NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GENACTIVATION INDUCED CYTIDINE DEAMINASE(AID) VÀ TỈ LỆ ĐỘT BIẾN GEN P53 TRONG UNGTHƯ DẠ DÀY VÀ UNG THƯ GAN NGUYÊN PHÁT

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GENACTIVATION INDUCED CYTIDINE DEAMINASE(AID) VÀ TỈ LỆ ĐỘT BIẾN GEN P53 TRONG UNGTHƯ DẠ DÀY VÀ UNG THƯ GAN NGUYÊN PHÁT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

LÊ THỊ THÚY

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN

ACTIVATION INDUCED CYTIDINE DEAMINASE (AID) VÀ TỈ LỆ ĐỘT BIẾN GEN P53 TRONG UNG THƯ DẠ DÀY VÀ UNG THƯ GAN NGUYÊN PHÁT

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI -2012

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở cácnước phát triển và là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở các nước đang pháttriển [117] Gánh nặng về ung thư tiếp tục gia tăng trên diện rộng vì sự giàhóa và phát triển dân số, cùng với sự gia tăng các yếu tố nguy cơ gây ung thư.Thống kê của GLOBOCAN năm 2008, trên thế giới có khoảng 12,7 triệutrường hợp ung thư mắc mới và 7,6 triệu trường hợp tử vong do ung thư.Trong đó có 56% trường hợp do ung thư mắc mới và 64% trường hợp do ungthư xảy ra ở các nước phát triển [28] Dự đoán vào năm 2020, tỷ lệ mắc ungthư s tăng 50 Ung thư dạ dày (UTDD), ung thư gan nguyên phát(UTGNP) là hai trong số năm bệnh lý ung thư hàng đầu [28], [59], [60] Chotới nay tuy chưa có số liệu điều tra chính xác về dịch t học UTDD trongphạm vi cả nước nhưng các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc UTDD khá caotrong cộng đồng Theo ghi nhận ung thư ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh

và một số tỉnh, ước tính tỷ lệ mắc UTDD năm 2000 ở nam giới là23,7/100.000 người, đứng hàng thứ 2 sau ung thư phổi, ở nữ giới là10,8/100.000 người, đứng hàng thứ 3 sau ung thư vú và ung thư cổ tử cung.Việt Nam là nước nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc UTGNP cao, hiện chưa có

số liệu thống kê cụ thể về tình hình ung thư gan trên phạm vi toàn quốc,nhưng theo một số báo cáo tại các cơ sở điều trị lớn trong nước thì ung thưgan là loại hình ung thư đáng báo động Điều tra của Phạm Hoàng Anh tại

22 cơ sở y tế của Hà Nội năm 2002 cho thấy UTGNP đứng hàng thứ 3 ởnam giới và hàng thứ 6 ở nữ giới [1]

Chẩn đoán UTDD và UTGNP dựa vào chẩn đoán hình ảnh (siêu âm, nộisoi, chụp cắt lớp vi tính, cộng hưởng từ hạtình ân, chụp động mạch gan, chẩnđoán bằng đồng vị phóng xạ), chẩn đoán tế bào học và mô bệnh học, định

lượng nồng độ Alpha Fetoprotein (AFP) Tuy nhiên, chẩn đoán UTDD vàUTGNP bằng các phương pháp kể trên chỉ chẩn đoán được khi khối u đã hìnhthành, phát triển rõ và thường là giai đoạn muộn của bệnh Có thể nói chúng

ta đang phải đối mặt với cuộc chiến đầy cam go và thách thức nhằm chống lạinhững mất mát về người và sự tốn kém về kinh tế trong việc điều trị căn bệnhung thư Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh học của ung thư

để từ đó có thể tìm ra phương pháp chẩn đoán sớm, điều trị hiệu quả là vấn đềthách thức và được quan tâm đặc biệt của các nhà Y sinh học hiện đại

Activation Induced cytidine Deaminase (AID) là một gen then chốt quyđịnh tính đa dạng của kháng thể thông qua hai quá trình: siêu đột biến(somatic hypermutation) và tái tổ hợp (class switch recombination) gen khángthể [78], [80] Trong điều kiện sinh lý bình thường, sự biểu hiện AID giới hạntại tế bào lympho B hoạt hóa sinh kháng thể và được kiểm soát chặt ch bởicác yếu tố điều hòa [54], [71] Khi gen AID bị đột biến thì gây ra hội chứngsuy giảm miễn dịch, tăng IgM2 b m sinh ở người Mặt khác, ở tế bào không

có th m quyền miễn dịch, sự tăng cường tổng hợp enzym AID gây nên hiệntượng chuyển đoạn nhi m sắc thể, tích lũy đột biến để khởi đầu cho quá trìnhung thư hóa tế bào lành [65], [78], [90], [95] Với vai trò quyết định trong quátrình siêu đột biến gen như vậy nên AID được coi như một tác nhân gây độtbiến nội sinh khi quá trình kiểm soát sự biểu hiện AID bị mất cân bằng Dướitác động của các yếu tố hoạt hoá, AID s tác động trực tiếp lên các gen áp chếung thư, tích lũy đột biến, từng bước làm bất hoạt và mất chức năng của cácgen áp chế ung thư này [52][99]

Gen p53 là gen áp chế ung thư quan trọng nhất, có vai trò ức chế chutrình tế bào, gây apoptosis và tương tác với một số gen để kiểm soát sự tăngsinh, biệt hoá của tế bào [100] Các nghiên cứu cho thấy, p53 có vai trò quantrọng trong một số bệnh lý ung thư của người ột biến hoặc mất gen p53được phát hiện trên 50% trường hợp ung thư và trên 60% trường hợp UTDD

và UTGNP [43], [63]

Kể từ khi gen AID được phát hiện bởi nhóm nghiên cứu của Gs Tasuku Honjo tại Trường ại học tổng hợp Kyoto, Nhật Bản vào năm 1999 đến nay, đã có nhiều công trình khoa học công bố trên các tạp chí khoa học nổi tiếng nhất trên thế giới về vai trò của AID, trong đó có mối liên quan giữa AID và p53 trong sự phát sinh, phát triển UTDD và UTGNP Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu về gen AID trong UTDD và UTGNP Chính vì vậy, đề tài

“Nghiên cứu mức độ phiên mã gen Activation Induced Cytidine Deaminase (AID) và tỉ lệ đột biến gen P53 trong ung thư dạ dày và ung thư gan nguyên phát” được thực hiện với ba mục tiêu:

1 Đánh giá mức độ phiên mã gen AID ở mô ung thư dạ dày và môung thư gan nguyên phát so sánh với mô lành đối chứng

2 Xác định tỷ lệ đột biến vị trí S249R tại exon 7 của gen p53 ở môung thư dạ dày và mô ung thư gan nguyên phát

3 Bước đầu tìm hiểu mối tương quan giữa mức độ phiên mã gen AIDvới đột biến vị trí S249R tại exon 7 của gen p53 trên mô ung thư dạdày và mô ung thư gan nguyên phát

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 UNG THƯ DẠ DÀY

1.1.1 Dịch tễ học

Tình hình ung thư dạ dày trên thế giới

Tỷ lệ mắc UTDD khá cao ở nhiều nước trên thế giới và thay đổi tùy theotừng khu vực, từng nước [104], cao nhất ở các nước ông Á, ông Âu, thấpnhất ở các nước Bắc Mỹ và Châu Phi ớc tính năm 2008, thế giới có989.600 trường hợp UTDD mắc mới, chiếm 8% số trường hợp ung thư và738.000 trường hợp UTDD tử vong, chiếm 10% số trường hợp tử vong do ung thư (hình 1.1) [28]

Tỷ lệ UTDD ở nam gấp 2 lần so với nữ và chưa có nghiên cứu nào cho

thấy tỷ lệ mắc UTDD của nữ cao hơn nam [28], [56] Theo báo cáo của Tổ

chức nghiên cứu ung thư thế giới năm 2008, tỷ lệ mắc UTDD ở nữ là 5,8% và

tỷ lệ tử vong do UTDD là 8,2% đối với nam t lệ mắc UTDD là 9,7%

và t lệ tử vong do UTDD là 11% [47] UTDD thường xuất hiện ở lứa tuổi trung

niên và người già Bệnh ít gặp ở lứa tuổi dưới 40 [50]

Hình T c ong UTDD rên thế giới

[28]

(A) Tỷ lệ mắc UTDD trên thế giới (B) Tỷ lệ tử vong UTDD trên thế

giới

Tình hình ung thư dạ dàu tại Việt Nam

Cho tới nay, tuy chưa có số liệu điều tra chính xác về dịch t học UTDDtrong phạm vi cả nước nhưng theo các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc UTDDkhá cao trong cộng đồng ớc tính năm 2008, Việt Nam có 15.068 trườnghợp UTDD mắc mới, chiếm 13,5% số trường hợp ung thư và 11.327 trườnghợp UTDD tử vong, chiếm 13,8% số trường hợp tử vong do ung thư (hình1.2) [28] Theo ghi nhận ung thư ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và một

số tỉnh, người ta ước tính tỷ lệ mắc UTDD năm 2000 ở nam giới là23,7/100.000 người, đứng hàng thứ 2 sau ung thư phổi, ở nữ giới là10,8/100.000 người, đứng hàng thứ 3 sau ung thư vú Theo nghiên cứu củaTrịnh Hồng Sơn cho thấy 50% bệnhình ân UTDD ở lứa tuổi 3150 [17]

(A) Tỷ lệ mắc UTDD tại Việt Nam (B) Tỷ lệ tử vong UTDD tại Việt Nam

1.1.2 Yếu tố nguy cơ

Nguy cơ do nhiễm H pylori: Nhiều nghiên cứu cho thấy mối liên

quan chặt ch giữa nhi m H pylori và UTDD, tỷ lệ UTDD ở người nhi

m H pylori cao hơn so với người không bị nhi m là 3,6 lần Một số tác giả cho rằng H pylori là nguyên nhân chính gây UTDD và điều trị triệt căn

H pylori có thể làm giảm tỷ lệ UTDD [8][10] Một số tác giả khác cho rằng người nhi m H pylori có gen CagA thì khả năng mắc UTDD cao hơn người nhi m H pylori không mang gen CagA [31][21].

Nguy cơ do hức ăn ôi rường: Nghiên cứu về dịch t học

UTDDịch o thấy mối liên quan giữa UTDD và chế độ ăn: chế độ ăn ít hoa quả

và rau xanh, chế độ ăn nhiều chất bột, nitrat, nitrit, muối và thức ăn hun khói

là nguy cơ gây UTDD [98] Các chất độc hại như thuốc lá, rượu, bụi than đá, bụi sắt, bụi silic… là những yếu tố nguy cơ của UTDD [98].

Nguy cơ do ínhình ạy c di ruy n huynh hư ng gia nh nh áu: UTDD có tính chất gia đình, khoảng 810% UTDD có tiền sử gia đình

Người nhóm máu A có nguy cơ UTDD cao hơn người nhóm máu khác [40]

Nguy cơ do nh dạ d y ạn ính: nhiều nghiên cứu cho thấy viêm dạ

dày mạn, polyp tuyến dạ dày, viêm dạ dày phì đại, loét dạ dày, dạ dày có tiền

sử phẫu thuật tăng nguy cơ UTDD [29][56], [84].

1.1.3 Gi i hẫu nh hân oại

UTDDịch iếm 60-70% ung thư tiêu hóa, chủ yếu ung thư biểu mô tuyến [22]

1.1.3.1 Phân loại đại thể

UTDD bao gồm UTDD sớm và UTDD muộn [22]:

- UTDD sớm gồm dạng trợt nông, dạng phẳng, dạng polyp

- UTDD muộn được chia thành 4 loại chính theo phân loại củaBorrman: thể polyp, thể loét, thể loét xâm lấn và thể thâm nhi m

1.1.3.2 Phân loại vi thể

Theo phân loại của WHO năm 2000, các typ mô học được mã hóa, loại

mô học ung thư biểu mô tế bào nhỏ được bổ sung [9]

B ng Phân oại ô nh h c h o WHO nă 000

Tân sản nội biểu mô tuyến

Ung thư biểu mô tuyến

Typ ruột

Typ lan tỏa

Ung thư biểu mô tuyến nhú

Ung thư biểu mô tuyến ống nhỏ

Ung thư biểu mô tuyến nhầy

Ung thư biểu mô tế bào nhẫn

Ung thư biểu mô tuyến v y

Ung thư biểu mô tế bào v y

Ung thư biểu mô tế bào nhỏ

Ung thư biểu mô không biệt hóa

Các loại khác

Carcinoid (u nội tiết biệt hóa cao)

8140/08140/38140/38144/38260/38211/38480/38490/38560/38070/38014/38020/3

- Nhóm các triệu chứng sớm và không đặc hiệu: Chán ăn, ăn không tiêu,gầy sút, da xanh, mệt mỏi

- Nhóm các triệu chứng rõ rệt: au bụng, khối u bụng, thể trạng suy kiệt,

di căn hạch thượng đòn trái, khối u buồng trứng, di căn xương hoặc các biếnchứng như thủng dạ dày, xuất huyết tiêu hoá

1.1.4.2 Thăm dò cận lâm sàng

Chụ X quang dạ dày : Các hình ảnh hay gặp trong UTDD gồm

hình khuyết, hình thấu kính và hình đám cứng, mấtình u động dạ dày tuỳ thuộcvào thể tổn thương Chụp đối quang kép dạ dày có thể phát hiện được các thểUTDD ở giai đoạn sớm khi tổn thương mới chỉ ở lớp niêm mạc chưa ăn sâuvào các lớp bên dưới, cho phép xác định tổn thương sớm hơn cách chụp thôngthường

N i soi dạ d y ằng ống soi : Nội soi dạ dày bằng ống soi mềm

kết hợp với sinh thiết là phương pháp quan trọng trong chẩn đoán UTDD Nộisoi cho biết vị trí và tính chất của khối u ộ chính xác của nội soi trên 95%với những trường hợp ung thư tiến triển Khi bấm sinh thiết qua nội soi từ 6đến 8 mảnh cho kết quả chẩn đoán đúng trên 95%

Siêu â n i soi: Là phương pháp thăm dò có giá trị, đáng tin cậy trong

chẩn đoán chẩn đoán sớm và đánh giá giai đoạn ung thư đường tiêu hóa, đặcbiệt đối với UTDD với độ nhạy 78-84% Siêu âm nội soi nhận dạng chính xáctái phát tại chỗ miệng nối, đánh giá chiều dày của tổ chức ung thư Tuy nhiên

phương pháp này không hiệu quả trong đánh giá di căn xa [67].

Chụ c i ính CT (Computer Tomography): CT giúp đánh giá

sự di căn của ung thư Hiện nay với phương pháp chụp xoắn ốc 3 pha có thểphát hiện khối u nhỏ để đánh giá mức độ xâm lấn trước mổ

Soi ổ ụng: Soi ổ bụng cho phép đánh giá những thương tổn mà chụp

cắt lớp vi tính không phát hiện được, cho biết tình trạng khối u xâm lấn vào

cơ quan lân cận, di căn gan, di căn phúc mạc

SPECT, PET CT (Single Photon Emission Computed Tomography, Positron Emission Tomography/Computed Tomography): Có thể phát hiện và

đánh giá ung thư tái phát ở giai đoạn rất sớm

Chẩn oán ô nh h c: Qua nội soi tiến hành sinh thiết để làm xét

nghiệm mô bệnh học là phương pháp không thể thiếu trong chẩn đoán UTDD,đây là tiêu chu n vàng giúp chẩn đoán xác định

Các chấ chỉ iể ung thư : Chất chỉ điểm khối u được xem như yếu

tố thăm dò có ý nghĩa trong phát hiện sớm ung thư Một số dấu ấn ung thư đãđược sử dụng trong chẩn đoán UTDD như CEA (Carcinogen Embrionic

Antigen), CA 19-9 (Carbohydrat Antigen 19-9), CA 72-4 [36] Kháng nguyên

ung thư bào thai CEA tăng khoảng 35% trong UTDD Khi kết hợp với cácdấu ấn khác như CA 19-9 và CA 50, giá trị chẩn đoán của CEA tăng lên [16]

CA 19-9 có độ nhạy cao hơn CEA (44,5%), song cũng không phải là yếu tốchỉ điểm đặc hiệu của UTDD CA 19-9 đóng vai trò như một chất chỉ điểmloại 2, phối hợp với CA 72-4 làm tăng độ nhạy của dấu ấn ung thư này đối vớiUTDD Kết hợp 2 xét nghiệm CEA và CA19-9 cho độ nhạy cao hơn Nghiêncứu của S.R Choi và cộng sự cho thấy độ nhạy CEA và CA19-9 tương ứng là73,1% và 85% [36] CA 72-4 được nhiều nghiên cứu cho thấy có giá trị trong chẩn đoán UTDD, CA 72-4 có độ nhạy 3476% [46]

1.2 UNG THƯ GAN

1.2.1 Dịch ễ h c

Tình hình ung thư gan nguyên hárên thế giới

Tỷ lệ mắc ung thư gan (UTG) đứng hàng thứ 15 trong toàn bộ ung thưtrên thế giới nhưng là nguyên nhân thứ hai gây tử vong do ung thư ở namgiới Ở nữ tỷ lệ mắc UTG đứng thứ 7 và là nguyên nhân thứ 6 gây tử vong.Năm 2008, trên thế giới có 748.300 trường hợp UTG mắc mới và 695.900trường hợp UTG tử vong trong đó Trung Quốc chiếm một nửa tỷ lệ mắc và tửvong (hình 1.3) [47] Trong các loại UTGNP thì ung thư tế bào gan thường

gặp nhất, chiếm 70-85% UTG trên toàn thế giới [92] Tần suất UTG tùy thuộc

rấtình iều vào vùng địa dư và chủng tộc

Tỷ lệ mắc UTG ở nam gấp hai lần so với nữ Ở Mỹ, tỷ lệ mắc UTG ở

nam/nữ là 3/1,4 Ở các nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia t

lệ mắc bệnh ở nam/nữ khoảng 4/1,1 Tuổi xuất hiện UTG thay đổi tùy theo từng nước Ở các nước có tần suất UTGNP cao như châu Á, châu Phi tuổi mắc bệnh khoảng 40, thấp hơn 1020 tuổi so với tuổi mắc bệnh ở những vùng

có tỷ lệ thấp (Bắc Mỹ, Bắc Âu) Các nước có tần suất mắc UTGNP trung bình, tuổi mắc bệnh thường gặp là 50 Các nước có tần suất UTPNP thấp như Bắc Mỹ, Tây Âu, tuổi mắc bệnh trung bình là khoảng 60, hiếm gặp tuổi dưới 50 Các nước có tỷ lệ mắc cao, UTG có thể gặp ở tuổi 20, có khithấp hơn [87]

Hình T c ong ung thư gan rên thế giới

[47]

(A) Tỷ lệ mắc UTG trên thế giới (B) Tỷ lệ tử vong UTG trên thế giới

Tình hình ung thư gan nguyên há ại Vi Na

Việt Nam nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc UTGNP cao, hiện chưa có sốliệu thống kê cụ thể về tình hình UTG trên phạm vi toàn quốc nhưng theo một

số báo cáo tại các cơ sở điều trị lớn trong nước, UTG là loại hình ung thưđáng báo động Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế ước tính năm 2008, ViệtNam có 23.251 trường hợp UTG mắc mới và 21.748 trường hợp UTG tửvong (hình 1.4), [47] Báo cáo của Phạm Hoàng Anh năm 2002, điều tra 22

cơ sở y tế tại Hà Nội cho thấy UTGNP đứng hàng thứ 3 ở nam giới và thứ 6 ở

nữ giới, tỷ lệ mắc bệnh ở nam/nữ là 3.6/1 [1] Ở Việt Nam, tuổi mắc bệnhtrung bình là 50, trẻ 3  4 tuổi cũng có thể mắc UTG [11]

(A) (B)

Hình T c ong ung thư gan ại Vi Nam [47]

(A) Tỷ lệ mắc UTG tại Việt Nam (B) Tỷ lệ tử vong UTG tại Việt

Nam

1.2.2 Yếu tố nguy cơ

Nguy cơ do nhiễm irus: Có nhiều loại virus gây viêm gan nhưng

virus liên quan nhiều tới UTGNP là virus viêm gan B, virus viêm gan C, virusviêm gan D

Virus viêm gan B (HBV) là virus DNA với 3200 nucleotid, thuộc họ

Hepadnavirus HBV có thể mã hoá cho các protein có vai trò quan trọng

trong sự hình thành UTG Theo Tổ chức Y tế thế giới, HBV là yếu tố thứ haisau thuốc lá được cho là nguyên nhân gây ung thư ở người Tỷ lệ nhi m HBVchiếm khoảng 60% trường hợp UTG ở những quốc gia đang phát triển vàkhoảng 23% trường hợp UTG ở các nước đã phát triển [89] Theo nghiên cứucủa Nguy n Sào Trung và cộng sự khoảng 72,5% trường hợp UTG nguyênphát có HBsAg (+) [20]

HCV là một RNA virus, thuộc họ Flavovirus HCV có kích thước 5060

nm với RNA chuỗi đơn gồm 10.000 nucleotid có vỏ lipoprotein bao bọc [57].

Hiện chưa có bằng chứng khẳng định HCV là một oncogen, nhưng có vai tròquan trọng như là một nguyên nhân của viêm gan mạn tính, xơ gan và UTGtương tự HBV Những người bị nhi m HCV mạn tính có nguy cơ bị UTGtăng gấp 100 lần so với người không bị nhi m Nhi m HCV mạn tính lànguyên nhân của 70% trường hợp UTG nguyên phát ở Nhật Bản và khoảng3050% các trường hợp UTG ở Hoa Kỳ [50]

Nguy cơ do iê gan ạn xơ gan: a số UTG đều phát triển trên

một gan đã xơ, nhất là xơ gan kiểu hậu viêm gan, nốt tái tạo to [12] Theo

Nguy n Sào Trung và cộng sự tỷ lệ UTGNP có kèm theo tổn thương xơ gan

là 71,4% [20]

Nguy cơ do nhiễm A a oxin: Aflatoxin chất gây UTG mạnhình ất

được biết đến, là sản ph m của nấm mốc Aspergillus flavus Người ta cho rằng

aflatoxin gây ung thư bằng cách tạo ra những biến đổi ở gen p53 và gây mấtchức năng áp chế khối u của p53 [110] Nhiều nghiên cứu cho thấy sự tiếpxúc đồng thời với aflatoxin B1 (AFB) và nhi m HBV mạn tính làm tăng nguy

cơ mắc UTG [70].

Nguy cơ do hú huốc á: Vai trò của hút thuốc là với UTGNP chưa

được rõ

Nguy cơ do uống rượu: Nghiên cứu dịch t trên thế giới cho thấy rượu

là một yếu tố nguy cơ trong sự phát triển UTG [17]

Nguy cơ do nhiễm c chấ : Dioxin là một loại hóa chất rất độc hại,

có tính gây ung thư mạnh và có thể gây xơ gan và UTG Công trình nghiêncứu của T.T.Tùng và Ủy ban 10-80 cho thấy điều này [4] Tiếp xúc với cácchất độc đối với gan: như PVC (polivinyl chloride), thuốc lá,…cũng được nêulên là yếu tố nguy cơ UTG

Nguy cơ do ínhình ạy c di ruy n huynh hư ng gia nh: 620%

bệnhình ân UTG có một hay nhiều người trong gia đình cũng bị UTG [35]

1.2.3 Hình nh gi i hẫu nh

1.2.3.1 Hình ảnh đại thể [3], [19]

Ung thư biểu mô tế bào gan là u ác tính phát sinh từ tế bào gan, là loạihay gặp nhất chiếm khoảng 90% các trường hợp u ác tính ở gan Hình ảnh đạithể của u thay đổi tùy theo kích thước, số lượng u Khối lượng gan to hơnbình thường (khoảng 23 kg) có trường hợp rất to (56 kg), gồm thể lan tỏa, thểkhối, thể cục

1.2.3.2 Hình ảnh vi thể [3], [19]

- Thể liên bào: chiếm 7090% các trường hợp Các tế bào ung thư được

sắp xếp dưới dạng bè, túi hoặc loạn sản xuất phát từ cạnh một khoảng cửa.Các tế bào thường chứa nhiều lipid và sắc tố mật, có thể có mộtình ân hoặcnhiều nhân.

- Ung thư liên bào đường mật: xuất phát từ tế bào ngoại tiết của vi quảnmật ở trong gan hoặc ống mật lớn, thể này chiếm 1520%

- Ung thư thể hỗn hợp: chiếm khoảng 5% hoặc tế bào gan chiếm ưu thếhoặc tế bào đường mật chiếm ưu thế

- Ung thư thể tổ chức đệm: rất hiếm khoảng 12%, đó là các hạt u mạchmáu, u tế bào Kuffer, u cơ trơn

1.2.4 Chẩn oán ung thư

gan

1.2.4.1 Triệu chứng lâm sàng [12], [14]

Triệu chứng lâm sàng UTG thường nghèo nàn và không đặc hiệu, cáctriệu chứng này có thể không thấy khi khối u còn nhỏ Thường có 2 nhómtriệu chứng:

- Triệu chứng của ung thư: Thường là gan to, cứng, có dạng u cục, khôngđau Trong trường hợp đau nhiều, phải nghĩ đến bội nhi m hoặc hoại tử [18]

- Hội chứng cận ung thư: ít gặp với 4 hội chứng sau: a hồng cầu, tăngcalci máu, hạ đường máu, hội chứng carcinoid và đái ra porphyrin [18]

1.2.4.2 t nghiệm cận lâm sàng

Xé nghi a ha o ro in (AFP): là xét nghiệm quan trọng có giá

trị chẩn đoán cao Tuy nhiên AFP không đặc hiệu cho UTG vì còn có trong utinh hoàn, u bào thai, xơ gan sau nhi m virus AFP là một glycoprotein bàothai, có trọng lượng phân tử khoảng 70.000 dalton Ở phụ nữ mang thai hàmlượng AFP huyết thanh tăng nhiều vào tháng thứ 2 và thứ 3 Sau khi đứa trẻ

ra đời 3 – 4 tuần, AFP giảm dần và chỉ còn lại rất ít Tế bào UTG có khả năngbài tiết loại protein này, do đó trong UTG hàm lượng AFP tăng cao Tuynhiên, khoảng 20 –25% trường hợp UTG có AFP không tăng Vì vậy, AFPphải tăng trên 100 ng/ml huyết tương mới có giá trị chẩn đoán Gần đây người

ta phát hiện thấy một tiểu phần của AFP đặc hiệu ung thư gan là HS-AFP(hepatoma-specific alpha-fetoprotein) có giá trị hơn AFP cả về độ nhạy và độđặc hiệu để phân biệt bệnh lý ung thư và không ung thư của gan [118] Dựatheo khả năng liên kết với lens culinaris agglutinin (LCA) hoặc sự khác biệt

về điểm đẳng điện mà AFP toàn bộ được chia thành 3 dạng là L1, L2, và AFP-L3 Các nghiên cứu trước đây cho thấy mặc dù không có mối liênquan nào giữa HS-AFP với AFP, cũng như tình trạng nhi m HBV, kích thước

AFP-và số lượng khối u, nhưng HS-AFP lại có mối liên quan với mức độ biệt hoá

tế bào ung thư, di căn và tái phát bệnh [61], [118] iều đó gợi ý rằng HS-AFP

có giá trị đặc hiệu hơn AFP trong chẩn đoán sớm và theo dõi tái phát UTG[2], [5], [13]

Các hương há chẩn oán hình nh

Soi ổ bụng: có thể nhìn được trực tiếp các tổn thương trên bề mặt gan, sự

lan tỏa và di căn của UTG vào các tạng khác trong ổ bụng, đánh giá được ugan trên nền gan xơ hoặc không xơ, phân biệt được UTGNP hoặc thứ phát.Tuy nhiên, không có khả năng phát hiện các UTG giai đoạn sớm, cũng nhưcác khối u nằm sâu trong nhu mô gan Hơn nữa đây là một thủ thuật thăm dòchảy máu, khá phức tạp và có thể có tai biến

Chụp nhấp nháy bằng đồng vị phóng xạ (scintigraphy): là một kỹ thuật

được sử dụng để nghiên cứu giải phẫu và chức năng của gan và đường mật

Sử dụng đồng vị phóng xạ có thể đánh giá được huyết động của gan và ghi lại

sự tập trung của nó ở gan Hình ảnh UTG là khối tổn thương choáng chỗ [13],[14]

Chụp động mạch gan (angiography): độ nhạy của chụp động mạch gan

để phát hiện các khối u có đường kính dưới 5cm là 86% Chụp động mạchgan có thể thấy được những hình ảnh của dạng tăng sinh mạch cấp máu chokhối u, thông động tĩnh mạch trong khối u và có thể tiến hành can thiệp bằngnút mạch hóa chất Tuy nhiên, đây là một kỹ thuật phức tạp, thăm dò chảymáu có thể gây tai biến [14]

Chụp cắt lớp vi tính: là phương pháp chẩn đoán tốt có độ nhạy 97% và

có độ đặc hiệu có thể phát hiện được u <3cm Có thể phân biệt giữa ung thưbiểu mô tế bào gan với một số tổn thương u khác ở gan như u máu, tăng sảnnốt vùng, u tuyến gan bằng chụp cắt lớp vi tính [13], [14]

Chụp cộng hưởng từ (Magnetic Resonance Imaging: MRI): là

phương pháp không xâm nhập, không sử dụng tia , cho phép phát hiện đượccác khối u

< 2cm với độ nhạy lên tới 81,6% và là phương pháp tốt để chẩn đoán [13], [14]

Siêu âm: là phương pháp tốt, rẻ tiền để xác định vị trí và kích thước của

tổn thương, có thể giúp phát hiện các khối trên gan xơ Tuy nhiên, độ đặc hiệukhông cao do không phân biệt được các nốt tân tạo của xơ gan, nhất là khikhối u có kích thước nhỏ, với u có kích thước < 3cm độ nhạy chỉ đạt được84% [2], [13], [14]

Chụp PET/CT: là một trong những phương pháp hiện đại nhất hiện nay

giúp chẩn đoán UTG nguyên phát, di căn, tái phát, đánh giá đáp ứng điều trị

Các hương há chẩn oán dựa o o h c ô nh h c

Sinh thiết gan: u điểm của phương pháp này là xác định được bản chất

u, nhưng nhược điểm là có thể có các biến chứng: chảy màu, thấm mật phúcmạc, thủng tạng rỗng, tràn khí màng phổi, gây đau đớn cho người bệnh và cóthể gây tử vong ược xem là tiêu chu n vàng của chẩn đoán [13]

Chọc hút bằng kim nhỏ: Ngày nay kỹ thuật chọc hút tế bào bằng kim nhỏ

đã được áp dụng rộng rãi vì đây là kỹ thuật đơn giản, nhẹ nhàng, có hiệu quả

cả về phương diện chẩn đoán lẫn kinh tế [13] Kỹ thuật chọc dưới sự hướngdẫn của siêu âm còn là một phương pháp điều trị ung thư gan tốt

1.2.4.3 Chẩn đoán xác định [13], [11]

Tiêu chu n chẩn đoán xác định UTG bao gồm:

- U gan

- AFP tăng có giá trị chẩn đoán sớm 5-20ng/ml

- Hình ảnh mô bệnh học của tế bào và tổ chức ung thư: tiêu chu nvàng trong chẩn đoán đặc biệt là u < 2 cm

1.3 CÁC BIẾN ĐỔI PHÂN TỬ TRONG UNG THƯ GAN VÀ UNG THƯ DẠ DÀY

Ung thư là kết quả của sự mất cân bằng giữa sự tăng sinh, biệt hóa vàchết theo chương trình của tế bào [72] Hầu hết các bằng chứng đều cho thấy

sự thay đổi của 1 gen thường không đủ để phát sinh khối u ác tính Ung thư làmột quá trình gồm nhiều bước với sự thay đổi liên tục nhóm các gen (thường

là nhiều gen) gây ung thư, gen áp chế ung thư và microRNA [32][116]

1.3.1 G n gây ung thư (oncogene)

Gen gây ung thư là gen mã hóa protein kiểm soát quá trình tăng sinh tếbào, quá trình apoptosis, hoặc cả hai Các gen gây ung thư có thể bị hoạt hóa

do sự thay đổi về cấu trúc như đột biến gen, kết nối gen (gene fusion) hoặcsao chép gen ột biến oncogen s đ y mạnh quá trình tăng sinh tế bào vàphát sinh ung thư Nhờ phương pháp hoá mô miễn dịch và phản ứng PCR, cácnhà nghiên cứu đã xác định được nhiều oncogen bị hoạt hoá và đột biến trongung thư như các gen MYC, cyclin D1, EGFR, RAS … [32], [73]

1.3.2 G n á ch ung thư

Gen áp chế ung thư là gen ngăn cản sự phát triển khối u và ức chế sựhoạt hóa của oncogen Gen áp chế có vai trò ức chế sự tăng sinh tế bào, thamgia kiểm soát chu trình tế bào, gây apoptosis và tương tác với một số gen khác

để ngăn ngừa sự phát sinh khối u trong cơ thể ột biến gen áp chế dẫn đếnhình thànhình iều loại ung thư khác nhau Hiện nay, nhiều gen áp chế đã đượcphát hiện trong ung thư như các gen Rb, p21, p73, p53 và p16…[ 94], [107]

1.3.3 MicroRNA

MicroRNA (miRNA) là những RNA nhỏ không mã hóa, dài khoảng

18-25 nucleotid Trong con đường tín hiệu của tế bào, một miRNA có thể điều hòa xuôi dòng nhiều gen đích bằng cách gắn bổ sung vào vùng 3 không dịch

mã của mRNA đích Do đó miRNA có vai trò quan trọng trong việc điều hòa

sự biểu hiện gen Sự bổ sung một phần hoặc hoàn toàn của miRNA vớimRNA dẫn đến giảm biểu hiện hoặc thoái hóa mRNA [115] Hầu hết cácmiRNA nằm ở vùng DNA không mã hóa giữa hai gen (intergenic regions)hoặc những vùng gen chứa các yếu tố điều hòa và promoter của miRNA Tuynhiên, có khoảng ¼ gen miRNA nằm ở vùng intron và có chung vùngpromoter với gen chủ (host gene) [115]

Cho đến nay, người ta phát hiện 900 miRNA ở người và ước tính khoảng30% số gen của người được điều hòa bởi miRNA Sự thoái hóa miRNA đượctìm thấy trong nhiều bệnh khác nhau, bao gồm cả bệnh ung thư Trong quátrình phát sinh và phát triển ung thư, miRNA có thể có vai trò như mộtoncogen hoặc gen áp chế ung thư [115]

1.4 VAI TR G N TRONG UNG THƯ

1.4.1 Cấu rúc c a g n

Protein p53 được phát hiện đầu tiên vào năm 1979 bởi Lionel Crawford

và cộng sự của Trường đại học Princeton, Dundee, Vương quốc Anh Ởngười, gen p53 nằm trên nhánh ngắn của nhi m sắc thể số 17, dài 20 kb gồm

11 exon (từ E1 đến E11, trong đó E1 không mã hóa) và 10 intron [38], [45].Gen p53 mã hóa cho một phân tử protein có trọng lượng 53 kDa, baogồm 393 acid amin với 3 vùng chức năng khác nhau hình 1.5 [34], [97]

- Vùng hoạt hóa N tận (NH2-terminal acidic transactivation domain TA)bao gồm:

Vùng amin tận (1-42): vùng này cần thiết cho hoạt động sao chép vàtương tác với MDM2 (murine double minute 2)

Vùng giàu prolin (61-94): liên quan đến chức năng pro-apoptosis và cóvai trò điều hòa hoạt động gen p53 Khi vùng này bị xóa bỏ s dẫn đến mấthoàn toàn chức năng pro-apoptosis của gen p53 [109]

- Vùng gắn kết DNA (DNA-binding domain DB) gồm các acid amin từ102-292 và gắn kết các DNA có trình tự đặc biệt.

- Vùng C tận (COOH-terminal oligomerization domain OD) bao gồm:Vùng oligomerization (324-355) tạo cấu trúc bậc 4 của gen p53

Vùng điều hòa nhóm carboxyl tận (363-393) có vai trò điều hòa xuôidòng sự gắn kết DNA với vùng trung tâm và liên quan đến apoptosis Nếu sựtương tác giữa vùng C tận và vùng gắn DNA bị phá v thì vùng gắn DNA tổnthương s hoạt hóa và gây tăng quá trình phiên mã

Ngoài 3 vùng chức năng điển hình, gen p53 còn có một số vùng đặc trưng cần thiết cho hoạt động của gen p53 như NLS (Nuclear LocalizationSignals), NES (Nuclear Export Signal) giàu leucin

Hoạt hóa sao chép Oligo

1.4.2.1 iểm soát chu k tế bào

Gen p53 có thể gây dừng chu kỳ tế bào ở pha G1/S và G2/M bằng cáchtác động đến các gen kiểm soát chu kỳ phân chia tế bào như GADD 45 growarrest and DNA-damage-inducible protein 45, p21 và 14-3-3 Sự dừng chu kỳ

tế bào giúp tế bào có thời gian sửa chữa tổn thương DNA trước khi bước vào

giai đoạn quan trọng của sự tổng hợp DNA và nguyên phân Chu kỳ tế bào

bước vào pha S cần enzym cdk2 và vào pha M cần cdc2 Enzym cdk2 có thể bị

ức chế bởi p21 và cdc2 có thể bị ức chế bởi p21, GADD45, 14-3-3 [27]

Khi DNA bị tổn thương, gen p53 gây tăng phiên mã p21 p21 có 2 vùnggắn với p53 là p21-WAF1 (wild type of p53 activate fragment 1) và p21-CIP1 (cyclin dependent kinase interacing protein 1) Protein p21-CIP gây bất hoạt phức hợp cyclinE-CDK2, p21-WAF1 gây bất hoạt phức hợp cyclinD1-CDK4 Các phức hợp CDK bất hoạt không có khả năng phosphoryl hóa pRB (retinoblastoma protein) và pRB không phosphoryl hóa là dạng kích hoạt, s gắn vào E2F E2F (transcription factor induces cyclin E gene) có tác dụng kích hoạt một loạt các gen như myc, mybB tham gia vào sự nhân lên của DNA trong pha S Sự hình thành phức hợp pRB-E2F trực tiếp ngăn cản chu trình tế bào từ pha G1 chuyển vào pha S và kết quả là chu trình phân bào bịdừng ở pha G1 cho đến khi DNA tổn thương được sửa chữa (hình 1.6), [27]

Hình 1.6 Cơ ch iể soá chu o c a qua rung gian [27]

Gen p53 gây tăng phiên mã GADD 45 GADD45 gắn vào CDC2, ngăncản sự hình thành phức hợp cyclin B/CDC2 và ức chế hoạt động của enzymkinase ồng thời GADD45 cũng tác dụng trực tiếp lên sự nhân đôi DNAtrong pha S bằng cách gắn với PCNA proliferating cell nuclear antigen vàchiếm chỗ của DNA polymerase Protein 14-3-3δ s loại bỏ cyclin B/CDC2khỏi nhân để phân tách cyclin B/CDC2 ra khỏi protein đích của nó Sự biểuhiện quá mức của 14-3-3δ gây ngừng chu kỳ tế bào ở pha G2 [51].

1.4.2.2 Quá trình chết tế bào apoptosis

Là “gatekeeper” tế bào, gen p53 có vai trò phát hiện tổn thương tế bào vàgây apoptosis khi cần thiết Gen p53 gây apoptosis thông qua yếu tố Bax(Bcl-2-associated X protein) [85], DR5/KILLER (death receptor 5, DRAL,Fas/CD95 (cell-death signaling receptor), PIG3 (p53-inducible gene 3), Puma(p53-upregulated modulator of apoptosis) [83], [85] PIDD (p53-inducedprotein with death domain), PERP (p53 apoptosis effector related to PMP-22), Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1, Scotin, p53AIP1 (p53-regulated apoptosis-inducing protein 1) [68], [75] và theo con đường bêntrong tế bào hay con đường ty thể (intrinsic path ay/mitochondrial path ay)

và con đường bên ngoài tế bào hay con đường cái chết thụ thể extrinsicpathway/death receptor pathway) Ngoài ra, p53 có thể trực tiếp kích hoạtApaf-1  apoptosis (hình 1.7)

Con đường bên ngoài tế bào (cái chết của thụ thể)

Con đường bên trong tế bào (con đường ty thể)

Hình 1.7 Các con ường gây a o osis c a g n

Có hơn 18.000 dạng đột biến gen p53 được phát hiện trong ung thưngười và khoảng 50% trường hợp ung thư người có đột biến gen p53 hoặcmất gen p53 [102] Trong một số ung thư khác, khoảng 50% trường hợp genp53 không bị bất hoạt hoàn toàn và bị giảm chức năng.

ột biến gen p53 chủ yếu là đột biến điểm nhầm nghĩa và hơn 80 độtbiến gen p53 là đột biến thay thế acid amin [103] Những đột biến nhầm nghĩanày dẫn đến việc tổng hợp ra phân tử protein không có chức năng gắn kếtDNA đặc hiệu và tích lũy trong nhân của tế bào u Việc duy trì p53 đột biếntrong tế bào u ức chế sự biểu hiện ide type p53 và biến đổi p53 đột biếnthành oncogen [103]

Nghiên cứu về cấu trúc gen p53 đột biến cho thấy, đột biến “hot spots”nằm ở vùng gắn kết DNA trung tâm của protein p53 102-292 Ngược lại,một số đột biến phát hiện được ở vùng điều hòa vùng N tận gồm acid amin102-292 và C tận gồm acid amin 301-393 Một vài codon có tần suất độtbiến cao, chiếm khoảng 28 tần số đột biến bao gồm: Arg175, Gly245, Arg248,Arg249, Arg273 và Arg282 [101] Trong đó Arg248 và Arg273 có tần suấtđột biến cao hơn [114] ột biến gen p53 có thể là dạng đồng hợp tử(homozygous) hoặc dị hợp tử (heterozygous) và các đột biến này đều dẫn đến

sự thay đổi chức năng p53 Gen p53 có thể bị đột biến ở các exon vùng đầugen (exon 2 – exon 4) hoặc vùng cuối gen (exon 9 - exon 11) nhưng đa phần

ở các exon giữa (exon 5 – exon 8) Khi bị đột biến gen p53 có thể bị mất cả 2allel hoặc mất 1 allen và allen kia bị đột biến ở một hoặc vài vị trí

1.4.3.1 Sự xuất hiện gen p đột biến trong ung thư dạ dày

Ngày nay, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng p53 đóng một vai tròquan trọng trong tất cả các dạng ung thư người, đột biến gen p53 hoặc mấtgen p53 được tìm thấy hơn 50% số trường hợp ung thư trên toàn thế giới vàtrên 60% trường hợp UTDD ột biến gen p53 thường ở dạng dị hợp tử LOH(loss of heterozygosity), đột biến nhầm nghĩa hoặc đột biến xóa bỏ sự dịchchuyển mã ột biến gen p53 có thể xảy ra ở giai đoạn sớm, nhưng thườngxuất hiện ở giai đoạn muộn của UTDD Trong UTDD, đột biến gen p53thường xảy ra ở exon 4-11 với tỷ lệ 0-77 và chủ yếu tại codon 175, 248,

273, 282, 245, 213 hotspot codon Dạng đột biến thay thế G:C  A:T ở vị tríCpG là dạng phổ biến nhất và gặp hơn 60 trường hợp UTDD có đột biến genp53 cũng biểu lộ LOH p53 [43] Tần số đột biến G:C  A:T và A:T  G:C giữangười Châu Âu và Châu Á có sự khác biệt [43]

Nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa tỷ lệ đột biến gen p53với mô bệnh học, giai đoạn phát triển, tuổi mắc bệnh và vị trí của khối u củaUTDD Tỷ lệ đột biến p53 trên bệnhình ân UTDD <40 tuổi thấp hơn 40tuổi, vùng tâm vị phổ biến hơn vùng hang vị và tăng cao đối với trường hợp

có di căn Nguy cơ UTDD di căn ác tính tăng cao nếu đột biến p53 nằm ởvùng codon hotspot (175, 248, 273) và ở vị trí non-CpG [43]

Trong 50 trường hợp UTDD, đột biến gen p53 là đột biến lệch mã củaalen thứ nhất và xóa đoạn của alen thứ hai Theo nghiên cứu của Sano chothấy cả đột biến p53 và LOH của p53 gặp 60 khối u Và trong một sốtrường hợp UTDD, nhiều nghiên cứu cho thấy có sự mất hoàn toàn nhánhngắn của nhi m sắc thể 17 [43] Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấycác bất thường gen p53 xảy ra ở các giai đoạn khác nhau của UTDD

1.4.3.2 Sự xuất hiện gen p53 đột biến trong ung thư gan

Nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến gen p53 và bất hoạt gen p53 có vaitrò chủ yếu trong UTG Có nơi người ta gặp đột biến gen p53 lên tới hơn50% các bệnhình ân UTG, trong đó có hơn một nữa là đột biến điểm tại vịtrí 249 (AGG to AGT, hospot), đột biến này gây ra sự thay thế acid aminserin bởi arginin (249ser) ột biến này ít gặp ở bệnhình ân UTG ở Hoa Kỳ

và Châu Âu [63] Khi nghiên cứu UTG ở một số nước Châu Á và Châu Phi

là những nơi có chứa hàm lượng AFB1 lớn trong thức ăn cho thấy đột biếngen p53 xảy ra chủ yếu ở acid amin 249 làm chuyển GT Với nhữngbệnhình ân UTG liên quan HBV và HCV đột biến chủ yếu xảy ra ở acidamin 244 chuyển GA và acid amin 250 chuyển CT [49]

Nghiên cứu của Hollstein cho thấy 8/16 bệnh nhân UTG có phơinhi m AFB1 cao thì có sự chuyển đổi G T ở vị trí nucleotid thứ 3 codon

249 của gen p53, trong khi đó vùng nhi m AFB1 thấp chỉ có 6/22 trườnghợp UTG có đột biến p53 nhưng không phải vị trí codon 249 [ 53] Theonghiên cứu của Hollstein cho thấy tỷ lệ đột biến gen p53 tại Thái Lan là15% còn ở Trung Quốc, ambia, Tây Phi nơi có nhi m HBV và AFB1 cao

Gen AID có chiều dài 1,2 kb, nằm tại vị trí 12p13 trên nhi m sắc thể số

12 Phân tử AID gồm 198 acid amin, có trọng lượng phân tử khoảng 24 kDa

và bao gồm bốn vùng chức năng khác nhau (hình 1.8) [24], [25], [82]:

- ầu N-tận và C-tận chứa các tín hiệu khu trú và di chuyển khỏi nhân

tế bào đồng thời là những vùng đặc hiệu tương ứng hai quá trình siêu đột biến(SHM) và tái tổ hợp gen kháng thể (CSR)

- Vùng tạo thành thể hoạt động có cấu trúc dimer từ acid amin 47-54

- Vùng có hoạt tính cytidine deaminase từ acid amin 56-94

1.5.2 Vai r sinh h c c a gen AID

Trong điều kiện sinh lý bình thường, sự biểu hiện AID giới hạn tại tế bàolympho B hoạt hóa sinh kháng thể, được kiểm soát chặt ch bởi các yếu tốđiều hòa [54] AID là một gen then chốt quy định tính đa dạng của kháng thểthông qua hai quá trình: siêu đột biến (somatic hypermutation) và tái tổ hợp(class switch recombination) gen kháng thể [78], [80]

Quá trình siêu đột biến tích lũy đột biến điểm với tần xuất cao hơn hàngtriệu lần so với các đột biến thông thường tại vùng gen thay đổi (variableregion) của phân tử kháng thể Kết quả của quá trình này là làm tăng ái lựccủa kháng thể với từng loại kháng nguyên [80] Quá trình tái tổ hợp gen xảy

ra ở vùng gen hằng định (constant region) để chuyển một trong các gen Cγ,

Cα hay Cε về vị trí tiếp nối với gen quy định “vùng gen thay đổi” của khángthể bằng cách “tạo” và “xóa” một DNA dạng vòng nằm giữa hai vùng nóitrên Kết quả là thay vì sản xuất ra các phân tử IgM, tế bào lympho B hoạt hóa

s tạo ra các phân tử IgG, IgA hoặc IgE làm tăng tính đặc hiệu của kháng thểđối với kháng nguyên [78], [81]

1.5.3 Cơ ch hoạ ng c a g n AID rong quá r nh ái ổ hợ g n háng hể

Hiện nay có hai giả thuyết về cơ chế hoạt động của AID [33], [54]:

- Tasuku Honjo và cộng sự cho rằng AID đóng vai trò như APOBEC-1,trong đó AID tác động trực tiếp lên các mRNA mà các mRNA này mã hóa sựtổng hợp các protein enzym xúc tác hai quá trình CRS và SHM [39], [54],[111]

- Neuberger và cộng sự lại chứng minh rằng AID tấn công trực tiếp lênDNA bằng hoạt tính deaminase để chuyển C thành U tại vùng gen S (s itchgene), tại điểm này chuỗi DNA bị bẻ gãy và sau đó nhờ hệ thống enzym sửachữa (N.H.E.J) nối lại hai đầu gen tự do [37], [93]

Hai nhóm nghiên cứu đều đưa ra các bằng chứng khoa học đầy thuyếtphục để chứng minh cho giả thuyết của mình Tuy nhiên, có một điểm chung

mà cả hai giả thuyết đều khẳng định là vai trò quyết định của AID trong CRS

và SHM thông qua hoạt tính deaminase (hình 1.9)

Hình 9 Quá r nh ái ổ hợ các g n rên chuỗi nặng c a háng hể

Vị trí các gen trên chuỗi nặng của kháng thể chuột bao gồm: hình ô vuông

và hình bầu dục là exon và vùng gen công tắc (S) Quá trình tổ hợp các gen

V, D và J xảy ra ở tủy xương trong khi SHM và CRS xảy ra ở các trung tâm mầm Quá trình tổ hợp các gen V, D và J đã chọn lựa mỗi loại chỉ một gen để tạo ra một gen tổ hợp V cho tế bào lympho B SHM tạo ra các đột biến trên gen tổ hợp V nhằm tạo ra dòng tế bào lympho B có khả năng tạo kháng thể có

ái lực cao với kháng nguyên CRS tái tổ hợp gen V với các gen C khác nhau bằng cách cắt bỏ các gen nằm gi a hai gen công tắc (S) oạn D cắt bỏ tạo thành D dạng vòng hi phân t ID được hoạt hóa xảy ra uá trình SHM và CSR SHM tích lũy đột biến với tần suất cao gấp hàng triệu lần so với bình thường trên gen V H còn CSR chuyển gen C H ở đầu ’ về vị trí tiếp giáp với tổ hợp gen VDJ H bằng cách tạo và xóa một D dạng vòng Khi

ID tăng cường biểu hiện ở các tế bào không phải lympho B sẽ tích lũy đột biến và phát sinh ung thư [54][79][111].

1.5.4 Đ i n g n AID gây h i chứng ăng IgM ẩ sinh rên người

Tạ Thành Văn và cộng sự đã đưa các gen AID đột biến này vào hệ

vector của retrovirus sau đó chuyển vào tế bào lympho B của chuộtình ắt đã bị

loại bỏ gen AID (AID knock out mice) và dòng tế bào sợi NH3T3 mang gen

cơ chất cho SHM (mutated GFB gene) để nghiên cứu quá trình CSR và SHM

in vitro Kết quả cho thấy đại đa số các AID đột biến mất cả hai hoạt tính

CSR và SHM Tuy nhiên, AID đột biến tại 17 acid amin đầu C tận vẫn duytrì hoạt tính SHM trong đó CSR hoàn toàn bị bác bỏ Sử dụng kỹ thuật tủamiễn dịch (immunoprecipitation) kết hợp với Western blot Tác giả đã đưa

ra bằng chứng khẳng định thể hoạt động của AID l à dimer hoặc multimer[111], [112]

1.5.5 Vai r g n AID rong ung thư

Gen AID là một gen then chốt quy định tính đa dạng của kháng thể thông qua hai quá trình: siêu đột biến và tái tổ hợp gen kháng thể Khi gen AID bị đột biến thì gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch, tăng IgM2 b m sinh

ở người Mặt khác, ở tế bào không có th m quyền miễn dịch, sự tăng cườngtổng hợp enzym AID gây nên hiện tượng chuyển đoạn nhi m sắc thể, tích lũy đột biến để khởi đầu cho quá trình ung thư hóa tế bào lành Với vai trò quyết định trong quá trình siêu đột biến như vậy nên cho đến nay gen AID được coi như một tác nhân gây đột biến nội sinh khi quá trình kiểm soát sự biểu hiện AID bị mất cân bằng Khi đó dưới tác động của các yếu tố hoạt hoá, AID s tác động trực tiếp lên các gen kháng ung thư, tích lũy đột biến, từng bước làm bất hoạt và mất chức năng của các gen áp chế ung thư (hình 1.10), [52]

Cy o in i n iê

Tế bào mật Tế bào gan Tế bào biểu mô

dạ dày Tế bào biểu mô đại tràng

ột biến gen liên quan ung thư

Ung thư đường mật tế bào ganUng thư Ung thư dạ dày đại tràngUng thư

Hình 10 Vai r c a gen AID rong sự há sinh ung thư [52]

Ung thư lympho

Quá trình biến đổi trên các vùng gen mã hóa kháng thể làm cho chúng tađặt một dấu hỏi rằng liệu các quá trình này có phải là một trong những tácnhân khiến cho bộ gen của tế bào mất tính ổn định Trên thực tế, quá trìnhchuyển đoạn nhi m sắc thể liên quan đến các vùng gen kháng thể là một trongnhững tiêu chu n vàng đánh giá ung thư tế bào lympho và hiện tượng siêu độtbiến trên các tiền gen ung thư (proto-oncogene) ở tế bào B trong ung thưlympho tế bào lympho B lớn (DLCLs) tương tự như quá trình siêu đột biếnxảy ra trên gen mã hóa kháng thể Một số lượng lớn các tế bào B ung thư cónguồn gốc từ các trung tâm mầm, nơi đồng thời xảy ra hai quá trình siêu độtbiến và tái tổ hợp gen Sự chuyển đoạn nhi m sắc thể và đột biến được cho làthông qua quá trình siêu đột biến và tái tổ hợp gen khác ở các tế bào B trongtrung tâm mầm Tuy nhiên, cơ chế phân tử của sự mất điều hòa hai quá trìnhtái tổ hợp gen và siêu đột biến hiện nay vẫn chưa được hiểu rõ [54]

Nghiên cứu của Tasuku Honjo và cộng sự đã chứng minh rằng rối loạnchức năng AID s gây nên bất thường cho hai quá trình siêu đột biến và tái tổhợp gen, tiền đề của quá trình ung thư hóa tế bào lympho bằng mô hình thựcnghiệm trên chuột chuyển gen AID Nhóm tác giả này nhận thấy rằng ở chuộtchuyển gen AID xuất hiện ung thư lympho tế bào T và các khối u nhỏ ở phổi.Các tế bào T này có tỷ lệ đột biến điểm cao ở các gen TCR và c-myc mà thủphạm chính là AID Feldhahn N và cộng sự đã chứng minh rằng AIDịch ính làtác nhân gây đột biến ở tế bào bệnhình ân ung thư bạch cầu cấp chuyển dạng-

BC R-Abl1 Nghiên cứu được tiến hành trên 108 bệnhình ân ung thư dònglympho cấp (acute lymphoblastic leukemia) với nhi m sắc thể Philadelphia

và – (Ph+ và Ph-) Kết quả nghiên cứu cho thấy ở bệnhình ân Ph- gen BCL6 vàvùng gen biến đổi (V) của chuỗi nặng (IGH) ở các tế bào lympho B khá toànvẹn trong khi các gen này bị đột biến tần suất cao ở bệnhình ân Ph+ Ở nhữngbệnhình ân ung thư bạch cầu cấp có Ph+, hoạt tính AID tăng cao một cách bấtthường và còn gây ra hiện tượng đứt gãy sợi DNA đơn của gen áp chế ungthư CDKN2B ở các tế bào B Những kết quả này đã cho phép đưa ra khuyếncáo rằng việc biểu hiện quá mức AID ở bệnhình ân ung thư bạch cầu cấp có

Ph+ là một tiên lượng xấu [55]

AID trong ung thư dạ dày

Nghiên cứu thực nghiệm in vitro trên tế bào biểu mô dạ dày nhi m chủng H pylori có cagPAI (+) (TN2GF4) cho thấy H pylori với cagPAI (+)

kích thích biểu hiện quá mức AID (khoảng 173 lần so với đối chứng) thôngqua việc hoạt hóa con đường tín hiệu Nuclear factor kappa B (NF-kB) phụthuộc IkB kinase, một kênh dẫn truyền tín hiệu nội bào quan trọng mà đíchđến là hoạt hóa các gen then chốt trong quá trình biệt hóa và nhân lên của tế

bào Sự biểu hiện quá mức AID do H pylori đã tạo ra sự tích lũy đột biến trên gen áp chế ung thư p53 trong tế bào biểu mô dạ dày in vitro Bằng chứng

khoa học này cho phép đưa ra giả thiết rằng việc biểu hiện quá mức AID do

nhi m H pylori đã gây ra sự tích tụ các đột biến gen ở tế bào biểu mô dạ dày

phải chăng là tiền đề cho sự phát sinh ung thư (hình 1.11), [76], [77]

Tế bào biểu mô

dạ dày Viêm dạ dày mạn tínhình i m H pylori UTDD

Hình 11 AID húc ẩy quá r nh há riển UTDD hông qua sự ích y

i n hi AID ăng cường iểu hi n ại o niê ạc dạ d y

Nghiên cứu của Matsumoto và cộng sự cho thấy có sự biểu hiện bất

thường AID ở mô UTDD, mô viêm dạ dày mạn tínhình i m H pylori và

không có sự biểu hiện AID ở niêm mạc dạ dày bình thường hoặc mô dạ dày

sau diệt H pylori [76] Nghiên cứu cũng cho thấy sự biểu hiện AID ở tế bào biểu mô dạ dày nhi m chủng H pylori có Cag PAI (+) cao hơn chủng H pylori Cag PAI (-) [76] Mặt khác, nghiên cứu của Peek đưa đến kết luận: nhi m chủng H pylori có Cag PAI (+) gây tăng hoạt hóa NF-kB ở tế bào biểu

mô dạ dày trên in vivo và in vitro [91] Như vậy, chủng H pylori có Cag PAI (+) trực tiếp gây biểu hiện AID thông qua hoạt hóa NF-kB và phản ứng tiền viêm do nhi m H pylori cũng gây biểu hiện AID thông qua hoạt hóa NF-kB

ở những loại tế bào khác nhau ối với dòng tế bào biểu mô dạ dày nuôi cấy

nhi m H pylori trên in vitro s gây đột biến trên gen áp chế ung thư p53 và đối với tế bào loại bỏ gen AID nhi m H pylori thì sự thay đổi nucleotid được giảm đáng kể Kết quả này cho thấy, tế bào biểu mô dạ dày nhi m chủng H pylori có Cag PAI (+) gây biểu hiện bất thường AID, dẫn đến tích lũy đột biến

trên gen p53 [91]

Các nghiên cứu gần đây tiếp tục cho rằng những tế bào biểu mô dạ dàybiểu hiện AID thường gây ra đột biến gen Trái lại những bất thường ditruyền không được quan sát ở tế bào biểu mô dạ dày thiếu hụt AID [76],

[77] Như vậy, sự biểu hiện sai lệch AID được gây ra bởi H pylori là cơ chế

giải thích cho sự thay đổi di truyền ở niêm mạc dạ dày trong suốt quá trìnhphát sinh UTDD

Trong thực nghiệm in vivo ở chuột chuyển gen AID sử dụng gen điều

khiển -actin (CAG) (-actin promoter), nhóm tác giả này đã phát hiện rarằng 2/59 (3,4%) chuột chuyển gen xuất hiện ung thư dạ dày Kết quả thực

nghiệm này một lần nữa khẳng định cơ chế gây ung thư của H pylori là

thông qua việc kích thích tăng cường biểu hiện AID ở các tế bào biểu m ô

này Sự biểu hiện bất thường AID trên tế bào biểu mô dạ dày nhi m H pylori được cho là cơ chế quan trọng trong phát triển UTDD Sự biểu hiện

quá mức AID ở tế bào biểu mô dạ dày thông qua sự hoạt hóa yếu tố NF -kB

được gây ra bởi H pylori, do đó ức chế con đường NF-kB có thể làm giảm

sự biểu hiện AID

AID trong ung thư gan

Endo Y và cộng sự trong thực nghiệm in vitro sử dụng dòng tế bào gan

người nuôi cấy cũng đã chứng minh sự gia tăng biểu hiện AID ở mức độmRNA và protein thông qua sự hoạt hóa kênh dẫn truyền tín hiệu NuclearFactor kappa B (NF-kB) và virus viêm gan C (HCV), một tác nhân chínhgây ung thư gan có tác dụng làm tăng cường sự biểu hiện AID Việc biểuhiện quá mức AID đã làm tích lũy sự biến đổi vật liệu di truyền ở các gen c-myc và pim1 iều này gợi ý rằng AID đóng vai trò như một tác nhân gâyđột biến và làm tăng cường tínhình ạy cảm của tế bào gan với các tác nhângây đột biến gen Trên mô hình chuột chuyển gen AID, 4/16 (25%) số chuột

có khối ung thư gan iều này cho thấy sự biểu hiện quá mức AID có thể là một tác nhân độc với nhóm gen phát sinh ung thư gan [41].

Khi nghiên cứu trên dòng tế bào gan HepG-2, nhóm nghiên cứu củaChiba và cộng sự tại bệnh viện Trường ại học Kyoto đã chứng minh rằng

sự có mặt các phân tử protein được tổng hợp từ bộ gen virus viêm gan Ctrong tế bào Hep-2 thì protein AID được gia tăng biểu hiện một cách rõ rệtkhi phân tích bằng kỹ thuật dánh dấu miễn dịch (immunoblot) trên bản gelacrylamide [35] Hơn nữa, dưới tác dụng của yếu tố hoại tử khối u alpha(tumor necrosis factor alpha, TNF-α), một yếu tố then chốt trong quá trìnhgây viêm, ung thư hoá và đóng vai trò quan trọng trong quá trìnhình ân lêncủa virus, tế bào HepG-2 cũng tăng cường tổng hợp AID một cách rõ rệt ở

cả hai mức độ mRNA và protein [35] Kết quả này mở ra một hướng nghiêncứu đầy hứa hẹn và hết sức có ý nghĩa về mối liên quan giữa các tác nhângây viêm gan với sự gia tăng biểu hiện AID và quá trình phát sinh phát triểnung thư tế bào gan nguyên phát trong đó đặc biệtình ấn mạnh vai trò củavirus gây viêm gan B Trong cả hai nghiên cứu trên thì sự tăng cường biểuhiện AID thông qua sự hoạt hoá kênh dẫn truyền tín hiệu Nuclear Factorkappa B (NF-kB), một kênh dẫn truyền tín hiệu nội bào quan trọng mà đíchđến là hoạt hoá các gen then chốt trong quá trình biệt hoá và nhân lên của tếbào [35], [41] iều này có ý nghĩa trong việc sử dụng các chất ức chế đặchiệu điều hoà và kiểm soát các quá trình kể trên cũng như buớc đầu sử dụngcác kết quả đó trong việc áp dụng liệu pháp điều trị gen đối với một số loạihình ung thư

Gần đây những nghiên cứu về tế bào gốc cho thấy, các tế bào gốc ungthư có khả năng duy trì sự hình thành hoặc sự phát triển khối u Alkalinephosphatase không đặc hiệu mô TNAP (tissue non-specific alkalinephosphatase) là một marker của tế bào gốc phôi thai và tế bào gốc chưa

trưởng thành và được biểu hiện ở mô gan bào thai chuột [105] Sự biểu hiệnAID ở những tế bào chuột mang TNAP (TNAP-AID mice) dẫn đến pháttriển HCC ở chuột với tần suất cao [105] Hơn nữa, sự tích lũy cao đột biếngen p53 được quan sát ở cả mô HCC chuột và mô không ung thư của chuộtmang TNAP [105] Kết quả này cho thấy sự biểu hiện AID ở tế bào ganchưa trưởng thành góp phần vào sự phát triển HCC thông qua sự tích lũy độtbiến gen Và nghiên cứu của Kou và cộng sự cho thấy AID biểu hiện bấtthường ở mô viêm gan mạn và mô xơ gan nhi m HCV [66].

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối ượng nghiên cứu

- Nhóm mẫu mô bệnh: gồm 72 mẫu mô được lấy từ 72 bệnhình ânUTDD và 30 mẫu mô được lấy từ 30 bệnhình ân UTGNP

- Nhóm mẫu mô chứng:

 Mẫu mô chứng bệnh bao gồm:

o Mẫu mô chứng bệnh dạ dày: gồm 5 mẫu mô được lấy

từ 5 bệnhình ân viêm dạ dày

o Mẫu mô chứng bệnh gan: gồm 10 mẫu mô được lấy từ

10 bệnhình ân xơ gan và 5 mẫu mô được lấy từ 5 bệnhình ân viêm gan

 Mẫu mô chứng lành: được lấy tại vị trí cách xa khối u, khối xơ

và khối viêm 5 cm với số lượng tương đương Các mô lànhnày được khẳng định bằng tế bào học

Tất cả các bệnhình ân này phải được thăm khám lâm sàng, làm các xétnghiệm cận lâm sàng và giải phẫu bệnh để chẩn đoán xác định bệnh.Bệnhình ân tham gia nghiên cứu không bị ung thư phối hợp hoặc kết hợp vớicác bệnh lý khác

- Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein,Trường ại học Y Hà Nội Toàn bộ các mẫu mô nghiên cứu được thu thập vàchẩn đoán mô bệnh học tại bệnh viện ại học Y Dược thành phố Hồ ChíMinh

Dụng cụ rang hi hoá chấ nghiên cứu

Dụng cụ rang hi :

- Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA)

- Máy Real-time PCR của hãng Eppendorf

- Tủ lạnh sâu: -300C, -800C (SANYO)

- Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)

- Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf ( ức)

- Máy quang phổ kế Thermo Electron Corporation của hãng Biomate

- Máy đo nồng độ acid nucleic Nano Drop 1000 (Mỹ)

Hóa chất dùng cho tách chiết D từ mô (Invitrogen):

- Dung dịch lysis buffer

- Dung dịch proteinase K

- Dung dịch SDS 10%

- Dung dịch phenol: cloroform: isoamyl (25:24:1)

- Dung dịch cloroform: isoamyl (24:1)

- Sodium acetate 3M, pH 5,2

- Ethanol 100% và ethanol 70%

- Dung dịch đệm Tris-EDTA (TE)

Hoá chất dùng cho PCR (Invitrogen): 10X buffer, dNTP mix, Taq

polymerase, mồi

Hóa chất điện di: Agarose, dung dịch TBE 10

En ym cắt giới hạn: HaeIII

Hóa chất để đọc trình tự: đệm, bigdye, mồi, hi-di, bộ kit tinh sạch sản ph m

PCR từ gel của Invitrogen

Phương há nghiên cứu

- Thăm khám lâm sàng và chẩn đoán cận lâm sàng, chẩn đoán mô bệnh học

- Các kỹ thuật sinh học phân tử gồm tách chiết DNA và RNA tổng số,tổng hợp cDNA, PCR và PCR định lượng (Real-time PCR) để xác định mức

độ phiên mã gen AID, sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (PCR-RFLP) vàgiải trình tự gen (Sequencing) để xác định đột biến gen p53

- Các kết quả nghiên cứu được sử lý toán thống kê nhằm tìm hiểu sựkhác biệt giữa các nhóm đối tượng nghiên cứu

MÔ UTDD MÔ UTG

2.3.1 Lấy ẫu

- Thu thập mô nh:

+ Mô gan gồm: 30 mẫu sinh thiết mô gan của 30 bệnhình ân UTG,

10 mẫu sinh thiết mô gan của 10 bệnhình ân xơ gan và 5 mẫu sinh thiết môgan của 5 bệnhình ân viêm gan

+ Mô dạ dày gồm: 72 mẫu sinh thiết mô dạ dày của 72 bệnhình ânUTDD, 5 mẫu sinh thiết mô dạ dày của 5 bệnhình ân viêm dạ dày được lựachọn để phân tích

- Thu thập mô lành Các mẫu mô lành tính thuộc mỗi đối tượng trên

được thu thập để làm đối chứng với số lượng tương đương Vị trí lấy mẫulành cách vị trí khối u, xơ hoặc viêm 5 cm và được khẳng định bằng tếbào học

- Tất cả các mẫu mô đều được chẩn đoán xác định bằng tế bào học vàbảo quản -700C cho đến khi đưa ra phân tích

- Tất cả các mẫu mô dạ dày được phân độ biệt hóa khối u dựa vào tiêuchu n WHO năm 2000 và được chia thành 3 độ: biệt hóa cao, biệt hóa vừa vàbiệt hóa kém

2.3.2 Quy r nh ách chi DNA

DNA được tách chiết từ mẫu mô dạ dày và mô gan bằng phương pháp

phenol/chloroform (hình 2.2):

- Một mẫu nhỏ mô gan (1g) và mô dạ dày được nghiền trong 600

μl dung dịch lysis buffer bằng cối nghiền đồng thể, sau đó chuyển sang ốngEppendorf 1,5 ml

- Thêm 4 μl proteinase K (20 mg/ml), ủ 560C/16h

- Cho 400 μl dung dịch hỗn hợp phenol : chloroform : isoamylalcohol(25:24:1), đảo nhẹ, ly tâm 8000v/10phút/40C Hỗn hợp được chia làm 3 phần:

 Lớp dung dịch phía trên có chứa DNA.

8000v/10phút/40C Hút lấy phần dịch trên cùng và tiến hành lặp lại 1 lần

nữa

- Tủa DNA bằng 1ml cồn tuyệt đối, cho thêm 50 μl Na acetat, để lạnhqua đêm ở -20°C

- Ly tâm 13000 v/p trong 20 phút ở 40C, đổ dịch trên, thu tủa

- Rửa tủa bằng cồn 70°, ly tâm thu tủa

- Tủa DNA được hoà tan bằng 50 µl nước tinh khiết hoặc đệm TE.DNA sau khi được tách chiết s được tiến hành đo nồng độ và độ tinhsạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị yêu cầu về tinh sạch (mật độ quang OD280/OD260 ≥1,8) mới được sử dụng cho các phân tích tiếp theo