Ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật để hòa thiện công nghệ sản xuất vacxin uống phòng ở qui mô bán công nghiệp

Vắcxin này còn được gọi là vắcxin "cổ điển" đã được tiêm cho hàng nhiều triệu người trên thế giới, nhưng thật ra mãi rất lâu về sau, vào quãng những năm 60, mới bắt đầu có những nghiên c

Bộ Y TẾ f ty / VIEN VE SINH DICH TE HOC

CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÁP NHÀ NƯỚC KY 01

ĐỀ TÀI KY.01.03

UNG DUNG TIẾN Bộ KHOA HOC KY THUAT DE HOA

ỨUI MÔ BẤN CÔNG NGHIỆP

- Sở Y Tế Thừa Thiên - Huế

Viện Vi Sinh và Miễn Dịch học, trường Đại học Gotebor Viện Sức Khỏe Guốc Gia (N.I.H.), Bethesda, Md

HÀ NỘI - 1995 ` - ee

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI KY - 01 - 03

GS TS ĐẶNG ĐỨC TRẠCH

PHÓ CHỦ NHIỆM PGS PTS ĐẶNG ĐỨC PHÚ

Chủ nhiệm đề mục:

KI - 01 - 03 -01 PTS Hoang thu Thuy

KI - 01 - 03 -02 TS Phùng Đắc Cam” KI- 01 - 03 -03 BS Nguyén Pht Quy KI- 01 - 03- 04 KI - 01 - 03 - 05 KS Phan Vii Diém Hang™

BS Đỗ Gia Cảnh) KI- 01 - 03 - 06 KI- 01 - 03 - Ơ7 PGS Nguyễn thị Ke2

(4) Sở Y tế thờa Thiên - Huế (5) Viện Vi sinh và Miễn dịch học, Trường đại học Goteborg, Thuy Điển (6) Viện sức khoẻ Quốc gia (N.LH.), Bethesda, Md, Mỹ.

I ĐẶT VẤN ĐỀ

I, TONG QUAN

Phần thứ nhất: Bổ xung các kháng nguyên cần thiết

Phần thứ hai: Sản xuất vắc xin tả ở qui mô bán công nghiệp

Phần thứ ba: Thí nghiệm thực địa

IV BÀN LUẬN CHUNG

V KET LUAN CHUNG

MUC LUC

43

44 45

I BAT VAN DE

Đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin uống phòng bệnh tả" 64 B - 07 - 03 -

01 (1990) đã có những kết quả như sau (3, 11, 12):

1 Một vắcxin chết, toàn tế bao, gdm Vibrio cholerae typ sinh hoe cé dién

va typ sinh hoc EI Tor, bất hoạt bởi nhiệt và formalin, đã được chế tạo

Sản phẩm đạt những yêu cầu của Trung Tâm Quốc Gia: Kiểm Định

Vắcxin đã được thí nghiệm trên người tình nguyện và tô ra an toàn, với

liêu uống 100 tỉ vi khuẩn x 3 lần Theo dõi đáp ứng miễn dịch ở người

tình nguyện, thấy có hiệu giá các lg đặc hiệu cao, đặc biệt các sIgA

Vắcxin đã được sản xuất ở qui mô phòng thí nghiệm, sản phẩm sản xuất

thử đạt 200.000 liều Giá thành ước tính của mỗi liều bằng 0,5 kg gạo

Nếu sản xuất và kiểm định ở qui mô lớn hơn, giá thành có thể sẽ thấp

Những vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu:

e_ Quy trình hợp lý cần để sản xuất vắcxin này ở quy mô lớn hơn

« Cải tiến để có thể tăng hiệu lực gây miễn dịch của vắcxin này -

Đề tài KY 01.03 (1992 - 1995) “Ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật để hoàn thiện công nghệ sản xuất vắcxin uống phòng tả ở qui mô bán công nghiệp” nhằm các mục dich:

1

2

Bổ xung một số kháng nguyên cần thiết để tăng hiệu lực của vắcxin

Nâng mức sản xuất từ qui mô phòng thí nghiệm lên qui mô bán ông nghiệp, với thiết bị hiện có

Thí nghiệm thực địa, và nhận xét sơ bộ về hiệu lực bảo vệ của vắcxin này.

II TONG QUAN

Bénh tả hiện nay vẫn xảy ra tại nhiều nơi trên thế giới Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, khoảng 35 nước vẫn còn có bệnh tả Bệnh tả, nếu

không được điều trị kịp thời và đúng cách, thường có tỷ lệ mắc/chết rất cao, khoảng 40% Mỗi năm ước tính có trung bình 1 triệu trường hợp mắc bệnh

tả, số tử vong là khoảng 200.000 ở Châu Phi và khoảng 100.000 ở Châu Á

Một phần ba số tử vong đó là trẻ em dưới 5 tuổi, một phần tư là trẻ em từ 5 tới 14 tuổi, và số còn lại là người lớn Hiện nay bệnh tả chủ yếu vẫn do

Vibrio cholera 01 nhưng mới đây thấy xuất hiện một tác nhân mới, Vibrio cholerae 0139, gây nhiêu vụ dịch lớn trên thế giới, đặc biệt ở những nước trong khu vực Á Châu (2) Việt nam là vùng dịch tả lưu hành, bệnh tả vẫn

là gánh nặng cho ngành y tế và xã hội Cũng không loại trừ khả năng có

thể xẩy ra dịch lớn do V.cholerae 0139 ở nước ta

Từ lâu nay việc nghiên cứu để có được một vắcxin hiệu nghiệm phòng

bệnh tả vẫn là mối quan tâm của y học thế giới Vắcxin tả đầu tiên có từ một thế kỷ nay, sau khi Koch phát hiện được Vibrio cholerae 01 là bệnh

nguyên của tả Vắcxin này (còn được gọi là vắcxin "cổ điển") đã được tiêm cho hàng nhiều triệu người trên thế giới, nhưng thật ra mãi rất lâu về sau,

vào quãng những năm 60, mới bắt đầu có những nghiên cứu đánh giá hiệu lực của vắcxin này trên thực địa Những: nghiên cứu tại Bangledesh, Ấn Độ

và Philippin cho phép nhận định rằng vắcxin "cổ điển" này chỉ có hiệu lực rất hạn chế, chỉ có thể bảo vệ được trong thời gian ngắn (3-6 tháng), khả

năng gây miễn dịch cho trẻ em rất thấp, và đặc biệt là tiêm vắcxin cũng không hạn chế được việc đào thải Vibrio cholerae qua phân Vì thế

vắcxin"cổ điển" không được coi là phương tiện hiệu nghiệm để dự phòng

bệnh tả, và hiện nay không còn được dùng nữa

Trong những năn 70, Ấn Độ và Inđônésïa có thí nghiệm liêm vắcxin hấp ˆ

phụ aluminium Vắcxin này có hiệu lực bảo vệ cao hơn và dài hơn vắcxin

"cổ điển" Cũng trong khoảng thời gian này Bangladesh và Philippin cũng thử tiệm giải độc tố (toxoid): loại vắcxin này, tuy có gây đáp ứng kháng thể

kháng độc tố, nhưng trên thực địa không có hiệu lực bảo vệ đáng kể

Lúc này Tổ chức Y tế Thế giới bắt đầu khuyến cáo không nên tiêm vắcxin

tả vì những lý do sau đây: Vắcxin này không có hiệu lực dự phòng tại

những khu vực lưu hành bệnh tả, không có tác dụng chống các vụ dịch tả,

và không có khả năng ngăn chặn bệnh tả lan truyền giữa các khu vực trên thế giới Ngoài ra, một lý do nữa cũng khiến cho mọi người không còn

quan tâm tới thức vắcxin"cổ điển" này: Việc điều trị bệnh tả đã có nhiều

tiến bộ và đơn giản hơn trước Phương pháp bủ nước trên thực tế đã làm

giảm tỷ lệ mắc/chết xuống tối thiểu (dưới 1%), và như vậy điều trị rõ ràng là

có tác dụng cứu được nhiều người hơn là tiêm phòng vắcxin tồi

Sau tai họa lớn ở Rwanda, từ năm 1995, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã thay

đổi quan niệm và đã nhận thấy sự cần thiết phải dùng vắc xin tả kiểu mới

để dự phòng dịch tả (13)

Xuất phát từ quan niệm rằng phòng vệ tự nhiên chống bệnh tả chủ yếu dựa vào các kháng thể hình thành tại đường ruột, có khả năng chống vi

khuẩn tả và độc tố tả, từ những năm 80 nhiều phòng thí nghiệm đã tập

trung nghiên cứu vắcxin tả uống, với hy vọng là vắcxin uống có thể kích thích đáp ứng miễn dịch tại đường ruột chống lại một noặc nhiều kháng

nguyên chủ yếu của Vibrio cholerae 01

I.1 NHỮNG KHÁNG NGUYÊN CHỦ YẾU CỦA VIBRIO CHOLERAE 01 Qua các nghiên cứu trên súc vật và trên người có thể thấy rằng các kháng

nguyên lipopolysaccharid của thành tế bào vi khuẩn (LPS) và độc tố (CT)

có khả năng tạo được miễn dịch bảo vệ -chống tả Những kháng thể đặc

hiệu chống các kháng nguyên này được hình thành tại đường ruột, và có tác dụng cộng lực Miễn dịch kháng vi khuẩn chủ yếu do LPS, nhưng các kháng thể kháng các protein khác của tế bào vi khuẩn tả cũng có thể có vai trò quan trọng Miễn dịch kháng độc tố có tác dụng chống lại tiểu đơn vị

B của độc tố tả

Vibrio cholerae 01, muốn gây được ia chảy, trước tiên cần phải: định cư- được tại đường ruột Quá trình này rất phức tạp, đòi hỏi có sự biểu hiện nhịp nhàng giữa các chức năng hóa ứng động và sau cùng là sự hình thành

độc tố (CT) Như vậy, nếu ngăn cản không cho V.cholerae 01 bám dính

vào tổ chức ruột, thì sẽ chặn đứng được quá trình sinh bệnh ngay từ giai đoạn sớm nhất Những nghiên cứu mới đây trên chuột nhắt mới đẻ và trên người tình nguyện cho phép kết luận được rằng V.cholerae 01 (cả týp sinh

được tại ruột TCP (viết tắt của toxin coregulated pilus = pilus đồng điều hòa độc tố) là một "lông" của vi khuẩn tả TCP biểu hiện được nhiều hay ít tùy theo ngoại cảnh, và điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho TCP biểu hiện

được nhiều cũng đồng thời thích hợp cho độc tố tả hình thành được nhiều

(6)

Gen cấu trúc chính của TCP, TepA, và các gen mã hóa sự tổng hợp độc tố,

là một phần của yếu tố điều hòa độc lực (toxR) Các kháng nguyên, do các

gen nói trên mã hóa, đều có khả năng riêng kích thích đáp ứng miễn dịch

chống lại bệnh tả thực nghiệm Các kháng nguyên này, nếu cộng lực, sẽ

ngăn các gen biểu hiện Do vai trò quan trọng của protêin tiết do toxR điều hòa, đặc biệt là TCP và tiểu đơn vị B của CT, được coi như là những kháng

nguyên miễn dịch mạnh, có thể dùng phối hợp với LPS trong vắcxin `

Trong thực nghiệm, kháng huyết thanh thỏ đa-clôn kháng TCP có hiệu lực

bảovệ thụ động cho chuột nhắt mới đẻ, sau khi thử thách gây bệnh bằng V.cholerae 01 (chủng Inaba và chủng Ogawa) Nếu hấp phụ kháng huyết

thanh khang TCP với một chủng V.cholerae 01 hoang dại, thì khả năng bảo

- vệ mất Nhưng nếu hấp phụ với một chủng V.cholerae 01 pilus-âm, thì khả năng bảo vệ còn nguyên vẹn Như vậy có thể nghĩ rằng khả năng báo vệ

có liên quan chặt chẽ với kháng thể kháng -TCP Các gen TcpA của các chủng V.cholerae 01, sinh týp cổ điển, Inaba và Ogawa, giống nhau hoàn toàn Các gen TcpA này không giống hẳn các gen TcpA của V.cholerae sinh - typ El Tor, nhung có lẽ có chung những quyết định kháng nguyên

Ngoài những gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp TCP, còn có những gen mã hóa các protêin màng ngoài tế bào vi khuẩn, và các gen mã hóa tổng hợp một yếu tố phụ định cư (ACF - accessory colonization factor) Tat

cả các gen này cũng đều do toxR điều hòa Như vậy, TepA có thể dùng

-như là "chỉ điểm" của các kháng nguyên mạnh khác cùng bị điều hòa bởi

toxR, trong quá trình sản xuất loại vắcxin toàn tế bào (WC - whole cell)

1.2 CÁC VẮCXIN UỐNG DỰ TUYỂN

Các vắcxin chết

Các vắcxin WC đơn hoặc phối hợp với tiểu đơn vị B của CT mới đây đã

Vắcxin phối hợp WC/BS gồm có tiểu đơn vị B tỉnh chế từ độc tố tả, và các

‘vi khuẩn tả thuộc sinh-týp cổ điển và sinh- -typ El Tor (Inaba va Ogawa) Tiểu đơn vị B hoàn toàn không độc, nhưng có khả năng sinh kháng thể trung hòa như độc tố toàn vẹn

Tiểu đơn vị B có khả năng gắn vào màng tế bào ruột, do đó có tính sinh

miễn dịch Tế bào vi khuẩn bất hoạt bởi nhiệt cung cấp được các kháng nguyên LPS Inaba và Ogawa, tế bào vi khuẩn bất hoạt bởi formalin cung cấp các kháng nguyên không kháng nhiệt Tiểu đơn vị B là một pentamer

dễ bị hủy bởi axít, vì vậy khi cho uống vắcxin cần phải dùng dung dịch đệm gồm có natri bicarbonat va axit citric

Qua những thí nghiệm thực địa đầu tiên ở quy mô nhỏ (Bangladesh, Thụy Điển, Mỹ) thấy rằng vắcxin WC/BS an toàn Tại Bangladesh có thí nghiệm đánh giá để xem vắcxin này có khả năng kích thích các đáp ứng kháng thể niêm mạc kháng vi khuẩn và kháng độc tố Kết quả thấy rằng : uống hai liều (hoặc nhiều liều hơn) thì gây được sự hình thành khang thé IgA kháng - LPS va khang độc tố trong nước rửa ruột, với hiệu giá cao như ở bệnh nhân

tả Các đáp ứng kháng thể này cao hơn rất nhiều và tồn tại lâu hơn nhiều, nếu so sánh các đáp ứng sau khi tiêm bắp thịt 2 liều cùng thứ vắcxin này Đáp ứng kháng thể ở người Thụy Điển thấp hơn so với đáp ứng ở người Bangladesh ở cùng lứa tuổi Theo dõi lâu dài , thấy rằng ký ức miễn dịch (lgA niêm mạo) có thể tồn tại f nhất 15 tháng ở người tình nguyện Bangladesh, và ít nhất 5 năm ở người tình nguyện Thụy Điển

Tại Hoa Kỳ, những người tình nguyện đã uống 3 liều vắcxin WC/BS có được tỷ lệ bảo vệ là 63%, nếu dùng WC thì tỷ lệ bảo vệ 56%, sau khi thử thách gây bệnh tả với V.cholerae 01 EI Tor Trong số những người tình nguyện Hoa Kỳ này, nếu uống WC/BS thì không có ai bị ïa chảy nặng

(nặng = bài tiết ít nhất 2 líVngày), và nếu uống WC thi 44% bi ia chảy nặng

Do thấy có những kết quả đáng khích lệ nói trên, Trung Tâm Quốc tế

Nghiên cứu Bệnh fa chay (ICDDR/B) tai Bangiadesh phối hợp với chính phủ Bangladesh và Tổ chức Y tế Thế giới, tiến hành một thực địa nghiên cứu hiệu lực của vắcxin tả uống tại Matlab từ năm 1985 Tất cả có 63.000

người (gôm trẻ em 2-15 tuổi và phụ nữ trên 15 tuổi) đã uống 3 liều, mỗi liều

cách nhau 6 tuân, theo các nhóm như sau: (a) vacxin WC/BS, (b) vắcxin

WC hoặc (c) placebo gồm có E.coli K12 bất hoạt Mỗi liều WC/BS gồm:

(Cairo 48), Ogawa cổ điển bất hoạt nhiệt (Cairo 50), lượng đều nhau

'Vắcxin WC cũng có công thức như trên, nhưng không có tiểu đơn vị B

Cả 2 vắcxin đều làm tăng hiệu giá kháng thể huyết thanh diệt Vibrio (tăng khoảng 2 bậc); riêng vắcxin WC/BS làm tăng hiệu giá kháng thể huyết thanh lgG kháng độc tố tả (tăng 4-6 bậc) Theo dõi các người uống vắcxin, không thấy có phản ứng gì xảy ra

Theo dõi hiệu lực bảo vệ của vắcxin qua 3 năm giám sát trong khu vực Matlab: Những số liệu chính được ghi lại trong bảng kèm theo Sau 3 năm theo dõi những người đã uống 3 liều vắcxin, thấy rằng WC có tỷ lệ bảo vệ 52%, vắcxin WC/BS có tỷ lệ bảo vệ 50% Tỷ lệ báo vệ ở đây có nghĩa là dự phòng được ia chảy do vi khuẩn tả gây ra (chứng minh bằng nuôi cấy vi

khuẩn}

Cả hai loại vắcxin đều có hiệu lực bảo vệ thấp đối với trẻ em 2-5 tuổi: 31%

và 24% với WC, và 38% và 47% với WC/BS, trong năm thứ nhất và năm

thứ hai Tới năm thứ 3 coi như không còn thấy hiệu lực bảo vệ nữa ở lứa

tuổi này Trái lại, ở lứa từ 6 tuổi trở lên, hiệu lực bảo vệ trong cả thời gian 3

năm là khá cao: 68% với WC, và 63% với WC/BS Trong nhóm placebo,

65% những người mắc bệnh tả là thuộc lứa tuổi từ 6 tuổi trở lên

Qua mỗi năm theo rõi, thấy rằng các trường hợp bệnh tả có cả V.cholerae

01 typ sinh học cổ điển hoặc typ sinh học El Tor, và phần lớn các chủng đã

phân lập được là Ogawa Hiệu lực bảo vệ của cả hai thứ vắcxin đối với

V.cholerae cổ điển cao hơn đối với V.cholerae EI Tor

So với WC, WC/BS có hiệu lực bảo vệ cao hơn trong 8 tháng đầu WC/BS cũng có tác dụng dự phòng ïa chảy cấp của trẻ em do ETEC, nhưng tác - dụng này rất ngắn hạn (khoảng 3 tháng).

Hiệu lực của vắcxin WC và WC/BS tại thực địa Bangladesh

Tuy thực địa này không nhằm nghiên cứu xem uống vắcxin bao nhiêu lần

là tối ưu, nhưng có thể thấy rằng uống 2 liều cũng có tác dụng tốt như uống

3 liều Nhưng nếu chỉ uống 1 liều thì không có tác dụng bảo vệ (1)

Các vắcxin V.cholerae 01 sống, giảm sức độc

Trong khoảng mười năm qua có khá nhiều nghiên cứu nhằm tạo được các

chủng đột biến V.cholerae 01 để làm vắcxin sống uống Phần lớn các

nhóm nghiên cứu đều theo đuổi mục đích tạo được các chửng đột biến

không sinh độc tố (kiểu hình độc tố A-B-) , hoặc chỉ sinh tiểu đơn vị B của

độc tố (kiểu hình A-B+)

Một số chủng dự tuyển (như Texas Star-R) đã được thí nghiệm trên người tình nguyện, và tỏ ra có khả năng sinh miễn dịch bảo vệ Tuy nhiên những chủng này đều không sử dụng được làm vắcxin, vì không được an toàn Chủng dự tuyển đáng chú ý nhất hiện nay là C.cholerae 01 CVD 103

Chúng này là một đột biến A-B+, tái tổ hợp từ chủng độc cổ điển Inaba 569B đã loại gen mã hổa tiểu don vi A Nhu vay chủng CVD 103 chỉ sinh tiểu đơn vi B Ching này cũng không có độc tố "giống Shiga" (thường có thể thấy ở nhiều chủng Vibrio cholerae, có khả năng tham gia vào quá trình

sinh bệnh ïa chảy)

Tại Hoa Kỳ có thí nghiệm CVD 103 trên người tình nguyện: 46 người lớn

khỏe, đã uống một liều 10 vi khuẩn sống, không có phản ứng gì nghiêm

trọng Tuy vậy, 5 người (11%) đã có ïa chảy nhưng không có những dấu

hiệu kèm theo như buồn nôn , khó chịu, đau quặn, biếng ăn Thử huyết

thanh thấy 45/46 người tinh nguyện (98%) có tăng hiệu kháng thể diệt Vibrio một cách đáng kể , và 93% có tăng hiệu giá kháng độc tố rõ rệt

Sau đó cũng tại Mỹ, có 3 thí nghiệm thử thách trên tổng số 26 người tình

nguyện Mỗi người uống một liều 2x10Ê vi khuẩn CVD 103, và sau 1 tháng

được thử thách gây bệnh với V cholerae 01 độc ( liều thử thách này gây ïa

chảy cho 24/25 người tình nguyện đối chứng không uống vắcxin) Kết quả

thấy rằng một liều CVD 103 duy nhất đã bảo vệ được 80% trường hợp không có xảy ra Ïa chảy,-và 94% không có ỉa chảy trầm trọng: - ~

Về sau, chủng CVD 103 đã được sửa đổi lại: gài thêm một gen mã hóa tính kháng thủy ngân vào vị trí hlyA của nhiễm sắc, do đó tên chủng này cũng được sửa là CVD 103-HgR Dấu ấn kháng thủy ngân này giúp để phân biệt với những chúng vi khuẩn tả hoang dại CVD 103-HgR đông khô được thử

trên 90 người tình nguyện ở Mỹ, với liều 5x10Ê và 5x10” vi khuẩn sống

Không có phản ứng gì đáng kể, chỉ có 3 người tình nguyện có phân lỏng `

Hiệu giá kháng thể huyết thanh diệt khuẩn tăng trong 91% các trường hợp, hiệu giá này tăng 3-4 bậc cao hơn hiệu giá của những người uống 3 liều WC/BS Điều đáng chú ý là chỉ thấy 30% trỨờng hop dao thai CVD 103

HgR qua phân (trong khi đó tỷ lệ đào thải CVD là 91%) Qua thí nghiệm

trên người tình nguyện uống 1 liều CVD-HgR, 65% có miễn dịch bảo vệ

chống thử thách gây bệnh với V cholerae 01 EI Tor Inaba (khac typ sinh học)

Sau đó, tại Thái Lan cũng có thí nghiệm CVD-HgR trên người tình nguyện:

12 người uống một liều 5x 108 không thấy có phản ứng, và 11/12 người có

tăng hiệu kháng thể huyết thanh diệt Vibrio, và 9/12 người có tăng hiệu giá

kháng thể huyết thanh kháng độc tố Tuy nhiên, trong những thí nghiệm

tương tự tiếp theo với một số lớn tân binh, kết quả huyết thanh học kém

hơn thế nhiều Có lẽ do quá trình đông khô vắcxin đã làm chết nhiều vi khuẩn Một thực địa để đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin này đang được tiến hành tại Jakarta, và tới cuối năm 1996 sẽ có tổng kết

Những vắcxin lai tạo

Đó là trường hợp vắcxin tả lai (của Trưởng Đại học Adelaide) : “cài” các gen mã hóa sự tổng hợp các kháng nguyên LPS của V.cholerae trên bề mặt của chủng S Ty21a sống Chủng lai này đã được thử trên 500 người tình nguyện Nhận xét đầu tiên là chỉ có xảy ra rất ít phản ứng phụ Cho

người tình nguyện uống 3 liều 2x 109 vị khuẩn sống, thấy 50% có đáp ứng kháng thể với LPS của V cholerae 01 và 35% có đáp ứng kháng thể diệt Vibrio Trong thí nghiệm có thử thách, cho người tình nguyện uống 3 liều 10?! vi khuẩn đông khô, nhưng chỉ bảo vệ được có 25% số người không

mắc bệnh tả, tuy nhiên những trường hợp mắc bệnh tả thì nhẹ hơn nhiều

so với đối chứng °

Những nghiên cứu kể trên đã mở ra một hướng tìm tòi các vắcxin lai, và

như vậy chỉ cần tuyển lựa được một vi khuẩn vận tải an toàn để có khả năng chế tạo được nhiều vắcxin dự phòng các bệnh nhiễm khuẩn khác ở

niêm mạc ruột Tuy nhiên, một số câu hỏi cần được giải đáp: (1) liệu có một

vi khuẩn vận tải nào có hiệu năng hơn Ty21a, mà lại an toàn? (2) Làm cách nào “cai” được những gen mã hóa các kháng nguyên cần thiết, để

4

tải có thể được dùng nhiều lần để đưa vào một cơ thể các kháng nguyên

khác nhau được không?

Vắcxin tả thích hợp cho Việt Nam

Đối với Việt Nam vắcxin tả nào thích hợp? Vắcxin lý tưởng, để có thể dùng

ở quy mô lớn, phải là một vắc xin an toàn và có mức độ hiệu lực có thể

chấp nhận được ngoài ra nhất thiết phải không có giá thành cao, có thể

sản xuất được ở quy mô lớn với công nghệ không quá phức tạp, có tính bền

vững qua quá trình bảo quản và vận chuyển, và dễ sử dụng Một vắcxin lý tưởng như vậy hiện nay không có được, nhưng vắcxin WC (vắcxin chết, toàn tế bào) rất đáng được chú ý, vì nó có thể đáp ứng một số những yêu cầu nói trên (4)

ill CÁC NỘI DỤNG NGHIÊN CỨU

Phần thứ nhất

BỔ SUNG CÁC KHÁNG NGUYÊN CẦN THIẾT

I CO SG CUA VAN DE:

_ Các kháng nguyên đồng điều hòa độc tố ( TCP : toxin coregulated pilus)

và ngưng kết hồng cầu nhay cam D-mannose ( MSHA: D-mannose-

sensitive haemagglutinin) la cần thiết để vắc xin đạt được khả năng sinh miễn dịch đặc hiệu cao phòng chống bệnh tả Ngoài ra, hàm lượng kháng nguyên LPS (lipopolysaccharide) cũng cần có trong vác xin ở mức độ đầy

đủ, để hiệu lực bảo vệ được chắc chắn (6, 9, 10)

Vắcxin chết, toàn tế bào , đã được thí nghiệm tại thực địa Bangladesh, và

đã được sản xuất tại nước ta, cần được bổ xung những kháng nguyên cần

thiết nói trên

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:

2.1 Các chủng vi khuẩn thí nghiệm :

- V cholerae 01 569 B, typ sinh học cổ điển, typ huyết thanh Inaba

~ V cholerae 01 Cairo 50,typ sinh học cổ điển, typ huyết thanh Ogawa,

- V cholerae 01 Phil 6973, typ sinh học EI Tor, typ huyét hanh Inaba, Các chúng nói trên nhận từ Trường Đại Học Goteborg, Thụy Điển

2.2 Nuôi cấy :

Môi trường IVAC va AKI ( 7, 14) nuôi cấy trên nồi lên men CHEMAP 75 lít

và 300 lít, ở các nhiệt độ từ 27 đến 30°C trong 16-20 giờ Gặt bằng li tâm, điều cHỉnh để có đậm độ 100 tỉ vi khuẩn/mI Nuôi cấy 12 loạt liên tiếp 2.3 Phương pháp kiểm tra :

Kiểm tra các kháng nguyên LPS và TCP bằng phương pháp ELISA cạnh tranh, kiểm tra kháng nguyên MSHA bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu thụ động, theo thường qui của trương Đại Học Goteborg (8)

2.3.1 Phương pháp định lượng LPS có trong vắc xin bằng kỹ thuật ELISA

Gắn 100 ni LPS của V cholerae Inaba 569B vào các giếng của bản nhựa

polystyren số 1 với nồng độ 25 ug/ml pha trong PBS Để ở nhiệt độ phòng

qua đêm

Trên bản nhựa số 2, sau khi Ủ 30 phút với BSA 1% ở 37°C, cho 60 uÌ BSA

1% pha trong PBS, sau đó cho 30 ni mẫu vắc xin thử vào giếng đầu tiên trong hàng Trộn đều và hút chuyển 30 ul sang giếng thứ hai, tiếp tục hút

chuyển pha loãng bậc 3 cho tới hàng G của bản nhựa Riêng hàng H chỉ cho đệm BSA-PBS 1% Sau đó, cho 60 ul vào mỗi giếng kháng thể đơn clén tu chuột khang LPS (Mab 8:4 880950) pha loãng 1/160 trong BSA- PBS 1% theo thứ tự đi từ hàng H trở lên Đập nắp kín vừa lắc vừa ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng Rửa bản số 1 ba lần với PBS Sau đó ủ bản này 200

ul/giéng BSA-PBS 1% 37°C trong 30 phút Rửa 1 lần: với PBS-Tween

0,05%

Chuyển 100 „i từ mỗi giếng của bản nhựa số 2 sang bản nhựa số 1, bắt đầu từ hàng H Ủ ở nhiệt độ phòng 90 phút, không lắc Rửa 3 lần với PBS- Tween Sau đó, cho 100 kị cộng hợp enzym lg peroxydaza kháng chuột (Jackson No 115 035068, lot 10538) pha loãng1/2000 trong BSA-PBS 1%

Ủ 90 phút ở nhiệt độ phòng Rửa 3 lần với PBS - Tween

Cho 100 ul orthophenylen diamin pha trong dém citrat natri 0,1M, pH 4,5 có

thêm 4 ul HeO2 30% DE G nhiét dé phéng 20 phút, đọc kết quả trên máy Titertex Muitiskan budc sóng 450 nm Kết quả dựa theo 50 % nồng độ bị ức chế của kháng thể kháng LPS kháng lại LPS chuẩn Theo tiêu chuẩn quốc

tế, một vắc xin có chất lượng tốt cần có nồng độ từ 500 - 1300 đơn vị (EU)

2.3.2 Phương pháp định lượng Tcp trong vắc xin bằng kỹ thuật ELISA cạnh

tranh: :

Gan vào bản nhya 50 wl/giéng vi khudn ta co Top [chủng JS 1569 (pJS

752-3) moc ở mơi trường AKi, 30°C] với nồng độ 10! vị khuẩn/mi đã xử lý glutaraldehyd Sau đĩ, mỗi giếng được ủ BSA 1% pha trong PBS 30 phút, 37°C Sau khi rửa 3 lần với PBS - Tween, cho 25 ul mau vắc xin thử vào giếng đầu của hàng A, trộn đều và hút chuyển 25 mi sang hàng thứ hai và tiếp tục cho đến hàng G, riêng hàng H-cho đệm Trộn đều và ủ ở nhiệt độ phịng 90 phút Rửa 3 lần với PBS - Tween Cho kháng thé don clon tu

chuột (Mab Tc 20:2) pha lỗng 1/400 trong BSA-PBS 0,1% Ủ nhiệt độ

phịng qua đêm Cho 100 kí cộng hợp enym phosphataza kiềm lgG+lgM (Jackson, West Grave, Pennsyivania), pha lỗng 1/3000 trong BSA-PBS- Tween Ủ 90 phút ở nhiệt độ phịng Sau khi rửa 3 lần như trên, cho cơ chất nitrophenyl phosphat (Sigma, St Louis, Missouri) Đọc kết quả trên máy

Titertex Multiskan, bước sĩng 405 nm Kết quả dựa vào độ ức chế 50% của kháng thể kháng TCP với kháng nguyên chuẩn

Theo tiêu chuẩn quốc tế, một vắc xin cĩ chất lượng tốt phải cĩ hàm lượng TCP tối thiểu là 1:150

2.3.3 Phương pháp định lượng kháng nguyên MSHA trong vắc xin:

Vắc xin thử được pha lỗng bậc hai, 25 HÍ vắc xin vào mỗi giếng của bản

nhựa sau khi pha lỗng (từ 1/2 đến 1/1624 hoặc hơn) Sau đĩ, cho vào mỗi giếng 25 ui hồng cầu 1% (chú ý: thử hồng cầu gà với chủng EI Tọ, hồng cầu người với chủng tả cổ điển) Mỗi bản cĩ một giếng chỉ cĩ hồng cầu và đệm để làm chứng Sau đĩ, ủ bản ở nhiệt độ phịng từ 30 - 60 phút Kết quả dương tính khi hồng cầu bị tan đều trong giếng, âm tính khi hồng cầu lắng thành một điểm ở đáy giếng

Theo tiêu chuẩn quốc tế vắc xin tốt cĩ hàm lượng kháng nguyên MSHA từ

Phần thứ hai

SAN XUAT VẮCXIN TẢ Ở QUI MO BAN CÔNG NGHIỆP

I CƠ SỞ CỦA VẤN ĐỀ

Vắcxin tả đã được sản xuất ở qui mô phòng thí nghiệm từ,vài năm nay, với

sản lượng không quá 150.000 liều/năm Số lượng~ này quá nhỏ, không đáp

ứng được nhu cầu sử dụng vắcxin dự phòng trong y tế công cộng, không

đủ ngay cả để tiến hành một thực địa lớn

Phương pháp nuôi cấy tĩnh ở phòng thí nghiệm không đạt một số yêu cầu

kỹ thuật của vắcxin này, nhất là việc sản xuất các kháng nguyên TCP và

MSHA cũng như việc tăng cường hàm lượng kháng nguyên LPS

Vĩ vậy, xây dựng một công nghệ sản xuất vắcxin này ở qui mô bán công nghiệp, với thiết bị hiện có, là cần thiết Công tác này được thực hiện tại Viện Vắcxin và các chế phẩm sinh học, Nha Trang-Đà lạt (11, 14)

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:

« V.cholerae 01 589B cổ điển, Inaba

* V.cholerae 01 Cairo 50, cé điển, Ogawa

* V.cholerae 01 Phil 6973 EI Tor, Inaba

Các chủng nói trên nhận được từ Trường Đại hoc Goteborg, Thụy Điển

Sinh khối được bất hoạt bằng nhiệt (60°C/1 giờ) hoặc formalin 0,025 Múit 2.4 Kiểm tra:

« Kiểm tra nồng độ vi khuẩn bằng quang kế Spectronic - 20

« Kiểm tra kết quả bất hoạt trên các môi trường Thạch máu, Pepton kiềm

và TCBS

«Kiểm tra tính an toàn bằng thí nghiệm tăng trọng chuột nhắt, theo thường

» Kiểm tra các kháng nguyên LPS, TCP và MSHA, theo thường quy của Trường Đại Học Goteborg (8)

2.3.1 Phương pháp định lượng LPS có trong vắc xin bằng kỹ thuật ELISA

cạnh tranh:

Gắn 100 ul LPS của V cholerae Inaba 569B vào các giếng của bản nhựa

polystyren số 1 với nồng độ 25 ug/ml pha trong PBS Để ở nhiệt độ phòng

Trên bản nhựa số 2, sau khi ủ 30 phút với BSA 1% & 37°C, cho 60 ul BSA

1% pha trong PBS, sau đó cho 30 ul mau vắc xin thử vào giếng đầu tiên trong hàng Trộn đều và hút chuyển 30 ul sang giếng thứ hai, tiếp tục hút

chuyển pha loãng bậc 3 cho tới hàng G của bản nhựa Riêng hàng H chỉ

cho đệm BSA-PBS 1% Sau đó, cho 60 ui vào mỗi giếng kháng thể đơn

ciôn từ chuột kháng LPS (Mab 8:4 880950) pha loãng 1/160 trong BSA-

PBS 1% theo thứ tự đi từ hàng H trở lên Đập nắp kín vừa lắc vừa ủ 1 giờ ở

- nhiệt độ phòng Rửa bản số 1 ba lần với PBS Sau đó ủ bản này 200

Hl/giếng BSA-PBS 1% 37°C trong 30 phút Rửa 1 tần với PBS-Tween

Ủ 90 phút ở nhiệt độ phòng Rửa 3 lần vdi PBS - Tween

Cho 100 kì orthophenylen điamin pha trong đệm citrat natri 0,1M, pH 3,5 có

thêm 4 uị HaOz 30% Để ở nhiệt độ phòng 20 phút, đọc kết quả trên máy

Titertex Multiskan bước sóng 450 nm Kết quả dựa theo 50 % nồng độ bị ức

chế của kháng thể kháng LPS kháng lại LPS chuẩn Theo tiêu chuẩn quốc

tế, một vắc xin có chất lượng tốt cần có nồng độ từ 500 - 1300 đơn vị (EU)

phòng 90 phút Rửa 3 lần với PBS - Tween Cho kháng thể đơn clôn từ chuột (Mab Tc 20:2) pha loãng 1/400 trong BSA-PBS 0,1% Ủ nhiệt độ phòng qua đêm Cho 100 uÍ cộng hợp enym phosphataza kiềm lgG+lgM (Jackson, West Grove, Pennsylvania), pha loãng 1/3000 trong BSA-PBS-

_`_Tween Ủ 90 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi rửa 3 lần như trên, cho cơ chất

nitrophenyl phosphat (Sigma, St Louis, Missouri) Doc két qua tran may

Titertex Multiskan, bước-sóng 405 nm Kết quả dựa vào độ ức chế 50% của kháng thể kháng TCP với kháng nguyên chuẩn

Theo tiêu chuẩn quốc tế, một vắc xin có chất lượng tốt phải cớ hàm lượng

TCP tối thiểu là 1:150

2.3.3 Phương pháp định lượng kháng nguyên MSHA trong vắc xin:

Vắc xin thử được pha loãng bậc hai, 25 uÌ vắc xin vào mỗi giếng của bản

nhựa sau khi pha loãng (từ 1/2 đến 1/1624 hoặc hơn) Sau đó, cho vào mỗi

giếng 25 uÍ hồng cầu 1% (chú ý: thử hồng cầu gà với chủng EI Tor, hồng cầu người với chủng tả cổ điển) Mỗi bản có một giếng chỉ có hồng cầu và đệm để làm chứng Sau đó, ủ bản ở nhiệt độ phòng từ 30 - 60 phút Kết quả dương tính khi hồng cầu bị tan đều trong giếng, âm tính khi hồng cầu lắng thành một điểm ở đáy giếng

Theo tiêu chuẩn quốc tế vắc xin tốt có hàm lượng kháng nguyên MSHA từ

1/8 trở lên

Các loại kháng nguyên được kiểm tra chất lượng song song tại Viện Vệ

Sing Dịch Tễ Học, Hà nội, và Viện Vi Sinh Y Học và Miễn Dịch Học

3 KET QUA

Dựa trên kết quả sản xuất của 7 loạt có kết quả tốt nhất, công nghệ sản

xuất vắcxin tả ở qui mô bán công nghiệp được xây dựng như sau (11):

- Bất hoạt: nhiệt độ 60°C/1 giờ đối với chủng Cairo 50; formalin 0,025 MMit

3.3 Kiểm tra nồng độ vi khuẩn:

Sau thời gian nuôi cấy theo số đo nói trên, các chủng V cholerae đạt trung bình 25-30 ti/ml

Kiém tra két qua bat hoat:

Các phương pháp bất hoạt bằng nhiệt độ và formalin đều đạt yêu cau Kiểm tra tính an toàn:

Các nhóm chuột nhắt thí nghiệm đều đạt tỉ lệ tăng trọng 85-90% (tiêư

chuẩn tối thiểu của TCYTTG là 60%)

Kiểm tra các kháng nguyên:

e Hiệu giá kháng nguyên LPS đạt trung bình 640 đơn vị quốc tế (tiêu chuẩn quốc tế là 500 đơn vị)

« Hiệu giá kháng nguyên TGQP đạt trung bình 1:570 đơn vị quốc tế (tiêu

chuẩn quốc tế là 1:150 đơn vị)

° Hiéu gia kháng nguyên MSHA đạt trung bình 1:4 đơn vi quốc tế (tiêu

chuẩn quốc tế là 1:8 đơn vị)

4 BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN

Trên cơ sở.thiết bị sắn có, đã xây dựng qui trình sản xuất vắcxin tả ở qui

mô bán công nghiệp, với những thông số thích hợp Qui trình công nghệ nay cho phép sản xuất hàng năm từ 450.000 liều (1992) đến 500.000 liều (1993) Sản lượng này có được do sản xuất trên thiết bị cỡ trung bình, sản xuất xen kẽ với các vắcxin khác (khoảng 1:6 thời gian) Nếu có thiết bị riêng hoặc nồi lên men cỡ lớn hơn, có thể đạt mức sản xuất gấp 6 đến 10 lần hơn, đủ cho nhu cầu dự phòng bệnh tả trong cả nước

Phần thứ ba

NHẬN XÉT HIỆU LỰC BẢO VE CUA VĂCXIN TẢ ˆ

TẠI THỰC ĐỊA HUẾ

_1 CƠ SỞ CỦA VẤN ĐỀ

Vắcxin chết toàn tế bào gồm Vibrio cholerae 01 týp sinh học cổ điển và EI Tor, gây miễn dịch bằng lối uống đã được thí nghiệm trên thực địa Bangladesh Kết quả sau 3 năm theo dõi thấy tỷ lệ bảo vệ là 52% (1) Vắcxin chế tạo tại nước ta có bổ sung thêm kháng nguyên TCP, và tăng

Cường hàm lượng kháng nguyên LPS đã được thí nghiệm tại thực địa Huế Nhận xét sơ bộ về hiệu lực bảo vệ của văcxin này được ghi lại sau 1 năm theo dõi

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thực địa:

Thành phố Huế thuộc tỉnh Thừa Thiên - Huế ở miền Trung Việt Nam có số

dân 266.000 người sống tại 23 xã phường Điều kiện khí hậu của Huế khá khắc nghiệt, mùa khô trời nắng nóng, nhiệt độ 38°C-39°C gây khô hạn kéo dài, mùa mưa lụt bão liên miên, nhiều sông ngòi, hồ ao làm cho tình trạng

ngập lụt nặng nê Chỉ có khoảng 40% dân được dùng nudc-may do nhà

máy nước Huế cung cấp với số iượng khoảng 40lit/ngudi/ngay Dan co tap quán ăn hải sản nấu không chín và uống nước lã, nước đá, nước giải khát

không đủ tiêu chuẩn vệ sinh Tử năm 1980 đến nay, ở Huế đã xảy ra 6 vụ dịch tả lớn vào các mùa hè (tháng 5 - tháng 8)

Dịch thường kéo dài, tốc độ lây lan ra các huyện trong toàn tỉnh nhanh gây

nhiều thiệt hại và lo lắng trong nhân dân

Thanh phé Huế là vùng lưu hành dịch tả, có số trường hợp mắc tâ trung bình qua các vụ dịch là 23,37/10.000 dan, thường chiếm gần 50% số trường hợp mắc tả trong toàn tỉnh Thừa thiên - Huế Hệ thống y tế xã,

phường có bác sĩ làm việc, nhiều bệnh viện có labo thuận tiện cho việc giám sát bệnh tả Dân cư sống khá tập trurig thuận tiện cho việc theo dõi

và dễ dàng lựa chọn các hộ gia đình cho thử nghiệm Nhân dân và chính quyền địa phương sẵn sàng cộng tác thực hiện

Chọn mẫu:

Dựa vào tỷ lệ mắc trung bình của bệnh tả :trên 10.000 dân là 23%00, căn

cứ hiệu lực vắcxin WC của kết quả nghiên cứu tại Bangladesh là trên 50%

Cỡ mẫu được chọn giữa 2 nhóm uống và không uống để tính hiệu lực