Thiết kế vector biểu hiện bước đầu định hướng biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---o0o--- LUẬN VĂN THẠC SĨ THIẾT KẾ VECT

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-o0o -

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN BƯỚC ĐẦU ĐỊNH HƯỚNG BIỆT HÓA

TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN THÀNH TẾ BÀO GAN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng – Trưởng

Phòng Hệ gen học chức năng - Viện Nghiên cứu hệ gen, người thầy - người anh

đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những

khó khăn cùng em trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến TS Nguyễn Văn Hạnh và Ths

Vi Đại Lâm, cán bộ Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ sinh học đã luôn

theo sát giúp đỡ và chỉ bảo cho em trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm

Qua đây, em cũng rất biết ơn tất cả các cô, các chị thuộc Phòng Hệ gen học

chức năng và Phòng Công nghệ phôi đã chỉ bảo em rất nhiều điều trong thời

gian thực hiện viết luận văn tốt nghiệp

Em cũng chân thành cảm ơn các thầy, các cô giáo tham gia giảng dạy

tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt hai năm

học qua

Cuối cùng, em xin gửi những lời tri ân tới bố mẹ, những người thân

trong gia đình và bạn bè xung quanh đã chia sẻ những khó khăn thử thách

trong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Lê Bắc Việt

Trang 3

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU vii

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1 TẾ BÀO GỐC 4

1.1 Định nghĩa tế bào gốc 4

1.2 Các đặc tính của tế bào gốc 4

1.3 Phân loại tế bào gốc 4

1.3.1 Phân loại tế bào gốc theo khả năng biệt hóa 5

1.3.2 Phân loại tế bào gốc theo vị trí thu nhận 5

1.3.3 Phân loại khác 7

1.4 Lợi ích của tế bào gốc dây rốn so với các nguồn tế bào khác 8

1.5 Tế bào gốc trung mô (TBGTM) phân lập từ lớp Wharton-Jelly (WJ) dây rốn (hWJSCs-human Wharton-Jelly Stem Cells) 9

1.5.1 Cấu tạo dây rốn 9

1.5.2 Các nghiên cứu về phương pháp phân lập, nuôi và biệt hóa hWJSCs 10

1.5.2.1 Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi cấy hWJSCs 10

1.5.2.2 Các nghiên cứu về biệt hóa hWJSCs 12

1.5.3 Các chỉ thị phân tử của hWJSCs 14

1.5.4 Tính ổn định di truyền của TBG và phương pháp xác định tính ổn định di truyền 14

1.6 Biệt hóa tế bào gốc bằng chuyển gen 15

1.6.1 Gen HNF-4α 16

Trang 4

1.6.2 Biệt hóa tế bào gốc trung mô bằng chuyển gen 17

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1 Nguyên liệu 20

2.1.2 Thiết bị 20

2.1.3 Hóa chất 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Thu nhận và xử lý dây cuống rốn 22

2.2.2 Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn 24

2.2.2.1 Phương pháp phân lập tế bào 24

2.2.2.2 Phương pháp cấy chuyển tế bào 24

2.2.2.3 Phương pháp nhuộm sắc thể 25

2.2.3 Tách chiết RNA tổng số 25

2.2.4 Định lượng RNA trong mẫu tách chiết 26

2.2.5 Điện di trên gel agarose 27

2.2.6 Khuếch đại trình tự mã hóa (CDS) của gen HNF-4α bằng RT-PCR 28

2.2.7 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 29

2.2.8 Nhân dòng trình tự mã hóa của gen HNF-4α và đọc trình tự 30

2.2.9 Biến nạp vào tế bào E.coli DH5α 31

2.2.10 Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện trong TBGTM 32

2.2.11 Nhiễm (transfection) vector tái tổ hợp vào TBGTM cuống rốn 33

2.2.12 Kiểm tra khả năng biểu hiện của các chỉ thị trong tế bào gốc 33

Trang 5

PHẦN III KẾT QUẢ VÀO THẢO LUẬN 34

3.1 Phân lập và nuôi cấy tế bào 34

3.2 Phân tích nhiễm sắc thể TBGTM 37

3.3 Tách chiết RNA tổng số 39

3.4 Định lượng RNA tổng số 40

3.5 Đánh giá đặc tính di truyền của TBGTM sau phân lập bằng RT-PCR 41

3.6 Khuếch đại trình tự mã hóa (CDS) của gen HNF-4α 45

3.7 Nhân dòng trình tự mã hóa của gen HNF-4α và đọc trình tự 47

3.7.1 Nhân dòng trình tự mã hóa của gen HNF-4α 47

3.7.2 Kết quả phân tích trình tự gen 49

3.8 Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện trong TBGTM 50

3.9 Đánh giá hiệu quả của quá trình chuyển gen 51

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

4.1 Kết luận 55

4.2 Kiến nghị 55

PHẦN V TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 61

Trang 6

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

cDNA Complement deoxyribonucleic acid

bFGF Basic fibroblast growth factor

CHT Collagenase / hyaluronidase trypsin

DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham 12 medium dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate

EGF Epidermal growth factor

FBS Fetal bovine serum

HSC Hemapoietic stem cell

hWJSCs Tế bào gốc phân lập từ lớp Wharton’s jelly dây rốn người

IVF In vitro fertilization

ITS Insulin – transferin - selenium

ICSI Intracytop plasmide sperm injecti

TBGTM Tế bào gốc trung mô

RT – PCR Reverse-transcription Polymerase chain reaction

E.coli Escherichia coli

Taq Thermus aquaticus

UV Ultra violet (tia cực tím)

CDS Coding sequence (trình tự mã hóa)

OD Optical density (mật độ quang)

hUCM human Umbilical Cord Matrix

Trang 7

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU

Hình 1 Cấu tạo của dây rốn

Hình 2 Cấu trúc vector biểu hiện pCMV-GFP

Hình 3 Mẫu dây rốn trước khi xử lý

Hình 4 Phân lập mảnh mô dây rốn trên đĩa nuôi

Hình 5 Tế bào bắt đầu mọc từ đĩa nuôi không bổ sung FBS

Hình 6 Tế bào phát triển thành những mảng song song, cuộn xoắn và gối lên nhau

Hình 7 Tế bào mọc kín đĩa nuôi

Hình 8 Nhiễm sắc thể ở lần cấy chuyền thứ 2

Hình 9 Điện di đồ tách chiết RNA tổng số

Hình 10 Điện di đồ RT-PCR mẫu TBGTM sau phân lập (A) và đối chứng dương –

tế bào gốc ung thư gan (B)

Hình 11 Điện di đồ RT-PCR khuếch đại CDS của gen HNF-4α

Hình 12 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pTZ57R/T tái tổ hợp bằng EcoRI

Hình 13 Trình tự được đọc bằng mồi vector (T7 promoter và T7 terminator)

Hình 14 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pCMV-GFP tái tổ hợp bằng NheI và

EcoRI

Hình 15 Điện di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy 4 tuần sau chuyển gen

Bảng 1 Trình tự oligonucleotide các mồi được sử dụng

Bảng 2 Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại CDS gen HNF-4α

Bảng 3 Thành phần phản ứng gắn nhân dòng CDS gen HNF-4α

Bảng 4 Thành phần phản ứng cắt với enzyme NheI và EcoRI

Bảng 5 Kết quả đo mật độ quang (OD) của các mẫu RNA tách chiết

Bảng 6 Thống kê biểu hiện của các chỉ thị phân tử trong tế bào gốc

Bảng 7 Sự biểu hiện của các chỉ thị phân tử trong TBGTM sau các lần cấy chuyền

Trang 8

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc (TBG) là tế bào tiềm năng trong cơ thể Khả năng biệt hóa cho phép TBG có thể phân chia phát triển thành tất cả các loại tế bào chuyên hóa Với đặc điểm này, TBG có thể được khai thác với nhiều ứng dụng

Nhiều nghiên cứu ứng dụng TBG trong lĩnh vực y sinh học đã được thực hiện nhằm điều trị các bệnh nan y khác nhau như: tiểu đường, liệt do chấn thương tuỷ sống, suy tim do tổn thương cơ tim, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen… Đặc biệt, trong chuyên khoa huyết học, TBG có thể điều trị trên 70 loại bệnh lý huyết học khác nhau liên quan đến tổn thương cơ quan tạo máu, một số bệnh di truyền bẩm sinh về chuyển hoá và suy giảm miễn dịch, ung thư máu… TBG còn được sử dụng trong các chuyên ngành khác như: thẩm mỹ, trong nghiên cứu dược lý [39,40] Nói cách khác, TBG mở ra một hướng phát triển, biện pháp chữa trị mới với những căn bệnh đến giờ vẫn vô phương cứu chữa, thắp sáng hy vọng về tiềm năng y học của kỹ thuật tái sinh

Trước đây, nguồn TBG sử dụng cho các nghiên cứu chủ yếu là TBG phôi [1] Nhưng vì phải lấy các TBG này từ phôi cho nên phần lớn các Giáo hội công giáo và chính trị gia đã phản đối gay gắt vì cho rằng đây là vấn đề xâm phạm đến đạo đức, niềm tin tôn giáo [1] Để tìm hướng giải quyết mới cho vấn đề này, các nhà khoa học đã tìm ra TBG từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó có TBG từ người trưởng thành TBG trưởng thành là TBG đa năng, có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau Tuy nhiên, việc thu thập TBG gặp phải khó khăn khi lượng tế bào thu được rất ít, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe, già và khó biệt hóa [2] Người ta cũng đã tìm thấy một loại TBG đa năng trong dây rốn của trẻ sơ sinh (TBG nhũ nhi), đây được cho là một phát hiện quan trọng vì có thể thu thập TBG từ dây rốn - vốn được coi là một loại rác thải y tế [2]

Trang 9

TBG dây rốn cũng có đầy đủ tính chất của một TBG đa năng như TBG tủy xương (TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) [11] Hiệu quả ứng dụng trong lâm sàng cao hơn vì việc thu thập TBG dây rốn khá dễ dàng, an toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe của mẹ và con, có thể chủ động kiểm soát tình trạng nhiễm các bệnh truyền nhiễm như HIV, viêm gan B, viêm gan C qua việc xét nghiệm trước sinh đối với sản phụ,… (http://www.baomoi.com/Thai-phu-luu-y-Te-bao-goc-tu-day-ron-la-gia-tri-nhat/82/11092699.epi) Bên cạnh

đó, tế bào gốc có khả năng biệt hóa và khả năng tự làm mới Biệt hóa là khả năng tạo ra các tế bào chuyên hóa trong cơ thể trong khi tự làm mới là quá trình duy trì tính gốc không đổi qua các thế hệ tế bào [3][35] Nhờ đó, biệt hóa tế bào gốc thành các dạng tế bào chuyên hóa khác đang là hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng cao Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan

và ung thư gan [4,5] Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của quá trình biệt hóa thành từ TBGTM cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ hơn Bên cạnh những tác nhân môi trường trong các môi trường biệt hóa tế bào gốc như dexamethasone hay yếu tố sinh trưởng như FGF (fibroblast growth

factor) [41], một số yếu tố phiên mã, ví dụ như gen HNF-4α, cũng đang được

tập trung nghiên cứu Từ đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Thiết kế

vector biểu hiện bước đầu định hướng biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan” để hoàn thiện quy trình thiết kế vector biểu hiện và chuyển vector vào

tế bào gốc cuống rốn bước đầu biệt hóa thành tế bào gan phục vụ cho các nghiên cứu sau này Để hoàn thành được đề tài này, chúng tôi cần thực hiện những mục tiêu như sau:

1 Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mẫu cuống rốn

2 Nhân dòng trình tự mã hóa gen HNF-4α ở người và tái tổ hợp trong

vector biểu hiện trong tế bào động vật

Trang 10

3 Kiểm tra khả năng biểu hiện của HNF-4α trong TGBTM sau chuyển

gen

Cuối cùng, nghiên cứu được thực hiện trích kinh phí từ đề tài “Derivation

of hepatocyte-like cells from human umbilical cord matrix stem cell by HNF-4α transfection” do quỹ TWAS, và đề tài nghiên cứu cơ sở cấp cho TS Nguyễn

Văn Hạnh.

Trang 11

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2 Các đặc tính của tế bào gốc

TBG có hai đặc tính chính:

Tính tự làm mới (self_renewal): Tế bào đó có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kì phân bào nguyên nhiễm, mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa

Tính tiềm năng không giới hạn (unlimited potency): TBG có khả năng biệt hóa thành bất kì kiểu tế bào trưởng thành nào, trên thực tế đặc tính này chỉ đúng với các tế bào gốc toàn năng hoặc vạn năng, tuy nhiên một TBG đa năng (hay tế bào tiền thân) cũng nhiều khi được gọi là TBG

1.3 Phân loại tế bào gốc

Dựa vào các tiêu chí khác nhau mà có những cách phân loại TBG khác nhau

Trang 12

1.3.1 Phân loại tế bào gốc theo khả năng biệt hóa

TBG toàn năng (totipotential stem cell): chúng có tiềm năng cao nhất vì

có thể biệt hóa thành tất cả các tế bào của cơ thể TBG toàn năng là hợp tử hay

blastomere (phôi bào)

TBG vạn năng (pluripotential stem cell): là những tế bào có khả năng biệt hóa thành hầu hết các mô của cơ thể, tiềm năng biệt hóa kém hơn TBG toàn năng, có thể biệt hóa thành tất cả các tế bào ngoại trừ tế bào phôi (TBG toàn năng) TBG vạn năng là khối tế bào bên trong của blastocyst

TBG đa năng (mutipotential stem cell): dùng để chỉ những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều tế bào khác, thường là những TBG thu nhận từ cơ thể trưởng thành, TBG nhũ nhi cũng là những TBG đa năng

Ngoài ra, còn có một số TBG một vài tiềm năng, cũng như đơn năng Ví dụ: TBG tủy xương tạo ra các loại tế bào máu và cơ chất dưỡng bào (Mast cell precursor) chỉ cho ra dưỡng bào

1.3.2 Phân loại tế bào gốc theo vị trí thu nhận

Theo quan điểm của các nhà khoa học Shinya Yamanaka (Đại học Kyoto của Nhật) và James Thompson (Đại học Wisconsin của Mĩ), TBG được chia thành năm nhóm chính:

1 TBG phôi (ES - Embryonic stem cell )

ES là TBG thu nhận từ phôi giai đoạn tiền làm tổ - Blastocyst, hầu hết là các TBG vạn năng Có thể thu nhận ES từ lớp sinh khối bên trong (ICM), các tế bào mặt trong của lớp dưỡng bào trophoblast, các tế bào mầm sinh dục (EG) và gần đây, người ta còn tiến hành thu nhận các TBG từ phôi sớm (trước blastocyst) Việc thu nhận TBG từ phôi ít nhiều sẽ gặp khó khăn vì liên quan đến vấn đề về luân lý và pháp lý (phôi người)

Trang 13

Nguồn phôi cho thu nhận TBG hiện tại chủ yếu từ công nghệ IVF hay ICSI Bằng một trong hai kỹ thuật này, từ các tinh trùngvà trứng, phôi được nuôi, ủ rồi thu nhận TBG ở giai đoạn cần thiết TBG phôi cũng có thể thu được

từ phôi chuyển nhân, chuyển gen, hay phôi tạo dòng hoặc nhân bản

2 TBG nhũ nhi

TBG nhũ nhi thường được thu nhận từ các mô của thai bỏ, hay các phần phụ của thai nhi sau khi sinh như máu dây rốn, dây rốn (màng lót quanh mạch máu, lớp Wharton’s jelly (lớp WJ), màng lót dây rốn), nước ối,

mô nhau thai, máu nhau thai [7,8,9]

Nguồn TBG thu từ những phần bỏ sau khi sinh như máu dây rốn, dây rốn, nước ối hay nhau thai chủ yếu là các TBG tạo máu và các TBG trung

mô (TBGTM) Các TBG nhũ nhi thường có tiềm năng biệt hóa ở mức độ đa năng hay vài tiềm năng, hoặc là các tế bào tiền thân

4 TBG vạn năng cảm ứng (iPS – TBG vạn năng cảm ứng)

Đây là loại TBG do chính con người tạo ra, nhờ kỹ thuật thao tác gen Về nguyên tắc, bất kì tế bào sinh dưỡng (somatic cell) nào đều có thể trở thành iPS,

nhờ chúng được cảm ứng bằng phương pháp chuyển gen in vitro, thông qua một

Trang 14

vector retrovirus Khi được kích hoạt, các tế bào sinh dưỡng sẽ khởi động cơ chế tái thiết lập chương trình bộ gen hay sự khử biệt hóa

iPS có các ưu điểm hơn hẳn TBG phôi và TBG trưởng thành như: Có tiềm năng như là các TBG phôi, không vi phạm đạo lý và pháp lý, dễ dàng thu nhận (có thể tạo ra từ bất kì mô nào đó của cơ thể), thao tác dễ dàng, ít tốn thời gian, không cần lượng mẫu lớn trên bệnh nhân, cấy ghép không gây phản ứng miễn dịch

Việc cảm ứng tế bào đã biệt hóa thành TBG được thực hiện bằng các phương pháp như sử dụng dịch chiết hay dung hợp tế bào, kĩ thuật chuyển gen

5 TBG ung thư (CSC)

Được coi là nguồn gốc của khối u và chúng chỉ có trong các khối u Các CSC có khả năng tự làm mới và dễ dàng phát triển thành bất kì tế bào nào của quần thể khối u, chúng có khả năng tăng sinh, hỗ trợ sự tăng sinh tiếp tục của quần thể tế bào ác tính Các đặc tính của tế bào phát sinh khối u có hai đặc tính song hành với hai đặc tính của TBG bình thường

Các CSC được tạo ra bởi các đột biến từ các TBG bình thường Tuy nhiên, môt vài dòng cho thấy rằng CSC cũng tạo ra từ các tế bào tiền thân bị đột biến [36] Các tế bào tiền thân này (cũng còn gọi là các tế bào khuếch đại chuyển – TAC) có thể có khả năng khuếch đại nhưng chúng lại không có khả năng tự làm mới như TBG [37] Để tạo thành CSC, tế bào tiền thân phải có sự tích tụ các đột biến gây nên sự lặp lại, tạo đặc tính làm mới

1.3.3 Phân loại khác

TBG còn có thể chia theo các nhóm sau đây:

TBG phôi (Embryonic stem cell _ES): được thu nhận từ giai đoạn của phôi nang (blastocyst) chúng là khối các tế bào bên trong, còn gọi là lớp sinh

Trang 15

khối bên trong (inner mass cell_ICM) của phôi nang TBG phôi có khả năng phân chia vô hạn trong nuôi cấy và biệt hóa thành các tế bào khác nhau từ ba lớp phôi Do vậy, đây là nhóm tế bào vạn năng (pluri potential stem cell) [11]

Tế bào mầm (tế bào gốc sinh dục - Embryonic germ cell_EG): được thu nhận từ rãnh sinh dục (genital ridge), chúng có tính vạn năng (pluripotent) Các

EG có một số khác biệt so với tế bào ES, các tế baò này được thu nhận tại vị trí

là tiền thân của cơ quan sinh dục sau này [11][34]

TBG ung thư biểu mô phôi (Embryonic carcinoma_EC): có bản chất giống như các TBG phôi, được thu nhận đầu tiên từ khối u trong tinh hoàn và buồng trứng ở một số chủng chuột EC có thể biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác [11][34]

TBG trưởng thành: là loại tế bào chưa chuyên hóa, chúng được tìm thấy hầu hết ở những mô chuyên biệt trong cơ thể trưởng thành (trong tủy xương, máu, giác mạc, võng mạc, tủy răng, gan, da, dạ dày và tụy…) Các tế bào này có thể tự đổi mới và biệt hóa thành những tế bào chuyên biệt [11][34]

1.4 Lợi ích của tế bào gốc dây rốn so với các nguồn tế bào khác

Hiện nay, các nhà khoa học chứng minh rằng dây rốn là nguồn cung cấp TBG lý tưởng nhất, sỡ dĩ như vậy vì TBG này có rất nhiều ưu điểm vượt trội [1]:

1 Dễ thu nhận và xử lý TBG, không gây bất kỳ ảnh hưởng gì đến sức khỏe của cả mẹ và con Thu hoạch và cất giữ tế bào gốc dây rốn không vi phạm đạo đức như TBG phôi

2 Có thể chủ động kiểm soát tình trạng các bệnh truyền nhiễm như HIV, viêm gan B, viêm gan C… đối với các mẫu TBG bằng các xét nghiệm trước sinh đối với sản phụ

3 Về phương diện tuổi phát triển, TBG dây rốn là TBG nhũ nhi, còn rất trẻ nên khả năng phân chia tốt và số lượng tế bào thu được trực tiếp hoặc sau tăng

Trang 16

sinh in vitro là rất lớn Các TBG dây rốn không còn là các TBG phôi do vậy

không còn khả năng tạo ra khối u ác tính như TBG phôi Đồng thời có thể thu được nhiều loại TBG bao gồm các TBG trong máu dây rốn (chứa nhiều TBG tạo máu) và các TBGTM và TBG biểu mô từ màng dây rốn, lớp WJ

4 TBG từ dây rốn có thể lưu trữ lâu dài để sử dụng điều trị cho chính người

có dây rốn ấy hoặc người thân trong gia đình họ hoặc cho người khác Xác định trước được kháng nguyên bạch cầu người (human leukocyte antigen– HLA) và các đặc điểm khác của mẫu TBG từ trước để họ xem có phù hợp với người bệnh cần điều trị bằng TBG hay không, từ đó có thể lấy ngay ra để sử dụng cho điều trị mà không mất thời gian tìm kiếm và xét nghiệm cho tế bào

5 Các TBG thu được từ dây rốn và nhau thai biểu hiện HLA ở mức thấp và

ít bị đào thải trong cấy ghép Đây là nguồn TBG quan trọng trong việc thay thế tủy xương khi không thể tìm được người cho có HLA phù hợp

Cuối cùng, có thể nhận thấy dây rốn là nguồn TBG lý tưởng xét về khả năng biệt hóa TBG dây rốn thuộc loại đa tiềm năng, chúng có thể biệt hóa thành các loại tế bào như : tế bào máu, tế bào xương, tế bào cơ tim, tế bào sụn, tế bào mỡ,

tế bào gan,…[3]

1.5 Tế bào gốc trung mô (TBGTM) phân lập từ lớp Wharton-Jelly (WJ) dây rốn (hWJSCs-human Wharton-Jelly Stem Cells)

1.5.1 Cấu tạo dây rốn

Dây rốn là đoạn kết nối giữa rốn của thai nhi và nhau thai bám ở thành tử cung của người mẹ, có vai trò là cầu nối giữa người mẹ và em bé để vận chuyển chất dinh dưỡng từ người mẹ chuyển qua đứa trẻ

Dây rốn thường có chiều dài 50 cm và dày 2 cm, có một tĩnh mạch và hai động mạch bao quanh bởi các mô nhầy hay gelatin, còn gọi là lớp WJ và được bọc bởi màng ối Có thể xác định ba vùng khác nhau của lớp WJ: vùng dưới

Trang 17

màng ối, chất nền Wharton, và lớp mô bao quanh các mạch máu Vùng chất nền Wharton gồm các phân tử collagen loại I, III, VI nằm ở trong những khoảng không gian có hình dạng giống như rãnh Xung quanh rãnh này là các phân tử collagen loại VI, laminin và heparin sulfate proteoglycan Các khoảng không gian chứa đầy chất nền Wharton có dạng rãnh được bao quanh bởi các tế bào chất nền là các nguyên bào sợi cơ mảnh có dạng ống biểu hiện vimentin, desmin

và actin cơ trơn Dây rốn giai đoạn sớm chỉ có vimentin và desmin Cấu trúc và thành phần của dây rốn giúp bảo vệ các mạch máu khỏi bị nén và cũng có thể

hỗ trợ quá trình trao đổi giữa máu dây rốn và dịch ối (hình 1)

Hình 1 Cấu tạo của dây rốn

Các nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng dây rốn là một nguồn giàu TBG Có hai loại TBG đã được xác định trong dây rốn: TBGTM từ lớp WJ, tĩnh mạch, các vùng xung quanh và giữa các động mạch, vùng dưới màng ối và máu của dây rốn; TBG tạo máu từ máu dây rốn [8]

1.5.2 Các nghiên cứu về phương pháp phân lập, nuôi và biệt hóa hWJSCs 1.5.2.1 Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi cấy hWJSCs

Với mục đích nghiên cứu là phát triển các phương pháp thích hợp nhất để phân lập TBGTM có nguồn gốc từ dây rốn người (hUCM-human umbilical cord

Trang 18

matrix) Parvin Salehinejad và cộng sự đã thực hiện bốn nhóm phương pháp để

collagenase/hyaluronidase/trypsin (CHT), collagenase/trypsin (CT) và trypsin (Trp) và một nhóm nuôi cấy mảnh mô nhỏ (Exp) Ở cả bốn nhóm, đều phân lập được các tế bào hUCM nhưng số lượng tế bào, khả năng tăng sinh, sự biểu hiện các chỉ thị… của các tế bào bị cô lập ở các phương pháp là khác nhau

Phân tích Flow cytometry (dòng tế bào) cho thấy CD44, CD73, CD90 và

CD105 được thể hiện trong tất cả các nhóm, trong khi CD34 và CD45 không

được thể hiện Các chỉ thị của TBGTM như CD73, CD90 được biểu hiện khác nhau trong các nhóm khác nhau: CD90 biểu hiện cao nhất ở nhóm CT và Exp;

CD73 biểu hiện cao nhất ở nhóm Exp

Về khả năng tăng sinh, nhóm Exp có khả năng tăng sinh cao nhất Với các nhóm enzyme, các tế bào không tiếp tục tăng sinh sau khoảng 30 ngày nuôi cấy, nhưng ở nhóm Exp, tế bào có thể kéo dài thời gian tăng sinh tới 80 ngày

Về thời gian phân lập, chỉ sau 2 – 3 tiếng đồng hồ đã có thể phân lập được TBG ở phương pháp enzyme, trong khi đó phương pháp Exp phải mất đến

2 – 3 tuần mới quan sát thấy có tế bào mọc ra Số lượng tế bào ban đầu thu được nhiều nhất ở nhóm CT (0,5-1 × 104 tế bào/cm lớp WJ), ít hơn ở CHT (0,25 ×

104 tế bào/cm lớp WJ), và ít nhất ở nhóm Trp (1 × 103 tế bào/cm lớp WJ)

Hình thái tế bào giữa nhóm phân lập bằng enzyme và phân lập bằng nuôi cấy mảnh mô cũng có sự khác nhau Quần thể tế bào trong nhóm Exp có tính đồng nhất cao với các tế bào giống nguyện bào sợi chiếm ưu thế Ở phương pháp enzyme, quần thể tế bào không đồng nhất, gồm các tế bào giống nguyên bào sợi với độ dài, ngắn khác nhau và cả các tế bào tròn nhỏ

Trang 19

Kết quả ở nghiên cứu trên cho thấy, phương pháp Exp tốn nhiều thời gian nhưng hiệu quả phân lập TBG là cao nhất Đối với phân lập bằng enzyme, tùy vào mục đích phân lập để lựa chọn hỗn hợp enzyme thích hợp

1.5.2.2 Các nghiên cứu về biệt hóa hWJSCs

Như đã nói ở trên, TBG từ dây rốn nói chung và hWJSCs có rất nhiều ưu điểm, hiệu quả cao trong ứng dụng trong lâm sàng, vì vậy đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng biệt hóa đa dòng của hWJSCs

Năm 2009, tạp chí Cytotherapy (tạp chí chính thức của Hiệp hội quốc tế

về liệu pháp tế bào) cho biết nhóm nghiên cứu thuộc đại học Shantou, Quảng

Đông, Trung Quốc tiến hành cảm ứng TBGTM để biệt hóa thành các tế bào

giống tế bào gan bằng cách bổ sung yếu tố tăng trưởng tế bào gan (HGF) và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi - 4 (FGF - 4) trong quá trình nuôi cấy

Phân tích reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) đã được thực hiện để xác định biểu hiện mRNA của của ba chỉ thị tế bào gan: ALB, AFP và CK-18 Kết quả cả 3 chỉ thị trên đều biểu hiện Western blot cũng được sử dụng để khẳng định cho kết quả này Phân tích Flow cytometry cho

thấy hWJSCs dương tính với các dấu hiệu TBGTM (CD105, CD90, CD73,

CD29, CD44, CD59) và không biểu hiện các chỉ thị CD45, CD34 Phương pháp

nhuộm PAS (Periodic acid–Schiff) và khảo nghiệm hấp thu LDL (Low-density lipoprotein) cũng được thực hiện để đánh giá khả năng lưu giữ glycogen và hấp thu lipoprotein của tế bào biệt hóa Kết quả cho thấy các tế bào nhuộm màu đỏ tươi với tỷ lệ phần trăm là 82,9%, tế bào có thể hấp thu LDL với tỷ lệ cao 85,8% [12]

Như vậy, hWJSCs đã được biệt hóa thành công thành tế bào có chức

năng và đặc điểm sinh học giống tế bào gan trong điều kiện in vitro

Trang 20

Trong nghiên cứu của mình, Ariff Bongso và Chui-Yee Fong đã thiết lập một số quy trình biệt hóa thành tế bào xương, tế bào cơ tim, tế bào mỡ và tế bào sụn [11,13,14,15]:

Biệt hóa tế bào xương: Cấy chuyền tế bào đến lần 2 và ủ trong môi trường tạo xương: DMEM – LG chứa 10% FBS, 50 µg/ml ascorbate -2 phosphate, 10-8 M dexamethasone vào 10 mM β – glycerophosphat Môi trường biệt hóa được thay ba ngày một lần, các tế bào sau khi biệt hóa hoàn toàn (dựa vào hình dạng), tiến hành nhuộm hóa mô hay hóa mô miễn dịch [41]

Biệt hóa tế bào cơ tim: Xử lí với 5 – azacytidine, ủ các TBGTM 24 giờ trong môi trường DMEM 3 μM 5 – azacytidine Chuyển sang môi trường DMEM 10% FBS để ngăn cản sự chết tế bào do sự tiếp xúc quá lâu của 5 – azacytidine Duy trì tế bào ở môi trường DMEM 10% FBS từ

3 ngày đến 5 tuần Để có được môi trường điều kiện tế bào cơ tim, phải chuẩn bị bằng cách nuôi cấy tế bào cơ tim chuột 7 ngày tuổi trong môi trường DMEM với 4,5 g/l glucose, và 10% FBS trong khoảng 72 giờ, môi trường được thu nhận và li tâm khoảng 800 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, cuối cùng dịch nổi được lọc để sử dụng như môi trường điều kiện cho TBGTM

Biệt hóa tế bào tạo sụn: Cấy chuyền tế bào 2 lần và ủ trong môi trường tạo sụn: DMEM-LG không huyết thanh có 1x insulin – transferin – selenium (IST) + premix (Gibco), 10 ng/ml transforiming growth factor (TGF) (Peprotech) [38]

Biệt hóa tạo mỡ: Cấy chuyền tế bào đến lầm 2 và ủ ấm trong môi trường tạo mỡ (DMEM và 1g/l glucose) chứa 10% FBS, 50 μg/ml ascorbate – 1 phosphate, 10 -7 M dexame thasone và 50 μg/ml indo methacin [41]

Trang 21

1.5.3 Các chỉ thị phân tử của hWJSCs

hWJSCs biểu hiện các chỉ thị của TBG, gồm chỉ thị của các loại tế bào

ES, EG, các tế bào tiền chất thần kinh hay TBG thần kinh, biểu hiện actin và vimentin cơ trơn, các chỉ thị cho nguyên bào sợi cơ, nestin, enolase chuyên biệt thần kinh (NSE) và protein sợi thần kinh đệm (glia Fibrillary xitic protein – IGFAP), c-kit, oct-4, Tra-1,60; biểu hiện các mức thấp của telomerase và cũng hình thành các cấu trúc tương tự các thể phôi khi nuôi cấy [11]

Qua phân tích bằng Flow cytometry, người ta thấy chúng có biểu hiện

mức cao các chỉ thị chất nền (CD44, CD105), chỉ thị integrin (CD29-CD51) và chỉ thị TBGTM như: CD105 (SH2), CD73 (SH3, SH4), CD90 nhưng không biểu hiện các chỉ thị của dòng tạo máu (CD34, CD45) Chúng có khả năng tăng sinh in vitro mạnh, và có thể cảm ứng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác: Đó

là các tế bào cơ tim (cardiomyocyte) bằng cách xử lý với 5 – azacytidine hay nuôi các TBG đó trong môi trường cơ tim, kết quả được chứng nhận là thành công khi chúng biểu biểu hiện các chỉ thị tế bào cơ tim là N – cadtherin và troponi tim I hWJSCs còn có thể biệt hóa thành các tế bào mỡ, sụn và xương bằng các yếu tố biệt hóa phù hợp [11,16]

1.5.4 Tính ổn định di truyền của TBG và phương pháp xác định tính ổn định di truyền

Trong điều kiện nuôi cấy in vitro các tế bào lắng xuống đáy bình, bám

vào bề mặt đáy để sinh trưởng và sinh sản bằng phân bào, như vậy mặt tiếp xúc coi như điều kiện cần thiết cho tế bào sinh sản Chúng thường phát triển thành lớp tế bào trật tự cho tới khi bám hết giá thể chúng ngừng sinh sản và không di động được do lực ức chế tiếp xúc bề mặt Trái lại tế bào ung thư có thể phát triển và sinh sản trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng sệt hoặc dạng huyền phù

và tạo thành các quần thể tế bào vô trật tự hoặc nhiều lớp chồng lên nhau trên

Trang 22

giá thể Điều đặc biệt là các tế bào ung thư không chịu tác động của lực ức chế tiếp xúc, chúng có thể di động chiếm một không gian nào đó cho đến khi chúng

ngừng sinh sản Như vậy, in vivo cũng như in vitro tế bào lành của các mô chịu

tác động của lực ức chế tiếp xúc cũng như lực định vị, trái lại tế bào ung thư không chịu tác động của các lực đó Điều này có thể là do thay đổi trong tính di truyền cũng như trong cấu trúc và tính chất của màng sinh chất của các tế bào ung thư đặc biệt là trong cấu trúc của các receptor màng đóng vai trò nhận biết

và đánh dấu Do đó, có thể quan sát hình thái và độ bám dính để đánh giá tính

ổn định di truyền trong quá trình tăng trưởng của TBG

Về bộ máy di truyền, có sự khác biệt giữa tế bào lành và tế bào ung thư:

tế bào lành thường giữ bộ thể nhiễm sắc ổn định là 2n, trong khi đó các tế bào ung thư thường có bộ thể nhiễm sắc dị bội (heteroploide) với các sai lệch rất đa dạng về số lượng và cấu trúc Hình thái nhiễm sắc của tế bào nhân chuẩn quan sát được ở trung kỳ nguyên phân thường có dạng hình chấm hoặc hình que và thường có kích thước vào khoảng 0,2 – 3 μm đường kính và 0,2 – 50 μm chiều dài Tuy nhiên ở các mô khác nhau của cùng một cơ thể, có thể biến đổi hình dạng và kích thước để thích nghi với chức năng của một giai đoạn phát triển Nhiễm sắc thể ở người, cái bé nhất là nhiễm sắc thể số 21 và 22 có kích thước L

= 1,5 μm; còn chiếc lớn nhất là nhiễm sắc thể số 1 có L = 10 μm Nhuộm nhiễm sắc thể với thuốc nhuộm Giemsa và quan sát hình thái, đếm số lượng của nhiễm sắc thể cũng là một phương pháp đánh giá tính ổn định di truyền thường được

sử dụng

Tế bào lành còn khác biệt với tế bào ung thư trong nhiều đặc tính sinh lý khác như chỉ số mitos (số tế bào đang phân bào trên 1000 tế bào quan sát được với kính hiển vi thường), phân bào có hạn định nếu môi trường nuôi cấy được cấy chuyền đổi mới…[17]

1.6 Biệt hóa tế bào gốc bằng chuyển gen

Trang 23

1.6.1 Gen HNF-4α

Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân xơ gan và ung thư gan [4,5] Đặc biệt, năm 2010, Ren và cộng sự đã công bố nghiên cứu phân lập tế bào TBGTM từ cuống rốn và tiến hành biệt hóa thành tế bào gan [18] Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của quá trình biệt hóa thành từ TBGTM cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ hơn Bên cạnh những tác nhân môi trường trong các môi trường biệt hóa tế bào gốc như dexamethasone hay yếu tố sinh trưởng như FGF (fibroblast growth factor), một số yếu tố phiên

mã, ví dụ như gen HNF-4α, cũng đang được tập trung nghiên cứu.

Hepatocyte nuclear factor 4 (HNF-4) được xác định có nguồn gốc từ hoạt tính trong dịch chiết thô từ gan chuột, nó gắn với các DNA cần thiết cho quá trình phiên mã của 2 gen đặc trưng cho gan là transthyretin (TTR) và apolipoprotein C3 (APOC3) Sau quá trình nhân dòng và tinh sạch protein, HNF4 được phát hiện như một thành viên của siêu họ receptor trong nhân NR2A1 thuộc những yếu tố phiên mã ligand-dependent [19] HNF-4 là một trong những receptor thuộc nhân tế bào có tính bảo thủ rất cao và được tìm thấy trong hầu hết cơ thể động vật, từ động vật biển cho đến cơ thể người [20]

Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF-4α) là một receptor trong nhân tế

bào được mã hóa bởi gen HNF-4α [21,22], đồng thời cũng là gen đầu tiên thuộc nhóm HNF-4 được tìm thấy, nó cư trú trên nhiễm sắc thể 20q13.1-13.2 Về mặt cấu trúc, gen HNF-4α bao gồm tất cả 10 exon và 9 intron, đặc biệt nó chứa 2 promoter P1 và P2 Về mặt kích thước, HNF-4α cố độ lớn lên tới hơn 70 kb

(hg19 chr20:43,029,924-43,060,029), trong đó trình tự không mã hóa intron chiếm đến gần 98%, còn lại 10 exon chỉ có độ dài 1339 bp mã hóa cho 442 axit amin [23] Protein HNF-4α được biểu hiện ở trong gan, thận, ruột non, ruột kết

Trang 24

và tuyến tụy, trong đó biểu hiện trong gan chiếm đa số [24] Đặc trưng biểu hiện của HNF-4α có thể tham khảo tại địa chỉ Nuclear Receptor Atlas (NURSA)

Là một thành viên trong nhóm HNF-4 nên HNF-4α cũng là một yếu tố

phiên mã liên kết với DNA cần thiết cho quá trình phiên mã cho các gen đặc trưng Protein được mã hóa bởi gen này kiểm soát sự biểu hiện của khoảng 100 gen trong đó có hepatocyte factor 1-alpha, một yếu tố phiên mã điều hòa sự biểu hiện của một gen liên quan đến gan [25] Gen này đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của gan, thận, tuyến ruột HNF-4α đã được chứng minh có

thể hoạt động như một gen điều phối trong các tác nhân phiên mã trong quá trình định hướng biệt hóa thành tế bào gan [26] Những nghiên cứu này cho

thấy trong hệ thống nuôi cấy tế bào gốc, sự biểu hiện nâng cao của HNF-4α có

thể là một sự đảm bảo cho sự cảm ứng biệt hóa thành tế bào gan và các chức năng của tế bào giống như tế bào gan Nhờ đó, các tế bào có biểu hiện tổng hợp

HNF-4α sẽ kích hoạt các gen đặc hiệu định hướng tế bào gan và tăng cường

trạng thái biệt hóa của TBGTM [27] Về việc ứng dụng tác nhân HNF-4α để

biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan, cho đến nay vẫn chưa có một công bố chính thức nào trên toàn thế giới

1.6.2 Biệt hóa tế bào gốc trung mô bằng chuyển gen

Tế bào gốc trung mô thuộc nhóm tế bào gốc đa năng có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào trưởng thành có chức năng như tế bào tim, tế bào thần kinh, tế bào tủy xương, tế bào cơ, tế bào mỡ, tế bào gan… Hiện nay, trên thực

tế, để tiến hành biệt hóa tế bào gốc trung mô, bên cạnh những phương pháp khá phổ biến sử dụng tác nhân môi trường trong các môi trường biệt hóa tế bào gốc như dexamethasone hay yếu tố sinh trưởng như FGF (fibroblast growth factor)

[41], một số yếu tố phiên mã, trong đó có gen HNF-4α, cũng đang được tập

trung nghiên cứu Bản chất của phương pháp sử dụng yếu tố phiên mã trong biệt hóa tế bào gốc đó là đưa vùng mã hóa cDNA của yếu tố phiên mã này vào trong

Trang 25

tế bào gốc để thực hiện quá trình biểu hiện protein thông qua những dòng vector biểu hiện tế bào động vật Yếu tố phiên mã sau khi được biểu hiện trong tế bào

sẽ tham gia điều tiết biểu hiện của hàng loạt những gen khác có liên quan đến sự phát triển của tế bào chức năng đang được định hướng biệt hóa

Hình 2 Cấu trúc vector biểu hiện pCMV-GFP

Những vector được sử dụng chủ yếu trong việc biểu hiện ở tế bào động vật là vector adenovirus và một loạt những vector thuộc dòng vector pSV và pCMV Trong số những vector biểu hiện này, dòng vector pCMV được sử dụng phổ biến nhất do nó có promoter CMV (cytomegalovirus) có khả năng điều tiết biểu hiện trình tự mã hóa cDNA rất mạnh Trong nghiên cứu này, dựa theo những đặc điểm vùng promoter, terminator, vùng đa nhân dòng (multi cloning site) và các vị trí origin, chúng tôi đã sử dụng vector pCMV-GFP (hình 2) trong

việc chuyển cDNA của gen HNF-4α vào tế bào gốc định hướng biệt hóa thành

tế bào gan Vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai sẽ được nhân bản trong E.coli

Trang 26

thông qua pBR322 origin trước khi được cho nhiễm vào tế bào và được cho phép tái bản trong tế bào động vật nhờ SV40 origin

Trang 27

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Trong nghiên cứu này, những mẫu dây rốn được cung cấp bởi Phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Dây rốn được chọn thường có chiều dài hơn 7 cm và được thu nhận ngay sau khi em bé ra đời Trước khi thu dây rốn, các sản phụ được xét nghiệm không nhiễm các virus nguy hiểm như HIV, HBV, HCV, HPV, … Bên

cạnh đó, để phục vụ cho việc phân lập và chuyển vùng mã hóa của gen HNF-4α

vào tế bào gốc, những mẫu tế bào gan đảm bảo không bị nhiễm bất kì loại vi khuẩn hay virus nào được thu thập tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương, 43 Tràng Thi, Hà Nội Các mẫu cuống rốn và tế bào gan thu thập được đảm bảo về đạo đức ngành y với sự đồng ý từ những người hiến tặng và sự đảm bảo bảo mật danh tính người hiến tặng của nhà nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị

Tủ lạnh sâu (Vestfrost, Đan Mạch), Lò vi sóng (Sharp, Nhật Bản), Cân điện tử (Precisa, Thụy Sỹ), máy chu trình nhiệt PCR (Labnet Multigene Mini - Mỹ) và (Veriti® 96-Well Fast Thermal Cycler Life Technologies - Mỹ), Máy

chụp gel (BioRad, Mỹ), Tủ lạnh thường (Toshiba, Nhật Bản), Máy điện di (Mupid – 2plus, Nhật Bản), Máy li tâm nhanh (Picofuge, Mỹ), Máy ly tâm (Eppendorf - CHLB Đức), Tủ hút (Esco - Singapore), Bể ổn nhiệt (Memmert, Hàn Quốc), Máy đo quang phổ (SP-300 nano, Nhật Bản), Tủ nuôi CO2 (Sanyo, Nhật Bản), Buồng cấy vô trùng (Esco class II Bsc - Singapore), Tủ ấm (Ketong

- Trung Quốc), Máy lắc (Labtech - Hàn Quốc), Kính hiển vi điện tử (Nikon, Nhật Bản)

Trang 28

2.1.3 Hóa chất

Các hóa chất dùng cho tách chiết RNA và PCR phiên mã ngược (RT – PCR) được lấy từ bộ kit nhập từ hãng QIAGEN (Hà Lan) Bộ kit tách DNA plasmid và chuyển vector vào tế bào gốc lần lượt được cung cấp bởi hãng

cấy tế bào động vật: DMEM/F12 và DMEM glucose thấp, FBS (fetal bovine serum – huyết thanh bào thai bò), 5 EGF (epidermal growth factor), penicillin, streptomycin, ciprofloxacin Một số hóa chất dùng cho nhân dòng và biểu hiện

gen: E coli DH5α (CHLB Đức), vector tách dòng pZT57RT thuộc bộ kit InsTA

cloning (Thermo Scientific), vector biểu hiện trong tế bào động vật pCMV-GFP (Novagen, CHLB Đức), kháng sinh ampicillin (Biobasic, Canada), enzyme giới

hạn NheI và EcoRI (New England Biolabs, Anh Quốc), môi trường LB

(Biobasic, Canada) Mẫu tế bào ung thư gan HepG2 được sử dụng làm đối chứng dương trong nghiên cứu được lấy từ bộ kit chuyển gen thương mại cung cấp bởi hãng Altogen Biosystems (Mỹ)

Bên cạnh đó, dựa vào trình tự mã hóa của gen HNF-4α có sẵn trên ngân

hàng GeneBank, cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để sử dụng cho RT – PCR với

mồi xuôi có trình tự cắt của NheI và mồi ngược có trình tự cắt của EcoRI (Bảng

1) Đồng thời, các trình tự mồi sử dụng để đánh giá biểu hiện của các chỉ thị

phân tử của TBGTM, tế bào gan cũng như của chỉ thị HNF-4α sau chuyển gen

cũng được liệt kê ở bảng 1

Trang 29

Bảng 1 Trình tự oligonucleotide các mồi được sử dụng

Eras 5’ – GCAAGGTCCTGTAGGGAGAA – 3’ 5’ – GCAGCTTTGAAACCCAAAAC – 3’

Oct – 1 5’ – GCAACCCTGTTAGCTTGGTC – 3’ 5’ – CTCTCCTTTGCCCTCACAAC – 3’

GATA4 5’ – CCAGAGATTCTGCAACACGA – 3’ 5’ – ATTTTGGAGTGAGGGGTCTG – 3’ [28]

HNF-4α

(chỉ thị)

G6P 5’– GCTGGAGTCCTGTCAGGCATTGC –3’ 5’– TAGAGCTGAGGCGGAATGGGAG – 3’ [29]

ALB 5 – CCAGAAGACACCCTCCAAAGGAC – 3’ 5’ – AACGATGTGGAGTTCACGG – 3’ [29]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu nhận và xử lý dây cuống rốn

Sau khi sinh, dây rốn được thu thập và lưu trữ trong cốc vô trùng có chứa muối sinh lý ở 40C Thông thường các dây được xử lý trước 12 – 24 giờ sau khi sinh Đầu tiên, dây rốn được xử lý trong tủ cấy vô trùng Bề mặt của dây rốn được rửa với đệm PBS loại bỏ máu Đánh giá chiều dài của dây rốn, xử lý dây rốn trong đĩa petri dài 10cm (hình 3)

Trang 30

Hình 3 Mẫu dây rốn trước khi xử lý

Dây rốn được xử lý trong tủ cấy vô trùng, bề mặt của dây rốn được rửa với đệm

PBS loại bỏ máu

Tiếp theo, dây rốn được cắt thành các đoạn có kích thước dài 3 – 5 cm (dao

vô trùng), dùng dao và kẹp để cắt theo chiều dọc của đoạn mô, loại bỏ các mạch máu và rửa hết máu đoạn mô Dao và kẹp được sử dụng để cắt các các đoạn mô

đã được xử lí, làm sạch các mảnh nhỏ (kích thước 1- 2mm) (hình 4)

Hình 4 Phân lập mảnh mô dây rốn trên đĩa nuôi

Dùng dao và kẹp để cắt các các đoạn mô đã được xử lí thành mảnh nhỏ kích thước 1 – 2 mm

Trang 31

2.2.2 Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn

2.2.2.1 Phương pháp phân lập tế bào

- Bước 1: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Chuẩn bị 300 ml môi trường gồm: DMEM-F12 bổ sung 15% (v/v) huyết thanh thai bò (FBS), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF) nồng độ 10 ng/ml, yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) nồng

độ 10 ng/ml, Antibiotic 1%, L – glutamine 2 mM, 1x isulin – transferin – selenium (IST) Lọc môi trường bằng xilanh 50ml qua màng lọc, đựng môi trường trong lọ thủy tinh 50 ml Bảo quản ở 4°C

- Bước 2: Dùng panh gắp mảnh có đường kính xấp xỉ 2 mm được cấy lên bề mặt đĩa petri 4 giếng (kẹp vô trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn), mỗi giếng cấy từ 4 – 5 mảnh, cho vào tủ ấm CO2 trong 2 tiếng đồng hồ để các mảnh

mô bám vào bề mặt đĩa

- Bước 3: Sau 2 tiếng, cho môi trường vào đĩa, khoảng 500 ml mỗi giếng (chú ý nhẹ nhàng để các mảnh mô không bị nổi lên)

- Bước 4: Thực hiện thay môi trường 3 ngày 1 lần bằng cách hút bỏ môi trường

cũ và cho môi trường mới vào (thao tác hút, bỏ phải thật nhẹ nhàng để tránh tạo bọt và nổi mảnh mô)

- Bước 5: Trong thời gian này, thực hiện thay môi trường cách 3 ngày một lần cho đến khi quan sát thấy các tế bào di cư ra rìa mảnh mô và bao phủ bề mặt đĩa nuôi cấy 80% Sau đó sẽ thực hiện cấy chuyền

2.2.2.2 Phương pháp cấy chuyển tế bào

- Bước 1: Làm ấm Trypsin, môi trường nuôi cấy tế bào và PBS đến 37°C

- Bước 2: Hút bỏ môi trường cũ

- Bước 3: Cho Trypsin 0.25% vào giếng ngâm 5 phút

- Bước 4: Cho môi trường DMEM/F12 vào (tỉ lệ enzyme : môi trường là 1:1), dùng pipet sục cho tế bào bong lên hết

- Bước 5: Ly tâm 2000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi

Trang 32

- Bước 6: Cho môi trường vào, trộn thật nhẹ nhàng để hòa tan cặn

- Bước 7: Chia đều huyền phù tế bào sang các đĩa nuôi cấy mới

- Bước 8: Thêm môi trường vào các đĩa nuôi cấy sao cho đủ 2 ml mỗi đĩa nuôi cấy

2.2.2.3 Phương pháp nhuộm sắc thể

- Bước 1: Chọn lấy một giếng có 500μl DMEM/F12 10% FBS chứa tế bào

- Bước 2: Cho thêm 5 μl colchicine Stock/ 1 giếng trong 10 phút ở 390C

- Bước 3: Hút bỏ dung dịch trên, rửa lại bằng PBS 2 lần, hút hết PBS

- Bước 4: Cho vào 100 μl Trypsin 0,05%, ủ 5 phút ở 390C

- Bước 5: Trung hòa bằng 900 μl DMEM/F12 10% FBS

- Bước 6: Hút dung dịch và tế bào ra ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn

- Bước 7: Cho vào 9 ml môi trường nhược trương hypotonic, ủ 15 phút ở 37°C Sau đó hút bỏ môi trường nhược trương

- Bước 8: Cho vào 2ml môi trường cố định, để 15 phút trong ngăn đá tủ lạnh

- Bước 9: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút, hút bỏ môi trường cũ

- Bước 10: Thêm môi trường cố định mới, để 15 phút trong ngăn đá tủ lạnh

- Bước 11: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút, hút bỏ môi trường cũ

- Bước 12: Thêm môi trường cố định, làm tan hết cặn tế bào vào môi trường

cố định, nhỏ lên lam kính độ cao 50 cm Để qua đêm

- Bước 13: Nhuộm Giemsa 5% trong 15 phút, để ở nhiệt độ phòng Soi kết quả NST bắt màu trên kính hiển vi, chụp ảnh

2.2.3 Tách chiết RNA tổng số

Mẫu tế bào gan và tế bào gốc trung mô cuống rốn sau chuyển gen được tiến hành tách chiết RNA thông qua bộ kit Rneasy Mini của hãng QIAGEN (Hà Lan) Trong đó, đặc biệt với mẫu gan, trước khi tiến hành tách bằng kit, cần

Trang 33

được nghiền nhẹ nhàng trong dung dịch đệm PBS trước khi cho đi qua màng lọc đển thu dịch tế bào gan trên đĩa môi trường nuôi cấy Sau khi loại bỏ hết môi trường nuôi cấy, 350 µl dung dịch đệm RLT được đưa vào đĩa tế bào (6 cm) để phá vỡ tế bào Dùng dao nạo toàn bộ tế bào trên đĩa nuôi và hút toàn bộ dung dịch vào ống eppendorf Tiếp theo, 350 µl ethanol 70% được thêm vào dung dịch tế bào và trộn đều Sau đó, các bước tách chiết RNA được tiến hành theo các bước của nhà sản xuất Cuối cùng, RNA được hòa loãng bởi 50 µl dung dịch RNA free water và điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 0,8%

2.2.4 Định lƣợng RNA trong mẫu tách chiết

* Nguyên lí

Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ ánh sáng khác nhau của các bazơ nitơ

của phân tử RNA mạch kép và mạch đơn để xác định hàm lượng RNA trong dung dịch

Cách tiến hành: Dung dịch chứa RNA tổng số được đo quang phổ ở

bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260 nm – Optical Density) của các mẫu RNA cho phép xác định nồng độ RNA trong dung dịch Mỗi đơn vị OD ở bước sóng 260 nm kí hiệu là A260 nm

Khi đó, công thức chung tính nồng độ RNA tổng số:

C RNA (ng/µl)= A260 nm × 40 × độ pha loãng

Trong đó:

CRNA:nồng độ RNA tổng số (ng/µl)

A260 nm: mật độ quang ở bước sóng 260 nm

Ngoài ra, để xác định độ tinh sạch của dung dịch RNA cần đo giá trị A280

nm Do protein có phổ hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở

Trang 34

bước sóng 260 nm gây nên sự sai lệch khi tính nồng độ RNA Để đảm bảo sự chính xác nồng độ CRNA, giá trị A260 nm/A280 nm được chúng tôi sử dụng Khi giá trị

A260 nm/A280 nm = 1,8 - 2,0 thì RNA tổng số được coi là tinh sạch

*Cách tiến hành thí nghiệm: lấy 6 µl RNA tổng số pha loãng 100 lần thành 600 µl dung dịch Đem toàn bộ dung dịch đi đo quang phổ tại lần lượt 2 bước sóng 260 nm và 280 nm Từ những kết quả thu được sẽ tính toán được hàm lượng RNA trong mẫu cũng như độ tinh sạch của mẫu RNA tách chiết được

2.2.5 Điện di trên gel agarose

* Nguyên lí:

Điện di là kỹ thuật tách các phân tử dựa trên điện tích, kích thước và hình dạng của chúng trên gel Trong phương pháp điện di trên gel, các phân tử DNA/RNA có điện tích âm, được kéo qua một lớp gel bán lỏng nhờ một dòng điện về phía cực dương trong buồng điện di

Thông thường, gel có chứa một phần đường của thạch tinh khiết gọi là agarose, chất này ngoài việc làm gel đồng nhất hơn so với thạch mà nó còn hoạt động như một rây phân tử, làm tách biệt các đoạn dựa trên kích thước của chúng khi trong điện trường

Các đoạn DNA/RNA càng nhỏ sẽ chuyển động càng nhanh và càng xa

so với các đoạn lớn Để xác định kích thước của một đoạn DNA/RNA, người ta

so sánh khoảng cách nó đã vượt qua so với khoảng cách mà các đoạn DNA/RNA tiêu chuẩn (là một tập hợp nhiều đoạn DNA đã biết rõ kích thước - marker) đi qua

Nồng độ agarose được sử dụng khác nhau tùy thuộc vào thí nghiệm cần nghiên cứu, thường nằm trong vùng từ khoảng 0,8 – 3,5% Để hiện hình các

Trang 35

băng DNA/RNA trên bản gel, người ta thường sử dụng thuốc nhuộm ethydium bromide (EtBr) Chất này liên kết với DNA/RNA bằng cách xen vào giữa và kề sát với các cặp bazơ (liên kết nhuộm) Khi chiếu ánh sáng (tia UV) vào bản gel, các liên kết nhuộm sẽ hấp thụ và phát huỳnh quang, kết quả có thể nhận biết được bằng mắt thường và chụp ảnh được

* Cách tiến hành thí nghiệm: Cân 0,8 g (đối với gel 0,8%) hoặc 1,5 g

(đối với gel 1,5%) agarose đưa vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X, đung nóng cho đến khi agarose tan hết trong dung dịch đệm thì đổ ra bản đựng gel đã gài sẵn lược để tạo các giếng điện di Sau khoảng 30 phút, gel sẽ đông lại, tiến hành chạy điện di trong điều kiện 100V/30 phút Cuối cùng bản gel được nhuộm trong Etbr và chụp ảnh kết quả dưới tia UV

2.2.6 Khuếch đại trình tự mã hóa (CDS) của gen HNF-4α bằng RT-PCR

Hoạt động của RT – PCR có sự tham gia của hai loại enzyme tổng hợp chuỗi oligonucleotide: enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) cần cho

quá trình tổng hợp sợi cDNA từ mRNA và taq DNA polymerase bền nhiệt cần

cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA Nguyên liệu để chạy RT - PCR gồm mẫu RNA tách chiết được, các loại hóa chất, vật liệu cần thiết để tiến hành phản ứng như: enzyme, 4 loại deoxyribonucleotide triphosphate gọi tắt là dNTP, dung dịch đệm cho hai phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại DNA, nước khử ion,

và cặp mồi,… Hiện nay, trên thị trường đã có sẵn các bộ kit chuyên dụng cho

Định dạng
Số trang	71
Dung lượng	1,1 MB