tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn achromobacter xylosoxidans bm13 bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion âm

Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide SDS – PAGE Điện di trên gel polyacrylamide với sự có mặt của SDS Sodium dodecyl sulfate là kỹ thuật thường được sử dụng trong hóa sinh, di tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- - -    - - -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY

VI KHUẨN ACHROMOBACTER XYLOSOXIDANS BM13

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION ÂM

Cần Thơ, tháng 5 năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- - -    - - -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY

VI KHUẨN ACHROMOBACTER XYLOSOXIDANS BM13

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION ÂM

Cần Thơ, tháng 5 năm 2015

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS TS Trần Nhân Dũng

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG

Cần Thơ, ngày tháng năm 2015

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ - -

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được sự động viên khích lệ to lớn cả về vật chất lẫn tinh thần từ gia đình, sự quan tâm hướng dẫn, giúp đỡ từ thầy cô và bạn bè Đó chính là động lực giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Xin được gửi lời cảm ơn đến thầy PGS TS Trần Nhân Dũng, thầy Ths Võ Văn Song Toàn, hai thầy cố vấn đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như tận tụy hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài Xin được gửi lời tri ân sâu sắc đến quý thầy

Xin được gửi lời cám ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Đức Độ, tất cả quý thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền đạt, giúp

đỡ tôi có những kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực hiện đề tài

Xin chân thành cám ơn các bạn sinh viên Ngô Thùy Dương lớp CNSHTT K36, Nguyễn Lê Bảo Trân lớp CNSHTT K36, các em sinh viên lớp CNSH K37, VSV K3

và các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm Công Nghệ Enzyme, Sinh Hóa đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Xin gửi lời cám ơn chân thành đến cố vấn học tập cô Trần Thị Xuân Mai đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình và người thân đã động viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian qua

để tôi vững tin hoàn thành đề tài này

Cuối lời, kính chúc mọi người luôn mạnh khỏe, hạnh phúc, vui vẻ và thành đạt Xin trân trọng cám ơn!

Cần Thơ, ngày 01 tháng 05 năm 2015

Võ Trung Nghĩa

- -TÓM LƯỢC

Đề tài “Tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BM13 bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion âm Uno Sphere Q” được thực hiện nhằm mục tiêu khảo sát phương pháp kết tủa hiệu quả và tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BM13 Dịch vi khuẩn BM13 được nuôi cấy trong môi trường bổ sung cơ chất bã mía sau khi ủ kị khí

ở 38 o C trong 5 ngày được ly tâm để thu enzyme ngoại bào Từ 700 ml dịch enzyme ngoại bào ban đầu với protein tổng là 28,2 mg và hoạt tính tổng là 985,2 U, dịch enzyme được tủa phân đoạn với ammonium sulfate (AS), tủa với các dung môi hữu cơ ethanol và acetone Kết quả cho thấy phương pháp tủa phân đoạn với AS hiệu quả hơn

cả khi hiệu suất thu hổi đạt khá cao và ít bị biến tính enzyme Trong đó, phân đoạn 50 – 80% AS là phân đoạn hiệu quả nhất khi protein tổng và hoạt tính tổng của endoglucanase đạt lần lượt là 7,38 mg; 672,2 U Phân đoạn tủa bằng AS từ 50 – 80% được giữ lại và tinh sạch tiếp tục bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion âm trên gel Uno Sphere Q Dịch enzyme tách ra phân đoạn FI Phân đoạn FI có hàm lượng protein và hoạt tính đặc hiệu lần lượt là 2,8 mg và 84,2 U/mg Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE kết hợp phương pháp nhuộm bạc với độ nhạy cao xác định enzyme tinh sạch có hai băng với trọng lượng phân tử là 64,4 kDa và 60,4 kDa Toàn bộ quá trình tinh sạch đạt hiệu suất 38,6% và độ tinh sạch tăng lên 7 lần

endoglucanase, sắc ký trao đổi ion âm

MỤC LỤC

Trang

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH HÌNH v

DANH SÁCH BẢNG vi

TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về Achromobacter xylosoxidans 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện 3

2.1.2 Phân loại 3

2.1.3 Đặc điểm của Achromobacter xylosoxidans 3

2.2 Tổng quan về endoglucanase 5

2.2.1 Enzyme cellulase 5

2.2.2 Cấu trúc endoglucanase 6

2.2.3 Cơ chế thủy phân của endoglucanase 8

2.2.4 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính endoglucanase 8

2.2.4.1 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ 8

2.2.4.2 Ảnh hưởng bởi pH 9

2.2.4.3 Ảnh hưởng của ion kim loại 9

2.2.4.4 Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase 9

2.2.4.5 Một số tính chất khác của endoglucanase 10

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 10

2.3.1 Trích ly protein 10

2.3.1.1 Phương pháp ly tâm 10

2.3.1.2 Phương pháp lọc 11

2.3.2 Phương pháp tủa protein 11

2.3.2.1 Phương pháp tủa bằng muối 11

2.3.2.2 Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ 12

2.3.2.3 Phương pháp tủa bằng điểm đẳng điện 13

2.3.3 Phương pháp sắc ký trao đổi ion 14

2.3.4 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE) 16

2.3.5 Các phương pháp phân tích protein 18

2.3.5.1 Khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 18

2.3.5.2 Khảo sát hoạt tính protein 19

a Định tính protein bằng vòng tròn đường kính thủy phân 19

b Định lượng hoạt tính bằng phương pháp Nelson - Somogyi 19

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 20

2.4.1 Trong nước 20

2.4.2 Ngoài nước 21

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Phương tiện nghiên cứu 22

3.1.1 Thời gian và địa điểm 22

3.1.2 Nguyên, vật liệu 22

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị 22

3.1.4 Hóa chất 22

3.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 23

3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.2.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate 24

3.2.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với ethanol 25

3.2.3 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với acetone 26

3.2.4 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 27

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 28

4.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate 28

4.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với ethanol 32

4.3 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với acetone 35

4.4 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký ion âm với gel Uno Sphere Q 39

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 3 KẾT QUẢ THỐNG KÊ

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans 4

Hình 2 Phân loại enzyme cellulase 5

Hình 3 Đặc tính và thứ tự phân cắt của 3 loại enzyme thuộc hệ enzyme cellulase 6

Hình 4 Cấu trúc các domain của endoglucanase 7

Hình 5 Cấu trúc tâm hoạt động endoglucanase khi tương tác với cơ chất cellobiose 7

Hình 6 2 cơ chế thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic 8

Hình 7 Ảnh hưởng của nồng độ muối đối với tính tan của protein 12

Hình 8 Cấu trúc amino acid khi pH thay đổi 13

Hình 9 Giản đồ thể hiện điểm đẳng điện của protein 14

Hình 10 Hai loại hạt gel dùng trong sắc ký trao đổi ion 15

Hình 11 Sắc ký trao đổi ion 16

Hình 12 Biểu đồ hấp thụ điện tích protein trong sắc ký trao đổi ion 16

Hình 13 Công thức phân tử Coomassie Brilliant Blue G-250 19

Hình 14 Hoạt tính giữa các phân đoạn tủa với AS bằng phản ứng thủy phân cơ chất CMC 29

Hình 15 ĐKTP các phân đoạn tủa với ammonium sulfate 30

Hình 16 Lượng cơ chất CMC bị thủy phân bởi enzyme tủa bằng ethanol 33

Hình 17 Đường kính thủy phân của enzyme tủa bằng ethanol 34

Hình 18 Lượng cơ chất CMC bị thủy phân bởi enzyme tủa bằng acetone 35

Hình 19 Đường kính thủy phân của enzyme tủa bằng acetone 36

Hình 20 Sắc ký đồ phân đoạn 50 – 80% AS 39

Hình 21 ĐKTP endoglucanase 40

Hình 22 ĐKTP endoglucanase 40

Hình 23 Điện di SDS-PAGE 41 Hình 24 Bảng chuẩn lượng muối ammonium sulfate khi tủa phân đoạn PL1 Hình 25 Đường chuẩn Bradford PL2 Hình 26 Đường chuẩn Nelson - Somogyi PL2 Hình 27 Đường chuẩn CMC PL2 Hình 28 Đường chuẩn trọng lượng phân tử của protein chuẩn PL2

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Thành phần môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn (M1) 23

Bảng 2: Thành phần môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn (M2) 23

Bảng 3: Tổng kết quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn ammonium sulfate 28

Bảng 4: Endoglucanase được tủa với ethanol 32

Bảng 5: Endoglucanase được tủa với acetone 35

Bảng 6: So sánh số liệu giữa 3 phương pháp tủa protein 38

Bảng 7: Sắc ký trên gel Uno Sphere Q 39

Bảng 8: Tóm tắt quy trình tinh sạch 41 Bảng 9: Dựng đường chuẩn BSA PL1 Bảng 10: Pha dung dịch đường chuẩn glucose PL1 Bảng 11: Dựng đường chuẩn glucose PL1 Bảng 12: Dung dịch chạy điện di PL1 Bảng 13: Dung dịch buffer PL1 Bảng 14: Thành phần gel phân tích PL1 Bảng 15: Thành phần gel tập trung PL1 Bảng 16: Giá trị OD 595nm đường chuẩn BSA PL2 Bảng 17: Giá trị OD 520nm đường chuẩn glucose PL2 Bảng 18: Giá trị độ nhớt đường chuẩn CMC PL2 Bảng 19: Số liệu đường tuyến tính trọng lượng phân tử và khoảng cách di chuyển của protein chuẩn PL2 Bảng 20: Giá trị OD 595nm định lượng protein các phân đoạn tủa với ammonium sulfate PL2 Bảng 21: Định lượng protein tủa bằng AS PL2 Bảng 22: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính các phân đoạn tủa với ammonium sulfate PL2 Bảng 23: Định lượng hoạt tính enzyme tủa bằng AS PL2 Bảng 24: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa bằng AS PL2 Bảng 25: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa bằng AS PL2 Bảng 26: Giá trị OD 595nm định lượng protein các phân đoạn tủa bằng ethanol PL2

Bảng 27: Định lượng protein tủa bằng ethanol PL2 Bảng 28: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính các phân đoạn tủa bằng ethanol PL2 Bảng 29: Định lượng hoạt tính enzyme tủa bằng ethanol PL2 Bảng 30: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa bằng ethanol PL2 Bảng 31: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa bằng ethanol PL2 Bảng 32: Giá trị OD 595nm định lượng protein các phân đoạn tủa bằng acetone PL2 Bảng 33: Định lượng protein tủa bằng acetone PL2 Bảng 34: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính các phân đoạn tủa bằng acetone PL2 Bảng 35: Định lượng hoạt tính enzyme tủa bằng acetone PL2 Bảng 36: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa bằng acetone PL2 Bảng 37: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa bằng acetone PL2 Bảng 38: Giá trị OD 280nm các phân đoạn sắc ký trên gel Uno Sphere Q PL2 Bảng 39: Giá trị OD 595nm định lượng protein các phân đoạn sau sắc ký PL2 Bảng 40: Định lượng protein các phân đoạn sau sắc ký PL2 Bảng 41: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính các phân đoạn sau sắc ký PL2 Bảng 42: Định lượng hoạt tính enzyme sau sắc ký PL2 Bảng 43: Trọng lượng phân tử các băng protein trong mẫu enzyme tinh sạch PL2

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Cellulose là nguồn vật chất dồi dào nhất trên trái đất và chiếm ưu thế trong toàn

bộ giới thực vật (Zvidzai và Johnson, 2012) Cellulose còn là nguồn carbon và có khả năng tái tạo lại nên được xem là nguồn năng lượng rất đáng hứa hẹn Một số các nghiên cứu đã được thực hiện với chiến lược là tận dụng cellulose để sản xuất năng lượng sinh học thay thế cho nguồn năng lượng hóa thạch đang dần cạn kiệt (Beguin và

Aubert, 1994; Demain et al., 2005) Bên cạnh đó, việc bảo toàn hệ sinh thái thông qua

việc tận dụng cellulose được xem như là một giải pháp khắc phục ô nhiễm môi trường

do chất thải rắn trong nông nghiệp Ngoài ra, một số sản phẩm có giá trị kinh tế như

bột giấy, rượu, acid… có thể được sản xuất từ cellulose (Coral et al., 2002)

Trong suốt nhiều năm, trở ngại đối với các nhà khoa học là tìm giải pháp cũng như cải tiến các phương pháp, kỹ thuật và phương tiện để có thể chuyển hóa nguồn cellulose trong thực vật cũng như các nguồn vật chất chứa cellulose (Sakata et al., 1985; Tewari et al., 1987; Julian et al., 1990) Việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý hay hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây ô nhiễm môi trường Trong khi

đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng enzyme cellulase ngoài bào từ vi sinh vật có ưu điểm về kinh tế, kỹ thuật và môi trường (Pason et al., 2006) Cellulase được phân loại vào nhóm enzyme hydrolase thủy phân các liên kết glycoside (glycodyl hydrolase) Cellulase là một hệ enzyme bao gồm endoglucanase, excoglucanase và cellobiase Mỗi loại enzyme có cơ chế, vị trí cắt và cho ra sản phẩm khác nhau nhưng nhìn chung đều thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic trong phân tử cellulose

Trong thập kỷ qua, enzyme được sử dụng trong các ngành công nghiệp ngày càng nhiều và trở thành nhu cầu thiết yếu cho xã hội Không ngoài xu thế đó, enzyme cellulase đã được ứng dụng khá rộng rãi Enzyme này được ứng dụng vào sản xuất thức ăn gia súc, điều chế các chất tẩy rửa, tạo mùi hương, công nghiệp giấy và cả trong sản xuất rượu Một trong những ứng dụng quan trọng của cellulase là áp dụng để sản xuất ethanol từ mùn bã hữu cơ Từ quá trình đường hóa các vật liệu chứa cellulose như

bã mía, bột bắp, vỏ thóc, mùn cưa… sẽ cho ra ethanol sinh học, đây là hướng ứng

dụng chính của cellulase hiện nay (Sukuraman et al., 2005; Kuhad et al., 2010)

Enzyme cellulase đóng góp 8% vào nhu cầu sử dụng enzyme trên toàn thế giới và tỉ lệ này hi vọng sẽ tăng thêm 10% trong năm 2014 (Costa et al., 2008).Đặc biệt trong số 3 loại enzyme, endoglucanase là enzyme có cơ chế cắt phổ biến hơn so với 2 loại enzyme còn lại

Nhu cầu xã hội hiện nay là sản xuất enzyme cellulase từ phế thải nhà máy như: rơm rạ, mạt cưa… đồng thời sẽ giúp bảo vệ được môi trường cũng như đẩy mạnh ứng dụng enzyme vào công nghiệp nước ta Bước đầu tiên của việc sản xuất là phải tinh sạch được enzyme với độ tinh khiết cao đủ đạt tiêu chuẩn để ứng dụng vào thực phẩm

và nguồn vi sinh vật là nguồn nguyên liệu phong phú nhất để ta có thể thu được nhiều cellulase Enzyme có thể được trích ly từ nhiều nguồn nhưng vi khuẩn là nguồn có nhiều tiềm năng nhất Vi khuẩn có khả năng tăng sinh khối rất nhanh chóng, hệ enzyme phân giải các chất gốc đường phức tạp hơn và do vi khuẩn có khả năng sinh trưởng ở những điều kiện khắc nghiệt nhất nên hệ enzyme cellulase của chúng có độ bền cao hơn so với trích ly từ những nguồn khác (Miranda et al., 2009) Một số chủng

vi sinh vật sản xuất cellulase được nghiên cứu nhiều như Clostridium, Cellulomonas, Thermomonospora, Trichoderma (Kuhad, 2010) Trong khi đó, vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans đã được nghiên cứu khi phối hợp với một số dòng nấm

men có khả năng phân hủy cơ chất bã mía (Võ Văn Song Toàn et al., 2014) Trên thế giới đã có những nghiên cứu về tinh sạch endoglucanase từ vi khuẩn nhưng tinh sạch enzyme từ dòng vi khuẩn này vẫn còn rất hạn chế; đối với nước ta vấn đề này vẫn còn khá mới mẻ và cũng chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn này Từ đó, đề tài “Tinh

sạch enzyme endoglucanase từ dịch nuôi cấy Achromobacter xylosoxidans BM13 bằng

phương pháp sắc ký trao đổi ion” được tiến hành nhằm khảo sát phương pháp tủa endoglucanase từ vi khuẩn này một cách hiệu quả

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được tiến hành nhằm mục tiêu tinh sạch endoglucanase của vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans BM13.

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về Achromobacter xylosoxidans

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Achromobacter xylosoxidans lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1971 bởi 2 nhà khoa học Yabuuchi và Ohyama (Duggan et al., 1996) Ban đầu VSV này có tên là Alcaligenes denitrificans thuộc phân loài xylosoxidans và Alcaligenes xylosoxidans thuộc phân loài xylosoxydans Tuy nhiên, dần dần chúng được biết đến rộng rãi với tên Achromobacter xylosoxidans

Hiện này, Achromobacter xylosoxidans được ứng dụng rộng rãi trong y học để

tìm hiểu về qui trình gây ra một số căn bệnh trên cơ thể người Đồng thời, chúng cũng được nghiên cứu về mặt hóa sinh trong sản xuất các enzyme phục vụ cho đời sống con người

2.1.3 Đặc điểm của Achromobacter xylosoxidans

A xylosoxidans là vi khuẩn hiếu khí, gram âm, có dạng que và di chuyển được

nhờ vào roi (flagella) VSV này sống chủ yếu ở môi trường nước (Duggan et al., 1996)

A xylosoxidans thuộc về nhóm các VSV có khả năng tổng hợp oxidase và

catalase, không có khả năng lên men và có sự tương đồng với một số các VSV khác

như Ochrobactrum anthropi, Agrobacterium tumefaciens hay Achrmobacter nhóm b Tuy nhiên các VSV này hình thái sinh học rất khác biệt nhau (Duggan et al., 1996)

Hình 1 Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

(*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Achromobacter_xylosoxidans ngày 22/5/2014)

A xylosoxidans còn thường xuyên được tìm thấy trong rễ cây và có nhiều chức

năng hiệu quả đã được nghiên cứu trước đó, một trong số những chức năng đó bao gồm kiểm soát các sinh vật gây bệnh trên thực vật (Joe et al., 2012), cải thiện môi trường bị ô nhiểm phenol (Ho et al., 2012) kích thích sự vận chuyển của ion để điều hòa sự phát triển của cây (Jha và Kumar, 2009) và ức chế sự tạo ra aflatoxin ở

Asperillus sp (Yan et al., 2004)

Hệ enzyme của A xylosoxidans cũng khá đa dạng như cellulase, glucanase, enzyme phân hủy lignin Đặc biệt hơn, A xylosoxidans đã được nghiên cứu trong việc tạo ra các enzyme để phân hủy 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) A xylosoxidans sử

dụng TNT như nguồn nitrogen, một số ít lại sử dụng như nguồn carbon và năng lượng cho quá trình sinh trưởng (Spain, 1995, Esteve et al., 2001, Nyanhongo et al., 2005) Trong đó, để phân hủy TNT thì vai trò của enzyme nội và ngoại bào là cực kì quan trọng Enzyme ngoại bào phân hủy lignin gồm lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) và laccase có tác dụng phân hủy rồi khoáng hóa hoàn toàn TNT

(Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự, 2009) A xylosoxidans hiện được nghiên cứu nhiều để

phục vụ cho việc tìm kiếm các phác đồ điều trị hiệu quả các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn gây nên

2.2 Tổng quan về endoglucanase

2.2.1 Enzyme cellulase

Cellulase hay còn được gọi với các tên khác như glucanase, beta-1,4-glucanase, beta-1,4-endoglucan hydrolase, cellulase A,1,4-(1,3, 1,4)-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase là enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân cellulose thành glucose Celulase có thể được tổng hợp bởi các loài nấm, vi khuẩn và các loài động vật nguyên sinh Phản ứng chính được xúc tác bởi cellulase là thủy phân các liên kết 1,4-beta-D-glycosidic trong cellulose, lichenin và ngũ cốc của các gốc đường β-D Tuy nhiên, cellulase là 1 hệ enzyme và để phản ứng diễn ra hoàn toàn cần có sự tham gia của 3 loại enzyme cellulase khác nhau (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

endo-1,4-beta-D-Hình 2 Phân loại enzyme cellulase

(*Nguồn: Kluepfel, 1988)

+ Endoglucanase (EC 3.2.1.4) (β-1,4-endoglucan hydrolase, β-1,4-glucanase, Endo-1,4-β-D-glucanase, Endo-1,4- β-D-glucanohydrolase) là enzyme thủy phân ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside ở phía trong cấu trúc cellulose và cho ra các một số sản phẩm như glucose, cellodextrin, cellobiose Sản phẩm sinh ra từ quá trình thủy phân của endoglucanase sẽ là cơ chất cho exoglucanse tiếp tục thủy phân Enzyme này

cũng được ghi nhận là có trong một số vi sinh vật như Clostridium thermocellum, cellulomonas fimi và một số VSV khác… (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

+ Exoglucanase (EC 3.2.1.91) bao gồm 2 loại enzyme là exo-β-1,4-glucanase và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase được gọi tắt lần lượt là CBHI và CBHII (Schemidhalter và Canevascini, 1993) CBHI bao gồm CBHII có thể phân cắt từ đầu

khử hoặc không khử của chuỗi polymer là sản phẩm từ endoglucanase và cho ra các sản phẩm là các đường đôi hoặc đường đa (chủ yếu là đường với 4 đơn vị) gọi là các

cellobiose (Zvidzai et al., 2012) Exoglucanase còn các tên gọi khác như avicecellase,

exocellulase, cellobiosidase (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

+ Cellobiase (EC 3.2.1.21) hay còn được gọi là β-D-glucoside glucohydrolase thủy phân tiếp tục các sản phẩm từ exocellulase là các cellobiose thành các đường đơn chủ yếu là glucose Cellobiase không có khả năng phân cắt cellulose từ ban đầu (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hình 3 Đặc tính và thứ tự phân cắt của 3 loại enzyme thuộc hệ enzyme cellulase

(*Nguồn: Lutzel và Nielson, 1983)

G: glucose

(1) Thủy phân trực tiếp do tác dụng của exocellulase

(2) Thủy phân do tác dụng phối hợp của endocellulase, exocellulase và β-glucosidase

(3) Thủy phân trước tiên bởi endocellulase và sau đó bởi exocellulase

2.2.2 Cấu trúc endoglucanase

Endoglucanase được xếp vào loại enzyme ngoại bào, tức là các loại enzyme được

vi sinh vật tiết ra bên ngoài tế bào để xúc tác các phản ứng thủy phân cơ chất để thu chất dinh dưỡng nuôi sống tế bào (Poulsen và Petersen, 1987)

Endoglucanase cũng như các enzyme trong phức hệ cellulase có cấu tạo gồm hai domain là: catalytic domain (CD-domain xúc tác) và module liên kết carbohydrate (CBM) còn được gọi là cellulose-binding domain (CBD-domain liên kết cellulose), cả hai được liên kết với nhau bằng liên kết peptide Liên kết này gồm có rất nhiều các acid amine như proline, threonine và serine, có vai trò duy trì sự liên kết giữa CD và CBM, 2 domain này có chức năng độc lập nhau (Zvidzai và Johnson, 2012)

Hình 4 Cấu trúc các domain của endoglucanase

(*Nguồn: Zong et al., 2008)

Domain xúc tác (CD) có kích thước to và module gắn kết cellulose (CBM) có kích thước nhỏ hơn Trong CD có chứa vùng kích hoạt enzyme chịu trách nhiệm thủy phân cellulose CBD là một chuỗi amino acid giúp đánh dấu và giữ CD nằm trên bề mặt cellulose thông qua các liên kết hydro và lực liên kết van der Waals (Boraston et

al., 2004; Guillen et al., 2010)

Các amino acid tích điện âm cận kề trong tâm hoạt động như asparatic acid, glutamic acid, tryptophan hay histidine hổ trợ và duy trì tính bền vững của sự hình thành ion oxocarboniuum (Henrissat et al., 1989; Gilkes et al., 1991; Kawaminami et al., 1998; Gebler et al., 1992) Trong tâm hoạt động của endoglucanase vi khuẩn, 8 trình tự amino acid với độ bảo tồn cao được hiện diện Những amino acid đó bao gồm

2 tryptophan, lysine, serine, 2 tyrosine, glutamate và histidine

Hình 5 Cấu trúc tâm hoạt động endoglucanase khi tương tác với cơ chất

cellobiose

(*Nguồn: Davies et al., 1998)

2.2.3 Cơ chế thủy phân của endoglucanase

Để phân cắt hoàn toàn cellulose cần có sự hợp tác hoạt động của 3 loại enzyme cellulase, chúng có sự tương tác và hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình thủy phân (Halliwel

và Riaz, 1970) Endoglucanase thủy phân rất mạnh các liên kết β-1,4-glucosides giải phóng sản phẩm rất đa dạng gồm glucose, cellodextrin Hai cơ chế thủy phân được biết đến là thủy phân đảo cấu hình (inverting mechanism) và thủy phân duy trì cấu hình β (retaining mechanism) Trong cả hai cơ chế, acid-baze cho một proton vào O-glycosidic để tạo sự tách rời liên kết này, đồng thời với sự thành lập của điện tích dương ở carbon C1 (Nutt, 2006)

Hình 6 2 cơ chế thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic (A) : Cơ chế duy trì cấu hình ; (B) : Cơ chế đảo cấu hình.

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính endoglucanase khác nhau tùy theo từng chủng vi khuẩn sản sinh ra Theo một số nghiên cứu thì nhiệt độ tối ưu cho cellulase trích ly từ

vi khuẩn hoạt động được dao động trong khoảng 30oC - 50oC (Yin et al., 2010) Vi

khuẩn Cellulomonas, Bacillus và Microccocus spp nhiệt độ tối ưu để để

endoglucanase hoạt động là 400C trong 1,5% nồng độ cơ chất (Immanuel et al., 2006) Nhìn chung endoglucanaase vi khuẩn có độ bền nhiệt khá cao, hoạt tính vẫn có thể được giữ khi nhiệt độ tăng lên 50oC - 60oC (Pason et al., 2006) Khoảng chịu nhiệt của

enzyme cũng khác nhau tùy theo loài vi khuẩn

2.2.4.2 Ảnh hưởng bởi pH

pH là một nhân tố tác động chính đến hoạt tính enzyme Endoglucanase của A xylosoxidans chưa được nghiên cứu nhiều, tuy nhiên theo một số nghiên cứu cho thấy endoglucanase của vi khuẩn có khoảng pH dao động từ 4 - 9 (Pason et al., 2006)

Immanuel và cộng sự (2006) cho thấy với 1,5% nồng độ cơ chất thì pH tối ưu cho hoạt

tính của endoglucanase từ vi khuẩn Cellulomonas, Bacillus và Microccocus spp là 7 Endoglucanase của Bacillus strain M-9 có thể hoạt động trong khoảng pH từ 3 - 10

nhưng ở pH 5 thì endoglucanase có hoạt lực mạnh nhất (Bajaj et al., 2009) Endoglucanase bền trong khoảng pH từ 4 - 10 tùy vào từng loài cụ thể

2.2.4.3 Ảnh hưởng của ion kim loại

Sự ảnh hưởng của ion kim loại đối với hoạt tính enzyme có 2 dạng, 1 dạng là tăng cường hoạt tính enzyme, dạng còn lại là ức chế hoạt tính enzyme Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể làm biến tính, kìm hãm không thuận nghịch enzyme Một số các báo cáo khác cho thấy các ion Co2+, Mn2+ tăng cường hoạt tính enzyme endoglucanase, trong khi các ion kim loại như Cu2+, Hg2+, Fe3+, Cd2+ lại là các tác nhân gây ức chế và kìm hãm hoạt tính enzyme (Seo et al., 2013) Các ion K+,

Na+, Ca2+ và NH4+ không ảnh hưởng hoạt tính enzyme (Mawadza et al., 2000)

2.2.4.4 Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase

CMC và β-glucan là 2 cơ chất mà endoglucanase cho hoạt tính rất cao Ngoài

ra, enzyme này còn cho thấy hoạt tính đối với một số các cơ chất khác như avicel,

xylan, coton nhưng hoạt lực không mạnh (Yin et al., 2010; Mawadza et al., 2000)

2.2.4.5 Một số tính chất khác của endoglucanase

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau sẽ sản sinh ra cellulase có phân tử lượng cũng như điểm đẳng điện khác nhau Thông thường, endoglucanase từ vi khuẩn có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 23 - 146 kDa (Gilkes et al., 1991) Ở trực khuẩn thì trọng lượng phân tử rơi vào khoảng 35 - 82 kDa (Park et al., 1991; Han et al., 1995; Kim et al., 1995; Mawadza et al., 2000) Điểm đẳng điện của endoglucanase trích ly từ các nguồn khác nhau thì cũng khác nhau

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Trích ly protein

Để có được nguyên liệu cho việc tinh sạch enzyme thì công đoạn tách chiết nguồn nguyên liệu enzyme ban đầu là bước không thể thiếu Dịch trích enzyme thô cũng là một yếu tố quyết định hiệu suất tinh sạch enzyme Để có thể lấy được enzyme trong tế bào VSV, ta cần phá vỡ màng tế bào và trích ly enzyme ra khỏi tế bào dưới dạng enzyme thô Có 2 dạng phương pháp được dùng để trích ly enzyme là phương pháp cơ học và phi cơ học

Phương pháp cơ học là phương pháp dùng những tác động vật lý (nghiền) để phá

vỡ màng tế bào, phóng thích enzyme khỏi tế bào Đối với tế bào động vật, màng tế bào

dễ bị phá vỡ, nhưng đối với tế bào VSV do kích thước quá nhỏ nên nếu không dùng các chất trợ nghiền sẽ không mang lại kết quả Những phương pháp phi cơ học là những phương pháp không dùng đến các tác động vật lý chẳng hạn như phương pháp hóa học, phương pháp sinh học Tuy nhiên đề tài này áp dụng phương pháp để trích

lý enzyme và 2 phương pháp chủ yếu được dùng là ly tâm và lọc

2.3.1.1 Phương pháp ly tâm

Ly tâm là quá trình tách vật thể rắn ra khỏi dung dịch Trong công nghệ enzyme, ly tâm là phương pháp thường được sử dụng để trích ly enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào, muốn thu enzyme nội bào cần phải tiến hành phá vỡ màng tế bào Dịch trích enzyme thô bao gồm các thành phần chính sau:

+ Protein

+ Các chất

+ Nước

2.3.1.2 Phương pháp lọc

Sau khi phá vỡ thành tế bào hay sau khi lên men, dịch enzyme nội bào hay enzyme ngoại bào hòa tan được thu nhận thông qua phương pháp lọc Trong công nghiệp sản xuất enzyme thường có các kiểu lọc sau:

2.3.2 Phương pháp tủa protein

Phương pháp tủa được sử dụng rất phổ biến để thu nhận enzyme Có một số phương pháp tủa thường được sử dụng như: tủa bằng dung môi hữu cơ, tủa bằng muối, tủa bằng nhiệt hay thay đổi pH

2.3.2.1 Phương pháp tủa bằng muối

Cơ chế của phương pháp tủa protein bằng muối dựa vào cấu trúc bề mặt, tính tan của protein và nồng độ muối Khi protein cuộn xoắn tạo thành cấu trúc bậc 3 thì luôn có xu hướng cuộn bề mặt kị nước vào trong lõi protein Tuy nhiên khi protein trong dung môi thì các gốc kị nước lại để lộ ra, lúc này trên bề mặt protein hình thành cấu trúc thể khảm gồm các gốc mang điện, không mang điện và các gốc kị nước (Jakoby, 1971)

Khi ta bổ sung muối vào dung dịch, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in)

do các ion muối tương tác với bề mặt protein Do các ion muối chen bám vào bề mặt protein nên lượng nước cần để hòa tan protein giảm xuống, lượng nước tự do tăng lên Nhìn chung ở giai đoạn này, tính tan của protein tăng

Tuy nhiên, khi nồng độ muối càng cao thì độ tan của protein đạt ngưỡng rồi giảm xuống Nguyên nhân là do các ion muối lúc này đã bám kín bề mặt protein nên

sẽ quay sang tranh giành các ion dung môi (nước) với protein làm giảm hiện tượng solvate hóa Các protein khi không tương tác với nước được nữa sẽ tương tác, liên kết với nhau thông qua các liên kết kị nước và các liên kết phân cực trên bề mặt Khi các điện tích trên bề mặt đã bị trung hòa, các phân tử protein không thể tương tác với nước nữa nên sẽ tủa xuống (salting out) (Jakoby, 1971)

Hình 7 Ảnh hưởng của nồng độ muối đối với tính tan của protein

(*Nguồn: Inyang và Iduh, 1996)

Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau

Log S = B – KI

Trong đó:

S: độ hòa tan của protein

B: hằng số (phụ thuộc vào loại protein, pH và nhiệt độ)

K: hằng số salting out (tùy thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối trong dung dịch)

I: cường độ ion của muối

Các muối được dùng để tủa protein thường là các muối sulphate, trong đó phổ biến hơn cả là (NH4)2SO4 (ammonium sulphate) Lí do là sử dụng (NH4)2SO4 tiết kiệm

về mặt kinh tế và đạt được hiệu quả rất cao, ngoài ra còn giúp ổn định cấu trúc bề mặt protein (Janson và Ryden, 1998) Nồng độ muối (NH4)2SO4 cần dùng để tủa protein khác nhau thì khác nhau

2.3.2.2 Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ

Nhìn chung phương pháp tủa protein bằng dung môi hữu cơ không khác nhiều

so với tủa bằng muối Cơ chế của phương pháp này là giảm tính tan của protein và độ linh động các phân tử nước thông qua các phân tử dung môi hữu cơ 2 loại dung môi hữu cơ thường được dùng là acetone và ethanol (Saha, 2004 và Golbeck et al., 2013), phương pháp này dựa vào hằng số điện môi của các chất trong hệ thống Các dung môi hữu cơ có hằng số điện môi thấp sẽ triệt tiêu các phân tử nước liên kết với protein

thông qua các liên kết ưu nước trên bề mặt, ngoài ra còn giúp cố định các phân tử nước làm giảm hằng số điện môi trong môi trường Do không còn liên kết với nước nữa, các protein liên kết với nhau thông qua các liên kết cộng hóa trị trên bề mặt và tủa xuống (Janson và Ryden, 1998) Yếu tố nhiệt độ rất cần được lưu ý trong phương pháp này, thông thường các phản ứng nên được giữ dưới 4oC để tránh biến tính protein

2.3.2.3 Phương pháp tủa bằng điểm đẳng điện

Tính tan của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là pH môi trường Protein được cấu thành từ những chuỗi polypeptide mà đơn phân là các amino acid Mỗi amino acid đều có điểm chung là có nhóm amine (NH2) và carboxyl (COOH), protein tích điện âm hay dương phụ thuộc vào sự đóng góp của 2 nhóm này Điểm đẳng điện (pI) là giá trị pH mà tại đó protein không mang điện, khi pH < pI protein mang điện tích dương do nhóm amine bị proton hóa, còn khi pH > pI thì protein mang điên tích âm do nhóm carboxyl mất đi proton (Hình 8) Tựa chung lại, khi protein mang điện tích dương hay âm thì khả năng tương tác giữa nước và protein

sẽ cao hơn khi protein không mang điện tích, do đó tại điểm đẳng điện protein sẽ thể hiện tính tan kém nhất (Xia, 2007) (Hình 9)

Hình 8 Cấu trúc amino acid khi pH thay đổi

(*Nguồn: Janson và Ryden, 1998)

Hình 9 Giản đồ thể hiện điểm đẳng điện của protein

(*Nguồn: Janson và Ryden, 1998)

2.3.3 Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Sắc ký là quá trình phân tách các chất trong hỗn hợp (khí hoặc lỏng) gồm nhiều chất khác nhau Phương pháp này được giới thiệu lần đầu vào những năm đầu 1900 bởi Mikhail Tsvet Trong sắc ký người ta phân biệt pha tính và pha động Theo đó, pha tĩnh là chất lỏng hoặc các hạt nhỏ có mang điện tích được nhồi vào trong cột có tác dụng giữ vật chất lại và có khả năng thay đổi điện tích Pha động là chất lỏng hoặc khí chảy qua cột chứa pha tĩnh theo một hướng nhất định có tác dụng kéo các chất cần phân tích ra Nguyên tắc cơ bản của sắc ký là dựa vào sự khác biệt về ái lực giữa các cấu tử đối với pha tĩnh, pha động di chuyển với tốc độ khác nhau sẽ giúp phân tách các chất ra (Scopes, 1994)

Định nghĩa của IUPAC (1993): “Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử cần phân tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định”

Một số phương pháp sắc ký thường được sử dụng là sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký tương tác kị nước

 Sắc ký trao đổi ion

a Khái niệm

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích của protein trong dung dịch Nói cách khác, phương pháp này phân tách protein dựa vào tương tác trao đổi ion giữa protein trong dung dịch (nước, dung dịch đệm) (pha động) và các tác

nhân trao đổi ion (pha tĩnh) Tác nhân trao đổi ion là những chất trơ, không tan trong nước có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có dạng lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polystirol (Scopes, 1994)

b Nguyên lý

Protein có cấu trúc gồm các gốc mang điện tích trên bề mặt, tùy vào pH môi trường và điểm đẳng điện pI mà chúng có thể tích điện dương hay âm Nếu pH < pI thì protein tích điện dương, nếu pH > pI thì protein tích điện âm, đây là cơ sở quan trọng

để lựa chọn loại gel thích hợp cho từng loại protein Có 2 loại gel trao đổi ion (Hình 10)

+ Gel trao đổi ion âm: các nhóm chức mang điện tích dương tương tác trao đổi ion âm với protein mang điện tích âm

+ Gel trao đổi ion dương: các nhóm chức mang điện tích âm tương tác trao đổi ion dương với các protein mang điện tích dương

Hình 10 Hai loại hạt gel dùng trong sắc ký trao đổi ion

(*Nguồn:

http://www.waters.com/waters/en_US/HPLC-Separation-Modes/nav.htm?cid=10049076&locale=en_US ngày 25/5/2014)

Trong quá trình sắc ký, các phân tử protein sẽ tạo liên kết ion thuận nghịch với pha tĩnh Các protein không bám sẽ đi ra trước, các protein bám sẽ được giữ lại trên pha tĩnh và sau đó được rửa giải từ từ bằng cách dùng nồng độ muối hoặc thay đổi pH

Có 2 cách rửa giải là rửa giải theo chiều gradient liên tục (continuous gradient) hoặc rửa giải từng bước (stepwise) Thứ tự protein được rửa giải sẽ tùy theo điện tích protein mạnh hay yếu Sau đó ta sẽ thiết lập một biểu đồ thể hiện sự tương tác giữa protein và mang chất mang, thông qua đó ta sẽ chọn ra những phân đoạn nào chứa protein cần thiết (Janson Rydén, 1998)

Hình 11 Sắc ký trao đổi ion

(*Nguồn: Nelson và Cox, 2005)

Hình 12 Biểu đồ hấp thụ điện tích protein trong sắc ký trao đổi ion

(*Nguồn: Janson và Ryden, 1998)

2.3.4 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)

Điện di trên gel polyacrylamide với sự có mặt của SDS (Sodium dodecyl sulfate)

là kỹ thuật thường được sử dụng trong hóa sinh, di truyền, sinh học phân tử để phân tách trọng lượng protein theo tính linh động điện di của chúng (chiều dài chuỗi polypeptide, trọng lượng phân tử, cấu hình protein và các nhân tố khác) Phương pháp này lần đầu được giới thiệu bởi Ornstein và Davis (2001) Đây là phương pháp giúp phân tách trọng lượng các phân tử sinh học và từ đó xác định trọng lượng phân tử của chúng (Westermeier et al., 2001)

Acrylamide là 1 hóa chất đơn phân tử có cấu trúc CH2=CH-CO-NH2 và acrylamide có cấu trúc CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 Gel được tạo thành

bis-do sự polymer hóa các đơn phân acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide, kích thước lỗ gel phụ thuộc vào các mật độ các đơn phân cũng như mức độ polymer hóa

Sự di chuyển của các phân tử sinh học phụ thuộc vào kích thước lỗ gel, điện tích phân

tử và điện trường (Westermeier et al., 2001)

Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate – PolyacrylAmide Gel Electrophoresis) là phương pháp điện di không liên tục (discontinuous) và mẫu protein được gây biến tính (denaturation) Trong phương pháp này, protein được xử lý bằng hóa chất SDS và β-mercaptoethanol SDS chính là tác nhân gây biến tính và làm âm tính hóa toàn bộ chuỗi polypeptide trong khi β-mercaptoethanol sẽ phân cắt các cầu nối disulfite (disulfite bridge) Quá trình polymer được xúc tác bởi APS (ammoniumpersulfate) và TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine) Do đã được xử lý bằng hóa chất, các cấu tử protein tách ra do cầu nối disulfite đã bị cắt đứt, toàn bộ chuỗi polypeptide đều mang điện tích âm Do đó, khi điện di dưới tác dụng của lực điện trường, protein sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương (Scopes, 1994)

Để ổn định protein trước khi điện di và tạo mức xuất phát đồng đều nhau, gel điện di được chuẩn bị với 2 lớp

+ Lớp gel tập trung (stacking gel): lớp gel này nằm phía trên với nồng độ gel thấp (4-5%) và là nơi các giếng cho mẫu vào được chuẩn bị Lớp gel này có mục đích

là để khi mẫu được cho vào các giếng, do nồng độ gel rất thấp, các lỗ gel rất thưa nên mẫu di chuyển theo chiều điện trường rất nhanh và tập trung tại mặt phẳng giới hạn giữa 2 lớp gel chuẩn bị cho quá trình điện di (Hames, 1998)

+ Lớp gel phân tích (separating gel): lớp gel này nằm phía dưới có nồng độ acrylamide cao hơn lớp gel tập trung Lớp gel này chính là vùng mà các protein di chuyển trong điện trường nên nồng độ gel cao để hạn chế tốc độ di chuyển của các protein và phân tách các băng protein có trọng lượng phân tử khác nhau trong hỗn hợp Thông thường, kỹ thuật SDS-PAGE được dùng để phân tích protein có trọng lượng phân tử từ 10000 - 200000 Dalton Nếu protein có trọng lượng lớn hơn 200 kDa, người ta dùng gel có nồng độ acrylamide thấp hơn 2.5% (Hames, 1998)

Trong kỹ thuật SDS-PAGE, gel không được đánh dấu phóng xạ và sau khi điện

di sản phẩm có màu trong suốt nên ta cần nhuộm màu gel để quan sát sự phân tách của các band protein trên gel điện di Sự lựa chọn phương pháp nhuộm phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính kinh tế, thiết bị đọc sẵn có Hiện nay có một số phương pháp

nhuộm thường được sử dụng như Coomassie Brilliant Blue G250, nhuộm bạc, Bromophenol Blue R-250 Nhuộm bạc là phương pháp nhạy nhất và thường được sử dụng khi nồng độ protein thấp từ 0,3 – 1 ng (Hames, 1998)

2.3.5 Các phương pháp phân tích protein

2.3.5.1 Khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

Khái niệm: Bradford là phương pháp được dùng để xác định hàm lượng

protein được giới thiệu lần đầu vào năm 1976 bởi nhà khoa học cùng tên, đến nay phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi tại để định lượng protein Ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy cao, chỉ cần sử dụng một loại thuốc thử, phức chất protein – thuốc nhuộm tương đối ổn định

Nguyên tắc: Phương pháp Bradford dựa vào sự thay đổi bước sóng hập thụ

cực đại khi Coomassie Brilliant Blue liên kết với protein và sự đổi màu xảy ra trong dung dịch acid Trong dung dịch có tính acid mạnh, khi bình thường không liên kết protien thuốc thử hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 465nm và có màu nâu đậm, nhưng khi phức chất thuốc thử - protein tạo thành bước sóng hấp thụ tăng lên 595nm, màu xanh xuất hiện và độ hấp thụ này liên quan trực tiếp đến nồng độ protein trong dung dịch Thuốc nhuộm liên kết trực tiếp với protein thông qua tương tác kị nước Ta có thể xác định hàm lượng protein thông qua xác định lượng thuốc thử tích điện âm màu xanh dương ở bước sóng 595nm (Bradford, 1976)

Để tiến hành xác định hàm lượng protein, trước hết ta cần lập một đường chuẩn với một protein chuẩn đã biết trước nồng độ, protein thường dùng là Bovine Serum Albumin (BSA) Sau đó ta tiến hành phản ứng thuốc thử với protein, sau 10 phút đem đi đo ở bước sóng 595nm bằng máy quang phổ kế Thông qua số liệu quang phổ và đường chuẩn ta sẽ xác định được hàm lượng protein trong dung dịch (Bradford, 1976)

Hình 13 Công thức phân tử Coomassie Brilliant Blue G-250

(*Nguồn: Ahmed, 2004)

2.3.5.2 Khảo sát hoạt tính protein

a Định tính protein bằng vòng tròn đường kính thủy phân

Quá trình này giúp ta xác định xem liệu enzyme có hoạt tính hay không để tiếp tục thực hiện các thí nghiệm sâu hơn, hóa chất được sử dụng ở đây là Congo red Congo red là một loại thuốc nhuộm liên kết rất chặt chẽ với các liên kết β-1,4-glycosidic và không bị rửa trôi khi rửa bằng NaCl Tuy nhiên khi các liên kết này bị cắt đứt bởi Exoglucanase, thuốc nhuộm không bám được nữa và sẽ bị rửa trôi, khi đó

ta sẽ quan sát được những vùng mà enzyme hoạt động Phương pháp được tiến hành bằng cách nhỏ giọt enzyme vào các giếng được tạo sẵn trên môi trường CMC, sau đó ủ

ở nhiệt độ và thời gian thích hợp để phản ứng diễn ra Cuối cùng rửa lại bằng dung dịch NaCl 1M, lúc đó ta sẽ thấy có những chấm tròn không bắt màu thuốc nhuộm, đó

là những vùng enzyme đã phân cắt các liên kết β-1,4-glycosidic (vòng halo), đường kính các vòng này càng lớn chứng tỏ hoạt tính enzyme càng mạnh (Wood và Bhat, 1988; Teather và Wood, 1981)

b Định lượng hoạt tính bằng phương pháp Nelson - Somogyi

Cơ sở của phương pháp này là dựa trên phản ứng giữa đường khử và thuốc thử Khi đun nóng, đường khử tác dụng với thuốc thử đồng cho kết tủa đỏ gạch, khi ta cho thuốc thử Aseno Moblybdate vào dung dịch sẽ đổi thành màu xanh da trời, màu sắc dung dịch đậm hay nhạt tỉ lệ cho biết nồng độ đường khử trong dung dịch cao hay thấp Sau đó ta đem đi ủ tối và cuối cùng đo quang phổ ở bước sóng 520nm (Nelson,

1944) Cũng tương tự như phương pháp Bradford, ta lập đồ thị đường chuẩn glucose

và kết hợp với các giá trị quang phổ, ta sẽ tính được lượng đường khử của mẫu và suy

ra hoạt tính enzyme

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.1 Trong nước

Trong nước hầu như là chưa có một báo cáo nào về tinh sạch enzyme cellulase từ

vi khuẩn Achromobacter nói riêng và vi khuẩn nói chung, chủ yếu tinh sạch cellulase

là tập trung vào đối tượng nấm Tuy nhiên có một số nghiên cứu về đặc tính hệ

enzyme của vi khuẩn Achromobacter đã được ghi nhận Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự

(2009) nghiên cứu về khả năng phân hủy chất 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) từ một số

chủng vi khuẩn trong đó có Achromobacter xylosoxidans Kết quả cho thấy sau 5 ngày nuôi lắc với nồng độ TNT ban đầu là 100 ppm, vi khuẩn A xylosoxidans loại bỏ được

99.35% TNT Bài báo cũng đề cập đến một số enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa như lignin peroxidase, manganese peroxidase, laccase giúp khoáng hóa rồi chuyển hóa hoàn toàn TNT Các enzyme này tham gia vào các chu trình phân hủy các hợp chất vòng có cấu trúc tương tự lignin

Phạm Thị Thanh Hà và cộng sự (2003) có báo cáo về nghiên cứu phân giải

phosphate vô cơ với một số chủng vi khuẩn trong đó có vi khuẩn Achromobacter sp

được nuôi cấy trong môi trường có nồng độ muối từ 0 – 5% Theo đó, 3 dòng vi khuẩn

Achromobacter sp được sử dụng đều cho thấy có khả năng phát triển ở nồng độ muối

từ 0 - 2% Bên cạnh đó, lượng phosphate khó tan được phân giải bởi 3 dòng vi khuẩn này cao nhất đạt từ 500 – 600 (g/l)

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Quỳnh Như và cộng sự (2013) đã cho thấy khả năng tổng hợp chất kích thích tăng trưởng Indole Acetic Acid (IAA) và cố định đạm của một loại vi khuẩn được phân lập từ rễ chuối vùng đồng bằng sông Cửu Long Kết quả

giải mã cho thấy vi khuẩn này đồng hình đến 97% với vi khuẩn Achromobacter sp Một số các nghiên cứu khác cũng cho thấy tính đa dạng hệ enzyme từ vi khuẩn A xylosoxidans Enyme từ vi khuẩn này có khả năng phân giải carbazol trong môi trường

nhiễm dioxin với sự có mặt các hợp chất như naphthalene và phenanthrene (Nguyễn Thị Hạnh và cộng sự, 2009) Các hợp chất nitrogen dưới dạng NO3-, NO2- cũng được

phân hủy bởi hệ enzyme của nhóm vi khuẩn A xylosoxidans (Nguyễn Văn Cách,

2010)

2.4.2 Ngoài nước

Cho đến nay các báo cáo về tinh sạch enzyme endoglucanase từ vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans hầu như là chưa có ngay cả trên thế giới Theo báo cáo Sesidharan Sreedevi et al (2013) thì 3 dòng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BSS4, Bacillus sp BSS3 và Pseudomonas sp BSS2 đều có khả năng sản xuất

cellulase với cơ chất basal salt medium (BSM) cộng thêm 0.5% CMC Bên cạnh đó, bài báo cũng có đề cập một số các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến enzyme cellulase như nhiệt độ, pH cũng như nồng độ CMC Theo đó, nhiệt độ tối ưu để sản sinh

cellulase của A xylosoxidans BSS4 là 40oC, pH là 7 và 0.5% CMC

Có một số bài báo cũng đề cập đến khả năng sản sinh cellulase ngoại bào từ

chủng vi khuẩn Achromobacter (Chawla et al., 2008) Điều này càng được củng cố

thêm bởi báo cáo của Maharana và Ray (2013) cũng cho biết chủng vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans có khả năng sản sinh endoglucanase ngoại bào Enzyme protease cũng đã từng được trích ly từ vi khuẩn Achromobacter lyticus M497-1 và

khảo sát một số đặc điểm (Masaki et al 1986)

Bên cạnh đó, vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans cũng cho thấy tiềm năng đối

với quá trình xử lý các chất thải môi trường Theo báo cáo của Tambekar et al (2012)

cho thấy A xylosoxidans được phân lập từ hồ Lonar ở Maharashtra-Ấn Độ có khả

năng sản sinh hợp chất sinh học có khả năng hoạt động bề mặt giúp khắc phục ô nhiễm dầu mỏ Kết quả cho thấy thời gian ủ tỉ lệ thuận với lượng dầu mỏ được phân hủy và ở thời gian ủ 98 giờ, lượng dầu mỏ bị phân hủy đạt 28,3%

Nghiên cứu của Konoshit et al (1975) chứng minh rằng dòng vi khuẩn

Achromobacter guttatus KI72 có khả năng sử dụng hợp chất vòng dimer aminocaproic

acid như là nguồn carbon và nitơ từ bùn, và có thể tổng hợp nylon mạch ngắn oligomer với độ dài phân tử trong khoảng ɛ-aminocaproic tới hexamer

Dù chưa có nhiều báo cáo về tinh sạch enzyme cellulase từ A xylosoxidans, tuy

nhiên với những tính chất đã nêu, cho thấy việc tinh sạch cellulase từ vi khuẩn này là điều khả thi

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian từ tháng 6/2014 đến tháng 12/2014

Địa điểm: Phòng Công nghệ Enzyme, Phòng Sinh hóa, Bộ môn Công nghệ sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học thuộc trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Nguyên, vật liệu

Dòng vi khuẩn BM13 đồng hình ở mức 91% với dòng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BM13 (Đỗ Thị Cẩm Hường, 2012) được cung cấp từ Phòng thí nghiệm

Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ

Bã mía được rửa bằng nước máy đến khi nước rửa trong không còn bụi bẩn, sấy khô đến khối lượng không đổi, nghiền mịn bằng lưới có kích thước đường kính 0,2mm

và được xử lý loại bỏ lignin (Phụ lục 1)

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị

Các thiết bị sử dụng bao gồm: Hệ thống điện di Mini protean (Bio Rad), tủ ủ vi sinh vật Memmert, tủ cấy vô trùng Esco, hệ thống sắc ký (Bio Rad), máy đo quang phổ, máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417R, máy lắc ủ Eppendorf (Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-International (Đức), bếp đun cách thủy Prolabo, tủ lạnh 4oC, -20oC

thử Bradford, Glucose (Merck), Glycerol (Merck), Commassie Brilliant Blue R250 (Pháp), Glycine (Merck), Methanol (CH3OH) (Sigma), Ethanol (C2H5OH) (Sigma), Ammonium persulfate (Sigma), Carboxy Methylcellulose (Sigma), EDTA (Merck), Tetramethylethylenediamine, yeast extract (Ấn Độ)

- Gel sắc ký: Uno Sphere Q

3.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

 Môi trường đặc Ryckeboer et al (2003) cải tiến

Bảng 1: Thành phần môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn (M1)

(*Nguồn: Ryckeboer et al (2003) cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh et al (2010))

 Môi trường lỏng Ryckeboer et al (2003) cải tiến

Bảng 2: Thành phần môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn (M2)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate

Muc đích thí nghiệm: Xác định hàm lượng ammonium sulfate cần thiết để kết tủa

endoglucanase có hoạt tính cao nhất

Tiến hành thí nghiệm

- Chuẩn bị dịch enzyme thô: chủng 1% dịch vi khuẩn (mật số khoảng 107

CFU/ml) vào 700ml môi trường lỏng (Ryckeboer, 2003) cải tiến bằng cơ chất bã mía (Bùi Thị Thiên Thanh, 2010), ủ kị khí trong 5 ngày ở 38oC

- Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi thu được ly tâm với tốc độ 6000 rpm, trong 20 phút ở 4oC Mục đích để bước đầu thu dịch enzyme thô

- Dịch enzyme thô tiếp tục được tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate với các nồng độ bão hòa lần lượt là 50%, 60%, 70%, 80% và 90% ở 4oC trong vòng 1 giờ Kết tủa ở mỗi phân đoạn được thu nhận bằng cách ly tâm 6000 rpm, trong 20 phút ở 4oC Enzyme thu được được sau ly tâm được hòa tan trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,05M (pH 7,5), sau đó thẩm tích tiếp trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,05M (pH 7,5) trong 24 giờ ở 4oC

- Dịch enzyme thô ở mỗi phân đoạn sau thẩm tích được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại khi đánh giá chỉ tiêu

Chỉ tiêu đánh giá

- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) (Phụ lục 1)

- Xác định phần trăm hoạt lực endoglucanase bằng lượng CMC bị thủy phân (độ nhớt) (Phụ lục 1)

- Định tính endoglucanase bằng vòng tròn đường kính thủy phân (Phụ lục 1)

- Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944) (Phụ lục 1)

3.2.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với ethanol

Muc đích: Xác định lượng ethanol cần thiết để kết tủa endoglucanase có hoạt tính

cao nhất

Tiến hành thí nghiệm

- Chuẩn bị dịch enzyme thô: chủng 1% dịch vi khuẩn (mật số khoảng 107CFU/ml) vào 600 ml môi trường lỏng (Ryckeboer, 2003) cải tiến bằng cơ chất bã mía (Bùi Thị Thiên Thanh, 2010), ủ kị khí trong 5 ngày ở 38oC

- Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi thu được ly tâm với tốc độ 6000 rpm, trong 20 phút ở 4oC Mục đích để bước đầu thu dịch enzyme thô

- Dịch enzyme thô được chia làm 4 phần bằng nhau (mỗi phần 150 ml), mỗi phần được dùng để tủa với ethanol với các tỉ lệ lần lượt là 1:1; 1:2; 1:3; 1:4

- Quá trình tủa như sau

1 Ethanol (1,5 lít) được làm lạnh và trữ ở 4oC

2 Cho mỗi phần enzyme thô vào 1 ống và cho ethanol (4oC) vào các ống ly tâm với các tỉ lệ tương ứng (1:1; 1:2; 1:3; 1:4)

3 Ủ các ống trong nước đá trong vòng 60 phút

4 Ly tâm các ống với tốc độ 6.000 rpm ở 4oC trong vòng 20 phút

5 Phần cặn lắng được hòa tan trong Tris-HCl 0,05M (pH 7,5)

Chỉ tiêu đánh giá

- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) (Phụ lục 1)

- Xác định phần trăm hoạt lực endoglucanase (Phụ lục 1)

- Định tính endoglucanase bằng vòng tròn đường kính thủy phân (Phụ lục 1)

- Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944) (Phụ lục 1)

3.2.3 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với acetone

Muc đích: Xác định lượng acetone cần thiết để kết tủa endoglucanase có hoạt

tính cao nhất

Tiến hành thí nghiệm

- Chuẩn bị dịch enzyme thô: chủng 1% dịch vi khuẩn (mật số khoảng 107CFU/ml) vào 600 ml môi trường lỏng (Ryckeboer, 2003) cải tiến bằng cơ chất bã mía (Bùi Thị Thiên Thanh, 2010), ủ kị khí trong 5 ngày ở 38oC

- Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi thu được ly tâm với tốc độ 6000 rpm, trong 20 phút ở 4oC

- Mỗi 150ml dịch enzyme thô được dùng để tủa với acetone với các tỉ lệ lần lượt

3 Ủ các ống trong nước đá trong vòng 60 phút

4 Ly tâm các ống với tốc độ 6.000 rpm ở 4oC trong vòng 20 phút

5 Phần cặn lắng được hòa tan bằng dung dịch đệm Tris-HCl 0,05M (pH 7,5)

Chỉ tiêu đánh giá

- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) (Phụ lục 1)

- Xác định phân trăm hoạt lực endoglucanase (Phụ lục 1)

- Định tính endoglucanase bằng vòng tròn đường kính thủy phân (Phụ lục 1)

- Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944) (Phụ lục 1)

3.2.4 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion

Mục đích: Tách endoglucanase ra khỏi các tạp chất khác dựa vào điện tích bề

mặt của protein

Tiến hành thí nghiệm:

a Chuẩn bị gel: Cân 10 gram gel Uno Sphere Q cho vào cốc chứa dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5) ngâm 1-2 ngày ở nhiệt độ phòng, rửa gel bằng dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5) Lặp lại quá trình rửa 2 lần

b Nhồi gel vào cột: Nhồi gel vào cột sắc ký (2,5x10cm) Cân bằng cột bằng 60ml dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5) (3 lần thể tích cột) Tốc độ dòng chảy 1ml/phút

c Bơm mẫu: 20ml dung dịch protein được xác định hoạt tính cao nhất ở 1 trong 3 thí nghiệm trên được bơm vào cột với tốc độ 1ml/phút

d Rửa cột: Cột được rửa bằng dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5), theo dõi quá trình rửa cột qua sắc ký đồ đến khi protein không bám được đẩy ra hết khỏi cột Tốc độ dòng chảy là 1ml/phút

e Rửa giải: Rửa giải bằng gradient nồng độ muối NaCl từ 0-1M, trong dung dịch đệm Tris-HCl (0,02M, pH 8,5), tốc độ dòng chảy 1ml/phút

Mỗi phân đoạn được tiến hành thẩm tích trong dung dịch đệm Tris-HCl (0,05M, pH 7,5) trong 24 giờ ở 4oC

Chỉ tiêu đánh giá:

- Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) (Phụ lục 1)

- Định tính endoglucanase bằng vòng tròn đường kính thủy phân (Phụ lục 1)

- Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944) (Phụ lục 1)

- Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của endoglucanase bằng phương pháp SDS-PAGE (Phụ lục 1)

- Lập bảng đánh giá kết quả tinh sạch

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate

Kết quả quá trình tủa enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn với muối ammonium sulfate được thể hiện trong bảng sau

Bảng 3: Tổng kết quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn ammonium sulfate

Phân đoạn Thể tích

(ml)

Protein tổng (mg)

Hoạt tính tổng (U)

Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)

Qua bảng 3 có thể thấy sau quá trình tủa phân đoạn với AS, hoạt tính đặc hiệu tăng dần từ nồng độ AS 50% đến nồng độ 80% và giảm mạnh xuống ở nồng độ AS 90% Ở phân đoạn nồng độ 50%, protein tổng thu được là cao nhất tuy nhiên hoạt tính

ở phân đoạn này không cao nên hoạt tính đặc hiệu gần như tương đương với mẫu enzyme thô chưa qua tinh sạch (lần lượt là 37,3 và 34,9 U/mg) Điều này cho thấy ở phân đoạn 50%, một số protein không phải protein mục tiêu đã bị tủa xuống Ở phân đoạn 60% AS, hoạt tính tổng thu được là cao nhất (196,5 mg) nhưng hoạt tính đặc hiệu chưa phải là cao nhất (137,4 U) Mặc dù vậy, điều đó cho thấy có khả năng endoglucanase có thể bắt đầu được tinh sạch từ giai đoạn này Từ 50 – 80% AS, hoạt tính đặc hiệu tăng lên rất cao xấp xỉ 8 lần Ở phân đoạn 80% AS, mặc dù protein tổng thu được khá thấp (0,616 mg) nhưng hoạt tính tổng ở phân đoạn này rất cao (176,3 U) Điều đó cho thấy endoglucanase có thể tủa hiệu quả ở phân đoạn này Ở 90% AS thì