ảnh hưởng của hoá chất khử trùng đến tỉ lệ nhiễm khi phân lập và xác định thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường nhân giống cấp 1, cấp 2 lên sự phát triển của hệ sợi nấm rơm (volvariella volvacea)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC ẢNH HƯỞNG CỦA HOÁ CHẤT KHỬ TRÙNG ĐẾN TỈ LỆ NHIỄM KHI PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG BỔ SUNG VÀO MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG CẤP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA HOÁ CHẤT KHỬ TRÙNG ĐẾN

TỈ LỆ NHIỄM KHI PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH

PHẦN DINH DƯỠNG BỔ SUNG VÀO MÔI TRƯỜNG

NHÂN GIỐNG CẤP 1, CẤP 2 LÊN SỰ PHÁT TRIỂN

CỦA HỆ SỢI NẤM RƠM (Volvariella volvacea)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS LÊ VĨNH THÚC MAI HOÀNG

MSSV: 3112364 LỚP: Sinh học K37

Cần Thơ, 2014

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA HOÁ CHẤT KHỬ TRÙNG ĐẾN

TỈ LỆ NHIỄM KHI PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH

PHẦN DINH DƯỠNG BỔ SUNG VÀO MÔI TRƯỜNG

NHÂN GIỐNG CẤP 1, CẤP 2 LÊN SỰ PHÁT TRIỂN

CỦA HỆ SỢI NẤM RƠM (Volvariella volvacea)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS LÊ VĨNH THÚC MAI HOÀNG

MSSV: 3112364 LỚP: Sinh học K37

Luận văn tốt nghiệp Cử nhân ngành Sinh học với đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA HOÁ CHẤT KHỬ TRÙNG ĐẾN TỈ LỆ NHIỄM

KHI PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG BỔ

SUNG VÀO MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG CÂP 1, CẤP 2 LÊN SỰ

PHÁT TRIỂN CỦA HỆ SỢI NẤM RƠM (Volvariella volvacea)

Do sinh viên Mai Hoàng thực hiện

Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014

Cán bộ hướng dẫn

TS Lê Vĩnh Thúc

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Cử nhân

ngành Sinh học với đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA HOÁ CHẤT KHỬ TRÙNG ĐẾN TỈ LỆ NHIỄM

KHI PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG BỔ

SUNG VÀO MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG CÂP 1, CẤP 2 LÊN SỰ

PHÁT TRIỂN CỦA HỆ SỢI NẤM RƠM (Volvariella volvacea)

Do sinh viên Mai Hoàng thực hiện và bảo vệ trước Hội đồng

Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:

Luận văn tốt nghiệp được Hội đồng đánh giá ở mức:

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết

quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong

bất kỳ luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Mai Hoàng

Em xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, các

thầy cô khoa Khoa học Tự nhiên, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng,

cùng tất cả các thầy cô đã tận tình giảng dạy em trong suốt thời gian học tập

vừa qua

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Lê Vĩnh Thúc - Người đã tận

tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành tốt

luận văn tốt nghiệp của mình

Xin cám ơn cô Phan Kim Định - cố vấn học tập, người đã luôn ủng hộ,

giúp đỡ và động viên em khi vừa bước chân vào giảng đường Đại học

Chân thành cám ơn anh Mai Vũ Duy, chị Duyên, chị Trân đã tận tình chỉ

dạy, dìu dắt và giúp đỡ đã em trong quá trình em thực hiện luận văn

Xin cám ơn các bạn lớp Sinh học khoá 37, các anh chị và các em trong

phòng thí nghiệm Cấy mô và Cấy nấm thuộc Bộ môn Khoa học Cây trồng,

khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng đã giúp đỡ về kiến thức cũng như

tinh thần trong quá trình em thực hiện luận văn

Cuối cùng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn

bè đã khích lệ và luôn ủng hộ em để em luôn vững tin hoàn thành khoá học

của mình

Trân trọng

cấp 1, cấp 2 lên sự phát triển của hệ sợi nấm rơm (Volvariella volvacea) Luận

văn tốt nghiệp Cử nhân ngành Sinh học Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại

học Cần Thơ, 39 trang Cán bộ hướng dẫn: TS Lê Vĩnh Thúc

TÓM LƯỢC

Đề tài “Ảnh hưởng của hoá chất và thời gian khử trùng đến tỉ lệ nhiễm

khi phân lập và xác định thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường nhân

giống cấp 1, cấp 2 lên sự phát triển của hệ sợi nấm rơm (Volvariella

volvacea)” được thực hiện nhằm mục tiêu tìm ra hoá chất và thời gian khử

trùng thích hợp sao cho tỉ lệ nhiễm của mẫu nấm khi phân lập là thấp nhất; xác

định được thành phần và tỉ lệ dinh dưỡng tự nhiên được bổ sung vào môi

trường nhân giống cấp 1 và cấp 2 phù hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm

rơm Đề tài được thực hiện bao gồm 3 thí nghiệm đều được bố trí theo thể

thức hoàn toàn ngẫu nhiên: (1) Ảnh hưởng của hoá chất khử trùng lên tỉ lệ

sạch khi phân lập nấm rơm Thí nghiệm có hai nhân tố, nhân tố 1 là 5 loại hóa

chất (Ca(ClO)2 10%; Ca(ClO)2 20%; NaClO 10%; NaClO 20%; cồn 70o) và

nhân tố 2 là hai mốc thời gian ngâm mẫu (1 phút; 5 phút); (2) Ảnh hưởng của

dinh dưỡng bổ sung lên sự phát triển của khuẩn lạc nấm rơm trên đĩa petri Thí

nghiệm có 1 nhân tố, gồm 4 nghiệm thức sau: PDA bổ sung (20% dịch chiết

cám; 20% dịch chiết giá; 20% dịch chiết bột bắp và đối chứng) (3) Ảnh

hưởng các loại cơ chất của môi trường cấp 2 đến tốc độ phát triển tơ nấm rơm

Thí nghiệm có 1 nhân tố, gồm 6 nghiệm thức sau: lúa; trấu; lúa + 10% cám;

lúa + 10% bột bắp; trấu + 10% cám; trấu + 10% bột bắp Kết quả thí nghiệm

1: Ca(OCl)2 20% khử trùng mẫu trong thời 1 phút hay NaOCl 10% trong 5

phút cho tỉ nhiễm 0% sau 5 ngày cấy mẫu Kết quả thí nghiệm 2: hệ sợi nấm

rơm phát triển tốt nhất trên môi trường PDA bổ sung 20% dịch chiết cám sau

5 ngày cấy Kết quả thí nghiệm 3: hệ sợi tơ nấm phát triển đồng đều, mật độ

dày nhất trên môi trường trấu bổ sung 10% cám gạo

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG iii

DANH SÁCH HÌNH iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về Nấm rơm (Volvariella volvacea) 3

2.1.1 Các giai đoạn phát triển của nấm rơm 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái của nấm rơm ở giai đoạn trưởng thành 6

2.1.3 Đặc điểm biến dưỡng và sinh lý của nấm rơm 7

2.2 Công thức môi trường phân lập giống gốc và nhân giống cấp 1 8

2.3 Phương pháp khử trùng bề mặt 8

2.4 Phương pháp phân lập nấm rơm từ quả thể 8

2.5 Phương pháp cấy chuyền nấm 9

2.6 Môi trường nhân giống cấp 2 9

2.7 Meo giống gốc 10

2.8 Hoá chất khử trùng 11

2.8.1 Dung dịch Sodium hypochoride (NaOCl) 11

2.8.2 Dung dịch Calcium hypochorite [Ca(OCl)2] - Chlorin 12

2.8.3 Cồn 12

2.9 Thành phần dinh dưỡng các chất của môi trường cấp 2 13

2.9.1 Cám gạo 13

2.9.2 Bột bắp 14

2.9.3 Trấu 14

2.10 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

2.10.1 Một số nghiên cứu trong nước 15

2.10.2 Một số nghiên cứu trên thế giới 15

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

3.1 Phương tiện nghiên cứu 17

3.1.1 Địa điểm - Thời gian thực hiện 17

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 17

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Môi trường cơ bản (PDA) được dùng trong thí nghiệm 17

3.2.2 Thu dịch chiết bột bắp, cám gạo 18

3.2.3 Thu dịch chiết giá đậu xanh 18

3.2.4 Chuẩn bị nguyên liệu lúa và trấu 18

3.2.5 Bố trí thí nghiệm 18

3.3 Phương pháp phân tích số liệu 22

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Ảnh hưởng của hóa chất lên tỉ lệ sạch khi phân lập nấm rơm 23

4.1.1 Tỉ lệ sạch của mẫu 23

4.1.3 Ảnh hưởng của hoá chất lên kích thước tế bào nấm 26

4.2 Thí nghiệm 2: ảnh hưởng của dinh dưỡng bổ sung vào môi trường cấp 1 lên sự phát triển của hệ sợi nấm rơm 29

4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hưởng của dinh dưỡng vào môi trường cấp 2 lên sự phát triển của hệ sợi nấm rơm 31

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Kiến nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 40

DANH SÁCH BẢNG

sau khi được phân giải bởi các enzyme của nấm rơm

13

giải bởi enzyme của nấm rơm (ppm)

DANH SÁCH HÌNH

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Nấm rơm (Volvariella volvacea) là một loại nấm ăn được trồng ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới rất thích hợp với khí hậu Việt Nam, là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng rất cao với protein (2,66 - 5,05%), chất béo (3%), nhiều loại vitamin như B1, B2, B5, C,… (Nguyễn Lân Dũng, 2002) Theo nghiên cứu

của Lin và Chou (1984) cho thấy chất lictin được ly trích từ nấm rơm có khả

năng hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư Hơn nữa, nấm rơm được trồng trên các phế phẩm nông nghiệp như rơm, bông phế thải,… nên có thể tận dụng các phế phẩm nông nghiệp, vừa góp phần bảo vệ môi trường, vừa tăng thu nhập cho nông dân (Reyes và Abella, 1997)

Khử trùng mẫu trước khi nuôi cấy là bước đầu trong quá trình phân lập, với những mẫu cấy khác nhau sẽ có những hoá chất và thời gian khử trùng khác nhau Theo Ahlawat và Tewari (2007) sử dụng cồn 70o khử trùng mẫu nấm rơm trước khi cấy Tuy nhiên, đối với phần lớn phòng thí nghiệm ở Việt Nam, trang thiết bị đơn giản nên việc khử trùng bằng cồn 70o mẫu rất dễ bị nhiễm Theo Vũ Văn Vụ (2007) ở nước ta thường sử dụng dung dịch

vẫn chưa có công trình nghiên cứu cụ thể và công bố kết quả

Adenipekun và Gbolagade (2006) cho rằng sự phát triển của nấm đòi hỏi được cung cấp thêm các dưỡng chất khác như: glucose, protein và khoáng Mặt khác, trong thành phần của cám gạo hay bột bắp lại chứa nhiều thành

phần dinh dưỡng trên (Melissa, 2012) Ukoima và ctv (2009) đã bổ sung dịch

chiết cám vào môi trường nuôi cấy nấm Dương Hải Nguyên (2009) sử dụng lúa bổ sung cám gạo để tạo meo nấm rơm Phần lớn các loại meo giống nấm trên thị trường sử dụng trấu bổ sung các thành phần dinh dưỡng như cám, bột bắp,…Tuy nhiên, về thành phần và tỉ lệ cụ thể của giống nấm thì người trồng

nấm vẫn chưa được biết rõ để có thể chủ động tạo nguồn meo giống Chang và

Miles (2004) cũng sử dụng môi trường trấu có bổ sung dinh dưỡng để tạo meo

nấm Vì vậy, đề tài “Ảnh hưởng của hoá chất khử trùng lên tỉ lệ nhiễm của

tơ nấm khi phân lập và xác định thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi

trường nhân giống cấp 1, cấp 2 lên sự phát triển của hệ sợi nấm rơm

(Volvariella volvacea)” được thực hiện nhằm mục tiêu tìm ra hoá chất và thời

gian khử trùng thích hợp sao cho tỉ lệ nhiễm của mẫu nấm khi phân lập là thấp nhất; xác định được thành phần và tỉ lệ dinh dưỡng tự nhiên được bổ sung vào môi trường nhân giống cấp 1 và cấp 2 phù hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm rơm

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về Nấm rơm (Volvariella volvacea)

Nấm rơm (Volvariella volvacea) thuộc họ Pluteaceae, bộ Agaricales, lớp

Hymenomycetes, ngành Eumycota

Hình 2.1 Quả thể nấm rơm (Giai đoạn hình trứng)

Nấm rơm có nguồn gốc từ các vùng mưa nhiều, có nhiệt độ cao, ở các khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới Nấm rơm được trồng đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 1822 (Chang, 1969) Sau đó được lan rộng và phát triển ở Việt Nam, Malaysia, Myanma, Philippin, Thái Lan, Nhật Bản, Triều Tiên, Hàn Quốc,… (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

2.1.1 Các giai đoạn phát triển của nấm rơm

Theo Chang và Miles (2004) quá trình tạo quả thể của nấm rơm được

chia thành sáu giai đoạn khác nhau: đầu kim, nút nhỏ, nút, trứng, kéo dài và giai đoạn trưởng thành Mỗi chủng nấm rơm có hình thái giải phẩu riêng:

Bao gốc

Mũ nấm

Cuống nấm

Phiến nấm

Hình 2.2 Các giai đoạn phát triển của nấm rơm

(*Nguồn Chang, 2004)

Đặc điểm các giai đoạn phát triển của nấm rơm theo Ahlawat (2007):

1 Giai đoạn đầu kim: giai đoạn này nấm rơm có kích thước của một đầu

kim, bao gốc có màu trắng (Hình 2.3) Trong đó phiến nấm, mũ nấm và cuống nấm chưa hình thành Toàn bộ cấu trúc là một nút thắt của các sợi nấm

2 Nút nhỏ: cả hai giai đoạn đầu kim và nút nhỏ đều được hình thành từ

sự đan xen của các sợi nấm Ở giai đoạn đầu của nút nhỏ, chỉ có đầu của bao gốc là có màu nâu, phần còn lại là màu trắng (Hình 2.3) Bên trong hình thành và nếu cắt dọc các nút, các phiến nấm dưới mũ nấm thu hẹp lại

3 Giai đoạn nút: giai đoạn này của nấm rơm được bán với giá cao trên

thị trường Trong giai đoạn này, toàn bộ cấu trúc được bao bọc trong một lớp phủ được gọi là bao gốc (Hình 2.3) Bên trong bao gốc, mũ nấm khép kín Như vậy các phiến nấm không được nhìn thấy nhưng trong mặt cắt dọc của nấm nó được nhìn thấy

Hình 2.3 Giai đoạn đinh ghim, hình nút nhỏ, hình nút, hình trứng

(*Nguồn: Ahlawat, 2007)

4 Giai đoạn trứng: mũ nấm bun ra khỏi bao gốc (Hình 2.3) Cuống nấm

vẫn không được nhìn thấy, các phiến nấm không mang bào tử, kích thước của mũ nấm vẫn rất nhỏ ở giai đoạn này

5 Giai đoạn kéo dài: mũ nấm vẫn đóng và kích thước còn nhỏ so với giai

đoạn trưởng thành, trong khi đó cuốn nấm đạt chiều dài tối đa (Hình 2.4)

Hình 2.4 Giai đoạn kéo dài

(*Nguồn: Ahlawat, 2007)

6 Giai đoạn trưởng thành: Ở giai đoạn trưởng thành, cấu trúc được chia

thành ba phần: mũ nấm, cuống nấm hay thân nấm và phiến nấm, mũ nấm được gắn ở trung tâm bằng cuống nấm và thường có đường kính 6-

12 cm Mũ nấm hoàn toàn trưởng thành có hình dạng tròn với mép liền,

bề mặt nhẵn Bề mặt có màu xám tối tại trung tâm và màu xám sáng gần mép Mặt dưới của mũ nấm là những phiến nấm với số lượng khác nhau từ 280-380 Phiến nấm thay đổi từ kích thước đầy đủ đến ¼ kích thước mũ nấm Dưới kính hiển vi, mỗi phiến nấm được quan sát, phiến

nấm được hình thành từ ba lớp nấm sợi đan xen Các lớp ngoài cùng được gọi là màng bao.

Hình 2.5 Giai đoạn trưởng thành

2.1.2 Đặc điểm hình thái của nấm rơm ở giai đoạn trưởng thành

Bao gốc

Theo Đường Hồng Dật (2002) bao gốc dài và cao lúc nhỏ, bao lấy tai nấm Khi tai nấm trưởng thành, nó chỉ còn lại phần trùm lấy phần gốc chân thân nấm Bao nấm là hệ sợi tơ nấm chứa sắc tố melanin tạo ra màu đen ở gốc

Độ đậm nhạt tùy thuộc ánh sáng Ánh sáng càng nhiều thì bao gốc càng đen Bao gốc giữ chức năng: chống tia tử ngoại của mặt trời, ngăn cản sự phá hoại của côn trùng, giữ nước và ngăn cản sự thoát hơi nước của các cơ quan bên trong Do đóng vai trò bảo vệ nên thành phần dinh dưỡng của bao gốc rất ít

Cuống nấm

Theo Lê Duy Thắng (1997) cuống nấm là bó hệ sợi xốp, xếp theo kiểu vòng tròn đồng tâm Khi còn non thì mềm và giòn Nhưng khi già xơ thì cứng lại và khó bẻ gãy Vai trò của cuống nấm là: đưa mũ nấm lên cao để phát tán bào tử đi xa, vận chuyển chất dinh dưỡng để cung cấp cho mũ nấm Khi bào tử chín thì vai trò vận chuyển dinh dưỡng không còn nữa

Mũ nấm

Mũ nấm có hình nón, cũng có melanin, nhưng nhạt dần từ trung tâm ra rìa mép Bên dưới có nhiều phiến Xếp theo dạng tia kiểu vòng tròn đồng tâm Mỗi phiến có khoảng 2.500.000 bào tử Mũ nấm cũng là hệ sợi tơ đan chéo

vào nhau, rất giàu chất dinh dưỡng dự trữ, giữ vai trò sinh sản (Nguyễn Hữu Đống, 1997)

2.1.3 Đặc điểm biến dưỡng và sinh lý của nấm rơm

Theo Reyes và Abella hầu hết các loài nấm đều lấy dinh dưỡng qua bề

mặt tế bào sợi Nấm có hệ enzyme phân giải tương đối mạnh giúp chúng có thể sử dụng các dạng thức ăn phức tạp, bao gồm các đại phân tử như chất xơ (cellulose, hemicellulose), chất đạm (protein), chất bột (amidon, polysacharide), chất mộc (lignin), … Với cấu trúc sợi tơ nấm len lỏi sâu vào trong cơ chất (rơm rạ, mạc cưa, gỗ, …) hấp thụ chất dinh dưỡng đem nuôi toàn bộ cơ thể nấm

Theo Lê Duy Thắng (1997) cho rằng các loại nấm đều cần sử dụng glucose, là nguồn cacbon chính trong việc tổng hợp các chất và cung cấp năng lượng cho nấm Nguồn cacbon hay đường là một yếu tố bắt buộc, không có nó nấm không thể tăng trưởng hoặc phát triển được Nấm rơm là loại nấm hoại sinh, hệ enzyme cellulase của nấm có hoạt tính phân giải được nhiều loại cơ chất khác nhau, sợi nấm sẽ tiết ra enzyme cellulase phân huỷ các nguồn carbon trên cơ chất thành dạng dễ sử dụng: monosaccharide, disaccharide để cung cấp năng lượng cho các quá trình biến dưỡng của tế bào nấm Nấm rơm tạo ra một hệ thống enzyme đa thành phần bao gồm các endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase, and β-glucosidase cho việc chuyển đổi cellulose thành glucose (Cai, 1998)

D-Thiếu Phospho sẽ kìm hãm sự hấp thụ glucose Kali có vai trò trong sự thẫm thấu và giữ nước của tế bào, tham gia trao đổi chất và biến dưỡng protein Magie cần cho sự biến dưỡng các chất đường (Lê Duy Thắng, 1997)

pH chua làm tơ nấm mọc chậm, thưa và thường xoắn đầu pH kiềm tơ mọc chậm hoặc ngừng tăng trưởng, quả thể bị chai và không phát triển tiếp tục (Lê Duy Thắng, 1997) Sợi nấm rơm phát triển ở pH từ 6,8 - 7,8 là thích hợp nhất (Zani, 1997)

Để nấm rơm phát triển tốt thì cần bổ sung một lượng vitamin, đặc biệt là các vitamin nhóm B Do đó trong nuôi trồng, việc bổ sung cám gạo vào cơ chất có tác dụng cung cấp cho nấm rơm một lượng vitamin B1 và là nguồn nitơ hữu cơ cho nấm phát triển (Đường Hồng Dật, 2002) Theo Lê Duy Thắng (1997) thì nguồn nitơ hữu cơ bổ sung sẽ giúp cho tơ nấm phát triển tốt hơn

2.2 Công thức môi trường phân lập giống gốc và nhân giống cấp 1

Công thức môi trường khoai tây - đường - thạch (PDA) theo Nguyễn Lân

Theo Vũ Văn Vụ và ctv., 2007 khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhất, vì

chúng sẽ tạo ra được nguồn mẫu invitro ban đầu Mục đích của khử trùng mẫu

là loại hết những vi sinh vật gây nhiễm bám trên mẫu, nhằm tạo được lượng mẫu sống và vô trùng cao nhất cho nuôi cấy Khử trùng mẫu cấy thường sử dụng các hoá chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật như: calcium hypochlorite [Ca(OCl)2], thuỷ ngân clorua (HgCl2), Chloramin B, sodium hypochlorite (NaOCl), oxy già (H2O2), các chất kháng sinh, … Trong đó, [Ca(OCl)2] và (NaOCl) được sử dụng nhiều hơn vì chúng có độc tính thấp đối với mô cấy và

an toàn cho người sử dụng, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt, mà giá thành lại rẽ Tuy nhiên, khả năng diệt khuẩn của hoá chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ xử lý và mức độ xâm nhập của vi sinh vật trên bề mặt mô cấy

2.4 Phương pháp phân lập nấm rơm từ quả thể

Phương pháp phân lập nấm rơm từ quả thể theo Ahlawat và Tewari (2007):

Dùng dao mổ khử trùng dưới ngọn lửa đèn cồn cắt đôi quả thể nấm, lấy một đoạn thân nấm hay mũ nấm và chuyển vào đĩa petri có môi trường PDA

từ mẫu cấy

Chuyển tiếp các khuẩn ty sang đĩa môi trường PDA mới đến khi khuẩn ty ròng

2.5 Phương pháp cấy chuyền nấm

Phương pháp cấy chuyền nấm rơm theo Cao Ngọc Điệp (2004):

- Dùng kim cấy cán cứng, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn

- Cắt một miếng môi trường có agar và khuẩn ty hình vuông hay chữ nhật

có kích thước (1 x 2 cm)

- Chuyển sang môi trường mới bằng cách úp miếng agar có khuẩn ty nấm lên mặt môi trường mới

- Ủ ở 30oC trong vài ngày

- Quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra độ ròng của mẫu

- Cuối cùng chuyển vào ống nghiệm (đối với nấm rơm được trữ ở 10 -

13oC)

2.6 Môi trường nhân giống cấp 2

Theo Nguyễn Lân Dũng (2001) một số môi trường nhân giống cấp 1 của nấm rơm như sau

Nước 140-160%

2.7 Meo giống gốc

Theo Chang và Miles (2004) hay Ahlawat và Tewari (2007) meo giống

bao gồm tất cả dạng trung gian, chứa đựng sinh khối của loài nấm dự định nuôi trồng Nguyên liệu làm meo giống có thể ở dạng hạt (như lúa, bo bo hoặc các hạt ngũ cốc khác), dạng phế liệu (như rơm, trấu, vỏ hạt sen, mạt cưa gỗ, sơ dừa, …) hoặc dạng dung dịch (như rỉ đường) Tóm lại là các giá thể (các cơ chất nuôi nấm) dễ dàng cho nấm mọc, nhưng cũng dễ dàng phân tán khi cấy giống vào nguyên liệu nuôi trồng Sinh khối nấm như meo giống gốc thường

là hệ sợi tơ nấm (tơ thứ cấp), đôi khi cũng có thể là bào tử nấm Điểm quan trọng là giống cấy phải thuần, nghĩa là không bị lẫn tạp với vi khuẩn, nấm mốc

và loài nào khác (Lê Duy Thắng, 1997)

Trong thực tế, việc sản xuất giống nấm là một khâu đặc biệt quan trọng trong toàn bộ quá trình nuôi trồng, quyết định đến sản lượng và chất lượng của nấm làm ra Meo giống tốt không những mọc nhanh và mạnh trên nguyên liệu nuôi trồng, chống chịu được các mầm bệnh mà còn có năng suất cao, giá trị thương phẩm tốt, chậm thoái hoá (Lê Duy Thắng, 1997)

Chỉ tiêu đánh giá chất lượng meo giống nấm theo Nguyễn Hữu Đống (1997)

Không bị nhiễm bệnh: quan sát bên ngoài giống có màu trắng đồng nhất,

sợi nấm mọc đều từ trên xuống dưới, không có màu xanh, đen, vàng, không có các vùng loang lổ

Giống có mùi thơm dễ chịu: nếu có mùi chua khó chịu là giống bị nhiễm

vi khuẩn, nấm dại, …

Giống không già hoặc non: nếu thấy có mô sẹo hay cây nấm mọc trong

chai, màu chai giống chuyển sang vàng, nâu đen là giống quá già Giống chưa

ăn kín hết đáy bao bì là giống còn non

 Sử dụng tốt nhất khi giống đã ăn kín hết đáy chai (hoặc túi) sau 3 - 4 ngày Muốn để lâu hơn phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh, giống nấm rơm bảo quản ở nhiệt độ 15 - 20oC, kéo dài 15 - 30 ngày

Hình 2.6 Quy trình tạo meo giống nấm rơm

(*Nguồn: Federico, 1997)

2.8 Hoá chất khử trùng

2.8.1 Dung dịch Sodium hypochoride (NaOCl)

Hình 2.7 Công thức hoá học của Sodium hypochlorite

Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox (chiếm 5 - 20%) Tác dụng khử khuẩn của dung dịch hypochlorite là clo được phóng thích và phá huỷ màng tế bào của cá vi sinh vật bám trên mẫu, bất hoạt

PDA - Môi trường Quả thê nấm hoặc bào tử

Cơ chất

quá trình tổng hợp acid amin, protein, làm tan các bào quan, acid nhân của vi sinh vật

(*Nguồn: Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare, 2008)

2.8.2 Dung dịch Calcium hypochorite [Ca(OCl)2] - Chlorin

Hình 2.8 Công thức hoá học Calcium hypochlorite

Chất này thường được bán ngoài thị trường với dạng bột (độ tinh khiết 65

(*Nguồn: Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare, 2008)

2.8.3 Cồn

Hình 2.9 Công thức hoá học của cồn

Thường cồn ethanol (70 - 95o) được sử dụng phổ biến Cồn không chỉ giết khuẩn mà còn lấy đi các chất sáp từ mô mẫu cấy (Salaverría, 2004) Cồn diệt khuẩn dựa trên cơ chế: làm biến tính protein của vi sinh vật Cồn sử dụng

hợp cồn và nước sẽ làm biến tính protein nhanh hơn cồn gần nguyên chất

(*Nguồn: Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare, 2008)

2.9 Thành phần dinh dưỡng các chất của môi trường cấp 2

2.9.1 Cám gạo

Cám gạo thường có dạng bột, mềm và mịn chiếm khoảng 10 - 12% khối lượng lúa chưa xay xát Cám được hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm phôi của hạt, những hạt gạo bị gãy vỡ, cũng như một phần từ tấm Thành phần của cám gạo có nhiều loại vitamin, chất béo và nhiều xơ dễ tiêu (Melissa, 2012) Ngày nay, cám gạo đã được ổn định bằng cách xử lý nhiệt để làm giảm

sự thủy phân và oxy hóa của dầu Cám gạo chứa nhiều thành phần dinh dưỡng

cơ bản như protein, tinh bột, axit béo, các hợp chất phenolic, vitamin nhóm B, khoáng vi lượng, xơ hòa tan Cám gạo rất giàu chất xơ hòa tan, mặc dù không được tiêu hóa nhưng nó có nhiều chức năng sinh học khác, một trong những chức năng quan trọng là sự kích thích sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật

có lợi (Vogt, 2003)

Kết quả nghiên cứu của Akinyele và ctv (2011):

Bảng 2.1 Thành phần (%) các chất dinh dưỡng trong cám gạo trước và

sau khi được phân giải bởi các enzyme của nấm rơm

Bảng 2.2 Thành phần khoáng của cám gạo trước và sau khi được phân

giải bởi enzyme của nấm rơm (ppm)

nấm rơm được tạo ra gần 110 µmol/phút/mL trên môi trường cám gạo sau 72 giờ nuôi cấy Enzyme beta amylase của nấm rơm được tạo ra gần 120

µmol/phút/mL trên môi trường cám gạo sau 72 giờ nuôi cấy (Akinyele và ctv.,

2011)

2.9.2 Bột bắp

Hàm lượng protein trong bột bắp dao động từ 80 - 120 g/kg phụ thuộc vào giống Chất béo tập trung chủ yếu ở mầm bắp, có tỉ lệ tương đối cao (4 - 6%) vì vậy, bột bắp khó bảo quản, dễ bị oxy hoá (Swinkels, 1985)

Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng của cám bắp vàng

khoảng 25 - 30% và cellulose chiếm khoảng 35 - 40% (Elijah và ctv., 2009)

Theo Oyenuga (1968), trong trấu chứa 2,9 - 3,6% protein thô, 8 - 12% lipid,

39 - 42% chất xơ và khoáng chiếm đến 15 - 22% Các chất hữu cơ của trấu là các mạch polycarbohydrate rất dài nên hầu hết các loài sinh vật không thể sử dụng trực tiếp được Zaid và Ganiyat (2008) cho rằng bên cạnh cellulose, hemicellilose, lignin, trong vỏ trấu còn có các thành phần dinh dưỡng khác

2.10 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.10.1 Một số nghiên cứu trong nước

Nguyễn Hiền Huỳnh (2010) sử dụng dung dịch chlorine 1% để khử trùng

bề mặt khi phân lập nấm rơm

Nguyễn Thị Bích Hằng và ctv (2014) đã khử trùng nấm linh chi bằng

10% dịch chiết cà rốt làm môi trường nhân giống nấm linh chi cấp 1 và môi trường lúa luộc là môi trường nhân giống cấp 2

Nguyễn Hiền Huỳnh (2010) đã làm thí nghiệm và kết luận sự phát triển của khuẩn lạc nấm rơm trên môi trường PDA là 3,0 cm sau 72 giờ cấy Trần Thuỳ Hương (2006) cũng nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo trên môi trường PDA, kết quả sau 3 ngày nấm đã bắt đầu hình thành khuẩn lạc

Dương Hải Nguyên (2009) đã sử dụng lúa và cám gạo tạo môi trường

cấp 2 nuôi nấm rơm với tỉ lệ 95% : 5% Hà Cẩm Thu và ctv (2011) kết luận

sau 6 ngày cấy nấm rơm vào môi trường mùn cưa + lúa thì hệ sợi tơ nấm đã ăn kín bình thuỷ tinh (250 mL)

2.10.2 Một số nghiên cứu trên thế giới

để khử trùng mẫu nấm trước khi phân lập nấm trên môi trường PDA

Theo Chang và Miles (2004) sử dụng môi trường PDA để nuôi cấy nấm,

sau 4 - 5 ngày có thể sử dụng tơ nấm để cấy vào môi trường cấp 2 Kết quả

nghiên cứu của Ukoima và ctv (2009) cho thấy sự phát triển của đường kính

khuẩn lạc nấm bào ngư trên môi trường PDA bổ sung dịch chiết cám là 7,8 cm

so với môi trường PDA là 1,5 - 4,4 cm

Chang và Miles (2004) nhân giống nấm rơm trên môi trường cấp 2 là hạt

dụng môi trường trấu có bổ sung phân ngựa, kết quả sau 2 tuần tơ nấm ăn kín

cơ chất và có thể sử dụng làm meo giống

Ahlawat và Tewari (2007) tạo meo giống nấm rơm với thành phần và tỉ

2/3 thể tích không gian vật chứa, hấp khử trùng và nuôi sợi khoảng 2 tuần có thể sử dụng

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm - Thời gian thực hiện

Địa điểm tiến hành thí nghiệm: phòng thí nghiệm cấy mô, cấy nấm

thuộc Bộ môn Khoa học cây trồng, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: đề tài được thực hiện từ tháng 4/2014 đến tháng 11/2014

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm

Vật liệu

- Quả thể nấm rơm (Volvariella volvacea) tươi được mua tại chợ Xuân

Khánh, phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ

- Trấu: tại các cửa hàng hoa kiểng trên đường Nguyễn Văn Cừ

- Lúa, cám gạo và bột bắp được thu mua từ cơ sở thức ăn gia súc Hồng Phước, đường 30/4 phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ

Thiết bị - dụng cụ

Tủ cấy, nồi khử trùng nhiệt ướt, đĩa petri, que cấy, dao mổ, keo thủy tinh, đèn cồn, kính hiển vi quang học, cân phân tích, pH kế, ẩm kế, nhiệt kế,…

Hóa chất

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Môi trường cơ bản (PDA) được dùng trong thí nghiệm

Khoai tây rửa sạch, cắt khối khoảng 1 cm3 thêm vào 500 mL nước cất, đun sôi 10 - 15 phút Lọc lấy phần nước trong 20 g agar và 20 g đường glucose được hòa tan trong 500 mL nước cất, sau đó cho phần nước khoai tây vừa nấu lên đúng thể tích 1 L, kiểm tra pH = 7, dung dịch được đun vừa sôi,

nắp giấy Môi trường vừa chế xong được hấp khử trùng ở 1atm, 121oC trong

20 phút Môi trường được lấy ra, đặt nghiêng 180o, để nguội và trữ ở 25oC

3.2.2 Thu dịch chiết bột bắp, cám gạo

25 g bột bắp (cám gạo) được cho vào 300 mL nước ấm (50 - 55oC), khuấy đều trong 4 - 5 phút, để yên 10 - 15 phút, lọc qua vải lọc 2 - 3 lần và thu lấy dịch trong

3.2.3 Thu dịch chiết giá đậu xanh

200 g giá đậu xanh được cho vào 300 mL nước cất, đun sôi đến khi cọng giá trong, lọc lấy phần nước trong

3.2.4 Chuẩn bị nguyên liệu lúa và trấu

Xử lý nguyên liệu lúa

Lúa được cân và cho vào thau nhựa, rửa nhiều lần bằng nước sạch để loại

bỏ bụi, đất và các hạt lúa lép; sau đó lúa được ngâm trong nước sạch 12 - 16 giờ để ngấm nước, chúng được rửa lại để khử mùi chua; lúa được cho vào nồi luộc cho đến khi vỏ trấu mở khoảng 1/3 thì chúng được vớt ra cho đến khi độ

ẩm còn khoảng 70 - 75%; 5% vôi được trộn đều vào lúa nhằm tránh các hạt kết dính với nhau trong quá trình thanh trùng và cấy giống

Xử lý nguyên liệu trấu

Trấu được rửa sạch để loại bỏ bụi và phần trấu bị đen, sau đó chúng được

ngâm trong nước vôi 5% trong 4 - 5 tiếng

3.2.5 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng lên tỉ

lệ nhiễm khi phân lập nấm rơm

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố, nhân tố 1 là 5 loại hóa chất (Ca(ClO)2 10%; Ca(ClO)2 20%; NaClO 10%;

phút); gồm 10 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 15 lần lặp lại

Mục tiêu thí nghiệm: hoá chất khử trùng mẫu nấm khi phân lập có tỉ lệ

nhiễm thấp nhất được chọn ra, sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 3 Bố trí thí nghiệm 1

1 phút 5 phút Ca(ClO)2 10% NT 1 NT 6

Cách tiến hành: quả thể nấm được ngâm trong hóa chất khử trùng trong

thời gian tương ứng của nghiệm thức; sau đó quả thể nấm được rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng Tiến hành cấy mẫu: quả thể nấm được bổ đôi, loại bỏ bao

tinh chứa môi trường PDA Mẫu sau khi cấy xong được đặt trong tủ kín và sợi nấm sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi

- Tỉ lệ mẫu nhiễm ngày thứ 1, thứ 2, thứ 3, thứ 4 và thứ 5 sau khi cấy

- Tỉ lệ mẫu sạch bệnh và tơ nấm phát triển 5 ngày sau cấy

- Hình dạng của tơ nấm được quan sát dưới kính hiển vi

- Kích thước chiều dài và rộng (µm) của 15 tế bào ngẫu nhiên được đo dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40X

Kích thước thực tế = [(Kích thước đo dưới kính * 0,1)/độ phóng

đại)]*1000 (µm)