ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG CÂY ỚT VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM GÂY BỆNH HÉO XANH VÀ NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH HÉO RŨ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Phòng trừ sinh học là một trong những chiến lược quan trọng để phòng trừ bệnh có nguồn gốc từ đất. Trong đó, nhóm vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng (plant growth promoting rhizobacteria = PGPR), nhất là nhóm vi khuẩn phát huỳnh quang Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn Bacillus subtilis…được chú ý khai thác và có nhiều ứng dụng trong sản suất (Nelson, 2004). Vì vậy đề tài: “ Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng cây ớt và khả năng đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum, nấm Fusarium oxysporrum của một số chủng PGPR trong điều kiện phòng thí nghiệm”, là việc làm cần thiết.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

  

HUỲNH THỊ NGỌC HÂN

ĐỀ TÀI

“ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG CÂY ỚT

VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM GÂY BỆNH HÉO XANH VÀ NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY

BỆNH HÉO RŨ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ

TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM.”

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

Tháng 05/2008

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ớt cay (Capsicum frutescens L., thuộc họ Cà Solanaceae) là loại rau gia vị

gần như không thể thiếu trong bửa ăn hằng ngày của mỗi gia đình Việt Nam, với tiềm năng xuất khẩu hiện nay, ớt là loại cây đang được chú ý phát triển nhiều nơi

ở ĐBSCL Tuy nhiên việc canh tác ớt thường gặp nhiều khó khăn, một trong các

nguyên nhân là bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum và bệnh héo

rũ do nấm Fusarium oxysporum gây hại, làm ảnh hưởng đến phẩm chất, năng suất và hiệu quả canh tác Bệnh do vi khuẩn R solanacearum là loại bệnh hại

quan trọng cho nhiều loại cây trồng ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và những vùng có khí hậu ấm áp trên thế giới (Brabury, 1986), trong đó Việt nam là một

trong các vùng phân bố chính (CMI, 1977) Bên cạnh đó, bệnh do nấm Fusarium oxysporum cũng là tác nhân gây hại nghiêm trọng cho các loài cây trồng cạn: ớt,

cà chua, khoai tây, thuốc lá…Bệnh này xảy ra nơi đất ẩm và sử dụng nguồn phân hữu cơ chưa hoai mục (Mai Văn Quyền, ctv., 1995) Việc phòng trị chúng thường rất khó khăn do vi khuẩn, nấm có phạm vi ký sinh và hoại sinh nên lưu tồn rất hữu hiệu trong đất (Đỗ Tấn Dũng, 2001) Từ xưa đến nay, người trồng rau luôn dựa vào thuốc hóa học với liều lượng cao để phòng trừ, nhưng hiệu quả mang lại thường không như mong muốn, ngoài ra việc luân canh cây trồng khác

họ, chọn giống kháng, sử dụng gốc ghép tốn nhiều chi phí nhưng không được áp dụng rộng rãi

Phòng trừ sinh học là một trong những chiến lược quan trọng để phòng trừ bệnh có nguồn gốc từ đất Trong đó, nhóm vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng (plant growth - promoting rhizobacteria = PGPR), nhất là nhóm vi khuẩn

phát huỳnh quang Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn Bacillus subtilis…được

chú ý khai thác và có nhiều ứng dụng trong sản suất (Nelson, 2004)

Vì vậy đề tài: “ Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng cây ớt và khả

năng đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum, nấm Fusarium oxysporrum của một số chủng PGPR trong điều kiện phòng thí nghiệm”, là việc

làm cần thiết

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC TÍNH THỰC VẬT CỦA CÂY ỚT

Tên tiếng Anh: Pepper

Tên khoa học: Capsicum frutescens L thuộc họ cà solanaceae

Cây ớt là cây hằng niên nhưng trong điều kiện tối hảo nhất định nào đó cây ớt có thể là cây nhiều năm

Một số đặc điểm của cây ớt có liên quan đến một số vi sinh vật trong đất

đã được ghi nhận như sau:

1.1.1 Rễ

Ban đầu cây ớt có rễ cọc phát triển mạnh với rất nhiều rễ phụ Do việc cấy chuyển rễ cọc chính đứt một hệ rễ chùm khoẻ phát triển, vì thế nhiều khi lầm tưởng ớt có hệ rễ chùm (Mai Phương Anh, 1997)

Nhờ đặc tính rễ phân nhánh mạnh và cây phát triển thành rễ chùm do đó

rễ phân bố trong vùng đất cày là chính (Trần Thị Ba và ctv., 1999)

Củng có một số giống trồng phổ biến ở miền trung là Sừng Bò, Chìa Vôi

ở ĐBSCL có giống Sừng trâu, Chỉ Thiên Viện nghiên cứu Nông Nghiệp Hà Nội công bố bộ sưu tập với 117 giống nội địa (1987), điều này chứng minh nguồn gốc giống ớt rất phong phú, đa dạng chưa được biết đến ở nước ta

Ngày nay qua quá trình lai tạo có một số giống ớt lai F1 đã tỏ ra thích nghi với việc đa canh tác ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) như giống ớt cay

số 20

Giống trồng trong sản xuất hiện nay phần lớn là giống lai F1 Hầu hết giống được nhập từ các nước Đài Loan, Trung Quốc, Ấn Độ

1.2 MỘT SỐ BỆNH HẠI QUAN TRỌNG TRÊN ỚT

Theo Trần Thị Ba và ctv (1999), thì ớt có một số loại sâu bệnh hại quan trọng như sau:

Bệnh héo vi khuẩn (Bacterial wilt) do vi khuẩn Ralstonia solanacearum

gây ra Vi khuẩn gây hại mạnh trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao Vi khuẩn

có ký chủ rộng rãi trong 25 họ thực vật, trong đó có nhiều loại cây trồng như: ớt,

cà chua, khoai tây, thuốc lá, cà tím, đậu phộng, chuối, đậu nành , sự thiệt hại do

vi khuẩn gây ra không thể nào tính toán được

Thường cây bị héo chết nhanh không kịp vàng do đó còn gọi là bệnh héo xanh (tươi), hệ thống mạch dẫn hoá nâu và sự phát triển rễ bất định dọc theo thân

có thể gia tăng trên cây bệnh Cắt ngang thân cây bệnh dịch nhớt có thể tiết ra từ

bó mach và nếu nhúng mặt cắt vào trong nước vài phút, dòng vi khuẩn màu trắng sữa sẽ tuôn chảy ra từ mặt cắt Bệnh không gây đốm trên trái và lá

Vi khuẩn ở trong đất (Soil - borne pathogen) do đó khó phòng trừ Phương pháp hữu hiệu nhất là trồng giống kháng tuy nhiên do vi khuẩn có nhiều dòng gây hại nên khả năng kháng của giống thay đổi theo điều kiện môi trường

Bệnh héo Fusarium do nấm Fusarium oxysporum f.sp lycopersici Lá

cây bị bệnh trở nên vàng, cây héo từ từ, triệu chứng héo bắt đầu từ lá bên dưới hay một nhánh của cây Bó mạch cây cũng hoá nâu đậm, hệ thống rễ cũng bị nhiễm nhưng không thối rữa Hai dòng sinh lý (race 1 và 2) của nấm được phân biệt tuỳ theo cách gây hại trên cây Phương pháp sử dụng giống kháng là phương pháp phòng trừ có ý nghĩa thực tiễn

Bệnh thối cây con do nấm Rhizoctonia solani tấn công ở cổ thân làm gốc

thân teo lại, thối đen Bệnh gây hại cây con trong vườn ươm và cây ngoài đồng (30 ngày sau khi cấy)

Bệnh đen trái do nấm Colletotrichum sp có 4 loài Colletotrichum được

tìm thấy trên ớt là C gllesporiodes, C capsici (2 loài quan trọng nhất), C acertatum và C coccodes Vết bệnh có kích thước 2 - 3 cm gây hại chủ yếu trên

trái làm mất thương phẩm Ở ĐBSCL nhất là các tháng 7, 8, 9 dương lịch Nấm bệnh tồn tại rất lâu trong đất, trên cây và trong hạt cây bệnh Tuy nhiên, bệnh khó phòng trị trong mùa mưa và bệnh chỉ xuất hiện rất trễ khi trái chín Hiện nay biện pháp dung giống kháng ớt hiểm để trồng trong mùa mưa là kinh tế nhất

Bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans Mont Nấm có thể gây

bệnh ở tất cả các bộ phận trên cây Ban đầu bệnh thường xuất hiện trên lá, sau đó lan khắp toàn cây thối nhũn, gặp thời tiết nắng cây bệnh chuyển thành khô giòn

và gẫy Hoa bị bệnh chuyển thành màu nâu và rụng Bệnh thường xuất hiện khi ban đêm có nhiều sương

Bệnh virus trên ớt giống như cà chua có khoảng 35 loài virus gây hại trên

cà được tìm thấy (Green và Kim 1998, Martelli; Quacquarelli, 1983), trong đó

có các bệnh quan trọng như sau:

TMV (Tomato mosaic virus) có nhiều dạng gây hại trên cà chua và làm thiệt hại năng suất 20 - 30% đôi khi đến 50% Bệnh làm mất màu lá, làm lá xanh vàng loan lỗ (mosaic), lá méo mó (leaf distortion) hay nhăn nheo (leaf punckering) Giống kháng mang gen Tm1, Tm2 được bán rộng rãi trên thị trường

CMV (Cucumber mosaic virus) được truyền chủ yếu bởi rầy Aphis gossypii và Myzus persicae Triệu chứng nhận diện CMV làm phiến lá nhỏ như

sợi chỉ (fern leaf) CMV cũng có nhiều dòng gây bệnh khác nhau như CMV -

RNAL, 2, 3, 4 và CMV - S (South African strain)

Nhiều loại khác cũng được ghi nhận gây hại trên cà chua như TSWV (Tomato spotted wilt virus) làm nghẽn mạch, hoại tử trên thân trái, gây héo chết cây TYDV (Tomato Yellow dwarf virus), làm vảnh và vặn vẹo Hiện nay chỉ có

thể dùng giống kháng, nhổ bỏ cây bệnh và diệt tác nhân truyền bệnh để ngừa virus

Bệnh chết nhanh (Choanephora Blight) bệnh này do nấm Choanephora

cucurbitarum gây ra Bệnh xuất hiện trên các đoạn phân cành xâm nhập và phá

huỷ các mô tế bào bên trong và lan dần lên phần trên của thân cây gây triệu chứng chết từng nhánh cây

1.3 BỆNH HÉO XANH DO VI KHUẨN

Do loài vi khuẩn Pseudomonas solanacearum Smith hay Ralstonia solanacearum Smith, 1896, Yabuuchi và ctv (1996), (trích Nguyễn Văn Viên,

Đỗ Tấn Dũng, 2003)

Đây là nhóm bệnh có tính phổ biến cục bộ giới hạn bởi vùng cây ký chủ, vùng khí hậu, địa lý đất đai Trong đó có các loài ưa nóng phổ biến chủ yếu ở

vùng nhiệt đới, á nhiệt đới như Pseudomonas solanacearum gây héo xanh ớt, cà

chua, các loại cây trồng cạn khác (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

1.3.1 Triệu chứng & chẩn đoán

Bệnh héo xanh trên ớt cũng như ở cà chua xuất hiện, gây hại ở giai đoạn cây con vườn ươm và giai đoạn ruộng trồng ngoài sản xuất, bệnh thường phát sinh và gây hại nặng khi cây đã lớn nhất là giai đoạn hình thành trái non - quả già thu hoạch (Nguyễn Văn Viên và ctv., 2003)

Bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây họ cà, họ đậu , xâm hại chủ yếu hệ thống mạch dẫn thân rễ, cành, lá phá huỷ bít tắc bó mạch dẫn trở thành nâu, đen gây cản trở sự vận chuyển nước, chất dinh dưỡng làm cây héo rũ nhanh chóng một số lá, cành sau toàn cây héo rũ và chết khô (Lê Lương Tề - Vũ Triệu Mân, 1999)

Theo Phạm Hoàng Oanh (2001), bệnh héo xanh trên cây ớt xảy ra rải rác trên từng cây hoặc từng nhóm cây ở giữa ruộng Triệu chứng đầu tiên trên cây già là các lá bên dưới bị héo nhẹ, ở cây con thì các lá non bị héo trước, sau và ngày cây bất thình lình héo nhưng lá không vàng

Nguyễn Văn Viên và Đỗ Tấn Dũng (2003), quan sát những cây bị nhiễm bệnh ở phần gốc sát mặt đất vỏ thân sù sì, đó là nét đặc trưng của bệnh héo xanh

vi khuẩn Nếu bệnh phát hiện chậm thì có nhiều rễ bất định xuất hiện trên thân gần gốc

Chẻ thân ở phần gốc gần rễ ta thấy các mạch nhựa biến thành màu xám đất đến nâu, nên nhúng phần bị cắt vào nước ta thấy dòng vi khuẩn tuôn ra có màu trắng sữa Đây là phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh héo xanh do vi khuẩn gây ra

Theo Lê Lương Tề và ctv (1999), bệnh càng nặng nếu trồng độc canh cây

ớt hoặc kế tiếp với các loài cây trồng cạn là những cây ký chủ của bệnh và trên đất cát nhẹ có nhiễm nhiều tuyến trùng

1.3.2 Phân loại hình thái và đặc điểm khuẩn lạc

Vi khuẩn có hình que, 2 đầu hơi tròn, ngắn, có 1 - 3 chiên mao ở đỉnh đầu Trên môi trường nhân tạo, khuẩn lạc có màu trắng kem, thời gian sau đó có màu nâu đỏ, kích thước 0,4 - 0,8 m (Lê Lương Tề, 2002)

Loài vi khuẩn Pseudomonas solanacearum phân hoá thành nhiều races

biovars khác nhau tuỳ theo loài cây ký chủ, vùng địa lý đặc điểm sinh thái, tính độc gây bệnh Cho đến nay dựa trên 2 cơ sở phân loại khác nhau để phân loại chúng:

Các pathovars, các races (chủng, nhóm nòi) phân định trên cơ sở phổ cây

ký chủ của chúng và vùng địa lý phân bố (Buddenhagen, 1962)

Race 1: có phổ ký chủ rộng, các cây họ cà, họ đậu (ớt, cà chua, khoai tây, lạc ) phân bố ở các vùng đất thấp, nhiệt đới cận nhiệt đối (Biovar1, 3 và 4)

Race 2: gây bệnh trên chuối (tam bội) Heliconia, phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, Châu Á (Biovar 3 và 2)

Race 3: chủ yếu hại khoai tây (ớt, cà chua) phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt

độ thấp hơn vùng đất núi cao nhiệt đới, cận nhiệt đới (Biovar 2)

Race4: hại trên cây gừng (Philippin) (Biovar 3 và 4)

Race 5: hại trên cây dâu tằm (Trung Quốc) (Biovar 5)

Các biovar phân định trên cơ sở đặc tính sinh hoá (oxy hoá các nguồn hydrate carbon gồm 3 loại đường lactose, maltose, cellobiose và 3 loại rượu mannitol, dulcitol, sorbitol (Hayward, 1964) đã xác định có 5 biovars ở các vùng trên thế giới là các biovar 1, 2, 3, 4 và 5 (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Theo Đoàn Thị Thanh và ctv (2005), dùng PCR có thể các định nhanh tác nhân gây bệnh héo xanh vi khuẩn trên mô bệnh hoặc cây nhiễm bệnh Kết hợp với sử dụng phân tích sinh hoá đã xác định rằng ở vùng ĐBSCL phổ biến và gây hại trên cây ớt, cà chua là dòng sinh học 3 và dòng sinh học 4, Race 1 của vi

khuẩn Ralstonia solanacearum Smith

Sự đa dang về tính gây bệnh

Khi phân lập 5 chủng vi khuẩn từ cây ớt, cà chua, khoai tây, lạc, thuốc lá , cây cà nhiễm bệnh héo xanh đều thể hiện tính độc và khả năng gây bệnh khác nhau trên các loài cây ký chủ của nó Tuy nhiên mỗi chủng vi khuẩn cũng thể hiện tính gây bệnh khác nhau khi lây nhiễm trên các loài cây ký chủ (Đỗ Tấn Dũng, 2002)

Dựa trên kết quả nghiên cứu của trường Đại Học Nông Nghiệp I – Hà Nội, viện nghiên cứu cây ăn quả, viện di truyền Nông Nghiệp, viện kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam trong mười năm qua đã cho thấy quần thể ký sinh của vi khuẩn gây bệnh héo xanh ở đồng bằng Sông Hồng và một số tỉnh ở Miền Bắc Việt Nam bao gồm các dòng sinh học 1, dòng sinh học 3 và dòng sinh học 4 thuộc Race 1 (theo hệ thống phân chủng (Hayward, 1964) trong đó phổ biến và chiếm ưu thế nhất là dòng sinh học 3 với dòng có tính độc cao ở vùng này là dòng BN.1 đã được sử dụng để nghiên cứu trong lây nhiễm nhân tạo đánh giá các giống kháng trong tập đoàn ớt, cà chua trong nước và nhập nội từ trung tâm rau châu Á (AVRDC) (Lê Lương Tề, 2002; trích bởi Trần Trọng Cần, 2007)

1.3.3 Đặc điểm sinh học và sinh thái học

Phạm Văn Kim (1999), nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 26

-30 0C, nhiệt độ tối thiểu là 18 oC, tối đa 37 oC, nhiệt độ làm vi khuẩn chết là 52

o

C trong 10 phút

Đỗ Tấn Dũng (2004), bệnh phát triển gây hại trong điều kiện khí hậu: gió, bão nhiều, bệnh thường phát sinh và thiệt hại nặng trên chân đất cát, đất thịt

nhẹ, đất bị nhiễm bệnh…

Theo Tạ Thu Cúc (2002), bệnh thích hợp trong phạm vi pH tương đối

rộng, độ pH phù hợp cho bệnh phát triển là 6,9 - 7,2

Vi khuẩn gây bệnh được giữ lại trong mô tế bào cây bị bệnh đến 7 tháng,

trong hạt 1 số ngày và trong đất 14 tháng Vi khuẩn sống lâu trong đất ẩm và

chóng chết hơn ở đất khô Chúng phát triển ở nhiệt độ cao cà ẩm, sau đó xâm

nhập vào mô bào cây qua những chỗ bị thương Bệnh phát triển mạnh ở 35o

C thấp nhất 15 oC cao nhất 42 oC (Đặng Thái Thuận, Võ Văn Đực, 1980)

1.3.4 Sự xâm nhiễm, phát sinh bệnh, khả năng lây lan và lưu tồn của mầm

bệnh

Theo Phạm Văn Kim (2000), héo do vi khuẩn Ralstonia solanacearum có

thể xâm nhiễm và gây hại theo 1 trong 2 cách:

Có thể các chất nhầy bên trong vi khuẩn (các polysaccharid có phân tử to

làm tăng độ nhờn của nước và muối khoáng do rễ hấp thu, từ đó làm giảm đáng

kể lượng nước và muối khoáng cung cấp cho cây và làm cho cây héo chết)

Ngoài ra do chất nhờn này là các phân tử to nên không lọt qua được lỗ

sàng trong mạch mộc, bị giữ lại nghẽn mạch mộc, từ đó nước và muối khoáng

không di chuyển được lên phía trên cung cấp đầy đủ cho phần trên của cây, cây

sẽ bị héo rồi chết vì thiếu nước

Sau khi xâm nhiễm vào vi khuẩn lan riêng theo bó mạch sinh sản phát

triển, sản sinh ra các men, độc tố dẫn đến sự phá hủy tế bào tắc nghẽn mạch dẫn

đến cản trở mạch dẫn nước, chất dinh dưỡng và nhựa cây gây héo nhanh và

chết…

Nghiên cứu về mặt sinh học phân tử cho thấy tính gây bệnh của các dòng

vi khuẩn có độc tính Pseudomonas solanacearum quyết định bởi các gen độc

hrp Những vi khuẩn này xâm nhiễm vào rễ, thân, cuống lá qua các vết thương cơ

giới do nhổ cây đem trồng, do côn trùng hoặc do tuyến trùng tạo ra, do chăm sóc

vun trồng… Vi khuẩn cũng có thể xâm nhập vào qua các lỗ hở tự nhiên, qua bì

khổng (khoai tây) Sau khi đã xâm nhập vào rễ lan tới bộ mạch dẫn xylem, sinh

sản phát triển ở đó Sản sinh ra các men pectinaza và cellulaza để phân hủy mô, sinh ra các độc tố ở dạng exopolysaccarit (EPS) và lipopolysaccaritb (LPS) bít tắc mạch dẫn cản trở sự vận chuyển nước và nhựa trong cây, dẫn tới cây héo nhanh chóng EPS được tổng hợp và nhờ có nhóm gen eps.A, eps.B và OPS (Cook, Secqueira, 1991)

Dựa trên sự nghiên cứu Đỗ Tấn Dũng (2004), thì các phương pháp lây nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn hại ớt, cà chua trong điều kiện nhân tạo thì phương pháp tiêm vào nách lá và tạo vết thương rễ sẽ cho tỷ lệ bệnh cao hơn so với phương pháp nhúng rễ và nhiễm hạt trên các giống ớt, cà chua kháng và nhiễm héo xanh vi khuẩn

Mặt khác, vi khuẩn gây bệnh là loài ký sinh đa thực với nhiều chủng nòi khác nhau, phân bố rộng, xâm nhiễm gây hại hệ thống bó mạch, mạch dẫn, truyền lan trên đồng ruộng bằng nhiều con đường khác nhau (Nguyễn Văn Viên,

Đỗ Tấn Dũng, 2003)

Bệnh héo xanh vi khuẩn lan truyền trên đồng ruộng từ cây này sang cây khác, từ ổ dịch này sang các vùng khác bằng nhiều con đường như: nước, mưa, không khí, hạt giống… Ngoài ra còn lây qua kỷ thuật chăm sóc của người dân (Nguyễn Văn Viên, 2003; Phạm Văn Kim, 1999)

Héo xanh do vi khuẩn Pseudomonas solanacearum có khả năng tồn tại lâu

dài trong đất, tàn dư thực vật, trong vật liệu giống nhiễm bệnh phổ biến là trong các cây ký chủ phụ thuộc họ cà, đậu, bầu bí…

Nguồn bệnh chủ yếu là trong đất, tàn dư, hạt giống (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

Tuy nhiên nguồn bệnh tồn tại nhiều dạng khác nhau, vi khuẩn tồn tại lâu dài trong đất, trong tài dư cây bệnh, giống nhiễm bệnh (hạt, cây giống…) và ký chủ phụ (Phạm Văn Kim, 1999)

1.3.5 Biện pháp phòng bệnh héo xanh trên ớt

Bón phân đầy đủ và cân đối N - P - K, vôi bột nhằm hạn chế nguồn bệnh

và cải tạo đất, cần nhổ bỏ cây héo xanh sớm, giảm bớt nguồn bệnh và sự lan truyền (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

Dựa trên kết quả nghiên cứu Nguyễn Văn Viên và Đỗ Tấn Dũng (2003), còn cho thấy nếu luân canh với cây trồng cạn, cây trồng là ký chủ của bệnh thì bệnh sẽ héo xanh vi khuẩn thường phát sinh nhiều và tác hại của bệnh về sau thường nặng

Theo Nguyễn Văn Viên (2003), cần phải làm tốt công tác vệ sinh đồng ruộng, thu dọn và tiêu hủy tàn dư cây bệnh, dọn sạch cỏ dại là ký chủ của mầm bệnh nhằm giảm bớt và tiêu hủy nguồn bệnh trong đất Chọn vụ gieo trồng ớt phù hợp với điều kiện khí hậu và đất đai, mật độ vừa phải, lên luống cao, dễ thoát nước, cần bón phân hữu cơ đã ủ oai mục, chế độ chăm sóc tưới nước, kỷ thuật làm giàn đúng kỷ thuật phù hợp với giai đoạn sinh trưởng của cây ớt tránh đổ ngã

Ngoài ra có thể sử dụng một số chủng của các loài vi khuẩn đối kháng như

Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens để sử lý hạt giống trước khi gieo,

nhúng rễ cây con vào vùng rễ ớt ngay sau trồng làm tăng khả năng chiếm chỗ,

cạnh tranh, ức chế và tiêu diệt loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum tác nhân

gây bệnh héo xanh

Biện pháp luân canh cây trồng là biện pháp tốt nhất là tiến hành luân canh với lúa nước trên chân đất 2 lúa 1 màu, không trồng ớt với các cây trồng cạn thuộc họ cà, đậu, ngoài ra còn luân canh với những cây không phải là ký chủ của bệnh héo xanh: ngô, mía… (Đỗ Tấn Dũng, 2004)

1.4 Bệnh héo rũ do nấm Fusarium oxysporum f.sp lycopersici

Bệnh héo rũ do nấm Fusarium còn gọi là bệnh héo vàng được mô tả đầu

tiên bởi Massee GE ở Anh năm 1895 Bệnh có ở khắp thế giới nhưng chủ yếu ở vùng nhiệt đới trong đó có Vệt Nam (trích Nguyễn Văn Viên, Đỗ Tấn Dũng,

2003)

1.4.1 Triệu chứng

Héo rũ do nấm Fusarium oxysperum f.sp lycopersici tấn công tất cả các

bộ phận và giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệt nó thể hiện rõ ở giai đoạn ra hoa, mang quả Cây trưởng thành bộ rễ và mạch dẫn cây không phục hồi được Đầu tiên là các là dưới bị biến thành màu vàng, rồi đến các lá ở trên, sau cùng toàn bộ cây héo và chết Cắt dọc gốc thân đến mô gỗ cho thấy mô bệnh mất màu

chuyển sang đỏ hoặc màu sậm Cây con nhiễm bệnh ngoài những triệu chứng trên còn bị lùn, hoặc héo có chu kỳ theo nhiệt độ trong ngày (CABI, 2003; trích bởi Nguyễn Thị Thu Hằng, 2008)

Triệu chứng sọc nâu dọc theo mạch dẫn ở rễ hoặc cổ rễ là do enzyme của mầm bệnh phá huỷ vách của mạch mộc, đồng thời oxy hóa các hợp chất phenol (do tế bào ký chủ tiết ra) Sự oxy hóa này cho phân tử màu, các phân tử màu này xâm nhập vào và nhuộm nâu các mạch mộc của ký chủ (Phạm Văn Kim, 2000)

Theo Phạm Hoàng Oanh (2001), nếu cây chết nhanh và ta quan sát ở gốc nơi mặt đất thấy thân và tóp nhỏ lại đôi khi có lớp tơ mỏng màu trắng bao phủ

do nấm Fusarium oxysporum f.sp lycopersici các lá già khi cây chết có màu

rộng, xuất hiện gây hại ở nhiều nơi nhất là vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới…

Bệnh gây hại cho sản xuất cà chua, có thể gây thất thu 100% năng suất canh tác trong điều kiện nhà kính hoặc ngoài đồng (CABI, 2003)

1.4.2 Phân loại

Nấm Fusarium oxysporum f.sp lycopersci thuộc lớp nấm bất toàn

(Deuteromycetes) Họ (Tubercularia) Bộ nấm bông (Hyphomycetabes) Ở giai

đoạn hữu tính chưa được xác định rõ ràng đối với nấm Fusarium Dựa trên một

số kết quả nghiên cứu về đặc điểm di truyền cho thấy loài này gần với nhóm

Liseola có giai đọan hữu tính Gibberella (Aseomyesta) (O’ Donnell et al., 1998;

trích dẫn bởi CABI, 2003)

Có rất nhiều môi trường đặc biệt môi trường PDA thích hợp cho nấm

Fusarium phát triển nhanh, mạnh và lấp đầy đường kính 9 cm của đĩa petri trong khoảng 7 ngày Khoanh khuẩn ty của nấm Fusarium oxysporum có màu trắng với

nhiều sắc tố khác nhau như hồng, cam, đỏ, tím, xanh tùy theo giai đoạn phát triển Nấm có khả năng sản sinh ra 3 dạng bào tử vô tính: đại bào tử, tiểu bào tử

và bào tử áo Đại bào tử có dạng hình liềm dài, vách mỏng với nhiều vách ngăn Tiểu bào tử có một tế bào dạng bầu dục được tạo ra trên từng thể bình ngắn là

điểm để phân biệt với Fusarium oxysporum Bào tử áo có vách dày, tròn hình

thành riêng rẻ hay từng cặp (CABI, 2003)

1.4.3 Đặc điểm sinh học và sinh thái học

Fusarium oxysporum f.sp lycopersici là loại nấm sống lưu tồn trong đất

dưới dạng bào tử áo trong thời gian dài Nấm có thể xâm nhiễm và ký sinh trên

mô rễ của nhiều loại cây trồng và cỏ dại Nấm có 3 nòi sinh lý trong đó nòi 1, 2

có phân bố rộng khắp thế giới (CABI, 2003)

Theo CABI (2003), thì các nghiên cứu về sinh học phân tử cho thấy nấm

Fusarium oxysporum f.sp lycopersici rất đa dạng về mặt di truyền Đa số các

dạng hình thường bao gồm các nhóm phụ khác nhau về di truyền Nấm có thể lây qua hạt chủ yếu được phát tán qua bộ phận cây nhiễm, đất, nơi có mang nguồn bệnh

Giữa các loài nấm khác nhau thì tốc độ phát triển cũng khác nhau, thậm chí những dòng khác nhau trong cùng một loài cũng có sự khác nhau khi nuôi trong cùng một nhiệt độ (Agrios, 1997)

Burgess, et al (1994), các yếu tố như hệ vi sinh vật đất, ẩm độ đất ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Fusarium Ẩm độ đất có thể ảnh hưởng trực

tiếp đến sự phát triển của mầm bệnh hay gián tiếp thông qua tính nhiễm bệnh của

cây ký chủ Ví dụ nấm Fusarium moniliform thường là nguyên nhân gây bệnh

nghiêm trọng chỉ xảy ra khi cây ký chủ bị ngập úng ở giai đoạn sinh trưởng

Phân bón ảnh hưởng đến tính độc của nấm Tính độc của nấm tăng khi bón phân vi lượng, lân, đạm amon, tính độc của nấm giảm khi bón đạm Nitrat (Jones, 1993)

Bệnh phát triển ở nơi có thời tiết ẩm, trên đất cát và đất chua Nấm tồn tại trong đất vài năm, nhiệt độ thích hợp là 28oC Bệnh thường phát sinh phát triển vào tháng 4, 5 hại cà chua (Nguyễn Văn Viên, Đỗ Tấn Dũng, 2003)

Nấm truyền lan qua hạt giống, cây con bị nhiễm trước khi trồng hoặc do

gió, nước, dụng cụ làm đất… (Dhesi, et al., 1968)

Nấm còn lưu tồn trong các cây bệnh xâm nhiễm vào rễ và qua các vết thương rồi phát triển lên thân, chủ yếu làm nghẽn sự vận chuyển nước, chất dinh dưỡng trong cây gây ra hiện tượng héo vàng (héo cây), ngoài ra còn tiết chất độc hại cây (Nguyễn Thị Nghiêm, 2001)

Một vài nghiên cứu cho thấy sự gây hại của tuyến trùng có thể giảm bớt hiệu quả của gen kháng bệnh cơ bản (major gene resistance) đối với bệnh héo

Fusarium, nhưng cũng có nhiều nghiên cứu cho thấy tuyến trùng không ảnh hưởng đến tính kháng bệnh héo Fusarium

1.4.4 Ký chủ và sự lưu tồn của nấm Fusarium

Nấm Fusarium oxysporum f.sp lycoperisici chỉ gây hại điển hình trên cây

họ cà chủ yếu là ớt, cà chua Tuy nhiên nấm cũng có khả năng xâm nhiễm và phát triển trên nhiều loại cây trồng khác như: chuối, khoai tây, hành ta…nhưng không tạo triệu chứng rõ rệt (CABI, 2003)

Theo Burgess, et al (1994), hầu hết những mầm bệnh có nguồn gốc từ đất

bị giới hạn khả năng hoạt động trong đất bởi sự cạnh tranh hay đối kháng với vi sinh vất khác Sự cạnh tranh và đối kháng này là định hướng ngăn chặn hoạt động của mầm bệnh ngoại trừ những nơi mầm bệnh có điều kiện thuận lợi trong

sự cạnh tranh

1.4.5 Biện pháp phòng trị

Thu, đốt cây bị bệnh, luân canh với cây ngũ cốc, nếu đất bị nhiễm nặng thì phải luân canh với cây không phải họ cà trong vòng 5 - 7 năm (Nguyễn Văn Viên, Đỗ Tấn Dũng, 2003)

Sử dụng giống kháng: có ít nhất 3 gen cơ bản; kháng 3 nòi đã được báo

cáo (nòi 1, 2 và 3) của chủng nấm Fusarium f sp lycopersici (CABI, 2003)

Chủ động hệ tưới tiêu, không tưới quá ẩm, trồng mật độ thích hợp đối với từng giống Bón phân cân đối và hợp lý tạo điều kiện cho cây khỏe (Nguyễn Văn Viên, Đỗ Tấn Dũng, 2003)

Nhiều nghiên cứu cho thấy có một số loại đất có khả năng ngăn chặn sự

gây hại của bệnh héo rũ do Fusarium Tác nhân kiểm soát sinh học như vi khuẩn

và chủng không gây bệnh của Fusarium hứa hẹn trong việc kiểm soát nấm gây

bệnh héo rũ (CABI, 2003)

1.5 Sự tương quan cuả các hệ vi sinh vật trong vùng rễ

Theo Phạm Văn Kim (2006), khái niệm vùng rễ (rhizosphere) là vùng bao quanh bộ rễ của thực vật, được Hiltner đề ra 1940, nhưng đến nay chúng ta cũng chưa có phương pháp thống nhất xác định phạm vi của hệ rễ Bộ rễ của cây rất phức tạp đồng thời ảnh hưởng của bộ rễ đối với môi trường xung quanh cũng thay đổi tùy theo loại cây và thời kỳ sinh trưởng của cây

Vi khuẩn vùng rễ (rhicobacteria) là những vi khuẩn sống ở vùng rễ và được định vị ở rễ cây, chúng có khả năng sinh sôi và chiếm lĩnh các ổ sinh thái, ổ

rễ vào tất cả các giai đoạn phát triển của cây Có khoảng 2 - 5 % vi khuẩn vùng

rễ, được chủng vào đất có hệ vi sinh vật cạnh tranh, biểu hiện có lợi cho sự tăng trưởng của cây được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích sự tăng trưởng cây (plant growth promoting rhizobacteria – PGPR) Ngoài ra rhizophere là thể tích bao chung quanh và chịu ảnh hưởng của hệ rễ cây, rhizoplane là diện tích mặt rễ cây

có ái lực mạnh với các phân tử đất Trong các nghiên cứu về vi sinh vật đất, thuật ngữ rhizophere bao hàm cả phần rhizoplane (Antoun và Prévost, 2005)

Vai trò của vi sinh vật vùng rễ

Vi sinh vật ở hệ rễ thực vật giữ vai trò khá quan trọng (Phạm Văn Kim, 2006)

Vi sinh vật tiết ra CO2, các acid hữu cơ và acid vô cơ trong quá trình hoạt động của chúng có tác động lớn đối với việc làm cho các khoáng chất hoặc các chất như P dưới dạng không tan sẽ chuyển biến thành dạng đơn giản, dễ tan và dễ được cây hấp thu

Vi sinh vật tiết ra kích thích tố tăng trưởng của thực vật giúp rễ thực vật

phát triển được tốt Một số loài thuộc chi Pseudomonas và Agrobacterium có khả

năng tiết ra chất idol – acetic – acid (IAA), là chất kích thích sự ra rễ của cây trồng Các chất kích thích tố sinh trưởng này có trong đất với nồng độ thấp, chưa

có ảnh hưởng đến cây, nhưng bón phân hữu cơ cho đất chúng ta làm gia tăng mật

số vi sinh vật trong đất tức là gia tăng nồng độ chất kích thích tố sinh trưởng này

có ảnh hưởng đối với bộ rễ của thực vật

1.5.1 Vi sinh vật quanh rễ cây

Nhiều bản báo về vi khuẩn vùng rễ cho thấy ảnh hưởng có lợi của vi khuẩn vùng rễ lên sự tăng trưởng của cây là do chúng có khả năng kiềm chế hay chiếm chỗ của mầm bệnh nhiều vùng của rễ non được định cư bởi vi khuẩn Nơi đây có nhiều hệ sinh thái thích hợp mà những vi khuẩn thuộc các loài

Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus và Pseudomonas có thể phát triển Những vi khuẩn này ngăn chặn vi sinh vật có hại (Lambert et al., 1987; trích bởi Cavaglieri

et al., 2004)

1.5.2 Vi sinh vật nội sinh rễ

Vi khuẩn nội ký sinh rễ thường là những vi khuẩn được tách ra từ mô cây

đã khử trùng bề mặt hoặc được trích ra từ phía trong của cây (Hallmann et al., 1997; trích dẫn bởi Kloepper et al., 2006)

Như vậy vi khuẩn vùng rễ PGPR là các chủng sống tự do, nhưng một số loài có thể xâm nhập vào bên trong mô cây sống mầ không làm cây biểu hiện triệu chứng bị xâm nhiễm gọi là các vi khuẩn nội sinh rễ (endophytes), để xâm nhập vào rễ, trước hết chúng phải là vi khuẩn vùng rễ (Antoun và Prévost, 2005)

1.5.3 Sự tác động qua lại giữa các chủng vi sinh vật trong đất

Phạm Văn Kim (2006), đưa ra 6 nhóm tác động như sau:

1 Không có tác động lẫn nhau (Neutralism) các chủng vi khuẩn gần như không có tác động lẫn nhau hoặc tác động quá nhỏ không đáng kể

2 Cạnh tranh (Compectition) hai chủng vi khuẩn cạnh tranh nhau về nguồn dinh dưỡng hoặc không gian phát triển

3 Tác động tương trợ (bổ trợ) (Mutalism) hai chủng tác động tích cực lẫn nhau, làm cho sự phát triển của cả 2 tăng lên so với lúc sống riêng lẻ

4 Tác động tích cực 1 chiều (Commensalism) một chủng tác động tích cực lên chủng thứ hai và không ngược lại

5 Tác động tiêu cực một chiều (Amensalism) chủng này tác động tiêu cực lên chủng kia và không ngược lại

6 Ký sinh (Parasitism) và làm mồi (Predation) chủng này sống nhờ chủng

kia Ví dụ: Nấm Arthrobotrys conoides bắt và giết tuyến trùng trong đất bằng

vòng trên chính chúng tạo ra

1.5.4 Sự đối kháng của vi khuẩn

Theo Phạm Văn Kim (2000), một số vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas Bacillus trong đất có thể sống bám trên sợi nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense hoặc Phytophthora spp đồng thời tiết ra chất ức chế sự pát triển của sợi

nấm này.Trong các vi sinh vật có lợi trong tự nhiên như: nấm, xạ khuẩn, virus thì

vi khuẩn đối kháng giữ vai trò vô cùng quan trọng chúng tồn tại khắp nơi trên thế giới và trên bề mặt cây trồng , chúng có khả năng hạn chế những vi sinh vật khác bằng các cơ chế như: tiết ra chất kháng sinh (Antibiotie) cạnh tranh về dinh dưỡng, nơi ở, ngoài ra nó còn hạn chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật khác góp phần tạo sự cân bằng sinh thái trong tự nhiên (Mukerji and Grag, 1993); trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Nga, 2003)

Nhiều vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng sản xuất chất chuyển hoá

thứ sinh như: chất kháng sinh, hợp chất bay hơi hoặc không bay hơi và enzymes

thuỷ phân Một vài chất kháng sinh được sản xuất bởi vi khuẩn Bacillus spp như:

bacillomycin, mycobacillin, iturin A, surfactin, mycosubtilin (Lemesa, 2006)

Nguyễn Ngọc Dũng và ctv (2003), đưa ra 4 giả thuyết về cơ chế đối

kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn Pseudomonas là: i do vi khuẩn Pseudomonas

có khả năng tổng hợp các phức liên kết ion sắt, ii tổng hợp cyanid, iii các chất kháng sinh và iv tổng hợp enzyme glucanase hoặc chitinase, nhưng chưa xác

định chúng có khả năng đối kháng theo cơ chế nào

Theo Nguyễn Thị Thu Nga (2003), các loài vi sinh vật đối kháng có khả năng tiêu diệt hoặc tiết ra enzyme phân huỷ thành phần vách tế bào như: glucan, chitin, protêin để ức chế hoạt động của các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu bằng các chất kháng sinh, những sản phẩm trao đổi chất trong quá trình sống của chúng (Lê Lương Tề và ctv., 1998)

Vi khuẩn Bacillus subtilis S9 được phân lập từ vùng rễ của cây mía đường

có tác dụng phân giải vách tế bào của nấm gây bệnh: Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, sau khi chủng 3 ngày trên môi trường PDA (“Đầu tiên tế bào vi khuẩn S9 được hấp thụ vào trong sợi nấm, phát triển

sinh sản cùng với sự phát triển và sinh sản của sợi nấm sau đó làm mục rữa sợi

nấm”) (Lin, et al., 2003)

1.5.5 Khả năng kích thích tăng trưởng của vi khuẩn vùng rễ

Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (plant Growth Promoting Rhizobacteria – PGPR) đại diện cho những loài vi khuẩn vùng rễ sống trong, trên hay xung quanh mô cây, mà khi liên kết với cây ký chủ dẫn đến kết quả là kích thích tăng trưởng của cây bằng bhiều cơ chế phức tạp khác nhau

Theo Nguyễn Ngọc Dũng và ctv., (2003), đưa ra giả thuyết và cơ chế

đoois kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn Pseudomonas là:

Do vi khuẩn Pseudomonas có khả năng tổng hợp các phức liên kết ion sắt,

tổng hợp cyanid, các chất kháng sinh, tổng hợp enzyme glucanase hoặc chitinase Tuy nhiên chưa xác định chúng có khả năng đối kháng theo cơ chế nào

Một trong những nguyên nhân vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật là khả năng sinh tổng hợp phytohocmon – 1 đặc tính phổ biến vi khuẩn liên kết thực vật Một mắc xích quan trọng trong cả quá trình bắt đầu từ việc vi khuẩn bám vào rễ đến thể hiện hiệu ứng kích thích sự phát triển của cây là phản ứng kiểm soát phytohocmon Có 80% vi khuẩn phân lập từ vùng rễ có khả năng sản sinh IAA và chúng được nghiên cứu không chỉ vì hiệu ứng sinh lý của chúng lên cây trồng mà còn có thể do vai trò của phytohocmon đáp ứng sự tương tác giữa

vi khuẩn – thực vật Vi khuẩn Bacillus được phân lập từ đất trồng có khả năng sinh tổng hợp IAA thay đổi theo thời gian và phụ thuộc vào từng chủng Vi khuẩn tiết ra IAA trong điều kiện bất lợi có thể có vai trò chức năng rất lớn tăng khả năng tạo mối liên kết “cây – vi sinh vật” Tạo thành mối liên kết là phương pháp vấn đề dinh dưỡng, bảo toàn khả năng sống sót và cuối cùng là tạo ưu thế đối với các loại vi sinh vật khác trong vùng rễ Việc IAA của vi khuẩn tham gia vào quá trình hình thành mối quan hệ “cây – vi sinh vật” ngày càng khẳng định (Phạm Việt Cường và ctv., 2003)

Theo Glick (1995); Glick et al (1999) thì PGPR giúp tăng trưởng cây

trồng theo 2 cơ chế: gián tiếp và trực tiếp Theo cơ chế gián tiếp, PGPR tiết chất kháng sinh chống lại vi khuẩn gây bệnh, làm giảm sút sắt hữu dụng đến mầm bệnh thực vật (phytophathogens) trong vùng rễ, tổng hợp các enzyme phân hủy vách tế bào nấm và cạnh tranh chổ ở ( vị trí ở rễ cây) với vi sinh vật gây hại Còn với cơ chế trực tiếp, PGPR giúp cho sự tăng trưởng, bao gòm tác động giúp giải

phóng phosphate hữu dụng sinh học cho cây trồng hấp thu, cố định nitơ cho cây trồng sử dụng, giúp cây trồng có thể sử dụng Fe hữu hiệu hơn thông qua việc tạo siderophores, là một hợp chất có trọng lượng phân tử thấp (400 – 1000 daltons)

có ái lực cao với Fe3+, hòa tan rất kém ở nhiều loại đất Ngoài ra, nhiều loại PGPR còn sản xuất hocmon thực vật như auxin, cytokinins và gibberllins và hạ thấp mức ethylene của cây, kích thích sự phát triển cây trồng (trích bởi Lucy, 2004) Theo Antoun và Prévost (2005), IAA có thể trực tiếp làm gia tăng sự phát triển rễ bằng cách kích thích sự kéo dài hoặc phân cắt tế bào một cách gián tiếp thông qua ảnh hưởng của hoạt tính men I – aminocyclopropane – 1 – cacboxylic acid (ACC) deamnase của vi khuẩn, làm phá hủy ACC (tiền chất của ethylene), nên cây tạo ra lượng ethylene ở mức ức chế sự phát triển của rễ

Có nhiều công ty phân bón sử dụng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật để xử lý cây trồng phát triển tốt, làm bộ rễ phát triển mạnh và tăng năng suất Công ty sinh hóa hữu cơ đã đưa 1 vài dạng vi sinh vật có khả nanưg tổng hợp kích thích tế tố tăng trưởng thực vật từ nước ngoài vào Việt Nam

để sản suất phân bón dạng sinh học hữu cơ (Nguyễn Thị Quý Mùi, 2001; trích bởi Cao Ngọc Điệp, 2003)

Vi khuẩn vùng rễ còn giúp cây trồng tăng trưởng làm tăng tỷ lệ nảy mầm, tăng trưởng rễ, sản lượng gồm hạt, diện tích lá, lượng chất dịp lục, magiê, nitơ, protein, khả năng hấp thu nước, chịu đựng khô hạn, trọng lượng cành và rễ làm chậm quá trình lão hóa của lá cây Một lợi ích khác của PGPR là kích kháng chống bệnh cây trồng thường được biết đến như biện pháp sinh học (Lucy, 2004)

Theo Vessey (2003), việc tổng hợp sử dụng các vi khuẩn Azobacter, Azospirilium, Acetobacter, Bacillus, Pseudomonas để giúp cây lúa nước phát

triển tốt và tăng năng suất so với đối chứng đã được (Roger và Watanabe, 1986;

Mailk et al.,1993), chứng minh và sử dụng tổng hợp IAA của vi khuẩn này giúp

rễ lúa phát triển nhiều hơn để hấp thu nhiều nước và dinh dưỡng hơn (Tiền và ctv., 1979; trích bởi Trần Trọng Cần, 2007)

Vi khuẩn Bacillus cereus có thể kích thích cây trồng tổng hợp IAA (Wilkinson et al., 1994) Ngoài ra Muller et al., (1989), thì Bacillus subtilus cũng có khả năng kích thích cây tiết ra IAA giống như Bacillus cereus

Như vậy vi khuẩn kích thích tăng trưởng được xem như một loại phân hữu

cơ vi sinh do trực tiếp quá trình cung cấp dưỡng chất cho cây ký chủ bằng cách làm gia tăng độ hữu dụng của dưỡng chất như phosphat hòa tan, hoặc gián tiếp giúp cho hệ thống rễ phát triển nhằm làm tăng sự hấp thu dưỡng chất hoặc tăng cưồng các mối quan hệ cộng sinh có lợi khác Tuy nhiên không phải tất cả PGPR đều có vai trò như phân hữu cơ vi sinh mà chúng cũng kích thích tăng trưởng

thực vật bằng cách giúp cây chống lại mầm bệnh (Whipps, 2001; Zehnder et al.,

2001; được trích dẫn bởi Vessey, 2003)

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP

2.1 Phương tiện

2.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ tháng 02/2008 đến tháng 05/2008

Địa điểm: Nhà lưới, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và

Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

Dụng cụ:

2.2.1 Vật liệu

Tủ lạnh, tủ cấy vi sinh, tủ định ôn, tủ thanh trùng khô, autolave, máy lắc ngang

Kính hiển vi, lam đếm hồng cầu, micropipette

Đĩa petri, ống nghiệm…

Hóa chất: peptone, MgSO4, K2HPO4…

Ớt giống: sừng vàng TN243 đang được canh tác phổ biến tại ĐBSCL Thước lấy chỉ tiêu

- Các môi trường sử dụng trong các thí nghiệm

Môi trường vi khuẩn: King’B, TZC, colloidal chitin

Môi trường trồng cây trong ống nghiệm: water agar 0.6%

Môi trường nấm: PDA

Môi trường nấm & vi khuẩn: PDAP

- Nguồn vi sinh vật

- Các dòng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng (PGPR) được phân lập, tách ròng từ mẫu rễ của các cây trồng cạn: ớt, cà chua, dưa hấu, trên môi trường King’B và trữ trong tủ lạnh ở 4oC

- Vi khuẩn Ralstonia solanacearum và nấm Fusarium oxysporum: Được

phân lập từ mẫu cây bệnh trên ruộng canh tác và chọn chủng độc sau khi thử khả năng gây bệnh theo quy trình Koch, tái phân lập và được trữ trong tủ lạnh ở nhiệt

độ 4o

C

2.2 Phương pháp

2.2.1 Điều tra và thu mẫu

Chọn ruộng điều tra: những ruộng có diện tích >1000 m2, có trồng các loại cây trồng cạn như: ớt, cà chua, dưa hấu…

Thu thập mẫu: 3 điểm (mẫu)/ruộng, mỗi mẫu là một cây phát triển vượt trội nhất trong ruộng có bệnh héo xanh, héo rũ, gồm rễ (1g) & đất bám vào rễ, cho vào bọc nilon riêng, ghi ký hiệu và một mẫu cây bệnh Mẫu được bảo quản

ở 2 - 5o

C

2.2.2 Chuẩn bị nguồn vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng (PGPR)

 Phân lập vi khuẩn phát huỳnh quang

Rễ (0.25g) thu từ các cây khỏe được rửa bớt đất và cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 10 ml nước cất đã vô trùng, sau đó lắc trong 2 giờ, thu huyền phù để phân lập

Vi khuẩn được phân lập từ huyền phù theo phương pháp chà trên mặt môi trường trong đĩa petri chứa môi trường King’ B, sau đó ủ trong tủ định ôn 30oC

 Phân lập vi khuẩn thuộc nhóm chịu nhiệt (tạo nha bào)

Để phân lập Bacillus spp.thực hiện như trên nhưng trước khi ủ còn được

xử lý ở 90o

C trong 15 phút)

 Phân lập vi khuẩn nội sinh rễ (endophytes)

Các mẫu rễ, sau khi dùng để phân lập vi khuẩn vùng rễ (PGPR), được khử trùng bề mặt bằng Canxi hypochlorite 1% trong 2 phút, rửa 3 lần với nước cất vô trùng, được giã nát rồi cho vào 10 ml nước cất vô trùng trong ống nghiệm và vortex trong 1 phút để có huyền phù dùng cho phân lập

Tiến hành các bước phân lập, tách ròng như đối với vi khuẩn vùng rễ Các dạng khuẩn lạc đặc trưng nhóm vi khuẩn tạo huỳnh quang và khuẩn lạc phát triển từ các đĩa petri có xử lý nhiệt được chọn, kiểm tra lại sự tinh ròng

Các chủng vi khuẩn tinh ròng được trữ ở 4oC, trong ống eppendoft, dùng làm vật liệu khảo sát khả năng đối kháng, kích kháng và kích thích tăng trưởng của cây

2.2.3 Chuẩn bị nguồn gây bệnh

 Phân lập nấm Fusarium spp từ mẫu rễ

- Chọn mẫu rễ nhiễm bệnh, mới, cắt thành đoạn 2 - 3 cm, khử trùng bề mặt (canxi hypochlorite 0.5%, 1 phút), rửa nước cất vô trùng, ủ trong đĩa petri có lót giấy thấm ẩm, trong tủ định ôn 30oC

- Khảo sát với kính hiển vi, nhận dạng và cấy truyền nấm Fusarium sang

môi trường PDA, tách ròng, kiểm tra lại các đặc điểm hình thái phân loại (Riddell, 1950)

 Phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum từ mẫu thân, rễ

Đoạn thân của cây bệnh được cắt ngắn, khử trùng bề mặt bằng cách nhúng trong hypochlorit Ca 1%, 1 phút, rửa với nước cất vô trùng, rồi ủ trên giấy thấm

ẩm vô trùng trong dĩa petri Sau 1 - 2 ngày, phân lập và tách ròng vi khuẩn từ dịch vi khuẩn theo phương pháp vạch trên môi trường TZC trong đĩa petri Sau khi ủ 2 - 3 ngày ở 28oC, chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho R solanacearum để

vạch kiểm tra mức độ tinh ròng và chọn khuẩn lạc tiêu biểu để trữ nguồn

Các nguồn bệnh sau khi được khẳng định về tính độc theo qui trình Koch (Burton & Engelkirk, 2003) được trữ trong eppendorf ở 4oC dùng làm tác nhân gây bệnh

2.3 Thí nghiệm 1: khảo sát khả năng định vị trên rễ và kích thích tăng trưởng của một số chủng vi khuẩn (PGPR)

● Mục đích

- Bước đầu tìm ra các chủng vi khuẩn có khả năng kích thích tăng trưởng

và định vị ở vùng rễ

● Chuẩn bị

- Các chủng vi khuẩn nhân lại 36 giờ trong môi trường King’B lỏng

- Hạt ớt giống: sừng vàng TN243 của công ty Trang Nông, hạt được khử trùng bề mặt với Ca(ClO)2 1% trong 30 phút rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng

● Tiến hành

- Hạt sau khi khử trùng ngâm vào huyền phù vi khuẩn (109 cfu/ml) trong 4 giờ

- Chuyển hạt sang ống nghiệm có 10 ml water agar 0,6% vô trùng

- Thí nghiệm được tiến hành với mỗi chủng vi khuẩn là một nghiệm thức, 4 lần lặp lại và bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

● Chỉ tiêu khảo sát

- Đánh giá khả năng định vị & kích thích tăng trưởng (chiều dài rễ mầm & chiều cao thân) vào 3 ngày sau khi gieo (NSKG) và sau mỗi 3 ngày cho đến

15 NSKG

- Khả năng định vị trên rễ: Không (-), Thấp (+), Trung bình (++), Cao (+++)

2.4 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn đối với vi

khuẩn Ralstonia solanacearum, trong đĩa petri

● Mục đích

- Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi

khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh

● Chuẩn bị

- Các chủng vi khuẩn được nhân 36 giờ trên môi trường King’B lỏng

-Vi khuẩn Ralstonia solanacearum được nhân lại 36 giờ trên môi trường

- Các đĩa petri được đặt trong tủ định ôn với nhiệt độ 30oC

● Chỉ tiêu theo dõi

- Đo bán kính vành khăn gây bệnh bị ức chế vi khuẩn đối kháng, theo 2 đường thẳng vuông góc tại tâm của khuẩn lạc PGPR, vào sau mỗi 48 giờ sau khi thử nghiệm, cho đến khi không còn sự khác biệt so với lần đánh giá trước

2.5 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn đối với nấm

Fusarium oxysporum, trong đĩa petri trên môi trường PDAP

● Mục đích

- Khảo sát và đánh giá khả năng đối kháng, duy trì khả năng đối kháng của

các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với nấm Fusarium spp gây bệnh héo rũ

● Chuẩn bị

- Những chủng vi khuẩn được nhân 36 giờ trên môi trường King’ B lỏng

- Nấm Fusarium spp được nhân lại 7 ngày trên môi trường PDA

● Tiến hành

- Thí nghiệm tiến hành trong đĩa petri trên môi trường PDAP, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lặp lại, mỗi chủng vi khuẩn là 1 nghiệm thức

- Đánh dấu 5 vị trí (tâm và 4 điểm cách đều nhau quanh tâm, cách tâm 2.5 cm)

- Khoanh khuẩn ty Fusarium oxysporum  = 7mm, được đặt ở tâm khoanh giấy thấm huyền phù PGPR 109 cfu/ml, được đặt ở 3 vị trí xung quanh, vị trí còn lại là khoanh giấy thấm nước cất vô trùng làm đối chứng

- Các đĩa petri được đặt trong tủ định ôn với nhiệt độ 30oC

● Chỉ tiêu theo dõi:

- Tiến hành lấy chỉ tiêu khi rìa của khuẩn ty phát triển đến điểm đối chứng

- Đo khoảng cách vùng ức chế (bán kính vành khăn) của vi khuẩn đối kháng Mỗi điểm trắc nghiệm đo theo hai đường thẳng vuông góc qua tâm của khuẩn lạc, đo từ tâm của khoanh khuẩn ty đến rìa sợi nấm

- Đo bán kính khuẩn lạc nấm Fusarium ở nghiệm thức có vi khuẩn và đối

chứng để tính hiệu suất đối kháng

Hình 1: Phương pháp trắc nghệm khả năng đối kháng của vi khẩn đối với nấm

2.6 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng tiết chitinase của các chủng vi khuẩn

Những chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Fusarium

oxysporum được nhân lại 36 giờ trên môi trường King'B lỏng Mỗi chủng vi

khuẩn được cấy 1 điểm (khoanh giấy thấm) trên đĩa petri có chứa sẵn môi trường chitin agar (4% colloidal chitin)

● Chỉ tiêu theo dõi

Đường kính & thời gian chitin bị phân giải trong đĩa petri