khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn escherichia coli sinh men β lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại một số nông hộ ở huyện tam bình và mang thít tỉnh vĩnh long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNGBỘ MÔN THÚ Y Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh men β-lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại một s

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

LÝ NGUYỄN ANH THƯ

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SINH MEN β-LACTAMASES PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TAM BÌNH VÀ

MANG THÍT - TỈNH VĨNH LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

MSSV: 3103061 Lớp: CN10Y4A1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh men

β-lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại một số nông hộ ở huyện Tam Bình

và Mang Thít, tỉnh Vĩnh Long” do sinh viên Lý Nguyễn Anh Thư thực hiện

tại Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại họcCần Thơ từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014

Cần Thơ, ngày….tháng… năm Cần Thơ, ngày….tháng… năm

Bùi Thị Lê Minh

Cần Thơ, ngày….tháng… năm

Duyệt Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trước tiên, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến ba mẹ và những người thân yêutrong gia đình Cám ơn ba mẹ đã không quản khó khăn vất vả để cho tôi đượccất bước đến trường, luôn bên cạnh động viên và là chỗ dựa tinh thần vữngchắc để tôi có thể bước đi đến ngày hôm nay.

Xin gửi lời biết ơn đến quý thầy cô Bộ môn Thú Y và Bộ môn Chăn nuôi đãhết lòng truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốtquá trình học tập tại trường Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến côBùi Thị Lê Minh, người đã tận tâm chỉ bảo và hỗ trợ nhiệt tình giúp tôi hoànthành luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng xin cảm ơn các anh chị cao học Thú y K19, các bạn bè trong vàngoài lớp Dược Thú y K36 đã giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốtkhoảng thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng xin kính chúc mọi người thật dồi dào sức khỏe, hạnh phúc và thànhcông trong cuộc sống!

Lý Nguyễn Anh Thư

TÓM LƯỢC

Đề tài được thực hiện từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2014 nhằm khảo sát sự

hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL trên 48 mẫu swab phân được lấy từ gà thịt và gà đẻ khỏe mạnh tại một số nông hộ ở huyện Tam Bình và Mang Thít, tỉnh Vĩnh Long Bằng phương pháp đĩa kết hợp phân lập được 21 mẫu E coli

ESBL dương tính chiếm tỉ lệ 43,75% Trong đó, gà đẻ khỏe có tỉ lệ E coli

ESBL là 58,33% (14/24 mẫu), cao hơn so với gà thịt khỏe là 29,17% (7/24 mẫu) Kiểm tra tính nhạy cảm của các chủng E coli ESBL phân lập được đối với một số loại kháng sinh bằng phương pháp kháng sinh đồ dựa theo nguyên

lý của Kirby-Bauer Kết quả cho thấy vi khuẩn E coli ESBL đã đề kháng mạnh với các kháng sinh ampicillin (93,02%), cefaclor (93,02%), cefuroxime (86,05%) và còn nhạy cảm với amikacin (97,67%), doxycycline (93,02%), fosfomycin (86,05%) Bên cạnh đó, các chủng E coli ESBL kiểm tra còn đề

kháng đồng thời từ 2 đến 9 loại kháng sinh khác nhau với 29 kiểu hình đa

kháng Trong đó, E coli ESBL đồng kháng với 5 đến 6 loại kháng sinh là chủ yếu với tỉ lệ 18,60% và đồng kháng với 2 loại kháng sinh có tỉ lệ thấp nhất là 4,65%.

MỤC LỤC

Trang duyệt i

Lời cảm ơn ii

Tóm lược iii

Mục lục iv

Danh sách chữ viết tắt vi

Danh sách bảng vii

Danh sách hình viii

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN 3

2.1 Tổng quan về vi khuẩn E coli 3

2.1.1 Lịch sử vi khuẩn E coli 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo 3

2.1.3 Đặc tính nuôi cấy 4

2.1.4 Đặc tính sinh hóa 5

2.1.5 Tính gây bệnh và sức đề kháng 5

2.2 Khái quát về men β-lactamases phổ rộng (ESBL) 7

2.2.1 Lịch sử phát hiện ESBL 7

2.2.2 Khái niệm và đặc tính của ESBL 8

2.2.3 Các phương pháp phát hiện ESBL 9

2.3 Kháng sinh 11

2.3.1 Định nghĩa 11

2.3.2 Sự đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh 11

2.3.3 Một số nhóm kháng sinh thông dụng 12

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

2.5 Tình hình chăn nuôi gà tại huyện Mang Thít và huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long 17

3.1.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 19

3.1.2 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm 19

3.1.3 Hóa chất và môi trường thí nghiệm 19

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 19

3.2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 20

3.2.3 Phương pháp kiểm tra tính nhạy cảm của E coli ESBL đối với kháng sinh 23

3.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả sự hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL trên gà thịt khỏe 25

4.2 So sánh tỉ lệ E coli ESBL dương tính trên gà thịt và gà đẻ khỏe 26

4.3 So sánh tỉ lệ E coli ESBL dương tính giữa 2 địa điểm lấy mẫu 27

4.4 Kết quả kháng sinh đồ 27

4.5 Sự đa kháng của vi khuẩn E coli ESBL đối với các loại kháng sinh 30

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ CHƯƠNG 37

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

ESBL Extended Spectrum β-Lactamases

CLSI Clinical and Laboratory Standards InstituteCFU Colony Forming Unit

4.3 Kết quả sự hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL tại 2 địa

điểm lấy mẫu

27

4.4 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng E coli ESBL phân

lập được

28

4.5 Kết quả kiểm tra tính đa kháng của các chủng E coli ESBL

phân lập được đối với các loại kháng sinh

30

DANH SÁCH HÌNH

2.1 Vi khuẩn E coli bắt màu gram âm 42.2 Vị trí địa lý tỉnh Vĩnh Long 183.1 Phương pháp đĩa kết hợp phát hiện E coli ESBL 213.2 Quy trình nuôi cấy và phân lập vi khuẩn E coli ESBL 224.1 Kết quả kháng sinh đồ 294.2 So sánh tỉ lệ đa kháng đối với một số loại kháng sinh của vi

khuẩn E coli ESBL

31

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta đã có nhữngbước phát triển đáng kể Tổng đàn gia cầm cả nước năm 2014 đạt 328,1 triệucon, tăng 4,6% so với năm 2013, trong đó đàn gà đạt 243 triệu con, tăng 4,7%(http://channuoivietnam.com/tinh-hinh-san-xuat-chan-nuoi-thang 112014/).Trứng và thịt gà là một nguồn thực phẩm quan trọng của con người và đónggóp rất lớn cho nền kinh tế Bên cạnh phương pháp chăn nuôi công nghiệp vớiquy mô lớn và tập trung, hình thức chăn nuôi gia cầm nhỏ lẻ tại các hộ giađình ở nước ta còn chiếm tỉ lệ khá cao tới 60% tổng số lượng gia cầm trêntoàn quốc (Đình Tú và Thạch Bình, 2011) Đặc biệt là ở Đồng bằng sông CửuLong nói chung và tỉnh Vĩnh Long nói riêng, hình thức nuôi nông hộ rất phổbiến Do quy mô vừa và nhỏ nên quy trình chăm sóc và quản lý dịch bệnhchưa được kiểm soát chặt chẽ làm cho dịch bệnh rất dễ xảy ra và lây lan nhanhchóng Việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho gà mang lại nhiều

thành công và có hiệu quả kinh tế Theo Bùi Thị Tho và ctv (2012) cho thấy

nếu tính theo hướng sản xuất thì tỉ lệ hộ chăn nuôi sử dụng kháng sinh đểphòng bệnh là 45,2% cao hơn so với để trị bệnh là 26,7%, điều này chứng tỏ

gà khỏe mạnh đã tiêu thụ một lượng kháng sinh tương đối lớn mặc dù chưa cóbiểu hiện bệnh Sử dụng kháng sinh không đúng cách hoặc lạm dụng khángsinh với nhiều mục đích khác nhau đã tạo áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn,làm cho vi khuẩn không chỉ đề kháng với chính kháng sinh đó mà nguy hiểmhơn là còn đề kháng chéo với nhiều kháng sinh khác

Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy rằng sinh men β-lactamases phổ rộng(ESBL) là nguyên nhân chủ yếu gây gia tăng đề kháng kháng sinh ở những vi

khuẩn gram âm, đặc biệt là Escherichia coli (E coli) và một số vi khuẩn thuộc

họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacae Ở Trung Quốc, theo nghiên cứu điều tra xu hướng kháng kháng sinh của 696 chủng E coli có nguồn gốc từ gà

trong giai đoạn 1970-2007 cho thấy xu hướng gia tăng tình trạng kháng kháng

sinh và các yếu tố quyết định tỉ lệ sinh β-lactamases cao trong các chủng E.

coli có nguồn gốc từ gà có thể là do việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi,

đặc biệt là nhóm β-lactam Nghiên cứu của Geser et al (2012) tại Thụy Sĩ cho

thấy từ 334 mẫu phân heo, trâu bò, cừu và gà, tỉ lệ vi khuẩn dương tính vớiESBL phân lập được là 26,9% Trong đó, vi khuẩn sinh ESBL có nguồn gốc

từ phân gà chiếm tỉ lệ cao nhất với 63,4% Ở Việt Nam, tình hình vi khuẩn

kháng thuốc của vi khuẩn E coli được phân lập từ gà đang ngày một gia tăng

và gây tổn thất không ít cho người chăn nuôi gà nói riêng và cho ngành chănnuôi gia cầm ở Việt Nam nói chung Do đó, việc xác định sự hiện diện và khả

năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ

khỏe mạnh là điều cần thiết, giúp cho người chăn nuôi có những chiến lượcđịnh hướng sử dụng kháng sinh sao cho hợp lí và đạt hiệu quả tối đa

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi

khuẩn Escherichia coli sinh men β-lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại

một số nông hộ ở huyện Tam Bình và Mang Thít - tỉnh Vĩnh Long” được

thực hiện

Mục tiêu của đề tài:

Xác định tỉ lệ hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ khỏe

tại một số nông hộ ở huyện Mang Thít và huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long

Kiểm tra tính nhạy cảm của các chủng E coli ESBL phân lập được đối với

một số loại kháng sinh

E coli do bác sĩ Thoedore Escherich phát hiện vào năm 1885 và công bố với

tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá Tuy nhiên, đến năm 1895 vi khuẩn được đổi tên thành Bacillus

coli và một năm sau đó là Bacterium coli Sau nhiều kiểu gọi tên, đến năm

1991, vi khuẩn này được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli

(http://www.about-ecoli.com)

Năm 1894, Ligniere lần đầu tiên báo cáo về trận dịch trên gà và đã phân lập

được vi khuẩn E coli từ tim, gan, lách của gia cầm bệnh Năm 1894-1922, với

những nghiên cứu tiếp theo, Ligniere đã phát hiện bệnh trên những loài giacầm khác và đã chứng minh tính gây bệnh của vi khuẩn phụ thuộc vào số

lượng và đường lây nhiễm E coli gây nhiễm khuẩn huyết trên gà được mô tả

lần đầu vào năm 1907, gây bệnh viêm ruột được mô tả và phân lập vào năm

1923 Từ năm 1938-1956, Garrard đã mô tả một thể bệnh u hạt do vi khuẩn

E coli gây ra (Hjarre’s disease), đồng thời đã xác định vai trò của vi khuẩn

E coli trong nhiều thể bệnh khác như viêm túi khí, viêm khớp, viêm cuốn rốn,

viêm mắt, viêm phúc mạc, viêm ống dẫn trứng (Hồ Thị Việt Thu và NguyễnĐức Hiền, 2012)

2.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo

E coli là trực khuẩn hình gậy, ngắn, kích thước 2-3µm x 0,6µm Trong cơ thể

trực khuẩn có hình cầu, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn

E coli di động do có lông ở xung quanh thân nhưng một số không thấy di

động Vi khuẩn không sinh nha bào, bắt màu gram âm (Lưu Hữu Mãnh,2009)

Hình 2.1 Vi khuẩn E coli bắt màu gram âm (x1000)

có mùi phân thối

Trên môi trường MC (MacConkey Agar), vi khuẩn lên men đường lactose vàhình thành khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy, mặt khuẩn lạc hơilồi, kích thước 2-3mm

E coli trên môi trường NA (Nutrient Agar) hay MHA (Mueller-Hinton Agar),

qua 18-24 giờ ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C, hình thành những khuẩn lạc trònướt, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi đường kính 2-3mm

Trên môi trường EMB (Eosin Methylen Blue Agar) khuẩn lạc E coli to, tròn,

hơi lồi, bóng, màu tím đen, có ánh kim

Indole: Trong môi trường có tryptophan, E coli nhờ có tryptophanase sẽ ly

giải tryptophan thành indole Để nhận diện indole, người ta nhỏ vào vài giọtthuốc thử Kovac’s, hợp chất indole với thuốc thử sẽ có vòng đỏ, ngược lạiphản ứng âm tính vòng đỏ sẽ không xuất hiện và môi trường vẫn giữ nguyênmàu vàng ban đầu: Indole (+)

Methyl Red: Trong môi trường có glucose, E coli tạo nồng độ H+ cao(pH < 4,5) Cho thuốc thử methyl red vào, môi trường có màu đỏ và ngược lại

nếu không phải là vi khuẩn E coli thì môi trường không đổi màu: MR (+).

Voges-Proskauer: tùy loại enzyme vi khuẩn có được mà quá trình lên menglucose sẽ cho sản phẩm cuối cùng khác nhau Một trong số đó là aceton sẽ

tạo phức màu đỏ với thuốc thử α-naphthol và KOH E coli có VP (-): không

nhiều type huyết thanh khác nhau (Nguyễn Thanh Bảo và ctv., 2009).

Theo Nguyễn Đức Hiền (2009), độc tố E coli gây bệnh ở gia cầm ít độc hơn ở

loài hữu nhũ Sự khác nhau có thể do sự sản sinh ít độc tố hơn ở gia cầm hoặc

có thể không tìm ra được do sử dụng test thử của chủng gây bệnh ở loài hữunhũ để thử trên gia cầm Độc tố được xác định theo loài vi khuẩn gây bệnh

- Enterotoxin: gồm 2 loại là chịu nhiệt (ST: heat stable toxin) và khôngbền với nhiệt (LT: heat labile toxin) Độc tố này là nguyên nhân gây bệnh tiêuchảy cấp tính

- Verotoxin (gồm VT1, VT2 và VTV2): độc tố này tương tự như

Shiga-toxin của vi khuẩn Shigella dysenteriae type 1 gây xuất huyết tiêu hóa, phổi,

thận và tác động đến hệ thần kinh

- Necrotoxin: gồm CNF1 và CNF2 là độc tố gây hoại tử

E coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề

kháng của con vật giảm sút (do chăm sóc nuôi dưỡng hoặc thời tiết thay đổi)

Bệnh do E coli có thể xảy ra như một bệnh truyền nhiễm kế phát trên cơ sở thiếu vitamin hoặc một bệnh virus hoặc kí sinh trùng E coli thường gây bệnh

cho con vật mới đẻ từ 2-8 ngày (Lưu Hữu Mãnh, 2009)

Theo Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền (2012), hầu hết các loài động vật

đều có E coli thường trú trong ống tiêu hóa Ở ống tiêu hóa gia cầm, mật độ

E coli có thể đến 106CFU/g Sự lây nhiễm E coli từ trứng thì phổ biến và là

nguyên nhân gây tỉ lệ chết cao cho gia cầm mới nở Bình thường có khoảng

0,5-6% trứng gia cầm khỏe có chứa E coli, 26,5% gà mái nhiễm E coli đẻ trứng có vi khuẩn E coli và khoảng 70% gà con mắc bệnh mềm nhũng ở gà con (mushy chick disease) có chứa E coli trong túi noãn hoàng Tuy nhiên

đường lây nhiễm qua phân vẫn là cách lây truyền quan trọng nhất Hầu hết các

chủng E coli phân lập từ gia cầm chỉ gây bệnh cho gia cầm, ít nguy hại đến

người và các động vật khác như: O1, O2, O35, O78, O18, O81, O115, O116

và O132 Tuy nhiên loài gia cầm cũng mẫn cảm với chủng E coli O157:H7 là

một chủng sinh độc tố Shiga gây hại cho người

Trong tự nhiên, vi khuẩn E coli tồn tại khắp nơi nền chuồng, máng ăn, nước

uống, chuồng trại ẩm thấp chật chội, mật độ nuôi cao, biên độ nhiệt thườngxuyên thay đổi, stress có thể là những điều kiện phát sinh mầm bệnh Nguồnlây bệnh chủ yếu là từ gà bệnh và gà khỏe mang trùng bài xuất mầm bệnh ramôi trường nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có thể do các loài gặm nhấm lâytruyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm bệnh từ môi trường ngoàivào (Nguyễn Xuân Bình, 2005)

Cũng như các loại vi khuẩn không sinh nha bào khác, E coli đề kháng yếu với

nhiệt độ, ở 550C sẽ bị diệt trong 1 giờ, 600C trong 30 phút và chết ngay khiđun sôi 1000C Ở môi trường ngoài các chủng E coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng Các chất sát trùng thông thường diệt được E coli: acid phenic, biclorua

thủy ngân, formol, hydroperoxide 0,1000 diệt vi khuẩn sau 5 phút (Lưu HữuMãnh, 2009)

2.2 Khái quát về men β-lactamases phổ rộng (ESBL)

2.2.1 Lịch sử phát hiện ESBL

Năm 1928, Alexander Fleming đã phát hiện ra chất kháng sinh đầu tiên có

nguồn gốc từ loài nấm mốc thuộc họ Penicillium và đặt tên là penicillin Đến

năm 1941 nhóm tác giả tại Oxford gồm Flory, Chain và Harley đã tinh chế

được penicillin G có tác dụng diệt Staphylococcus aureus (S aureus) nhưng

kém hiệu quả với trực khuẩn gram âm Cùng thời gian này Abraham và Chain

đã phát hiện ở các trực khuẩn gram âm có sinh một loại enzyme kháng lại

penicillin Năm 1944, vi khuẩn S aureus kháng penicillin do sinh enzyme

penicillinase lần đầu tiên xuất hiện Từ năm 1948 đến năm 1956, cáccephalosporin thế hệ đầu tiên được nghiên cứu và đưa vào sử dụng gọi làcephalosporin thế hệ 1 (Abraham and Chain, 1940)

Năm 1961, thế hệ pencillin phổ rộng đầu tiên là ampicillin được ra đời, có tácdụng điều trị cả trực khuẩn gram âm và cầu khuẩn gram dương Năm 1963, tạiAthens Hy Lạp, người ta phân lập từ máu một bệnh nhân tên là Temoneira

được chủng E coli kháng ampicillin có sinh loại enzyme β-lactamases, và

dùng tên bệnh nhân đặt tên cho enzyme này là TEM-1 TEM-1 thường gặp

hơn ở các vi khuẩn gram âm Có tới trên 90% các chủng E coli kháng kháng

sinh ampicillin là do sinh loại enzyme này Năm 1965, TEM-2 được phát hiện

là do TEM-1 biến đổi một amino acid Nhờ TEM-1 và TEM-2 đã làm cho vikhuẩn gram âm kháng lại các penicillin, ampicillin và cephalosporin thế hệ 1trong một thời gian dài sau đó Đến năm 1974, người ta phát hiện một β-

lactamases loại khác ở Klebsiella pneumonia (K pneumonia) và E coli có

nhiều thay đổi về amino acid so với TEM-1 và TEM-2 nên đặt tên là SHV-1(Sulphyryl Variable) Các enzyme này kháng cao với các kháng sinh penicillin

và cephalosporin thế hệ 1 (Datta and Kontomichalou, 1965; Paterson andBonomo, 2005)

Đầu những năm 1980, các kháng sinh β-lactam phổ rộng như cephalosporinthế hệ thứ 2, thế hệ thứ 3 và monobactam được đưa vào điều trị các vi khuẩnkháng thuốc Nhưng rồi một loại enzyme β-lactamases có nguồn gốc doTEM-1, TEM-2, SHV-1 đột biến thay đổi một số amino acid gọi là ESBL(Extended spectrum β-lactamases) đã xuất hiện, enzyme này có khả năng phânhuỷ các loại kháng sinh phổ rộng trên (Paterson and Bonomo, 2005) Năm

1983 ở Đức đã phát hiện chủng Klebsiella ozaenae sinh enzyme β-lactamases

phân huỷ cefotaxime gọi là SHV-2, đây là trường hợp sinh ESBL đầu tiên

CTX-1 Tại Nhật (1986) và Đức (1989) phát hiện ra E coli sinh ESBL kháng

cefotaxime không phải TEM và SHV nên đặt tên là CTX-M-1 Điều đáng longại là CTX-M có khả năng phân huỷ hầu hết cephalosporin thế hệ 3 và cả

cephalosporin thế hệ 4 (Knother et al., 1983; Paterson and Bonomo, 2005).

Như vậy, với việc sử dụng các kháng sinh ngày càng nhiều và có nhiều ESBLđược mã hoá qua R-plasmid (Resistance plasmid: Plasmid mang tính kháng,mang các gen có khả năng kháng lại các thuốc kháng sinh hay các chất độc),nên ngày càng làm gia tăng tỉ lệ lẫn chủng loại ESBL trong đó có các ESBLngoài TEM, SHV, CTX-M như OXA-, PER-, VEB-,…Đến nay các ESBL mớivẫn đang tiếp tục được thông báo Những bài báo cáo nghiên cứu về menESBL có từ các tác giả trên hơn 30 quốc gia trên thế giới, điều này phản ánh

sự phân bố toàn cầu của vi khuẩn sinh ESBL (Paterson and Bonomo, 2005)

2.2.2 Khái niệm và đặc tính của ESBL

Khái ni ệm

ESBL là các β-lactamases có khả năng tác động lên các penicillin,cephalosporin thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và aztreonam (trừ kháng sinhcefamycin và carbapenem) do chúng có khả năng ly giải các kháng sinh nàynhưng chúng lại bị ức chế bởi các các chất ức chế β-lactamases nhưacid clavulanic, sulbactam, tazobactam (Nguyễn Thị Khánh Ly, 2013)

Đặc tính

Bản chất hoạt lực của ESBL chính là khả năng thủy phân các cephalosporin(trừ cephamycin), các penicillin (trừ temocyllin) và aztreonam Nhómcarbapenem như imipenem, meropenem, ertapenem đều bền vững với ESBL.Với các biến thể gen khác nhau, chúng có hoạt lực khác nhau với cáccephalosporin Người ta thấy rằng một số chủng vi khuẩn có ESBL nhưng vẫnnhạy cảm với một số kháng sinh cephalosporin trên kết quả kháng sinh đồ.Tuy nhiên, trong lâm sàng nếu chúng ta dùng các kháng sinh đó để điều trị vẫnthường bị thất bại Plasmid mang gen ESBL có kích thước tương đối lớn, đặcbiệt là trên plasmid đó thường có một số gen kháng kháng sinh khác, tạo nênhiện tượng đồng kháng rất nguy hiểm Đồng kháng thường gặp trong cácchủng có ESBL là kháng aminoglycoside, fluoroquinolon, tetracycline,chloramphenicol và sulfamethoxazole+trimethoprim Các plasmid đã kháng

thuốc này đều được tìm thấy ở các vi khuẩn họ Entobacteriaceae, trong đó hay gặp nhất là E coli (Nguyễn Tuấn Minh, 2008).

2.2.3 Các phương pháp phát hiện ESBL

Phát hiện ESBL bằng các phương pháp kỹ thuật vi sinh lâm sàng theo nguyêntắc chung là dựa trên chất ức chế men β-lactamases (thường là acid clavulanic)kết hợp với một cephalosporin thế hệ 3 như ceftazidime, cefotaxime Acidclavulanic ức chế men β-lactamases, làm tăng mức độ nhạy cảm của khángsinh với vi khuẩn

Phương pháp đĩa đôi (Double disk diffusion test)

Phương pháp này được mô tả bởi Jarlier et al vào năm 1988 Dựa trên nguyên

tắc acid clavulanic ức chế ESBL nên làm giảm mức độ đề kháng của vi khuẩnvới cephalosporin, mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporinkhi đặt gần một đĩa kháng sinh chứa acid clavulanic Một đĩa kháng sinhamoxicillin-acid clavulanic được đặt ở trung tâm đĩa thạch MHA đã cấy vikhuẩn, cách các đĩa kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 là 30mm Nếu có hiệntượng tăng kích thước vòng vô khuẩn về hướng có acid clavulanic của đĩakháng sinh cephalosporin thế hệ 3, đó là do tác động cộng hưởng của acidclavulanic và kháng sinh β-lactam, kết luận vi khuẩn sinh ESBL Sử dụngnhiều kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 sẽ làm tăng tính nhạy cảm của xétnghiệm này Hiện nay, phương pháp này vẫn được nhiều phòng xét nghiệmtrên thế giới dùng Tuy nhiên, theo Paterson thì có thể làm tăng độ nhạy củaxét nghiệm lên nếu giảm khoảng cách giữa 2 đĩa amoxicillin-acid clavulanic

và cephalosporin thế hệ 3 (Paterson and Bonomo, 2005)

Phương pháp đĩa kết hợp (Combination disk test)

Phương pháp này được Jacoby và Han mô tả lần đầu tiên vào năm 1999.Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự so sánh đường kính vòng vôkhuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 khi không có và có sự kếthợp với acid clavulanic Các ESBL có khả năng phân hủy các cephalosporinphổ rộng nhưng bị ức chế bởi acid clavulanic Do đó, Viện nghiên cứu nhữngtiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm CLSI (2014) đề nghị sử dụng đồngthời cả 2 kháng sinh cefotaxime và ceftazidime cho xét nghiệm này Thêm10µg acid clavulanic vào đĩa kháng sinh cefotaxime và ceftazidime, nếu có sựgia tăng hơn 5mm đường kính vòng vô khuẩn so với đĩa kháng sinh không cóacid clavulanic thì xét nghiệm dương tính, xác nhận có sự sinh men ESBL của

vi khuẩn

Phương pháp ChromeID-ESBL

khuẩn nếu có trong môi trường Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ có khả năng pháttriển trên môi trường ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có màu sắc khácnhau, đặc trưng cho các loài vi khuẩn khác nhau Vì vậy có thể đồng thời vừađịnh danh vi khuẩn vừa phát hiện vi khuẩn đề kháng.

Phương pháp pha loãng

Phương pháp này sử dụng một loại cephalosporin phổ rộng đơn thuần kết hợpvới acid clavulanic (hay chất ức chế men β-lactamases khác như sulbactam) đểphát hiện ESBL dựa vào sự giảm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) củacephalosporin khi có thêm chất ức chế men β-lactamases (Paterson andBonomo, 2005) Hiện nay, trên thị trường có nhiều bộ xét nghiệm sử dụngphương pháp pha loãng này như:

- E-test: Dùng que E-test với một đầu là dãy chứa nồng độ của cephalosporin

và đầu đối diện là dãy nồng độ của cephalosporin/acid clavulanic Khi đầuchứa acid clavunic cho MIC giảm từ 8 lần trở lên so với đầu còn lại thì kết

luận vi khuẩn có sinh ESBL (Cormican et al., 1996).

-Vitek: Sử dụng cefotaxime hay ceftazidime có và không có kết hợp với acidclavulanic (4 µg/ml) Nếu có sự giảm sản sinh vi khuẩn trong giếng có acidclavulanic so với giếng không có acid clavulanic thì có sự hiện diện của menESBL: MIC cephalosporin lớn hơn MIC cephalosporin/acid clavulanic từ 8

lần trở lên (Sanders et al., 2000; Monaghan, 2004).

- Microscan: Tấm bảng nhựa có 4 giếng chứa môi trường kháng sinhcephalosporin và cephalosporin/acid clavulanic, cấy vi khuẩn vào các giếngrồi để vào tủ ấm từ 18-24h, nếu vi khuẩn không phát triển ở giếng cócephalosporin kết hợp acid clavulanic thì có sự hiện diện của ESBL (Andreaand William, 2005)

- BD Phoenix: Hệ thống ủ nhanh cho việc xác định vi khuẩn và tính nhạy cảmvới kháng sinh Xét nghiệm tìm men ESBL dựa trên sự phát triển của vi khuẩnđáp ứng lại với môi trường có cephalosporin và cephalosporin/acid clavulanic.Máy sẽ tự động báo kết quả vi khuẩn có sinh ESBL hay không (Leverstein-

van Hall et al., 2002).

Ngày nay, ngoài các kỹ thuật trong vi sinh lâm sàng thì các kỹ thuật xác địnhESBL bằng sinh học phân tử cũng đang được ứng dụng rộng rãi như: dò ADN,PCR

2.3 Kháng sinh

2.3.1 Định nghĩa

Kháng sinh là những chất hóa học được chiết xuất từ môi trường nuôi cấy visinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp, chúng có khả năng kìm hãm sự phát triểnhoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt trên một giai đoạnchuyển hóa cần thiết của vi sinh vật (Võ Thị Trà An, 2010)

2.3.2 Sự đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh

Theo Trần Đức Hậu (2007), sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể chialàm 2 loại: đề kháng tự nhiên và đề kháng tiếp nhận

Đề kháng tự nhiên: là tình trạng giống hoặc loài vi khuẩn nào đó không nhạycảm với tác động của kháng sinh Điều này có thể do vi khuẩn thiếu cấu trúcđích cho tác động của kháng sinh hoặc do thành tế bào vi khuẩn không chokháng sinh thấm qua

Đề kháng tiếp nhận: vi khuẩn có thể phát triển đề kháng với kháng sinh màtrước đó nhạy cảm do nguyên nhân:

- Do đột biến nhiễm sắc thể hình thành nên các gen đề kháng kháng sinh

- Do plasmid: Plasmid là các phân tử ADN nhỏ không thuộc nhiễm sắc thể (ởngoài nhân), có khả năng nhân đôi độc lập, có nhiều gen và mỗi gen xác địnhtính đề kháng với một loại kháng sinh Vì vậy plasmid có khả năng đề khángnhiều loại kháng sinh cùng lúc Hơn nữa, plasmid còn có khả năng trao đổigiữa các vi khuẩn không phân biệt loài hay họ khi có sự tiếp xúc giữa các vikhuẩn với nhau, làm gia tăng tỉ lệ và tốc độ đề kháng một cách đáng kể

Theo Huỳnh Kim Diệu (2012), vi khuẩn đề kháng với kháng sinh là do các cơchế chủ yếu sau:

- Sản sinh ra enzyme làm biến đổi và vô hoạt kháng sinh

- Biến đổi điểm tác động của kháng sinh

- Làm giảm tính thấm của thành tế bào vi khuẩn

- Làm giảm nồng độ của kháng sinh trong tế bào vi khuẩn nhờ hệ thống bơmchủ động

- Phát triển một kiểu biến dưỡng khác không bị ảnh hưởng ức chế của khángsinh

- Penicillin A: gồm ampicillin, amoxicillin Phổ kháng khuẩn giống

penicillin G, mở rộng thêm một số vi khuẩn gram âm như E coli, Salmonella,

Shigella.

- Penicillin M: gồm methycillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin Phổkháng khuẩn hẹp tác dụng lên các tụ cầu khuẩn, đặc biệt với các tụ cầu khángvới penicillin G và V

Cephalosporin:

- Thế hệ 1: gồm các cephalotin, cefazolin, cefaclor, cefalexin Có phổ

hẹp, tác dụng chủ yếu trên cầu khuẩn gram dương và vài loại Enterobacter như E coli, Klebsiella.

- Thế hệ 2: gồm các cefuroxim, cefoxitin, cefamendol Phổ kháng khuẩn

như cephalosporin thế hệ 1 nhưng nới rộng hơn trên Enterobacter.

- Thế hệ 3: gồm cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidime Phổ kháng khuẩnrất rộng nhưng có tác dụng với vi khuẩn gram âm nhiều hơn, thời gian tácdụng lâu hơn

- Thế hệ 4: gồm cefepim, cefpirom Phổ tác dụng giống nhưcephalosporin thế hệ 3 nhưng tác động tốt hơn trên cả vi khuẩn gram dương,thời gian xuyên thấm qua vách tế bào nhanh hơn

Carbapenem: đại diện là imipenem, bền vững với men β-lactamse Phổ kháng

Monobactam: đại diện là aztreonam, tác động mạnh lên các vi khuẩn gram âm Các chất ức chế β-lactamases: gồm acid clavulanic, sulbactam, tazobactam.

Bản thân các chất này không có hoạt tính kháng sinh nhưng do ức chếβ-lactamases nên khi dùng phối hợp với kháng sinh nhóm β-lactam sẽ mở rộngphổ kháng khuẩn của những kháng sinh này lên các vi khuẩn tiết menβ-lactamases

Cơ chế tác động của nhóm β-lactam:

- Ức chế enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp peptidoglycan (thành phầnchính của vách tế bào vi khuẩn)

- Hoạt hóa hệ thống thủy giải ở tế bào vi khuẩn, gây tổn thương và giết chết vikhuẩn

Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh nhóm β-lactam:

- Đề kháng enzyme: vi khuẩn tiết ra men β-lactamases, thủy phân vòngβ-lactam làm vô hoạt kháng sinh

- Đề kháng không enzyme: bằng cách thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào

vi khuẩn (nhất là vi khuẩn gram âm), làm biến mất hoặc biến đổi các Penicillin Biding Protein (chủ yếu ở vi khuẩn gram dương)

PBP-Nhóm aminoglycoside:

Gồm streptomycin, kanamycin, gentamicin, amikacin Kháng sinh nhóm nàyhầu hết có tác dụng sát khuẩn nhanh, phụ thuộc nồng độ và hiệu quả hậukháng sinh dài Phổ kháng khuẩn rộng (trừ streptomycin), tập trung chủ yếu là

vi khuẩn gram âm và một số vi khuẩn gram dương

Cơ chế tác động của nhóm aminogycoside:

Các kháng sinh nhóm aminoglycoside là thuốc diệt khuẩn, tác động bằng cách

ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn Aminoglycoside gắn vào tiểu thể30S ribosom của vi khuẩn, gây việc đọc nhầm tín hiệu dẫn đến sản xuấtprotein lạ khiến vi khuẩn không sử dụng được Quá trình vận chuyển quamàng phụ thuộc vào oxy nên aminoglycoside không có tác động trên vi khuẩnyếm khí

Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh nhóm aminoglycoside:

Vi khuẩn thường đề kháng với nhóm kháng sinh này bằng cách tiết ra nhữngenzyme làm giới hạn sự cố định của kháng sinh trên các receptor của ribosom

Nhóm tetracycline:

Gồm oxytetracycline, tetracycline, doxycycline, minocycline Các kháng sinhnhóm tetracycline có hoạt phổ rộng, không chỉ trên vi khuẩn gram dương vàgram âm mà còn trên một số vi khuẩn nội bào Các tetracycline tác động trên

vi khuẩn gram dương ở liều thấp hơn so với vi khuẩn gram âm, nhưng thực tế

ít dùng điều trị nhiễm khuẩn gram dương do các chủng vi khuẩn đề khángnhanh với thuốc Hiệu lực mạnh nhất là minocycline, kế đến là doxycycline,tác dụng yếu nhất là tetracycline và oxytetracycline

Cơ chế tác động của nhóm tetracycline:

Tất cả các kháng sinh nhóm tetracycline có tác động kìm khuẩn, ngoại trừminocycline có tác động diệt khuẩn Các tetracycline kết dính với tiểu thể 30Scủa ribosom sau khi đi qua màng tế bào vi khuẩn Sự kết dính dẫn đến ngăncản tARN (transport ARN) kết hợp với mARN (messenger ARN), cuối cùngacid amin không được phóng thích tại ribosom, do vậy sự tổng hợp protein của

vi khuẩn bị ức chế

Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh nhóm tetracycline:

Có 2 cơ chế chính dẫn đến sự đề kháng tiếp nhận của vi khuẩn với kháng sinhnhóm tetracycline là thông qua hệ thống bơm thoát dòng để đẩy kháng sinh từtrong tế bào ra ngoài, làm giảm nồng độ kháng sinh bên trong tế bào chất của

vi khuẩn hoặc thông qua các protein có khả năng bảo vệ ribosome làm ngăncản sự kết dính của kháng sinh với ribosome của vi khuẩn (Võ Thị Trà An,2010)

Nhóm quinolone

Gồm norfloxacin, enrofloxacin (chỉ được sử dụng trong thú y) Các quinolone

có phổ kháng khuẩn rộng, đặc biệt có hiệu quả cao với vi khuẩn gram âm hiếukhí

Cơ chế tác động của nhóm quinolone:

Các quinolone ức chế ADN gyrase, là enzym mở vòng xoắn ADN giúp cho sựsao chép và phiên mã, vì vậy ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi khuẩn Ngoài

ra còn tác dụng cả trên mARN nên ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn.Các quinolone đều là thuốc diệt khuẩn

Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh nhóm quinolone:

Vi khuẩn kháng thuốc là do đột biến điểm tại các gen mã hóa cho enzyme