớn trong hoạt động kháng viêm và giảm quá trình miễn dịch không có lợi cho cơ thể [9,17, 21]
N hìn chung, quá trình viêm hệ thống mất kiểm soát được xem như là các đặc trưng của nhiễm trùng, của triệu chứng viêm cấp tính đường hô hấp Một chất được biết đó Hydrocortisone, là một glucocorticoid, có thể làm giảm đi đáng kể mức plasma của protein C, phospholipase A2, và loại bỏ bớt các tế bào neutrophil trong các bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng [22] N hững nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra chất này có thể điều hòa hầu hết các cytokine tiền viêm [11], bao gồm ức chế các cytokine có vai trò quan trọng trong miễn dịch bNm sinh và nhiễm trùng [22] Hiệu quả của glucocorticoid đã được chứng minh trong
các bệnh nhiễm trùng nặng như nhiễm vi khuNn meningitis, pneumocystis pneumonia, typhoid fever, và những trường hợp nhiễm H5N 1 [11]
4.6 ROS và p47phox
4.6.1.Gốc oxy hóa ROS
Trang 11ROS (reactive oxygen species) là một đại diện nhỏ của phản ứng oxy hóa, bao gồm superoxide (O2-) anion, hydrogen peroxide (H2O2), peroxyl (ROO-) radical, acid (HOCl), ozone (O3)[14] ROS được tạo ra thông qua một loạt các phản ứng mà bắt đầu bằng quá trình tạo ra superoxide [14] Quá trình tạo ra ROS trong sinh lý được xem như sản phNm phụ xảy ra trong mitochondria, cytochrome
P-450, và các yếu tố tế bào khác [23] ROS có thể tương tác cùng với vô số phân
tử, bao gồm những phân tử hữu cơ nhỏ, protein, lipid, carbohydrate và nucleic acid [14] Thông qua những tương tác, ROS có thể gây ra thảm họa hoặc làm thay đổi chức năng của phân tử đích [14] N icotinamide adenine dinucleotide phosphate (N ADPH) oxidases (N ox) cũng tạo ra ROS Thực ra, ROS tham gia trong các cơ chế truyền tín hiệu kích thích liên quan tới khả năng miễn dịch và quá trình viêm [14] ROS kích thích hoạt động của N F-κB Ví dụ, quá trình sản xuất của TN F-α được điều hòa bằng con đường N F-kB được kích hoạt bởi ROS trong
tế bào Kuffer, macrophage ở trong gan [25] Hơn nưa, ROS có thể điều hòa hoạt động activator protein-1 (AP-1) (một yếu tố tham gia trong quá trình viêm) thông qua nhiều cơ chế khác nhau [28]
4.6.2 Vai trò của p47phox trong quá trình sinh ROS
N ox sản xuất ROS thông qua rất nhiều tiểu đơn vị của nó bao gồm các thành phần điều hòa cytoplasma là Rac, p67phox, p47phox, p40phox và các
protein màng flavocytochrome b558, bao gồm tiểu đơn vị gp91phox (N ox2) và p22
phox [28] p47phox có vai trò cơ bản đối với hoạt động của N ox [28] Ở trạng thái
bất hoạt, p47phox chuyển động tới các tiểu đơn vị trong cytoplasma khác là p67phox và p40phox Ở trạng thái hoạt động, các tiểu đơn vị này sẽ kết hợp lại và chuyển electron ra ngoài màng tế bào được biết như các gốc oxy hóa (O2-) [10]
N hiều công bố đã chỉ ra p47phox có một vai trò quan trọng đối với quá trình tạo nên ROS N ó được biểu hiện trong các tế myeloid, các đoạn mô như ở bên trong tai, ở nơron thần kinh, các tế bao gan, phổi [14]
O 2 -
Trang 12Hình 3: Quá trình liên kết để tạo ra ROS (gốc oxy hóa)
Ở trạng thái bất hoạt của tế bào, các prtotein thuộc cytoplasma bao gồm phức hệ p40phox, p47phox, và p67phox, và guanosine diphosphate (GDP), không liên kết với
hoạt động, có sự thay đổi của GDP đối với guanosine-5'-triphosphate (GTP) trên Ras được xem như là độc tố C3 botulinum dẫn tới kích hoạt Lúc này, p47phox được phospho hóa và truyền tín hiệu tới và làm cho phức hệ p67phox, p40phox được chuyển tới trên màng tế bào plasma Quá trình phospho hóa của p47phox sẽ làm thay đổi cấu trúc dẫn tới tương tác với p22phox Quá trình chuyển tới màng của phức hệ p67phox, p40phox sẽ làm cho p67phox tương tác với <ox2 Cuối cùng enzym GTP trên Rac tương tác cùng với
<ADPH trong cytoplasma thành oxy hóa ra ngoài tế bào [14]
4.7 Vai trò của đại thực bào trong đáp ứng viêm
Đại thực bào (macrophage) là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào,
có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống Vai trò chính của chúng là thực bào các thành phần cặn bã của tế bào và các tác nhân gây bệnh N goài ra, chúng còn đóng vai trò các tế bào trình diện kháng nguyên khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể Do đóng vai trò quan trọng trong quá trình thực bào của cơ thể, đại thực bào
Trang 13có liên quan đến một số tình trạng bệnh lý do miễn dịch Ví dụ các đại thực bào tham gia vào quá trình hình thành u hạt (granuloma) hay các tổn thương viêm do nhiều nguyên nhân khác nhau Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ thống và trong nhiễm trùng huyết, đại thực bào giải phóng các cytokine gây viêm mạnh, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bệnh lý của các hội chứng này Các cytokine chính được phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1 (IL-1), yếu tố họai tử khối u
TN F-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN -γ, nitric oxide (N O) vàc các phân tử dính kết tế bào dẫn đến làm tăng quá trình viêm N hư vậy, việc kiểm soát sản xuất các chất này có thể làm giảm khả năng viêm Macrophage là tế bào có kích thước tương đối lớn và
có khả năng đáp ứng nhanh với các kích thích viêm tạo ra bởi LPS N goài ra, các TLR ở macrophage được biểu hiện mạnh hơn so với các tế bào bạch cầu khác (Hình 4) nên nó thường được lựa chọn trong các mô hình sàng lọc và nghiên cứu
cơ chế kháng viêm in vitro
Hình 4: Biểu hiện của các thụ thể ở các tế bào bạch cầu
5 Mô hình nghiên cứu viêm thực nghiệm in vivo sử dụng LPS
Khả năng kháng viêm của một chất nghiên cứu, đặc biệt là sau bước sàng lọc in vitro, chỉ được khẳng định khi tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật thực
nghiệm Đối với chất kháng viêm, các nghiên cứu thường sử dụng chuột vì hệ gen chuột và nguời có mức độ tương đồng khá cao (85%) [18] N goài ra , sử dụng chuột sẽ ít tốn kém và dễ thực hiện hơn so với các động vật thực nghiệm khác Các
Macrophage Granulocyte
Trang 14nghiên cứu trước đây thường sử dụng trực tiếp các mô hình gây viêm thực nghiệm
in vivo để sàng lọc và nghiên cứu cơ chế kháng viêm của chất cần nghiên cứu Các
mô hình này thường là: i) sử dụng carrageenan, một polysaccharide tách từ tảo đỏ,
để gây viêm ở chân chuột (caageenan-induced hind paw edema) trong điều kiện có mặt và vắng mặt của chất cần nghiên cứu và sau đó so sánh thể tích bàn chân viêm với đối chứng [33]; ii) gây viêm xoang bụng (peritroneal inflammation) bằng cách tiêm carrageenan vào bụng chuột trong điều kiện có mặt và vắng mặt của chất nghiên cứu Lượng dịch viêm tiết trong xoang bụng chuột sẽ được thu lại và so sánh với đối chứng về thể tích cũng như lượng bạch cầu và protein trong dịch [15]; iii) gây viêm mạn tính (chronic inflammation) bằng cách tiêm carrageenan vào phần cơ chuột trong điều kiện có mặt và vắng mặt của chất nghiên cứu để tạo khối u Sau đó khối u được lấy ra để đo trọng lương khô so với mẫu đối chứng [29] Hiện nay, mô hình gây viêm thực nghiệm sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới gọi là shock nội độc tố (endotoxin shock model) thường sử dụng zymosan của nấm (một tác nhân gây viêm mạnh) để gây viêm cấp và viêm đặc hiệu với thụ thể Dectin-1 cần nghiên cứu Ở mô hình này, chuột sau khi được gây viêm sẽ được tiêm chất nghiên cứu Hàm lượng các chất trung gian tiết ra trong quá trình tiền viêm cũng như những yếu tố tham giá vào các con đường tín hiệu viêm được theo dõi và đánh giá, ví dụ như cytokine, chemokine tiền viêm
(T<F-a; IL-6, IL-8) và kháng viêm(IL-10), interferon, quá trình phospho hóa các
yếu tố tự phân bào protein kinase (MAPKs), hay phản ứng ôxy hóa Từ đó tác
dụng của chất nghiên cứu được khẳng định Với mô hình in vivo này, việc đánh
giá tác dụng của chất kháng viêm sẽ có hệ thống, chính xác và chi tiết hơn ở mức phân tử
6 TÌH HÌH GHIÊ CỨU TROG VÀ GOÀI ƯỚC
6.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Các chất kháng viêm được phân loại thành 3 nhóm chính gồm:
6.1.1 Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (SAID)
Trang 15Đại diện cho nhóm này là aspirin, ibuprofen và naproxen Cơ chế kháng viêm của N SAID được phát hiện là do chúng ức chế sự tổng hợp PG Đích tác dụng được biết rõ nhất của các chất này là cyclooxygenase (COX), là enzym có vai trò chuyển hóa axit arachidonic thành prostaglandins (PG) và thromboxane (TX) Một
số N SAID lại có khả năng ức chế enzym liên quan đến sự bào mòn màng nhày dạ dày N ghiên cứu lâm sàng đã chứng minh các chất N SAID này có tác dụng ức chế
sự hình thành PG ở màng nhày dạ dày Tuy nhiên, salysilate, một chất kháng viêm thuộc nhóm này cũng có tác dụng ức chế sự sinh tổng hợp của PG nhưng lại không làm bào mòn màng nhày dạ dày như aspirin Lý do tại sao lại có sự khác nhau về cơ chế tác dụng giữa aspirin và salisylate là vấn đề chưa giải thích được [31]
6.1.2.Các chất kháng viêm có bản chất steroid
Steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc mang một vòng 4 cycloalkane Thuộc về nhóm chất này có các chất corticoid Chúng tác dụng thông qua ức chế enzyme phospholipases A2, là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa phospholipase A2 thành axit arachidonic N hư vậy, cuối cùng thì corticoid cũng
ức chế sự sinh tổng hợp của PG, TX và LT Các chất kháng viêm có bản chất sterod ức chế phospholipase A2 một cách gián tiếp thông qua việc giải phóng các chất ức chế protein có tên gọi là macrocortin, lipomodulin hay renocortin có khối lượng phân tử đạt khoảng 15, 30 và 40 kDa Đại diện nhóm chất này là lipocortin
đã được tinh sạch, thương mại và được xem là một trong những chất kháng viêm mạnh [31] Các chất có bản chất steroid thường là phối tử của thụ thể glucocorticoid
6.1.3 Các chất khác
Thuộc về nhóm này có vàng và colchicine Trong trường hợp của colchichine, chất này ức chế sự hình thành tinh thể urate trong khớp của bệnh nhân gout thông qua việc làm giảm sự tiết các chất chemotaxis của bạch cầu đa nhân và giải phóng enzyme lysosom Colchicine có tác dụng ức chế đặc hiệu sự giải phóng một glycoprotein có trọng lượng phân tử 8400 Da Đây là một chất chemotaxis của
