phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế (perionyx excavatus)

Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế Perionyx excavatus” được tiến hành nhằm phân lập những dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS BÙI THỊ MINH DIỆU

Cần Thơ, Tháng 5/2015

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG ĐẠM TỪ HỆ TIÊU HÓA TRÙN QUẾ

(Perionyx excavatus)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts BÙI THỊ MINH DIỆU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cần Thơ, Tháng 5/2015

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Ts Bùi Thị Minh Diệu Huỳnh Như Ý DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2015

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp

LỜI CẢM TẠ -* -

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô, đặc biệt là những thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giảng dạy kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập

Xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu cán bộ hướng dẫn đề tài của em Trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn, cô đã giúp đỡ, truyền thụ kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn Cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập, người đã luôn quan tâm, chia sẻ, giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cảm ơn bạn Nguyễn Trung Duẩn, Nguyễn Ngọc Thanh, tập thể lớp Công nghệ sinh học tiên tiến khóa 36 Cảm ơn các cán bộ quản lý ở các phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài cũng như các anh chị đã nhiệt tình chia sẻ kiến thức kinh nghiệm cho em hoàn thành tốt đề tài

Ngoài ra, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ em về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Kính chúc quý thầy cô, anh chị cùng tất cả các bạn sinh viên dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc

Cần thơ, ngày 19 tháng 5 năm 2015

TÓM LƯỢC

Vấn đề ô nhiễm môi trường, đặc biệt là ô nhiễm nguồn nước đã và đang là một mối

đe dọa đối với cuộc sống và sức khỏe của con người Một trong những nguyên nhân gây

ra vấn nạn trên chính là lượng đạm cao từ chất thải chăn nuôi Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra những phương án tốt nhất để xử lý ô nhiễm môi trường nước Trùn quế (Perionyx excavatus) là một loài sinh vật đất có nguồn thức ăn chính là chất thải giàu đạm và được biết đến với rất nhiều lợi ích trong nông nghiệp cũng như xử lý môi trường Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ

hệ tiêu hóa trùn quế (Perionyx excavatus)” được tiến hành nhằm phân lập những dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm trong hệ tiêu hóa của trùn quế để đưa vào ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường Từ ba mẫu trùn quế được thu thập ở những địa điểm và nguồn cơ chất khác nhau (phân bò và rác thải hữu cơ), sau quá trình nuôi cấy đã phân lập được 31 dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm Căn cứ vào sự phát triển của 31 dòng vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu bổ sung ammonium hoặc nitrate hoặc nitrite ở dạng hợp chất với nồng độ tăng dần đã tuyển chọn được hai dòng vi khuẩn R575

và V411 Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh hóa của hai dòng vi khuẩn R575 và V411 có thể nhận định hai dòng này thuộc chi Bacillus theo khóa phân loại Bergey Kết hợp với kết quả so sánh đoạn gen 16S RNA của hai dòng R575 và V411 với dữ liệu trong ngân hàng gen NCBI thông qua phần mềm BLAST có thể kết luận hai dòng vi khuẩn này là Bacillus firmus

Từ khóa: ammonium, nitrate, nitrite, Perionyx excavatus, trình tự DNA, trùn quế

MỤC LỤC

Trang

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG

CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1.GIỚI THIỆU iv

1.1 Đặt vấn đề - 1 -

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về trùn quế 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Đặc tính sinh học của trùn quế 3

2.1.3 Đặc tính sinh lý của trùn quế 4

2.1.4 Sự sinh sản và phát triển 5

2.1.5 Lợi ích của trùn quế 5

2.2 Chu trình nitơ 6

2.2.1 Quá trình cố định đạm 7

2.2.2 Quá trình nitrate hóa 8

2.2.3 Quá trình phản nitrate hóa 9

2.2.4 Vi khuẩn khử đạm 9

2.3 Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử 12

2.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 12

2.3.2 Kỹ thuật điện di DNA 14

2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm 15

2.4.1 Trên thế giới 14

2.4.2 Trong nước 15

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Phương tiện 16

3.1.1 Thời gian và địa điểm 17

3.1.2 Nguyên vật liệu 17

3.1.3 Phương tiện nghiên cứu 17

3.1.4 Hóa chất, môi trường 18

3.2 Phương pháp 20

3.2.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ trùn quế 20

3.2.2 Khảo sát và sơ tuyển các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite 22

3.2.3 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite 22

3.2.4 Khảo sát đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite 23

3.2.5 Nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite 25

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế 30

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm 30

4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập 30

4.2 Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite của các dòng vi khuẩn đã phân lập 33

4.3 Khảo sát đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được 38

4.4 Nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite 41

4.4.1 Dựa vào khóa phân loại Bergey 41

4.4.2 Nhận diện bằng các kỹ thuật sinh học phân tử 41

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 52

Phụ lục 1 Kết quả 52

Phụ lục 2 Hình ảnh thiết bị 60

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần hóa chất pha chế môi trường dinh dưỡng tối thiểu 18

Bảng 3.2 Thành phần môi trường bổ sung ammonium, nitrate và nitrite 19

Bảng 3.3 Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR 27

Bảng 4.1 Tổng hợp kết quả phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng

đạm 30

Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái của 31 dòng vi khuẩn được phân lập 31

Bảng 4.3 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường dinh

dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2 ở 10mM 33

Bảng 4.4 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường

dinh dưỡng tối thiểu bổ sung NH4+, NO3-, NO2- ở 1000mM 36

Bảng 4.5 Tổng kết kết quả khảo sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi

trường dinh dưỡng tối thiểu lần lượt bổ sung NH4+, NO3-, NO2- ở nồng độ

10mM đến 1000mM 37

Bảng 4.6 Kích thước một dòng số dòng vi khuẩn phân lập được 38

Bảng 4.7 Kết quả khảo sát phản ứng catalase của các dòng vi khuẩn 39

Bảng 4.8 Khả năng sinh enzyme oxydase của các dòng vi khuẩn phân lập được

40

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Trùn quế (Perionyx excavatus) 3

Hình 2.2 Lợi ích của trùn quế 5

Hình 2.3 Chu trình nitơ 7

Hình 2.4 Vi khuẩn Pseudomonas 10

Hình 2.5 Vi khuẩn Bacillus firmus 12

Hình 3.1 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 28

Hình 4.1 Các dạng khuẩn lạc của vi khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được 33 Hình 4.2 Biểu đồ kết quả khảo sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu lần lượt bổ sung NH4+, NO3-, NO2- với nồng độ tăng dần 38

Hình 4.3 Kết quả nhuộm Gram 39

Hình 4.4 Kết quả so sánh trình tự DNA của dòng R575 với ngân hàng gen của NCBI bằng phần mềm BLAST 42

Hình 4.5 Kết quả so sánh trình tự DNA của dòng V411 với ngân hàng gen của NCBI bằng phần mềm BLAST 43

Hình 1 phụ lục 2 Một số thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 60

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADP Adenosin Triphosphate ATP Adenosine Triphosphate CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTPs Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylene Diamin Tetra Aceticacid

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Cùng với sự phát triển của kinh tế nông nghiệp, ngành chăn nuôi ngày càng chiếm vị trí quan trọng và hệ lụy là vấn đề ô nhiễm môi trường, một trong những vấn đề toàn cầu được quan tâm nhiều nhất hiện nay Lượng chất thải trong quá trình chăn nuôi được đưa vào môi trường tạo ra một mối đe dọa đến đời sống và sức khỏe của con người Do đó, việc xử lý chất thải chăn nuôi là một trong những vấn đề cấp bách hiện nay

Lượng lớn nitrate được tạo ra từ chất thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân chính gây ô nhiễm nghiêm trọng nguồn nước mà đặt biệt là nguồn nước ngầm (Rivett et al., 1999) Theo Moreno-Vivian (1999) việc sử dụng nitrate hay khử nitrate ở vi khuẩn bao gồm ba mục đích khác nhau: dùng nitrate như một nguồn nitơ cho sự sinh trưởng (đồng hóa nitrate), chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyển hóa năng lượng (hô hấp nitrate) và tiêu hao điện tích nhằm cân bằng phản ứng oxy hóa khử (dị hóa nitrate) Trong khi đó, trùn quế là một loài sinh vật đất có khả năng chuyển hóa nitrate thành khí nitrogen tự do với hiệu quả cao và chi phí thấp nhờ vào các vi sinh vật khử đạm trong hệ tiêu hóa của chúng (Drake và Horn, 2007) Trong tự nhiên, quá trình khử đạm được xem

là then chốt trong chu trình nitơ Quá trình này được ứng dụng để loại trừ ammonium và nitrate một cách hiệu quả thông qua sự phối hợp hoạt động của hai nhóm vi sinh vật, vi khuẩn nitrate hóa và vi khuẩn khử nitrate (Lee et al., 2002)

Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa

trùn quế (Perionyx excavatus)” được tiến hành nhằm tìm ra những vi sinh vật có khả năng

sử dụng đạm trong hệ tiêu hóa của trùn quế để đưa vào ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa của trùn quế tạo tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng xử lý ô nhiễm môi trường

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập và khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ hệ tiêu hóa trùn quế Đánh giá khả năngsử dụng ammonium, nitrate

và nitrite của các dòng vi khuẩn phân lập được để tuyển chọn hai dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng các loại đạm tốt nhất với nồng độ tăng dần Nhận diện hai dòng vi khuẩn tuyển chọn được dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA và các đặc tính hình thái, sinh hóa

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Lớp: Có đai sinh dục (Clillata)

Phân lớp: Giun ít tơ (Oligochaeta)

Bộ: Haplotaxida

Họ: Megascolecidae

Chi: Perionyx

Loài: Perionyx excavatus

Tên khoa học: Perionyx excavatus

2.1.2 Đặc tính sinh học của trùn quế

Trùn quế là loài có kích thước tương đối nhỏ, độ dài khoảng 10 –15 cm, thân hơi dẹt, chiều ngang của giun trưởng thành có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, có màu từ đỏ đến màu đỏ hồng (tùy theo tuổi), màu đậm dần về phía hai đầu, bụng màu nhạt hơn Cơ thể trùn có hình thon dài, nhọn ở hai đầu, thân nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành

tơ Khi di chuyển, lực đẩy được tạo ra từ nhờ vào sự co duỗi các đốt thân kết hợp với các lông tơ phía dưới bám vào cơ chất khiến cơ thể di chuyển một cách dễ dàng

Bề ngoài của trùn quế được bao bọc bởi một lớp biểu bì mỏng màu đỏ, với các tế bào chuyên biệt tiết chất nhầy để giữ ẩm cơ thể và dễ dàng di chuyển qua đất Dưới da

là một lớp các mô thần kinh, hai lớp cơ bắp một lớp bên ngoài mỏng cơ trơn và một lớp bên trong dày hơn là cơ dọc (Edwards và Bohlen, 1996) Trùn quế có một đường tiêu hóa chạy thẳng từ miệng đến hậu môn

Hình 2.1 Trùn quế (Perionyx excavatus)

Trùn quế hô hấp qua da và mao mạch, chúng hấp thu O2 và thải CO2 trong môi trường nước, điều này giúp trùn quế có khả năng sống trong thời gian dài Ngoài ra, nước và muối cũng có thể vận chuyển qua da bằng cách vận chuyển tích cực

Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, ngoại trừ ba đốt đầu và những đốt cuối cùng (Farabee, 2012), các cơ quan này giúp thực hiện chức năng bài tiết chất thải dưới dạng urea và ammoniac Sau đó, các chất thải này được đưa ra khỏi cơ thể nhờ vào những lỗ chân lông trên bề mặt trùn quế

Thức ăn vào miệng, cổ họng hoạt động như một máy bơm hút Ruột của động vật có

vú thường cuộn lại trong khi ruột của trùn quế làm tăng diện tích bề mặt để tăng hấp thu chất dinh dưỡng bằng nhiều nếp gấp chạy dọc theo chiều dài ruột (Edwards & Bohlen,

1996)

2.1.3 Đặc tính sinh lý của trùn quế

Trùn quế là động vật rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn Nhiệt độ thích hợp nhất vào khoảng từ

20 – 300C Điều kiện lý tưởng cho sự sinh trưởng và sinh sản của trùn quế là ở nhiệt độ khoảng 300C và độ ẩm thích hợp Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng hoạt động và có thể chết Trùn có thể chết khi điều kiện khô và ánh sáng cao nhưng có thể tồn tại trong môi trường nước nếu được cung cấp oxy

Trùn quế thích sống trong những môi trường ẩm ướt với độ pH ổn định pH thích hợp nhất khoảng 7,0 – 7,5, nhưng chúng có khả năng chịu đựng được phổ pH khá rộng,

từ 4 – 9

Trùn quế thích nghi với rất nhiều loại thức ăn, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào

có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm,…) Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn hơn, giúp trùn sinh trưởng và sinh sản tốt hơn

Trong tự nhiên, trùn quế thích sống nơi có nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy và thối rữa như trong các đống phân động vật, các đống rác đang mục rửa

2.1.4 Sự sinh sản và phát triển

Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, chúng có cả cơ quan sinh dục đực lẫn sinh dục cái Đai và các lỗ sinh dục nằm ở đốt từ 9 – 15 Tuy nhiên, chúng không thể tự sinh sản được, do đai sinh dục (tinh trùng và trứng) không chín cùng một lúc Do đó, chúng phải giao phối chéo với nhau để hình thành kén Khi giao phối, hai cá thể phải nằm ngược đầu với nhau, kén được tạo ra ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang

từ 2 – 20 trứng, kén trùn di chuyển dần về phía đầu và ra bên ngoài Kén áo hình dạng thon dài, hai đầu túm nhọn lại gần giống như hạt bông cỏ, ban đầu có màu trắng đục, sau chuyển sanh xanh nhạt rồi vàng nhạt Mỗi kén có thể nở từ 2 – 10 con Khi mới nở, con nhỏ như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3 mm, sau 5 –

7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một đường đỏ thẫm trên lưng Khoảng từ 15 –30 ngày sau, trùn trưởng thành và bắt đầu xuất hiện đai sinh dục từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản (Arellano et al., 1995)

2.1.5 Lợi ích của trùn quế

Hình 2.2 Lợi ích của trùn quế

Dựa trên những hoạt động sống của trùn quế mà chúng được sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp nhằm góp phần bảo vệ môi trường, làm thức ăn trong chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy hải sản Thêm vào đó, phân của trùn quế cũng là một trong những loại phân hữu cơ thiên nhiên giàu dinh dưỡng nhất

Trùn Quế Phân hữu cơ

nông nghiệp

Giảm ô nhiễm môi trường

Cải tạo đất

Thức ăn trong chăn nuôi

Trùn quế có sức chịu đựng tốt đối với thuốc trừ sâu và kim loại nặng Sau khi hấp thụ các chất này vào cơ thể, trùn quế giữ chúng trong các mô nhưng không bị ảnh hưởng bởi những chất độc này, sau đó đưa chúng trở lại môi trường bằng cách gia tăng tiết chất nhầy, hạn chế di chuyển và tái sản xuất với một nồng độ nhất định

Do trùn quế có khả năng loại bỏ một số lượng những chất hóa học không mong muốn nên chúng có thể được được xem như tác nhân phân hủy thứ cấp trong đất Những động vật không xương sống này cũng sử dụng như một thước đo chỉ tiêu sinh học trong xử lý ô nhiễm môi trường (Lavelle et al., 1997) Các vi khuẩn đường

ruột khác như Flavobacterium, Dechloromonas, Pseudomonas, Ralstonia, Paracoccusindicate, là những nhân tố giúp trùn quế có khả năng khử đạm, góp

phần bảo vệ môi trường

Với hàm lượng protein thô có sự cân bằng tốt giữa các acid amin và rất giàu lysine chiếm 80% trọng lượng khô cơ thể, trùn quế được sử dụng như một nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng trong nông, ngư nghiệp Thức ăn chủ yếu của trùn quế là phân trâu bò, lợn, gà, rác thải, rau củ quả, cây thân thảo và các loại rác hữu cơ hoại mục,…sau khi thức ăn được trùn quế tiêu hóa sẽ thải ra ngoài thành phân và lượng phân này có thể làm thức ăn trong chăn nuôi

Hình 2.3 Chu trình nitơ

(http://kenpitts.net/bio/ecology/nitrogen_cycle.htm)

Trong tự nhiên nitơ tồn tại ở 3 dạng chủ yếu:

- Dạng chất hữu cơ: acid amin, protein,

Trong tự nhiên, sự cố định đạm sinh học đã đóng góp một lượng đạm lớn cho

sự hấp thu của cây trồng (khoảng 30kg đạm/ha/vụ) trong khi phân đạm hóa học chỉ được cây trồng sử dụng 30% (Boddy và Dobereiner, 1984)

* Quá trình cố định đạm theo Evans và Barber (1997) như sau:

N2 + H2 + 6e NH3

NH3 tạo thành sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo ra protein :

NH3 + Acid hữu cơ Acid amin Protein

2.2.2 Quá trình nitrate hóa (Nitrification)

Sự nitrate hóa là sự chuyển đổi từ ammonium (NH4+) thành nitrate (NO3-) bằng hoạt động của các vi sinh vật Quá trình này được thực hiện dưới tác động của hai loại vi sinh vật trong hai giai đoạn bao gồm: chuyển hóa ammonium thành nitrite và

từ nitrite thành nitrate

a Chuyển hóa ammonium thành nitrite

Quá trình được thực hiện nhờ vào hoạt động của các vi khuẩn oxy hóa

ammonium, các vi khuẩn này được sắp xếp theo nhóm phụ beta (Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus) và gamma proteobacteria (Nitosococcus) (Purkhold et

b Chuyển hóa nitrite thành nitrate

Quá trình này được thực hiện nhờ vào các vi khuẩn oxy hóa nitrite Các loài được xếp vào nhóm phụ alpha của proteobacteria và các loài tự dưỡng bắt buộc ngoại

Nitrogenase

Ammonia monooxygenase

Hydroxylamine oxydoreductase

trừ Nitrobacter Các vi khuẩn oxy hóa nitrite khác như Nitrospina, Nitrospira, Nitrococcus, Pseudomonas, (Bitton, 2005)

Quá trình nitrate hóa chịu ảnh hưởng bởi những yếu tố bao gồm độ pH, nhiệt độ,

độ ẩm và oxy

2.2.3 Quá trình phản nitrate hóa (Denitrification)

Đây là quá trình hô hấp kỵ khí trong đó NO3- hay NO2- được biến đổi qua nhiều giai đoạn và cuối cùng trở thành khí nitơ (N2) nhờ vào hoạt động của các vi khuẩn khử nitrate Tuy nhiên, trong điều kiện oxy không khí chênh lệch, một số loài vi khuẩn cũng có thể tiến hành khử nitrate hiếu khí (Robertson và Kuenen, 1990) Quá trình làm giảm lượng nitrat và hoàn thiện chu trình nitơ

Sự khử nitrate được thực hiện theo trình tự sau (Zumft, 1997):

NO3- NO2- NO N2O N2

Phản nitrate hóa còn bao gồm quá trình oxy hóa ammonium trong điều kiện kị khí được gọi là ANAMMOX (Anaerobic Ammonium Oxidation) Trong đó, ammonium và nitrite sẽ được chuyển đổi trực tiếp thành nitơ phân tử (Mulder, 1989)

Trong đó các thử nghiệm xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất

Các vi sinh vật có liên quan đến sự khử nitrate như Pseudomonas aeruginosa, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas stutzeri, Bacillus licheniformis, Achromobacter severin,

* Chi Pseudomonas

Đây là những vi khuẩn Gram âm, hình que, di chuyển nhờ chiên mao ở đầu, không tạo bào tử

Nhiệt độ thuận lợi để chúng phát triển là 30 - 370C Vi khuẩn Pseudomonas

sp phân bố rộng rãi trong tự nhiên và rất đa dạng nhiều chủng loài Một số loài thuộc chi Pseudomonas có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite, trong đó nổi bật là Pseudomonas stutzeri và Pseudomonas aeruginosa

b Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc khả năng tiết ra nhiều

loại sắc tố, bao gồm pyocyanin (lam hoặc lục), fluorescein (vàng lục) và pyorubin (đỏ nâu) Tuy nhiên trong môi trường thiếu oxy nhưng có sự hiện diện của NO3-

làm chất nhận điện tử và nhiệt độ tối ưu thì chúng vẫn có thể phát triển được

Khuẩn lạc của P.aeruginosa có 3 dạng tiêu biểu: (Trần Linh Thước, 2003)

+ Dạng nhỏ, thô (phân lập ở nhũng chuẩn hoang dại từ đất, nước)

+ Dạng nhầy (phân lập từ bệnh phẩm)

+ Dạng trơn, to, nhô cao, phần rìa có màu trắng

* Chi Bacillus

Bacillus hay trực khuẩn bao gồm các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu

khí hay khị khí không bắt buộc, có khả năng di chuyển nhờ và tạo bào tử hình bầu dục

Chi Bacillus rất đa dạng và phân bố rộng rãi trong tự nhiên Trong đó đáng chú ý nhất và được hiểu rõ nhất là Bacillus subtilis với khả năng phân thủy phân

protein cao và khử đạm Ngoài ra các loài khác cũng có khả năng khử đạm như:

B cereus, B firmus, B Amyloliquefaciens,

Bacillus firmus

Bacillus firmus là vi khuẩn hình que, hiếu khí, Gram dương, có khả năng phát

triển ở môi trường có nồng độ pH cao đến 11, môi trường sống chủ yếu là trong đất

Hình 2.5 Vi khuẩn Bacillus firmus

(Nguồn:http://atlas.sund.ku.dk/microatlas/food/bacteria/Bacillus_firmus/bacillusfirmusspor

ermik.jpg)

2.3 Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử

2.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật được áp dụng trong sinh học phân tử được Kary Mullius phát minh năm 1985 Kỹ thuật này cho phép các nhà khoa học tạo ra hàng trăm nghìn bản sao từ 1 mẫu DNA ban đầu Cơ chế của PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA từ mạch khuôn Bởi vì chỉ có thể gắn các nuleotide vào đầu 3’-OH nên DNA polymerase cần các đoạn mồi để gắn nuleotide đầu tiên vào mạch khuôn Đây là cơ sở để phân định khu vực cần khuếch đại trong PCR

Phản ứng PCR thường được tiến hành từ 35 – 40 chu kỳ

* Những nguyên liệu cần thiết cho PCR:

- Buffer

* Một phản ứng PCR bao gồm các giai đoạn:

- Biến tính (Denaturation): dùng nhiệt độ cao, khoảng 94oC – 95oC trong 30 giây đến 1 phút, để tác động làm đứt các liên kết hydro trong phân tử DNA, tách mẫu DNA từ mạch kép thành mạch đơn

- Gắn mồi (Annealing): Hạ nhiệt độ xuống khoảng 50oC – 70oC nhằm tạo điều kiện cho các đoạn mồi bắt cặp với các mạch đoạn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên tắc bổ sung, quá trình xảy ra trong 30 giây – 1 phút

- Tổng hợp (Elongation): dựa trên hoạt động của enzyme Taq polymerase tiến hành sinh tổng hợp DNA bắt đầu từ các đoạn mồi, quá trình thực hiện theo chiều

từ 5’ – 3’ Nhiệt độ tối ưu là khoảng 72oC và thời gian tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA cần khuếch đại

+ Có các thành phần nucleotide cân bằng, tránh lặp lại nhiều lần GC

+ Đặc hiệu cho sự khuếch đại trình tự DNA mục tiêu

+ Tránh hiện tượng mồi tự bổ sung (khả năng tạo nên 2 cấu trúc hình kẹp tóc)

- dNTPs: bốn loại nucleotide được sử dụng tối ưu ở nồng độ 200 µM cho mỗi loại Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide dễ gây ra lỗi trong quá trình sao chép

- Nồng độ MgCl2 ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả PCR Nồng độ Mg2+ tối ưu cho mỗi phản ứng PCR tùy thuộc vào những yếu tố khác nhau như Taq polymerase, buffer và DNA mẫu

- Buffer: Hiệu suất và độ chính xác của Taq polymerase phụ thuộc nhiều vào thành phần của buffer sử dụng, một số buffer đã chứa sẵn một lượng Mg2+

2.3.2 Kỹ thuật điện di DNA

Điện di DNA là một phương pháp trong sinh học phân tử nhằm sắp xếp các đoạn DNA dựa trên đặc tính cấu trúc (chiều dài và điện tích) Do DNA tích điện

âm trên bề mặt nên khi bị tác động bởi một điện trường thích hợp chúng sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường

Dung dịch đệm dùng trong kỹ thuật điện di thường là TAE, TE, TBE, Hai loại gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di là agarose và polyacryamide:

- Gel agarose là loại gel thông dụng nhất với nồng độ agarose từ 0.7 - 2% tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA

- Gel polyacryamide dùng để phân tách các đoạn có kích thước dưới 1.000 cặp nucleotide

* Các bước tiến hành:

- Điện di DNA được thực hiện bằng cách hòa lẫn các mẫu acid nucleic vào loading buffer sau đó bơm vào các giếng trên gel đã được trộn với chất nhuộm huỳnh quang Runsafe Tiếp theo, đặt mẫu gel này vào một điện trường Quá trình kết thúc khi mẫu DNA được trộn với loading buffer (nhận biết bởi màu xanh của loading buffer) chạy được ¾ chiều dài gel

- Sau đó, các acid nucleic (đoạn DNA) trong gel agarose sẽ hiện ra thành các băng dưới sự chiếu sáng của tia tử ngoại (λ = 300nm) nhờ Runsafe

2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm

Năm 1999 Sikorski và các cộng sự đã ứng dụng PCR trong phân tích đa dạng

kiểu gen và quan hệ giữa các dòng Pseudomonas stutzeri Năm 2002, ông sử dụng môi trường SW - LB để phân lập Pseudomonas stutzeri từ môi trường đất

Cùng lúc đó, các đặc điểm phân tử của quần xã vi khuẩn trong bùn hoạt tính dựa trên vùng 16S của rDNA được nghiên cứu bởi Lee cùng cộng sự của ông Nhằm tìm hiểu về quá trình khử đạm ở những vi khuẩn Gram dương, Verbaendert và các cộng sự (2011) đã nghiên cứu về các đặc tính khử nitrate ở các

vi khuẩn và giải thích những vấn đề còn tồn tại trong việc giải mã gen quyết định đến khả năng khử đạm nhằm nói lên tầm quan trọng của các vi khuẩn Gram dương trong hệ sinh thái

trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả là 20 dòng vi khuẩn được phân

lập thành công và nhận diện được một dòng Pseudomonas stutzeri

Tô Thị Lài (2008) đã tiến hành khảo sát cho thấy Pseudomonas stutzeri được

phân lập từ nước ở các ao cá tra đều có khả năng xử lý ammonium hiệu quả

Nguyễn Thành Nhân (2008) đã phân lập và nhận diện 17 dòng vi khuẩn

Pseudomonas stutzeri từ chất thải các trại chăn nuôi heo ở 2 huyện Châu Thành và

Chợ Gạo thuộc tỉnh Tiền Giang Sau khi giải trình tự 3 dòng 6RC, 7RA và 10NA

kết quả cho thấy chúng đều có mức độ đồng hình 99% với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri CCUG 11256

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu trùn quế nuôi trên 2 nguồn cơ chất khác nhau như: phân bò và rác thải hữu

cơ được thu tại thuộc phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học và khu Hòa An, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.3 Phương tiện nghiên cứu

- Máy ảnh, kính hiển vi Olympus CH-2 (Nhật Bản)

- Tủ ủ vi sinh vật Binder (Hoa Kỳ)

- Máy vortex IKA (Mỹ)

- Tủ lạnh trữ mẫu Panasonic (Nhật Bản)

- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)

- Máy li tâm Eppendorf (Đức)

- Máy PCR Perkin Elmer (Hoa Kỳ)

- Máy sấy chân không Eppendorf Concentretor 5301 (Đức)

- Máy đo OD Beckman Coulter DU 640B (Đức)

- Cân điện tử Sartorius (Đức)

- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternatinal (Đức)

- Lò vi sóng Panasonic NN – GX 36WF (Thái Lan)

- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ)

- Hệ thống chụp hình gel Bio- Rad UV 2000 (Hoa Kỳ)

- Bộ điện di một chiều Embi-Tec (Hoa Kỳ)

- Cối chày, khay khử trùng, đĩa petri, que cấy, que gạt thủy tinh, ống nghiệm, bình tam giác, lam, lamen, bọc nylon, găng tay, quả bóp cao su…

3.1.4 Hóa chất, môi trường

*Các hóa chất dùng để khảo sát đặc tính sinh lý - sinh hóa:

- Thuốc thử oxydase (giấy có tẩm thuốc thử tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride)

1 mL/L

100 mL/L

- 8,5g/L

- 8,1g/L 3,4 mg/L 4,35mg/L

1 mL/L

100 mL/L

-

- 8,5g/L 8,1g/L 3,4 mg/L 4,35 mg/L

1 mL/L

100 mL/L

*Các hóa chất dùng để trích DNA:

- Proteinase K (20 mg/mL) - Sodium dodecyl sulfate (SDS)10%

- Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% NaCl 0,75 M

- TE pH 8,0 (10 mM Tris HCl; pH 7,6; 1 mM EDTA)

*Các hóa chất dùng để thực hiện phản ứng PCR:

- Bovine Serum Albumin Acetylated (BSA) - Buffer

*Các hóa chất dùng điện di sản phẩm PCR:

- Thang chuẩn DNA 100 bp plus và 100 bp (Fermentas)

3.2 Phương pháp

3.2.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng sử dụng đạm từ trùn quế

* Mục đích

Phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và

nitrite dựa trên môi trường chuyên biệt

a Chuẩn bị và xử lý mẫu

- Ba mẫu trùn quế được thu từ 2 nguồn cơ chất nuôi khác nhau: phân bò (thu từ khu Hòa An và phòng thí nghiệm Sinh học phân tử ) và rác thải hữu cơ (quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ)

- Mẫu trùn quế trên mỗi nguồn cơ chất thu lấy 15 - 20 con đã được nuôi khoảng

2 tháng Các mẫu được gắn nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phòng

- Trước khi tiến hành thí nghiệm, mẫu trùn được rửa bằng nước sạch cho đến khi không còn lẫn cơ chất nào

- Sau đó, rửa mẫu lại bằng ethanol 70% và nước cất vô trùng 2 lần

b Phân lập

- Cắt nhỏ và nghiền mịn trùn quế trong cối sứ Sau đó cân 1 g mẫu cho vào bình

tam giác loại 50mL và thêm 9 mL nước cất vô trùng Sử dụng máy lắc để đồng nhất mẫu trong 30 phút nhằm phóng thích hệ vi sinh vật trong đường ruột trùn quế

- Thu lấy dịch mẫu rồi pha loãng nồng độ 10-2 đến 10-3 Sau đó, hút lấy 50 µL nhỏ lên đĩa petri đã có môi trường dinh dưỡng tối thiểu

- Dùng que thủy tinh trải mẫu đều khắp mặt môi trường, mở nắp đĩa để khô trong vòng 5 đến 10 phút dưới đèn cồn trong tủ cấy Sau đó ủ đĩa trong tủ ủ vi sinh vật

từ 24 - 48h ở 30oC để vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc

- Lựa chọn các dạng khuẩn lạc có nhiều trên môi trường cấy phân lập đến khi vi khuẩn ròng (khuẩn lạc rời rạc trên các đường cấy)

- Tiến hành kiểm tra độ ròng bằng kính hiển vi quang học:

+ Khử trùng lamen và lam kính bằng ethanol 70%

+ Nhỏ khoảng 30 - 50 µL nước cất vô trùng lên lam kính

+ Dùng que cấy lấy 1 ít khuẩn lạc ròng trải lên giọt nước trên lam kính (que cấy

đã khử trùng bằng đèn cồn và để nguội)

+ Để một cạnh của lamen tiếp xúc với lam kính theo 1 góc 45o rồi từ từ đậy lamen lên mẫu để tránh bọt khí

+ Quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu bao gồm màu sắc, hình dạng, độ nổi của khuẩn lạc

- Chuyển những khuẩn lạc ròng trữ trong ống nghiệm chứa môi trường

3.2.2 Khảo sát và sơ tuyển các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate và nitrite

- Từ các dòng vi khuẩn ròng, tiến hành nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu có chứa ammonium hoặc nitrate hoặc nitrite ở dạng hợp chất (NH4Cl, NaNO3, KNO2)

- Sau 24 – 48 giờ nuôi cấy, dựa vào khả năng phát triển để đánh giá khả năng sử dụng đạm của từng dòng:

+ Chủng vi khuẩn nào không phát triển được ký hiệu là - , được xem là không có khả năng sử dụng đạm

+ Chủng phát triển yếu, ký hiệu + Chúng được xem là có khả năng khử thấp (khuẩn lạc chiếm 1/3 diện tích bề mặt đĩa petri)

+ Chủng phát triển mạnh, ký hiệu ++, có khả năng chuyển hóa trung bình (khuẩn lạc chiếm 2/3 diện tích bề mặt đĩa petri)

+ Chủng nào phát triển rất mạnh, ký hiệu +++, có khả năng chuyển hóa tốt (khuẩn lạc chiếm nhiều hơn 2/3 diện tích bề mặt đĩa petri)

- Các chủng phân lập, sau khi đã tuyển chọn được trữ lại

3.2.3 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng ammonium, nitrate

và nitrite

- Khảo sát khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu có bổ sung NH4Cl, NaNO3, KNO2 (nồng độ 10 mM) Tiếp tục kiểm tra khả năng phát triển của chúng với các nồng độ tăng dần (100 mM, 200mM, 400 mM,

600 mM, 800 mM và 1000 mM)

- Quan sát sự phát triển của chúng sau 24 – 48 giờ nuôi cấy, từ đó ghi nhận khả năng sử dụng đạm của chúng

- Các dòng vi khuẩn phát triển mạnh trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu tối thiểu

có bổ sung NH4Cl, NaNO3, KNO2 với nồng độ cao được chọn

3.2.4 Khảo sát đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng

sử dụng ammonium, nitrate và nitrite

* Đo kích thước tế bào vi khuẩn

Tiến hành quan sát tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi ở vật kính dầu x100 (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008)

+ Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh để thấy rõ ảnh của thước Dịch chuyển thước trắc vi vật kính và thước trắc vi thị kính sao cho 2 thước song song và gần sát nhau

+ Tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho

2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính thế nào cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thi kính

+ Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính + Trị số mỗi khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau:

x= N/n*10 µm Trong đó: N: số khoảng của trắc vi vật kính N = 6

n: số khoảng của thước trắc vi thị kính n = 36

x: trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính

Ta có: x = * 10 µm = 1,67µm

Thay thước trắc vi thị kính bằng vi mẫu, điều chỉnh để thấy rõ ảnh của vi mẫu

Di chuyển mẫu vật để một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính Tìm vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo Đếm số khoảng trắc vi và tính kích thước của mẫu

6 36

Suy ra kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính

* Nhuộm Gram

Lấy một ít khuẩn lạc cho vào nước cất vô trùng trên kính mang vật rồi trải mẫu thật đều lên kính mang vật, cố định mẫu bằng cách hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm cố định tế bào vi khuẩn trên kính mang vật

Nhỏ 1 – 2 giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu tế bào vi khuẩn đã

cố định, trải đều bằng que cấy và để yên trong 2 phút

Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước Nhỏ 1 – 2 giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để yên trong 1 phút Rửa mẫu bằng nước cất

vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước

Tẩy màu bằng dung dịch acetone trong vòng 2 – 3 giây, rửa lại với nước cất Nhỏ 1 – 2 giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy và để yên trong một phút Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng cho đến khi không còn màu của fushin, chậm nhẹ cho khô nước

Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu x400 và ghi nhận Gram của vi khuẩn Nếu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008)

- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc cho lên lam kính sạch

- Nhỏ một giọt H2O2 30% lên trên khuẩn lạc