Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) (họ La đơn (Iridaceae))

Về nghiên cứu hoạt tính sinh học 2.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm của các dịch chiết cho thấy chỉ có cặn chiết ethyl acetat EB-Et của củ sâm đại hành, cặn chiết ethyl acetat E

A (BS-3), irigenin (BS-4), irilin D (BS-7), tectoridin (BS-9) và tectorigenin

4’-O-β-D-glucoside (BS-10); 3 hợp chất flavonoid là rhamnocitrin (BS-6),

kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (BS-11) và isoquercetin (BS-12); và 4 hợp chất khác là acetovanillone

5), daucosterol 8), 24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol 13), axit myristic

(BS-14) Trong số đó, 4 hợp chất là: acetovanillone (BS-5),

kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (BS-11), isoquercetin (BS-12) và axit myristic (BS-14) là các hợp chất

lần đầu được phân lập từ loài này Hai hợp chất tectorigenin và tectoridin là thành phần

chính trong thân rễ thực vật này

2 Về nghiên cứu hoạt tính sinh học

2.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm của các dịch chiết cho thấy chỉ có cặn chiết

ethyl acetat (EB-Et) của củ sâm đại hành, cặn chiết ethyl acetat Et) và cặn nước

(BS-W) của thân rễ xạ can có hoạt tính kháng viêm theo đường uống với mức độ ức chế khối

viêm tương ứng là 52,12%, 70%, 64,26% Tất cả các cặn chiết củ sâm đại hành và thân rễ

xạ can không thể hiện hoạt tính khi thử nghiệm theo đường bôi

2.2 Lần đầu tiên nghiên nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ

tế bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của 14 hợp chất phân lập

được từ củ sâm đại hành Kết quả cho thấy có 4 hợp chất: (2S)

dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1), hongconin (EB-4), eleutherine (EB-5), và isoeleutherin

(EB-6) có hoạt tính tốt ức chế sự sản sinh các cytokine IL-12 p40 (với giá trị IC50 từ

0,1±0,08→5±0,4 µM) và IL-6 (với giá trị IC50 từ 1,7±0,1→8,7±0,3 µM) từ tế bào tua

(DCs) sinh ra từ tủy xương Kết quả này cho thấy có thể sử dụng các hợp chất này như là

các chất kháng viêm tiềm năng trong tương lai

2.3 Đã đánh giá hoạt tính kháng viêm và độ an toàn của tectorigenin là hoạt chất

chính phân lập được từ thân rễ xạ can

- Tác dụng kháng viêm, giảm đau:

Tectorigenin có tác dụng giảm đau rõ rệt nhất ở liều 100 mg/kg cân nặng chuột nhắt

Với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin có tác dụng chống viêm cấp và

viêm mạn

- Độc tính cấp tính của tectorigenin đã được xác định với giá trị LD50 là (1,78 ± 0,13)

g/kg P

- Độc tính bán trường diễn: tectorigenin với các liều thử 100 mg/kg cân nặng và 300

mg/kg cân nặng, cho chuột ống thuốc liên tục 28 ngày không làm ảnh hưởng đến cân

nặng, không làm thay đổi chức phận tạo máu và chức năng gan, thận so với lô chứng

KIẾN NGHỊ

Nghiên cứu thành phần hoá học của cặn chiết n-hexane của hai loài xạ can và sâm đại

hành

Nghiên cứu hợp chất mới EB-1 (hợp chất kháng viêm tiềm năng) cùng một số hợp

chất khác để tạo sản phẩm mới

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, được thiên nhiên ưu đãi nên có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng hơn 14.000 loài thực vật bậc cao Trong đó, có khoảng gần 4.000 loài được sử dụng làm thuốc chữa bệnh trong y học cổ truyền Nước ta có nền y học cổ truyền hết sức đa dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử, nền y học dân tộc cũng không ngừng phát triển qua các thời

kỳ đó Nhiều bài thuốc, vị thuốc có tác dụng tốt trên lâm sàng nhưng chưa được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý và độc tính Nghiên cứu để khai thác, kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta

Trong chương trình sàng lọc các cây thuốc có hoạt tính kháng viêm từ nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tôi đã phát hiện thấy các cây thuốc họ La dơn có hoạt tính kháng viêm khá tốt Ngoài ra, chúng còn có một số hoạt tính khác như: kháng nấm, kháng

khuẩn, độc tế bào, chống oxy hoá Trong đó, đáng chú ý nhất là hai loài Belamcanda chinensis (L.) DC (xạ can) và Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb (sâm đại hành) Đây là

hai cây thuốc mới chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học cả ở Việt Nam và trên thế giới Trong y học dân gian, cây xạ can thường được sử dụng để chữa viêm họng, viêm amidan, đau cổ, ho và khó thở do nhiều đờm, chữa sốt, tắc tia sữa… Còn cây sâm đại hành thường được dùng để trị thiếu máu, vàng da, hoa mắt, nhức đầu, mệt mỏi, ho ra máu, cầm máu, ho, ho lao…

Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm

đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.)

(họ La dơn (Iridaceae))” với mục tiêu làm sáng tỏ thành phần hoá học và hoạt tính sinh học (đặc biệt là hoạt tính kháng viêm), nhằm nâng cao giá trị sử dụng và khai thác có hiệu quả nguồn hoạt chất quý giá từ hai cây thuốc dân gian này

2 Đối tượng nghiên cứu và nội dung của luận án

Đối tượng nghiên cứu của luận án là củ cây sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và thân rễ cây xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.)

Nội dung chính của luận án là:

1 Điều chế và đánh giá hoạt tính kháng viêm các cặn chiết của củ sâm đại hành và thân

rễ xạ can

2 Chiết tách và phân lập các hợp chất từ 2 loài thực vật này

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập

4 Đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập được

3 Những đóng góp mới của luận án 3.1 Từ củ sâm đại hành đã phân lập và xác định cấu trúc hoá học của 14 hợp chất là: (2S)

dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1), eleutherinol (EB-2), eleutherinoside A (EB-3), hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5), isoeleutherin (EB-6), eleuthoside C (EB-7), eleutherineoside C (EB-8), eleutherinoside B (EB-9), (R)-7-acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyltetralone 10), eleuthoside A 11), eleuthoside B (EB-12), eleutherinoside D (EB-13) và 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) từ

củ sâm đại hành Trong đó, (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1) là

hợp chất mới và hợp chất 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) lần đầu được

phân lập từ loài này

3.2 Từ thân rễ xạ can đã phân lập và xác định cấu trúc hoá học của 14 hợp chất là:

irisflorentin (BS-1), tectorigenin (BS-2), iristectorigenin A (BS-3), irigenin (BS-4),

acetovanillone (BS-5), rhamnocitrin (BS-6), irilin D (BS-7), daucosterol (BS-8),

tectoridin (BS-9), tectorigenin 4’-O-β-D-glucoside (BS-10),

kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (BS-11), isoquercetin (BS-12), 24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol (BS-13)

và axit myristic (BS-14) Trong đó 4 hợp chất: acetovanillone (BS-5),

kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (BS-11), isoquercetin (BS-12) và axit myristic (BS-14) lần đầu được

phân lập từ cây xạ can

3.3 Đã xác định được cặn chiết ethyl axetat (BS-Et), cặn nước (BS-W) của thân rễ xạ can

và cặn ethyl axetat (EB-Et) của củ sâm đại hành có hoạt tính kháng viêm theo đường

uống với phần trăm ức chế khối viêm tương ứng là 52,12%, 70%, 64,26%

3.4 Là công trình đầu tiên nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh các cytokine gây viêm

từ tế bào tua DC sinh ra từ tuỷ xương bị kích thích bởi LPS của 14 hợp chất phân lập

được từ củ sâm đại hành Hợp chất mới EB-1 và các hợp chất EB-4, EB-5 và EB-6 ức

chế khá tốt sự sản sinh các cytokine IL-12 p40 (với giá trị IC50 từ 0,1±0,08→5±0,4

µg/mL) và IL-6 (với giá trị IC50 từ 1,7±0,1→8,7±0,3 µg/mL) Gợi ý cho thấy có thể sử

dụng các hợp chất này như là các chất kháng viêm tiềm năng trong tương lai

3.5 Đã đánh giá tác dụng kháng viêm, giảm đau và độ an toàn của hợp chất chính

tectorigienin phân lập được từ thân rễ xạ can

- Tác dụng kháng viêm, giảm đau: Tectorigenin có tác dụng giảm đau rõ rệt nhất ở liều

100 mg/kg cân nặng chuột nhắt Với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin có

tác dụng chống viêm cấp và viêm mạn

- Độc tính cấp tính của tectorigenin được xác định với giá trị LD50 là (1,78±0,13) g/kg P

- Độc tính bán trường diễn: tectorigenin với các liều thử 100 mg/kg cân nặng và 300

mg/kg cân nặng, cho chuột ống thuốc liên tục 28 ngày không làm ảnh hưởng đến cân

nặng, không làm thay đổi chức phận tạo máu và chức năng gan, thận và mô bệnh học so

với lô chứng

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm 148 trang với 27 bảng số liệu, 125 hình, 159 tài liệu tham khảo và 62

phụ lục Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan (30 trang), Chương

2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (5 trang), Chương 3: Thực nghiệm (26 trang),

Chương 4: Kết quả và thảo luận (82 trang), Kết luận (2 trang), Các công trình đã công bố

(1 trang), Tài liệu tham khảo (17 trang)

II NỘI DUNG LUẬN ÁN

Mở đầu: đề cập đến tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, tính thời sự, mục tiêu và nhiệm vụ

của luận án

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Trên cơ sở nghiên cứu tài liệu, chương này đề cập đến tình hình nghiên cứu hoá học

và hoạt tính sinh học của loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và loài xạ

can (Belamcanda chinensis (L.) DC.), khái niệm về viêm và một số hợp chất phenolic

thực vật có hoạt tính kháng viêm

Protein toàn phần (g/L)

N14 46,29±0,98 46,13±0,96 47,36 ± 1,11 > 0,05 N28 43,89±2,27 44,98±1,54 44,49±2,61 > 0,05

p: so với lô chứng; Lô thử 1: 100 mg tectorigenin/kg P; Lô thử 2: 300 mg tectorigenin/kgP

+ Kết quả bảng 4.24 cho thấy: tại ba thời điểm nghiên cứu, không thấy có sự khác biệt về thông số AST, ALT cholesterol toàn phần và protein toàn phần giữa các lô chuột thực nghiệm (p>0,05)

+ Kết quả quan sát đại thể mô bệnh học gan chuột sau 28 ngày uống thuốc như sau: ở

cả 2 lô thuốc thử và lô chứng mặt gan nhẵn, mật độ bình thường, màu đỏ, không có sung huyết, không có dấu hiệu tổn thương

- Đánh giá chức năng thận

Kết quả định lượng creatinin ở các lô chuột thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.25

Bảng 4.25 Ảnh hưởng của tectorigienin đến thông số creatinin huyết thanh của

chuột thực nghiệm

Chỉ số nghiên cứu

Thời điểm nghiên cứu

Lô chứng (n = 10)

Lô thử 1 (n = 10)

Lô thử 2 (n = 10) p Creatinin

(µmol/L)

N14 399,94±10,26 368,26 ± 15,41 354,65±29,44 > 0,05 N28 417,54±12,38 419,83 ± 5,46 431,98±7,45 > 0,05

p: so với lô chứng; Lô thử 1: 100 mg tectorigenin/kg P; Lô thử 2: 300 mg tectorigenin/kgP

Kết quả bảng 4.25 cho thấy: sau 2 tuần và 4 tuần uống thuốc liên tục, hàm lượng creatinin trong máu chuột không có sự thay đổi khác biệt so với lô chứng (p>0,05) Quan sát đại thể mô bệnh học thận chuột sau 28 ngày uống thuốc cho thấy thận ở mức bình thường, mật độ chắc bình thường, màu đỏ thẫm, mặt nhẵn, màu đỏ, không thấy đám sung huyết và đám tổn thương

Kết quả nghiên cứu cho thấy các chỉ số creatinin không có sự khác biệt so với lô chứng, chứng tỏ tectorigienin không ảnh hưởng đến chức năng lọc của cầu thận Kết quả này phù hợp với hình ảnh cấu trúc vi thể của thận

KẾT LUẬN

1 Về thành phần hoá học

1.1 Từ củ sâm đại hành đã phân lập và xác định được cấu trúc của 14 hợp chất là: (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1), eleutherinol (EB-2), eleutherinoside A(EB-3), hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5), isoeleutherin (EB-6), eleuthoside C (EB-7), Eleutherineoside C (EB-8), eleutherinoside B (EB-9), (R)-7-acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyltetralone (EB-10), eleuthoside A (EB-11), eleuthoside B (EB-12), eleutherinoside D (EB-13), 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) Trong số đó, (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1) là hợp chất mới

và hợp chất 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) lần đầu được phân lập từ

loài này

1.2 Từ thân rễ loài xạ can đã phân lập và xác định được cấu trúc của 14 hợp chất

gồm: 7 hợp chất isoflavonoid là irisflorentin (BS-1), tectorigenin (BS-2), iristectorigenin

Chuột ở các lô thí nghiệm đều tăng cân rõ rệt sau 2 tuần và 4 tuần uống thuốc

(ptr/s<0,01) Không thấy có sự khác biệt về mức độ tăng trọng lượng giữa lô chứng và các

lô thử (p > 0,05)

- Ảnh hưởng lên chức năng tạo máu

Kết quả định lượng các thông số huyết học: số lượng hồng cầu (HC), nồng độ

hemoglobin (Hb), tỷ lệ hematocrit (HCT), số lượng tiểu cầu (PLT) và số lượng bạch cầu

(BC), tại các thời điểm sau khi cho uống thuốc 14 ngày (N14) và sau khi uống thuốc 28

ngày (N28) được trình bày ở bảng 4.23

Bảng 4.23 Ảnh hưởng của tectorigienin trên các thông số huyết học của chuột thực

nghiệm

Chỉ số nghiên

cứu

Thời điểm nghiên cứu

Lô chứng (n = 10)

Lô thử 1 (n = 10)

Lô thử 2 (n = 10) p

HC (10 12 /L) N14 8,16 ± 0,21 7,92 ± 0,33 6,87 ± 0,57 > 0,05

N28 7,99 ± 0,27 8,38 ± 0,22 8,51 ± 0,21 > 0,05

Hb

(g/100mL)

N14 13,35 ± 0,36 12,14 ± 0,49 11,34 ± 1,00 > 0,05 N28 13,34 ± 0,31 12,56 ± 0,43 13,17 ± 0,39 > 0,05

HCT

(%)

N14 37,59 ± 1,11 35,57 ± 1,49 32,72 ± 2,16 > 0,05 N28 37,89 ± 1,29 37,20 ± 1,13 38,28 ± 0,88 > 0,05

PLT N14 716,56± 31,88 721,00±40,46 694,60±47,05 > 0,05

N28 812,20± 38,41 792,90±35,59 793,78± 33,35 > 0,05

BC

(10 9 /L)

N14 1,95 ± 0,20 1,80 ± 0,15 1,64 ± 0,21 > 0,05 N28 1,58 ± 0,19 1,99 ± 0,22 1,48 ± 0,11 > 0,05 Tại cả 3 thời điểm nghiên cứu, không thấy có sự biến đổi về số lượng hồng cầu, hàm

lượng hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, số lượng tiểu cầu và số lượng bạch cầu giữa các lô

thực nghiệm (p > 0,05)

- Đánh giá chức năng gan

Kết quả định lượng các thông số AST (aspartat aminotransferase), ALT (alanin amino

transferase), cholesterol toàn phần, protein toàn phần tại các thời điểm N14, N28 được

trình bày trong bảng 4.24

Bảng 4.24 Ảnh hưởng của tectorigienin đến các thông số AST, ALT,

cholesterol toàn phần và protein toàn phần

Chỉ số

nghiên cứu

Thời điểm

nghiên cứu

Lô chứng (n = 10)

Lô thử 1 (n = 10)

Lô thử 2 (n = 10) p ALT

(U/L)

N14 176,28±9,38 156,75±7,11 155,13±7,54 > 0,05 N28 194,58±17,27 173,91±18,61 209,41±22,02 > 0,05

AST

(U/L)

N14 59,68 ± 4,79 64,74±3,15 64,80±5,93 > 0,05 N28 75,04 ±3,99 82,66±5,48 74,09±7,90 > 0,05

Cholesterol

toàn phần

(mmol/L)

N14 1,88±0,10 2,06±0,11 2,05 ± 0,12 > 0,05 N28 2,04±0,14 1,79±0,13 1,76 ± 0,10 > 0,05

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu thực vật: củ sâm đại hành thu tại Chí Linh, Hải Dương vào tháng 1 năm

2011 và thân rễ cây xạ can thu vào tháng 1 đến tháng 3 năm 2010 tại Lạng Sơn

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp

mỏng điều chế, sắc ký cột (CC) pha thường và pha đảo

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất: kết hợp giữa các thông số vật lý với các

phương pháp phổ hiện đại như: phổ khối lượng, phổ khối phân giải cao, phổ cộng hưởng

từ hạt nhân 1D, 2D NMR

2.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học:

Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vivo của các cặn chiết:

- Theo đường bôi: theo phương pháp của Mrudula Kale (2007), Jaijoy K (2010)

- Theo đường uống: theo phương pháp của Miklos Gabor (2009)

Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC (dendritic cells) sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS (lipopolysaccharide) của các hợp chất phân lập được từ cây sâm đại hành: được tiến hành tại Viện CN sinh học Hàn

Quốc, các hợp chất được thử nghiệm ở các nồng độ 50,0; 25,0; 12,5 và 6,3 µM, dịch huyền phù được thu hoạch sau 16 giờ kích thích, phát hiện nồng độ murine 12p40,

IL-6 và TNF-α bằng máy ELISA

Nghiên cứu tác dụng dược lí in vivo và độ an toàn của tectorigenin phân lập được từ thân rễ cây xạ can

- Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, giảm đau của tectorigenin thực hiện tại bộ môn Dược

lí, trường đại học Dược Hà Nội theo các phương pháp chuẩn thường qui

- Nghiên cứu độ an toàn của tectorigienin được tiến hành tại bộ môn Dược lí, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương: độc tính cấp, độc tính bán trường diễn được đánh giá theo phương pháp của OECD

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM

Chương này mô tả chi tiết các quá trình chiết, phân lập các hợp chất và đánh giá các hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập được

Quy trình phân lập các hợp chất từ củ sâm đại hành

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat của củ sâm đại hành

SKC, SiO 2 HX:Aceton (5:1)

Cặn EB/Et

SKC, SiO 2 , gradient HX:Aceton (40:1 -1:1)

SKC, SiO 2 CHCl 3 :Aceton 10:1)

EB-14 (10mg)

EB-2 (12mg) EB-10 (8mg)

SKC, YMC RP-18, MeOH:H 2 O (6:1)

EB-4

SKC, YMC RP-18 MeOH:H 2 O (3:1)

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước của củ sâm đại hành

Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành

Hợp chất EB-1 (1)

Chất bột màu vàng nhạt; [ α ]25D–58,1(MeOH, c = 0,3); ESI-MS m/z 419 [M‒H]–;

HR-ESI-MS m/z 455,1126 [M+Cl]– (C21H24O9Cl, 455,1114), m/z 419,1338 [M‒H]–

(C21H23O9, 419,1348), m/z 257,0818 [M‒Glc]– (C15H13O4, 257,0819)

1

H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,87 (1H, ddq, J=4,0; 6,1; 12,0, H-2); 2,57

(1H, dd, J=4,0; 16,8, Hb-3); 2,62 (1H, dd, J=12,0; 16,8, Ha-3); 6,85 (1H, s, H-6); 6,67

(1H, s, H-7); 6,45 (1H, s, H-9); 1,46 (1H, d, J=6,1, 2-Me); 2,45 (1H, s, 5-Me); 4,93 (1H,

d, J=7,2, 1′); 3,40 (1H, 2′); 3,47 (1H, 3′); 3,31 (1H, d, J=8,5, 4′); 3,42 (1H,

H-5′); 3,62 (1H, dd, J=5,6; 12,2, Hb-6′); 3,83 (1H, dd, J=2,2; 12,2, Ha-6′)

13

C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,4 (C-1); 78,0 (C-2); 45,9 (C-3); 194,3

(C-4); 114,6 (C-4a); 137,6 (C-5); 124,2 (C-6); 141,4 (C-6a); 103,6 (C-7); 161,4 (C-8);

103,5 (C-9); 158,7 (C-10); 109,9 (C-10a); 20,7 (2-Me); 23,3 (5-Me); 101,7 (C-1′); 74,8

(C-2′); 78,0 (C-3′); 71,4 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,5 (C-6′)

Thuỷ phân hợp chất EB-1

Hoà tan hợp chất EB-1 trong dung dịch HCl 0,1 N (dioxane/H2O, 1:1, v/v, 1,0 ml) rồi

đun cách thuỷ ở 800C trong 3h Sau đó, dung dịch axit được trung hoà bởi Ag2CO3, và

dung môi được loại bỏ triệt để bởi khí N2, sau đó chiết với CHCl3 được lớp CHCl3 và lớp

nước Lớp CHCl3 đem tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi CHCl3

-MeOH (8:1, v/v) thu được hợp chất EB-1a

Lớp nước được làm khô kiệt bởi khí N2, phần cặn hoà tan trong 0,1 ml pyridine khô

rồi thêm vào đó este L-cysteine methyl hydrochloride trong pyridin (0,06 M, 0,1 mL)

Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 600C trong 2 giờ rồi bổ sung thêm 0,1 ml dung

dịch trimethylsilylimidazole và tiếp tục gia nhiệt đến 600C trong 1,5 giờ Sản phẩm sau

khi được làm khô được phân bố với n-hexan (0,1 ml) và H2O (0,1 ml), lớp n-hexan được

phân tích bằng sắc ký khí GC (cột SPB-1 (0,25 mm×30 m), detector FID, nhiệt độ cột

2100C, nhiệt độ tiêm 2700C, nhiệt độ detector 3000C, khí mang He (2,0 ml/phút)) Thời

gian lưu của peak được phát hiện ở 14,11 phút Với những điều kiện trên thì peak của

Cặn EB-W

SKC, Dianion HP-20P, MeOH (0%, 25%, 50%, 75%, 100%)

SKC, SiO 2

EB-1

EB-7

(12mg) (15mg) EB-8

SKC, YMC RP-18

Aceton:H 2 O (1:2)

EB-9

(8mg)

EB-12 (9mg) (14mg) EB-13

SKC, YMC RP-18 MeOH:H 2 O (1:1) EB-F

EB-11 (19mg)

Lô thử uống tectorigienin liều 60mg/kg

313,48±40,52

p3/1<0,05

p3/2>0,05

35,67

56,49±5,01

p3/1<0,01

p3/2>0,05

43,54

Ghi chú: p x/y : mức độ tin cậy của lô x so với lô y

Từ bảng 4.20 ta thấy tectorigienin thể hiện rõ tác dụng chống viêm mạn khi cân khối lượng u hạt lúc ướt và lúc khô Tỷ lệ ức chế u hạt của tectorigienin tương đối cao, khi cân ướt là 35,67%, khi cân khô là 43,54% Tác dụng chống viêm của tectorigienin liều 60 mg/kg cân nặng tương đương với tác dụng chống viêm của prednisolon liều 5 mg/kg cân nặng

b Nghiên cứu về tính an toàn của tectorigienin

* Độc tính cấp

Đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp của tectorigenin ở 5 mức liều khác nhau Số lượng chuột chết ở các lô thử cụ thể được trình bày trong bảng 4.21

Bảng 4.21 Kết quả theo dõi động vật thí nghiệm

Mức liều

Liều thử (g mẫu thử/kg chuột)

Số chuột chết/

sống thực tế

Số chuột chết/

sống kỳ vọng % chết

Từ kết quả trên theo công thức tính của Behrens đã xác định được độc tính cấp của tectorigienin với giá trị LD50 = (1,78 ± 0,13) gam/kg chuột

* Độc tính bán trường diễn

- Về tình trạng chung:

Trong thời gian thử nghiệm, chuột ở cả 3 lô hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống bình thường, phân khô, nước tiểu bình thường Không thấy biểu hiện đặc biệt ở cả 3 lô chuột trong suốt thời gian nghiên cứu Tiến hành cân chuột trước, trong và lúc kết thúc thí nghiệm Mức độ tăng cân của chuột so với trước khi uống

thuốc tại các thời điểm nghiên cứu như sau:

Bảng 4.22 Ảnh hưởng của tectorigienin đến mức độ tăng cân của chuột (%)

Thời điểm nghiên cứu

Lô chứng (n = 10)

Lô thử 1 (n = 10)

Lô thử 2 (n = 10)

p

N0 24,00 ± 0,53 25,98 ± 0,63

ptr/s < 0,01

25,94±0,29

ptr/s < 0,01 >0,05 N14 26,40 ± 0,52 28,75 ± 0,64

ptr/s < 0,01

28,38±0,51

ptr/s < 0,01 >0,05 N28 27,96 ± 0,79 33,76 ± 0,97 p

tr/s < 0,01

31,24±0,68

ptr/s < 0,01 >0,05 p: so với lô chứng ptr/s: so với thời điểm N0

Ghi chú: N0: lúc bắt đầu dùng thuốc; N14: thời gian dùng thuốc sau 14 ngày; N28: thời gian dùng thuốc sau 28 ngày

Tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin được đánh giá qua tác dụng ức chế khả

năng gây phù bàn chân chuột cống bằng carragenin, với liều thử nghiệm là 60 mg

tectorigienin/kg cân nặng chuột cống (mức liều này tương đương với 100 mg

tectorigienin/kgP chuột nhắt) Kết quả được trình bày tại bảng 4.18 và 4.19

Bảng 4.18 Tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin

Lô thí nghiệm Tỉ lệ phù chân chuột tại các thời điểm nghiên cứu

Lô 1

(Chứng trắng)

NaCMC 1%

12,24±1,67 40,27±2,72 46,62 ± 2,7146,9 ± 1,94 62,4±2,20 20,1± 1,66

Lô 2

(Chứng+)

Indomethacin

liều 10mg/kgP

4,69 ± 0,80 12,7± 1,19 22,9 ± 1,13 25,3±1,17 34,7±1,91 11,3±1,35

p2/1 > 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 >0,05

Lô 3

tectorigienin liều

60mg/kgP

1,6 ± 0,85 18,6 ± 2,66 23,5 ± 2,84 19,7±2,62 20,4±2,77 7,6±2,05

p3/1 > 0,05

p3/2 > 0,05

p3/1 > 0,05

p3/2 > 0,05

p3/1 > 0,05

p3/2 > 0,05

p3/1 < 0,05

p3/2 > 0,05

p3/1 < 0,05

p3/2 > 0,05

p3/1 > 0,05

p3/2 > 0,05

Ghi chú: px/y: so sánh lô x và lô y

Như vậy, với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin thể hiện tác dụng

chống viêm rõ nhất là sau 5-7 giờ gây viêm

Bảng 4.19 Tỷ lệ % ức chế phù chân chuột của tectorigienin so với lô chứng trắng

Lô 1 giờ 2 giờ 4 giờ 5 giờ 7 giờ 24 giờ

Lô chứng dương uống

indomethacin liều 10mg/kg 61,69 68,39 50,86 46,31 44,32 43,89

Lô thử tectorigienin liều

60mg/kg 86,93 53,77 49,58 58,04 67,32 62,27

Từ bảng 4.19 cho thấy tỷ lệ ức chế phù chân chuột của tectorigienin liều 60mg/kg cân

nặng khá cao và tương đương với tỷ lệ ức chế phù chân chuột của indomethacin liều 10

mg/kg cân nặng Tỷ lệ ức chế cao nhất ở thời điểm 1 giờ sau gây viêm là 86,93% Thậm

chí, tỷ lệ ức chế phù chân chuột của tectorigienin liều 60 mg/kg cân nặng hầu như cao

hơn tỷ lệ ức chế phù chân chuột của indomethacin ở các thời điểm 1 giờ, 4 giờ và 5 giờ

sau khi gây viêm

* Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigienin

Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigienin trên mô hình gây u

hạt thực nghiệm bằng amian được thể hiện trong bảng 4.20

Bảng 4.20 Tác dụng chống viêm mạn của tectorigienin trên mô hình gây u hạt thực

nghiệm bằng viên amian

(mg)

% ức chế khi cân ướt

M TB khô (mg)

% ức chế khi cân khô

Lô chứng trắng uống

Lô chứng dương uống

prednisolon liều 5mg/kg

280,05±24,43

p <0,05 42,53 55,48±5,20

p <0,01 44,55

đường chuẩn D-glucose và L-glucose có thời gian lưu tương ứng là 14,11 và 14,26 phút

Do đó, có thể xác định được gốc đường của EB-1 là D-glucose

Hợp chất EB-1a

Chất bột màu vàng nhạt; [ α ]25D –38,3(MeOH, c = 0,3); HR-ESI-MS m/z 257,0810

[M-H]‒ (C15H13O4, 257,0819)

1

H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,88 (1H, H-2); 2,72 (1H, dd, J=3,7; 16,8, Hb

-3); 2,80 (1H, dd, J=12,0; 16,8, Ha-3); 6,90 (1H, s, H-6); 6,48 (1H, d, J=2,2, H-7); 6,35 (1H, d, J=2,2, H-9); 1,60 (1H, d, J=6,1, 2-Me); 2,59 (1H, s, 5-Me)

13

C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,8 (C-1); 77,9 (C-2); 46,0 (C-3); 194,0 (C-4); 113,7 (C-4a); 137,3 (C-5); 123,3 (C-6); 141,7 (C-6a); 102,6 (C-7); 162,0 (C-8); 102,9 (C-9); 158,9 (C-10); 108,3 (C-10a); 20,8 (2-Me); 23,4 (5-Me)

Hợp chất EB-2 (2)

Chất bột màu trắng, mp.>310oC, C15H12O4, ESI-MS m/z 257 [M+H]+

1

H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,19 (1H, s, H-6); 6,56 (1H,

s, H-7); 6,58 (1H, s, H-9); 2,37 (1H, s, 2-Me); 2,71 (1H, s, 5-Me); 10,05 (1H, s, 8-OH); 10,15 (1H, s, 10-OH)

13

C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,8 (C-1a), 163,5 (C-2); 112,1 (C-3); 178,6 (C-4); 116,3 (C-4a); 134,4 (C-5); 124,8 (C-6); 138,7 (C-6a); 102,9 (C-7); 156,9 (C-8); 101,2 (C-9); 159,3 (C-10); 107,2 (C-10a); 19,4 (2-Me); 23,0 (5-Me)

Hợp chất EB-3 (3)

Chất bột màu trắng, mp 175-1760C, C21H22O9, ESI-MS m/z 417 [M-H]¯

1

H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,27 (1H, s, H-6); 6,89 (1H,

d, J=2,1 Hz, H-7); 6,66 (1H, d, J=2,1 Hz, H-9); 2,35 (1H, s, 2-Me); 2,70 (1H, s, 5-Me); 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,24 (1H, t, J=7,6 Hz, H-2′); 3,36 (1H, m, H-3′); 3,19 (1H,

t, J=8,3 Hz, H-4′); 3,28 (1H, m, H-5′); 3,69 (1H, dd, J=1,2; 11,4 Hz, Ha-6′); 3,49 (1H, dd,

J=5,5; 11,4 Hz, Hb-6′)

13

C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,3 (C-1a), 163,7 (C-2); 112,1 (C-3); 178,5 (C-4); 117,1 (C-4a); 134,7 (C-5); 125,5 (C-6); 138,1 (C-6a); 101,5 (C-7); 158,5 (C-8); 103,1 (C-9); 156,5 (C-10); 108,7 (C-10a); 19,5 (2-Me); 23,0 (5-Me); 100,0 (C-1′); 73,2 (C-2′); 77,1 (C-3′); 69,6 (C-4′); 76,7 (C-5′); 60,6 (C-6′)

Hợp chất EB-4 (4)

Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp 175-176oC, C16H16O5, ESI-MS m/z 289

[M+H]+

1

H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,49 (1H, q, J=7,0 Hz, H-1); 4,69 (1H, q, J=7,0 Hz, H-3); 8,04 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,38 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 7,01 (1H, t, J=8,0 Hz, H-8); 1,64 (3H, d, J=7,0 Hz, 1-Me); 1,53 (3H, d, J=7,0 Hz, 3-Me); 4,07 (3H, s,

9-OMe); 12,82 (1H, s, 5-OH)

13

C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 1); 69,5 3); 202,9 4); 153,4 (C-5); 118,1 (C-6); 125,4 (C-7); 109,1 (C-8); 155,7 (C-9); 139,4 (C-10); 121,0 (C-11); 107,8 (C-12); 126,0 (C-13); 119,6 (C-14); 17,4 (CH3-1); 16,3 (CH3-3); 56,4 (OCH3-9)

Hợp chất EB-5 (5)

Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp 175-1770C, C16H16O4, ESI-MS m/z 273

[M+H]+

H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,36 (3H, d, J=6,5 Hz, 3-CH3); 1,54 (3H, d,

J=6,5 Hz, 1-CH3); 2,20 (1H, dd, J=10,1; 18,1 Hz, Hß); 2,75 (1H, dd, J=2,1; 18,1 Hz,

4-Hα); 3,60 (1H, m, H-3); 3,96 (3H, s, 9-OCH3); 4,85 (1H, q, J=6,5 Hz, H-1); 7,27 (1H, d,

J=7,5 Hz, H-8); 7,64 (1H, dd, J=8,0; 8,5 Hz, H-7), 7,73 (1H, d, J=8,5 Hz, H-6)

13

C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 70,2 1); 68,7 3); 29,8 4); 183,9

(C-5); 117,7 (C-6); 134,5 (C-7); 118,9 (C-8); 159,3 (C-9); 183,7 (C-10); 148,6 (C-11); 139,9

(C-12); 133,9 (C-13); 120,2 (C-14); 20,7 (1-CH3); 21,2 (3-CH3); 56,4 (9-OCH3)

Hợp chất EB-6 (6)

Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp 174-175oC, C16H16O4, ESI-MS m/z 273

[M+H]+

1

H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,35 (3H, d, J=6,0 Hz, 3-CH3); 1,53 (3H, d,

J=7,0 Hz, 1-CH3); 2,24 (1H, dd, J=10,1; 16,0 Hz, 4-Hß); 2,71 (1H, dd, J=3,5 Hz, 18,5

Hz, 4-Hα); 3,98 (1H, m, H-3); 4,01 (3H, s, 9-OCH3); 5,02 (1H, q, J=6,5 Hz, H-1); 7,28

(1H, d, J=7,5 Hz, H-8); 7,65 (1H, t, J=7,5 Hz, H-7); 7,74 (1H, d, J=7,5 Hz, H-6)

13

C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 1); 62,4 3); 29,5 4); 182,7

(C-5); 117,7 (C-6); 134,7 (C-7); 119,0 (C-8); 159,7 (C-9); 184,2 (C-10); 148,0 (C-11); 139,4

(C-12); 134,0 (C-13); 119,6 (C-14); 19,7 (1-CH3); 21,5 (2-CH3); 56,4 (9-OCH3)

Hợp chất EB-7 (7)

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O14, ESI-MS m/z 599 [M+H]+

1

H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,02 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 3,42 (1H, H-3);

2,68 (1H, dd, J=11,7; 16,5 Hz, Hb-4); 3,00 (1H, Ha-4); 8,07 (1H, d, J=8,9 Hz, H-6); 7,28

(1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, H-7); 6,86 (1H, d, J=7,6 Hz, H-8); 1,49 (1H, d, J=6,2 Hz, 1-Me);

1,23 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 3,99 (1H, s, 9-OMe); 9,60 (1H, s, 10-OH); 4,51 (1H, d,

J=8,3 Hz, H-1′); 3,37 (1H, H-2′); 3,15 (1H, H-3′); 3,24 (1H, H-4′); 3,21 (1H, H-5′); 3,55

(1H, dd, J=5,5; 11,0 Hz, Hb-6′); 3,91 (1H, dd, J=1,4; 11,0 Hz, Ha-6′); 4,12 (1H, d, J=8,3

Hz, H-1ʺ); 2,92 (1H, H-2ʺ); 3,10 (1H, H-3ʺ); 3,03 (2H, H-4ʺ, H-5ʺ); 3,39 (1H, Hb-6ʺ);

3,61 (1H, br d, J=11,6 Hz, Ha-6ʺ)

13

C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 70,0 1); 69,0 3); 33,1 4); 140,5

(C-5); 115,5 (C-6); 125,7 (C-7); 104,2 (C-8); 155,9 (C-9); 146,3 (C-10); 120,5 (C-11); 129,6

12); 128,3 13); 113,1 14); 21,8 (1-Me); 21,7 (3-Me); 56,4 (9-OMe); 105,3

1′); 74,1 2′); 75,1 3′); 69,9 4′); 76,6 5′); 68,6 6′); 103,1 1ʺ); 73,7

(C-2ʺ); 76,7 (C-3ʺ); 70,0 (C-4ʺ); 76,9 (C-5ʺ); 61,1 (C-6ʺ)

Hợp chất EB-8 (8)

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O14, ESI-MS m/z 599 [M+H]+

1

NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,21 (1H, q, J=6,8 Hz, 1); 4,11 (1H, m,

H-3); 2,46 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, Hb-4); 3,50 (1H, Ha-4); 7,90 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6);

7,31 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 6,85 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,56 (1H, d, J=6,8 Hz, 1-Me);

1,32 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 4,03 (1H, s, 9-OMe); 4,79 (1H, H-1′); 3,51 (1H, H-2′);

3.16 (1H, H-3′); 3,57 (1H, H-4′); 3,52 (1H, H-5′); 3,94 (1H, dd, J=4,8; 11,7 Hz, Hb-6′);

3,95 (1H, Ha-6′); 3,95 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 3,30 (1H, H-2ʺ); 3,22 (1H, H-3ʺ); 3,30

(1H, H-4ʺ); 3,30 (1H, m, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd, J=6,2; 12,4 Hz, H-6aʺ); 3,53 (1H, dd,

J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ)

13

C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,8 1); 64,4 3); 62,4 4); 141,8

(C-5); 117,0 (C-6); 126,7 (C-7); 105,2 (C-8); 157,2 (C-9); 147,0 (C-10); 121,0 (C-11); 127,3

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của tectorigienin lên số cơn đau quặn

Thời gian Mẫu thử

Số cơn đau quặn 0–5 phút 5-10 phút 10-15 phút 15–20 phút 20–25 phút 25–30 phút

Lô 1 (Chứng trắng)

dung dịch NaCl 0,9%)

10 ± 0,61 18 ± 0,47 18,1±0,39 13,77±0,35 14± 0,28 11,3± 0.32

Lô 2 (Chứng +)

aspirin liều

240 mg/kgP

5,25± 0,54 11 ± 0,43 9,75±0,45 7,5 ± 0,22 7,25 ± 0,26 6,87 ± 0,24

p2/1> 0,05 p2/1< 0,05 p2/1< 0,05 p2/1< 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1< 0,05

Lô 3

tectorigienin liều

50 mg/kgP

8,2 ± 0,27 15,4 ± 0,29 11,7±0,33 10,3 ± 0,28 7,9 ± 0,36 6,3 ± 0,26

p3/1 > 0,05

p3/4 > 0,05

p3/1 > 0,05

p3/4 < 0,05

p3/1< 0,05

p3/4 <0,05

p3/1 < 0,05

p3/4 > 0,05

p3/1 < 0,05

p3/4 > 0,05

p3/1 < 0,05

p3/4 > 0,05

Lô 4

tectorigienin liều

100 mg/kgP

5,57 ± 0,49 11,1 ± 0,33 7,14±0,54 8,4 ± 0,33 7,14 ± 0,40 6,0 ± 0,28

p4/1>0,05

p4/2>0,05

p4/1<0,05

p4/2>0,05

p4/1<0,05

p4/2>0,05

p4/1<0,05

p4/2>0,05

p4/1<0,05

p4/2>0,05

p4/1 < 0,05

p4/2 > 0,05

Lô 5

tectorigienin liều

200 mg/kgP

7,77 ± 0,32 13,0 ± 0,27 12,1±0,20 10,2±0,25 7,5 ± 0,35 5,5 ± 0,17

p5/1 >0,05

p5/4 >0,05

p5/1 < 0,05

p5/4 > 0,05

p5/1 < 0,05

p5/4 < 0,05

p5/1 < 0,05

p5/4 > 0,05

p5/1 < 0,05

p5/4 > 0,05

p5/1 < 0,05

p5/4 > 0,05

Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy của lô x so với lô y Tectorigenin thể hiện tác dụng giảm số cơn đau quặn rõ rệt ở cả 3 liều đã thử Với liều

50 mg/kg cân nặng, tectorigenin bắt đầu thể hiện tác dụng từ giai đoạn thứ 3 của quá trình nghiên cứu (10-15 phút sau khi gây đau bằng acid acetic) Khi dùng liều 100 mg/kg

và liều 200 mg/kg cân nặng, tectorigenin có tác dụng giảm đau sau 5 phút sau khi tiêm acid acetic và tác dụng này vẫn còn thể hiện rõ tại thời điểm 30 phút sau khi gây đau

Bảng 4.17 Ảnh hưởng của tectorigienin đến tỷ lệ giảm đau của các lô uống thuốc so với

lô không uống thuốc qua các giai đoạn

Lô

Liều dùng (mg/kg)

Tỷ lệ giảm đau (%) ở các giai đoạn

0-5 phút

5-10 phút

10-15 phút

15-20 phút

20-25 phút

25-30 phút

Lô chứng dương uống aspirin 240 47,50 40,00 46,17 45,56 48,21 39,34

Lô thử uống tectorigienin

50 18,00 16,00 35,40 25,24 43,57 44,41

100 44,29 39,22 60,56 38,82 48,98 47,06

200 22,22 29,09 33,13 25,81 46,03 47,06 Tectorigenin có tác dụng giảm đau với tỷ lệ % ức chế số cơn đau khá cao, cao nhất là tectorigenin liều 100mg/kg cân nặng ở giai đoạn thứ 3 (10-15 phút), tỷ lệ giảm đau lên đến 60,56% Với liều 100mg/kg cân nặng, tectorigenin có khả năng giảm số cơn đau tốt hơn so với liều 50 mg/kg cân nặng và liều 200 mg/kg cân nặng Ở tất cả các giai đoạn và với liều này, tectorigenin có tác dụng ức chế tương đương với aspirin liều 240mg/kg cân nặng

* Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin

Tectorigenin

4’-O-β-D-glucopyranoside (BS-10)

Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (BS-11) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can

Isoquercetin (BS-12) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can

24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol (BS-13)

Axit myristic (BS-14) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can 4.2.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm

Hợp chất tectorigenin đã được phân lập từ thân rễ xạ can với hàm lượng tương đối lớn

và là thành phần chính trong cây xạ can Nhằm định hướng tạo cơ sở để phát triển, khai

thác và sử dụng hợp chất này có hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sâu hơn về

tác dụng dược lý (hoạt tính kháng viêm, giảm đau) và độ an toàn của tectorigenin trên

động vật thực nghiệm

4.2.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm các cặn chiết thân rễ xạ can

Với hoạt tính kháng viêm theo đường bôi, cả 4 cặn chiết: methanol, hexan, etyl axetat

và cặn nước của mẫu nghiên cứu đều không có khả năng ức chế khối viêm cục bộ theo

đường bôi so với đối chứng Dexamethasone

Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm theo đường uống cho thấy có 2 mẫu

ức chế được trên 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử dụng hoạt

chất), đó là cặn chiết etyl axetat (BS-Et) và cặn chiết nước (BS-W) với % ức chế khối

viêm tương ứng là 70,0% và 64,26% Chất đối chứng dương Indomethacine có hoạt tính

ổn định và ức chế được 64,59% khối viêm

4.2.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học và độ an toàn của tectorigenin phân lập

được từ thân rễ xạ can

a Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau của tectorigenin

* Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của tectorigienin

Tác dụng giảm đau của tectorigenin được tiến hành trên chuột nhắt theo phương

pháp gây đau bằng acid acetic Kết quả được trình bày tại bảng 4.16 và 4.17

12); 130,3 13); 114,4 14); 19,5 (1-Me); 22,2 (3-Me); 56,9 (9-OMe); 105,2 1′); 75,5 2′); 74,7 3′); 71,2 4′); 77,3 5′); 70,8 6′); 103,8 1ʺ); 74,7

(C-2ʺ); 77,3 (C-3ʺ); 71,2 (C-4ʺ); 77,3 (C-5ʺ); 62,4 (C-6ʺ)

Hợp chất EB-9 (9)

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O15, ESI-MS m/z 615 [M+H]+

1

H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,1 (1H, q, J=6,8 Hz, H-1); 4,2 (1H, m, H-3);

4,10 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, H-4); 8,24 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,37 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 6,98 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,63 (1H, d, J=6,8 Hz, 1-Me); 1,06 (1H, d, J=6,2 Hz,

3-Me); 4,07 (1H, s, 9-OMe); 4,07 (1H, H-1′); 3,22 (1H, H-2′); 3,30 (1H, H-3′); 3,25 (1H,

H-4′); 3,29 (1H, H-5′); 3,30 (1H, dd, J=4,8; 11,7 Hz, Hb-6′); 3,41 (1H, Ha-6′); 3,62 (1H,

d, J=7,6 Hz, 1ʺ); 3,11 (1H, 2ʺ); 3,16 (1H, 3ʺ); 3,22 (1H, 4ʺ); 3,29 (1H, m, H-5ʺ); 3,30 (1H, dd, J=6,2, 12,4 Hz, H-6aʺ); 3,33 (1H, dd, J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ)

13

C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,9 1); 67,0 3); 62,6 4); 144,0 (C-5); 117,7 (C-6); 127,0 (C-7); 106,2 (C-8); 157,6 (C-9); 148,0 (C-10); 120,8 (C-11); 128,0 12); 130,4 13); 116,2 14); 17,8 (1-Me); 21,0 (3-Me); 56,9 (9-OMe); 106,2 1′); 77,3 2′); 75,0 3′); 71,2 4′); 77,8 5′); 71,8 6′); 104,2 1ʺ); 75,4

(C-2ʺ); 77,6 (C-3ʺ); 71,6 (C-4ʺ); 77,7 (C-5ʺ); 62,6 (C-6ʺ)

Hợp chất EB-10 (10)

Bột vô định hình màu trắng, C13H14O4, ESI-MS m/z 233 [M-H]¯

1

H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 2,52 (1H, dd, J=8,2; 16,5 Hz; Haq-2); 2,82

(1H, dd, J=3,4; 16,5 Hz, Heq-2); 4,22 (1H, m, H-3); 2,89 (1H, dd, J=7,5; 15,8 Hz, Haq-4); 3,14 (1H, dd, J=3,4; 15,8 Hz, Heq-Haq-4); 6,60 (1H, s, H-5); 2,40 (3H, s, 8-CH3); 2,42 (3H, s, 7-CH3)

13

C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 199,3 1); 50,0 2); 66,8 3); 40,4 (C-4); 114,7 (C-5); 158,8 (C-6); 132,2 (C-7); 140,4 (C-8); 124,9 (C-8a); 147,1 (C-4a); 19,2 (8-CH3); 208,4 (C=O); 32,6 (7-CH3)

Hợp chất EB-11 (11)

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C20H22O9, ESI-MS m/z 407 [M+H]+

1

NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,05 (1H, q, J=6,6 Hz, 1); 8,16 (1H, s,

H-4); 7,60 (1H, d, J=8,3 Hz, H-5); 7,47 (1H, t, J=8,3 Hz, H-6); 7,11 (1H, d, J=8,3 Hz, H-7); 1,70 (1H, d, J=6,6, 1-Me); 3,99 (1H, s, 8-Ome); 4,99 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (2H,

H-2′, Ha-6′); 3,10 (1H, m, 3′); 3,39 (1H, t, J=9,3 Hz, 4′); 3,47 (1H, t, J=9,3 Hz, H-5′); 3,68 (1H, dd, J=2,1; 11,7 Hz, Hb-6′)

13

C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 80,9 (C-1); 172,3 (C-3); 124,0 (C-4); 123,7 (C-5); 128,4 (C-6); 109,8 (C-7); 157,4 (C-8); 147,9 (C-9); 140,7 (C-10); 125,9 (C-11); 139,3 (C-12); 124,0 (C-13); 19,4 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,2 (C-1′); 76,0 (C-2′); 77,8 (C-3′); 71,6 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,4 (C-6′)

Hợp chất EB-12 (12)

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H32O14, ESI-MS m/z 569 [M+H]+

1

H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,12 (1H, q, J=6,9, H-1); 8,15 (1H, s, H-4); 7,60 (1H, d, J=7,6 Hz, H-5); 7,46 (1H, t, J=7,6 Hz, H-6); 7,10 (1H, d, J=7,6 Hz, H-7); 1,68 (1H, d, J=6,9 Hz, 1-Me); 3,98 (1H, s, 8-OMe); 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, 2′); 3,47 (1H, t, J=8,9 Hz, 3′); 3,56 (1H, 4′); 2,32 (1H, H-5′); 3,67 (1H, dd, J=4,9; 11,0 Hz, H -6′); 4,00 (1H, dd, J=2,0; 11,0 Hz, H-6′); 4,16 (1H,

d, J=8,3 Hz, H-1ʺ); 3,12 (1H, dd, J=7,6; 8,3 Hz, H-2ʺ); 3,25 (1H, H-3ʺ); 3,21 (1H, t,

J=8,2 Hz, H-4ʺ); 3,17 (1H, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd, J=4,1; 11,7 Hz, Hb-6ʺ); 3,81 (1H, dd,

J=2,1; 11,7 Hz, Ha-6ʺ)

13

C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 81,1 (C-1); 172,3 (C-3); 124,2 (C-4); 109,8

(C-5); 128,4 (C-6); 123,7 (C-7); 157,5 (C-8); 147,8 (C-9); 140,8 (C-10); 126,0 (C-11);

139,3 (C-12); 124,1 (C-13); 19,2 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,0 (C-1′); 76,2 (C-2′); 77,4

(C-3′); 71,1 (C-4′); 78,0 (C-5′); 69,0 (C-6′); 104,3 (C-1ʺ); 75,1 (C-2ʺ); 76,6 (C-3ʺ); 71,7

(C-4ʺ); 78,0 (C-5ʺ); 62,9 (C-6ʺ)

Hợp chất EB-13 (13)

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H34O14, ESI-MS m/z 571 [M+H]+

1

H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,33 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 5,03 (1H, d,

J=13,1 Hz, Hb-3); 5,40 (1H, q, J=13,1 Hz, Ha-3); 8,03 (1H, d, J=8,2 Hz, H-5); 7,31 (1H,

t, J=8,2 Hz, H-6); 6,91 (1H, d, J=8,2 Hz, H-7); 1,45 (1H, d, J=6,2 Hz, 1-Me); 3,99 (1H, s,

8-OMe); 4,53 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1′); 3,30 (2H, H-2′, H-5′); 3,08 (1H, m, H-3′); 3,20

(1H, H-4′); 3,56 (1H, dd, J=6,2, 11,0 Hz, Hb-6′); 3,95 (1H, d, J=11,0 Hz, Ha-6′); 4,11

(1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 2,94 (1H, m, H-2ʺ); 3,01 (2H, H-3ʺ, H-4ʺ); 3,20 (1H, H-5ʺ);

3,38 (1H, dd, J=4,8; 11,0 Hz, Hb-6ʺ); 3,62 (1H, dd, J=5,5; 11,0 Hz, Ha-6ʺ)

13

C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 78,3 (C-1); 70.6 (C-3); 137,6 (C-4); 115,7

(C-5); 125,8 (C-6); 104,6 (C-7); 156,2 (C-8); 143,8 (C-9); 124,8 (C-10); 130,9 (C-11);

130,4 (C-12); 114,9 (C-13); 20,1 (1-Me); 56,2 (8-OMe); 104,6 (C-1′); 73,8 (C-2′); 76,6

(C-3′); 69,9 (C-4′); 75,2 (C-5′); 68,7 (C-6′); 103,2 (C-1ʺ); 73,5 (C-2ʺ); 76,8 (C-3ʺ); 69,9

(C-4ʺ); 76,3 (C-5ʺ); 61,0 (C-6ʺ)

Hợp chất EB-14 (14)

Chất bột màu trắng, mp.>310oC, C15H10O5, ESI-MS m/z 271 [M+H]+

1

H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 2,61 (3H, s, 8-CH3); 6,40 (1H, d, J=2,7 Hz,

H-2); 6,94 (1H, d, J=2,7 Hz, H-4); 6,80 (1H, d, J=2,7 Hz, H-7); 7,31 (1H, d, J=2,7 Hz,

H-5);

13

C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 166,2 (C-1); 109,3 (C-2); 165,3 (C-3); 108,2

(C-4); 113,3 (C-5); 163,0 (C-6); 125,6 (C-7); 146,6 (C-8); 189,5 (C-9); 184,1 (C-10);

111,6 (C-9a); 135,8 (C-4a); 138,3 (C-10a); 124,3 (C-8a); 24,2 (8-CH3)

penta-substituted và một nhóm methoxyl tại δ 3,87 (3H, s, OCH3-6) Tín hiệu doublet doublet tại δ 6,84 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz, 3′, 5′) và 7,35 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz,

H-2′, 6′) dự đoán nhóm thế của vòng thơm là para-substitued,

Phổ 13C-NMR của BS-2 chỉ ra tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon, gồm một nhóm

methoxyl và 15 cac bon của khung isoflavone, các tín hiệu này đã được xác nhận thêm qua phổ DEPT 90, DEPT 135 và HSQC Thêm vào đó, trên phổ ESI MS pic ion phân tử [M-H]+ của BS-2 xuất hiện tại m/z 299 hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử

C16H12O6

Khi so sánh với tài liệu tham khảo, tất cả dữ liệu phổ của chất BS-2 đồng nhất với các

dữ liệu phổ của 4′,5,7-trihydroxy-6-methoxyisoflavone hay tectorigenin vì vậy chất BS-2

được xác định là tectorigenin

Hình 4.18d Cấu trúc của hợp chất BS-2 (Tectorigenin) Bảng 4.13 Bảng tổng hợp các hợp chất BS-1→BS-14 phân lập được từ thân rễ cây

xạ can

Irisflorentin (BS-1) Tectorigenin (BS-2) Iristectorigenin A (BS-3)

Irigenin (BS-4) Acetovanillone (BS-5)

Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can

Rhamnocitrin (BS6-)

Irilin D (BS-7) Daucosterol (BS-8) Tectoridin (BS-9)

Kết quả cho thấy hợp chất mới EB-1 và 3 hợp chất đã biết khác là EB-4, EB-5, và

EB-6 thể hiện hoạt tính ức chế sự sản sinh IL-12p40 ở nồng độ 25 µM Do vậy các hợp

chất này được tiếp tục lựa chọn để làm các thử nghiệm tiếp theo ở nồng độ 6,3 đến 50,0

µM SB203580 được sử dụng làm đối chứng dương, chất này ức chế sự sản sinh của

IL-12 p40, IL-6 và TNF-α với giá trị IC50 tương ứng là 5,2±0,1, 3,5±0,1 và 7,5±0,2 µM

(Bảng 4.12)

Bảng 4.12 Hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành trên tế

bào tua sinh ra từ tủy xương được kích thích bởi LPS

IC50

IL-12 p40 (µg/mL) IL-6 (µg/mL) TNF-α (µg/mL)

Cặn chiết methanol 0,1 ± 0,05 16,2 ± 0,3 >50

SB203580 a)

Hợp chất IL-12 p40 (µM) IL-6 (µM) TNF-α (µ M)

SB203580 a)

a)

đối chứng dương

Kết quả cho thấy các hợp chất EB-1, EB-4, EB-5, EB-6 và cặn chiết EB-Me ức chế

sự sản sinh IL-12 p40 được kích thích bởi LPS với giá trị IC50 từ 0,1±0,08 µM đến

5,0±0,4 µM Các hợp chất EB-1, EB-5 và EB-6 cũng ức chế sự sản sinh IL-6 với giá trị

IC50 từ 1,7±0,1 µM đến 5,0±0,2 µM Tuy nhiên, chỉ có hai hợp chất EB-4 và EB-5 có

hoạt tính ức chế ở mức độ trung bình sự sản sinh TNF-α với giá trị IC50 tương ứng là

61,2±1,5 µM và 39,6± 2,0 µM Các hợp chất (–)-hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5) và

isoeleutherin (EB-6) được phân lập từ cây Eleutherine americana cũng ức chế sự sản

sinh nitric oxide ở dòng tế bào đại thực bào ở chuột RAW 264,7 được hoạt hóa bởi LPS

Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của cây E bulbosa được

công bố Như vậy, hợp chất mới EB-1 và 3 hợp chất đã biết EB-4, EB-5 và EB-6 phân

lập từ củ sâm đại hành đã thể hiện hoạt tính ức chế sự sản sinh của TNF-α, IL-6 và IL-12

p40 trong tế bào DCs được kích thích bởi LPS Kết quả nghiên cứu này cho thấy các hợp

chất trên có thể được sử dụng như là chất kháng viêm tiềm năng trong tương lai

4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI XẠ CAN

4.2.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ thân rễ cây xạ can

Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc 14 hợp chất

phân lập được từ thân rễ xạ can, trong đó có 4 hợp chất BS-5, BS-11, BS-12 và BS-14

lần đầu được phân lập từ cây xạ can và 2 hợp chất có hàm lượng lớn là tectoridin và

tectorigienin Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

tectorigienin (BS-2):

Chất BS-2 phân lập được dạng tinh thể màu vàng nhạt, điểm chảy 235-236°C Sự có

mặt của khung isoflavon trong phân tử chất BS-2 được dự đoán qua phổ hấp thụ tử ngoại

UV tại λmax 259, 320nm Phổ 1H-NMR của BS-2 chỉ ra sự có mặt một singlet tại δ 7,99

(1H, s) là của proton H-2, các tín hiệu singlet khác tại δ 6,41 (1H, s) dự đoán vòng A là

Quy trình phân lập các hợp chất từ thân rễ xạ can

Hình 3.4 Sơ đồ phần lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat cây xạ can

Hình 3.5 Sơ đồ phần lập các hợp chất từ cặn nước cây xạ can

Hằng số vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất phân lập được từ cây xạ can Hợp chất BS-1 (15)

Bột màu vàng nhạt, mp 168-169oC, C H O ESI-MS m/z 385 [M-H]¯

Cặn BS/W (4,7gam)

SK cột, CH 2 Cl 2 : MeOH (4:1)

SK cột CHCl 3 : MeOH : H 2 O (80:18:2)

BS- 11

(12 mg)

BS-12

(11 mg)

SK cột RP 18

E4.1

BS-10

(7 mg)

SKLMĐC RP 18 MeOH: H 2 O (5:5)

BS-8

(12 mg)

BS-7

(5 mg)

SKC, RP18 MeOH:H 2 O (4:6)

BS-6

(10 mg)

BS-9

(42 mg)

1.SKC, RP18, MeOH:H 2 O (1:1) 2.SKLMĐC, RP18, MeOH:H 2 O (6:4)

Cặn BS-EtOAc

SKC, SiO 2 , gradient CHCl 3 :MeOH (99:1 -50:50)

F3.1 F3.2 F3.3

SKC, SiO 2

CHCl 3 :MeOH

SKC MeOH:CHCl 3 (15:1)

SKC, SiO 2

CHCl 3 :MeOH (20:1)

SKC, SiO 2

CHCl 3 :MeOH (15:1)

Kết tinh lại MeOH

BS-13

(5 mg)

BS-14

(15 mg)

SKC, SiO 2 , HX:EtOAC 10:1

F1

BS-2

(480 mg)

F4

BS-1

(8 mg)

BS-5

(9 mg)

BS-4 (8 mg)

F5.2.1 SKLMĐC RP18 MeOH:H 2 O (7:3)

BS-3

(20 mg)

H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 7,77 (1H, s, H-2); 6,56 (1H, s, H-8); 6,67

(2H, s, H-2′, H-6′); 5,99 (2H, s, -O-CH2-O-); 4,00 (3H, s, OCH3-5); 3,81 (6H, s, OCH3-3′,

5′), và 3,77 (3H, s, OCH3-4′)

13

C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 56,0 (OCH3-3′, 5′); 60,6 (OCH3-4′); 60,9

(OCH3-5); 92,9 (C-8); 102,1 (-O-CH2-O-); 106,6 (C-2′, 6′); 113,4 (C-10); 125,4 (C-3);

127,3 (C-1′); 135,2 (C-6); 137,9 (C-4′); 141,5 (C-5); 150,8 (C-2); 152,8 (C-3′, 5′); 152,9

(C-7); 154,5 (C-9); và 175,3 (C-4)

Hợp chất BS-2 (16)

Tinh thể màu vàng, mp 235-236oC, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]¯

1

H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,87 (3H, s, OCH3-6); 6,41 (1H, s, H-8); 6,84

(2H, dd, J=8,5; 1,5Hz, H-3′, 5′); 7,35 (2H, dd, J=8,5; 1,5Hz, H-2′, 6′); và7,99 (1H, s,

H-2)

13

C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10);

116,2 (C-2′,6′); 123,1 (C-3); 124,1 (C-1′); 131,3 (C-3′, 5′); 132,7 (C-6); 154,4 (C-5);

154,7 (C-7); 154,8 (C-2); 158,5 (C-9); 158,6 (C-4′); và 182,4 (C-4)

Hợp chất BS-3 (17)

Tinh thể màu vàng nhạt, mp 237-238°C, C17H14O7, ESI-MS m/z 329 [M-H]¯

1

H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3-6); 3,90 (3H, s, OCH3-3′);

6,46 (1H, s, H-8); 6,88 (1H, d, J=8,0 Hz, H-2′); 6,96 (1H, dd, J=8,0; 2,0 Hz, H-6′); 7,14

(1H, J=2,0Hz, H-5′); và 8,06 (1H, s, H-2)

13

C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 56,4 (OCH3-3′); 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8);

106,6 (C-10); 113,8 (C-5′); 116,1 (C-2′); 122,7 (C-6′); 123,5 (C-3); 124,2 (C-1′); 132,7

(C-6); 147,7 (C-4′); 148,6 (C-3′); 154,4 (C-5); 154,7 (C-7); 154,8 (C-2); 158,6 (C-9); và

182,4 (C-4)

Hợp chất BS-4 (18)

Bột màu vàng, mp 184-185°C, C18H16O8, ESI-MS m/z 359 [M-H]¯

1

H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ: (ppm) 3,88 (3H, s, OCH3-4′); 3,89 (3H, s, OCH3-5′);

3,94 (3H, s, OCH3-6); 6,48 (1H, s, H-8); 6,68 (2H, dd, J=6,0; 2,0 Hz, H-2′, 6′); và 7,90

(1H, s, H-2)

13

C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 55,7 (OCH3-6); 60,3 (OCH3-4′); 60,4

(OCH3-5′); 93,9 8); 104,9 10); 105,7 2′); 109,4 6′); 122,9 3); 126,4

(C-1′); 131,2 (C-6); 136,2 (C-4′); 149,8 (C-3′); 152,7 (C-5′); 152,8 (C-5); 153,2 (C-9); 153,3

(C-2); 156,7 (C-7); và 180,7 (C-4)

Hợp chất BS-5 (19)

Bột màu trắng, mp 113oC, C9H10O3, ESI-MS m/z 167 [M+H]+

1

H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 2,56 (3H, s, CH3-8); 3,96 (3H, d, J=7,5Hz, OCH3-9);

6,06 (1H, s, OH); 6,94 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,54 (1H, dd, J=1,8; 8,0 Hz, H-7); và

7,53 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-3)

13C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 196,7 (C=O); 130,3 (C-2); 124,1 (C-3); 146,6 (C-4);

150,4 (C-5); 113,8 (C-6); 109,8 (C-7); 26,17 (CH3-8) và 56,12 (CH3-9)

Hợp chất BS-6 (20)

Tinh thể màu vàng, mp.221-223°C, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]+

1

H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3); 6,54 (1H, s, H-8); 6,56

(1H, s, H-6); 6,93 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3′, 5′) và 7,82 (2H, d, J=9,0 Hz, H-2′, 6′)

methylchroman-4-one có độ quay cực là [α]D= +53,2 Điều này xác nhận hợp chất

EB-1a có cấu hình ở C-2 là S Do vậy, hợp chất EB-1 được xác định là (2S)

dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được

phân lập từ thiên nhiên

Hình 4.1d, h Cấu trúc của hợp chất EB-1a và EB-1

4.1.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm

4.1.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của các cặn chiết của củ sâm đại hành

Với hoạt tính kháng viêm theo đường bôi, cả 4 cặn chiết methanol, n-hexan, ethyl

axetat và cặn chiết nước của củ sâm đại hành đều không có khả năng ức chế khối viêm cục bộ theo đường bôi so với đối chứng Dexamethasone

Kết quả nghiên cứu theo đường uống cho thấy chỉ có cặn chiết etyl axetat (EB-Et) ức

chế được trên 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử dụng hoạt chất)

với % ức chế khối viêm là 52,12% Chất đối chứng dương Indomethacine có hoạt tính ổn

định và ức chế được 64,59% khối viêm

4.1.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân lập được

từ củ sâm đại hành

Đầu tiên, chúng tôi đã sử dụng phương pháp nhuộm màu MTT để đánh giá ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào của 14 hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành Sau

đó đã tiến hành thử hoạt tính ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh

ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành

Hình 4.15 Tác dụng của hợp chất EB-1-EB-14 ở nồng độ 25,0 µm đến sự sản sinh

IL-12p40 từ tế bào tua DC được kích thích bởi LPS