Lên men thu nhận GABA (gamaamino Butyric axit) từ bột hạt bụp giấm bởi Lactobacillus acidophillus

Lên men thu nhận GABA (gamaamino Butyric axit) từ bột hạt bụp giấm bởi Lactobacillus acidophillus. Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện của quá trình lên men thu nhận GABA: pH, Nhiệt độ, tỉ lệ giống cấy...

MỤC LỤC

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, một số các hoạt chất có hoạt tính sinh học được rất nhiều sự quan tâmcủa các nhà khoa học vì tính chất quan trọng của nó đối với sức khỏe và đời sống conngười Trong đó, gamma amino butyric acid (GABA) là một thành phần được nghiêncứu rất nhiều trong thời gian gần đây GABA là amino acid có vai trò thiết yếu để đảmbảo duy trì sự hoạt động bình thường của não bộ đặc biệt là các neuron thần kinh.GABA đóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt động của các neuron thần kinh

và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền Vì thế, GABA giúp cho cơ thể đượcthư giãn, an thần GABA được tìm thấy nhiều ở các loại ngũ cốc đặc biệt là ngũ cốcnảy mầm Ngoài ra, hàm lượng GABA cũng được tăng lên đáng kể dưới tác động của

vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn lactic Do đó, quá trình sản xuất GABA bằng lên men visinh vật đang được đào sâu nghiên cứu và đã được sản xuất ở một số nơi

Cho đến nay, GABA chỉ được khai thác nghiên cứu trên các loại nguyên liệu làcác hạt ngũ cốc, gạo có giá trị thương phẩm khá cao Trong khi đó, hạt bụp giấm ởnước ta từ trước đến nay chỉ được xem như một loại phế liệu ít có giá trị sử dụng vàthường bị thải bỏ Nhưng hạt bụp giấm chứa một hàm lượng protein khá cao (26 –27%) với tỷ lệ aicd glutamic là cao nhất trong tổng số các amino acid (22%) Do đó, cóthể xem hạt bụp giấm là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc sản xuất GABA

Đề tài “Khảo sát điều kiện lên men chuyển hóa acid glutamic thành GABA từ

hạt bụp giấm bằng Lactobacillus acidophilus” góp phần khai thác nguồn nguyên liệu

bụp giấm chưa được sử dụng hiệu quả, nâng cao được giá trị kinh tế cho cây bụp giấm.Hiện nay cây bụp giấm được mở rộng diện tích vì nó đã được xem là cây xóa đói giảmnghèo cho một số các tỉnh thành Đồng thời nghiên cứu cũng sẽ là mở đầu cho cácnghiên cứu sản xuất GABA với giá thành thấp hơn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về GABA

1.1.1 GABA

GABA là một amino acid phi protein có 4 carbon, được tìm thấy trong các loài

vi khuẩn đơn giản đến cây trồng và ở ngay cả động vật có vú GABA được phát hiệntrong cây từ hơn nửa thế kỷ trước Tuy nhiên vai trò của nó ở trong thế giới thực vậtvẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhưng trong thế giới động vật thì các nhàkhoa học đã tìm ra được vai trò của GABA: là một chất dẫn truyền xung thần kinhquan trọng, có rất nhiều hoạt tính sinh học như giảm stress, chống oxy hóa, giảm thiểunguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và thần kinh Ở vi khuẩn và thực vật GABA đóngvai trò trao đổi chất trong chu trình Krebs, còn ở động vật có xương sống nó đóng vaitrò như một máy phát tín hiệu thần kinh mạnh (Diana và cộng sự, 2014)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của GABA

GABA chủ yếu được hình thành bằng phản ứng α–decarboxylation khôngnghịch đảo của acid L–glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme

decarboxylase acid glutamic Enzyme này được tìm thấy ở vi khuẩn như Lactobacillus (Bertoldi và cộng sự, 1999), Escherichia (Rice và cộng sự, 1993), Streptococcus,

3

Aspergillus (Kato và cộng sự, 2002) và Neurospora (Kubicek và cộng sự, 1979); ở

trong thực vật như trà (Zhao và cộng sự, 2011), cà chua (Yoshimura và cộng sự, 2010),đậu nành (Serraj và cộng sự, 1998), gạo lứt nảy mầm (Daixin và cộng sự, 2008); vàtrong não của động vật có vú (Nathan và cộng sự, 1994) Tuy nhiên vi khuẩn

Lactobacillus và nấm men là hai loại phổ biến nhất để sản xuất GABA Ngoài ra,

GABA còn được tìm thấy ở côn trùng như gián, châu chấu, sâu bướm và ong mật(Anthony và cộng sự, 1993)

1.1.2 Chức năng sinh lý của GABA

Ngày nay GABA được nghiên cứu nhiều do nó có hoạt tính sinh học mạnh, cónhiều chức năng sinh lý và nhiều tác động tích cực có lợi cho sức khỏe con người

Như đã nói GABA là một chất dẫn truyền xung thần kinh quan trọng, có rấtnhiều hoạt tính sinh học, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và thần kinhnhư bệnh Huntington, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer (Wong và cộng sự, 2003)

Ngoài ra GABA còn có chức năng sinh lý khác như thư giãn (Wong và cộng sự,2003), mất ngủ và trầm cảm (Okada và cộng sự, 2000), các bệnh này đã được điều trịbằng GABA Hơn nữa, amino acid này góp phần làm tăng nồng độ của hormone tăngtrưởng trong huyết tương và tỷ lệ tổng hợp protein trong não (Tujioka và cộng sự,2009) Mới đây các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng đó là một secretor mạnh của insulin,

và do đó có thể giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường (Adeghate và cộng sự, 2002)

GABA có thể làm chậm hoặc ngăn chặn sự xâm nhập và di căn của các loại tếbào ung thư khác nhau chẳng hạn như tuyến vú, đại tràng và các tế bào ung thư gan(Kleinrok và cộng sự, 1998; Minuk, 2000; Opolski và cộng sự, 2000) Ngoài ra, GABAcòn có tế bào chống viêm và nguyên bào sợi hoạt động phổ biến, trong đó thúc đẩyviệc chữa lành da vết thương (Han và cộng sự, 2007)

Các chức năng sinh lý của GABA đã được tổng hợp ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Các chức năng sinh lý của GABA (Diana và cộng sự, 2014)

Chức năng sinh lý Chức năng cụ thể

Dẫn truyền thần kinh Ức chế dẫn truyền thần kinh

Điều chỉnh huyết áp Giảm huyết áp

Bệnh tâm thần

Tăng cường trí nhớLàm giảm các rối loạn tâm trạngTác dụng thư giãn

Làm giảm triệu chứng mất ngủGiảm phiền muộn

Phòng ngừa và điều trị các chứng nghiện rượuCác cơ quan quan trọng

Bảo vệ và chống lại bệnh thận mãn tínhKích hoạt chức năng gan

Cải thiện chức năng thị giácTăng tốc độ tổng hợp protein trong não

Hệ thống miễn dịch Tăng khả năng miễn dịch

Bảo vệ và phòng chống ung thư Làm chậm và ức chế tế bào ung thư tăng sinhKích thích các tế bào ung thư tự hủy diệt

Ức chế các khối u

Điều chỉnh tế bào Chống viêm và tăng sinh tế bào nguyên bào sợiTổng hợp acid hyaluronic

Nâng cao hiệu suất của các nguyên bào sợi daTim mạch Làm suy giảm các phản ứng trao đổi chất làm thiếu máu cục bộ

Kiểm soát đường hô hấpĐiều chỉnh nội tiết tố

Tăng hormone tăng trưởngKiểm soát bài tiết hormoneKiểm soát progesteroneKiểm soát hormone tuyến giápNgăn ngừa béo phì

5

1.1.3 Cơ chế hình thành GABA

Trong cây và trong động vật, GABA được hình thành qua 3 enzyme: enzymeglutamate decarboxylase (GAD), enzyme GABA transaminase (GABA–T) và enzymesuccinic seminaldehyde dehydrogenase (SSADH)

Chu trình thủy phân nitrogen bởi enzyme glutamine–synthetase hay glutamate–synthase (GS hay GOGAT) là một con đường chính để đồng hóa nitrogen thànhglutamate và amino acid trong thực vật Glutamate decacrboxylase (GAD) là mộtenzyme trong dịch tế bào chịu ảnh hưởng bởi phức hợp Ca2+–calmondulin (CaM), làmxúc tác cho quá tình decarboxyl glutamate biến đổi thành GABA Sau đó, GABA đượcchuyển vào trong ty thể và bị biến đổi thành succinic seminaldehyde bởi enzymeGABA transaminases sử dụng cả α–ketoglutarate (thành enzyme GABA–TK) vàpyruvate (thành enzyme GABA–TP) như là những nơi tiếp nhận các amino acid Tiếptheo, succinic seminaldehyde được biến đổi thành succinate bởi enzyme succinicsemialdehtde dehydrogenase (SSADH), sau đó tham gia vào chu trình TCA Cả ATP

và NADH có thể trở thành chất ức chế hoạt động của enzyme SSADH Các enzymesuccinyl–CoA ligase và α–ketoglutarate dehydrogenase (α–KGDH) là các enzyme củachu trình TCA nhưng có liên quan đến chu trình biến đổi GABA và các enzyme nàynhạy cảm với sự stress oxy hóa Succinic semialdehyde còn có thể bị biến đổi thành γ–hydroxybutyric (GHB) ở bên ngoài là dịch bào ở cả động vật và thực vật Ở động vật

có vú, GHB được biết đến như là một chất dẫn truyền xung thần kinh, trong khi đó, ởthực vật thì vẫn chưa biết rõ chức năng của GHB

Vai trò của enzyme GABA–TK vẫn còn đang được nghiên cứu, trong khi đó,vai trò của enzyme GABA–TP đã được nghiên cứu rõ ràng trong cây thuốc lá và cây

hoa Arabidopsis GABA–TP là một enzymee chức năng cho quá trình biến đổi GABA.

GABA–TP có một vài chức năng đặc biệt ở các loài hoa: đóng góp vào sự cân bằng

C:N, điều chỉnh lại độ pH, chống lại sự oxy hóa, bảo vệ cây khỏi côn trùng, GABA còn

là chất điều hòa thẩm thấu màng tế bào (Palanivelu và cộng sự, 2003)

Như vậy cơ chất chính trong quá trình tạo thành GABA chính là glutamate, sau

đó GABA sinh ra sẽ được chuyển hóa tiếp tạo thành succinic semialdehyde và cuốicùng tạo thành sản phẩm GHB (ở dịch tế bào) và succinate (ty lạp thể) Ngoài ra tacũng có thể thu được glutamate từ con đường dị hóa lysine (Bouche' và cộng sự, 2004)

Có rất nhiều nghiên cứu mới để làm tăng hàm lượng GABA như tác động lên bộgen của enzyme glutamate dehydroxylase, biến tế bào thành một nhà máy sinh tổnghợp thừa GABA Bên cạnh đó, các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp lên men vi

sinh vật Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, ; Escherichia coli; Monascus,

… trên nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau để sản xuất GABA Và còn nhiều phươngpháp khác (Bouche' và cộng sự, 2004)

7

Hình 1.2 Chu trình chuyển hóa GABA

1.2 Tổng quan về bụp giấm

Cây bụp giấm có tên khoa học là Hibiscus sabdariffa Linn Có hai loại chính của Hibiscus sabdariffa là Hibiscus sabdariffa var altissima và Hibiscus sabdariffa var sabdariffa.

Altissima hầu như không có cành và cây có thể phát triển đến chiều cao từ 3 – 5

m Hoa của loài này có màu vàng, đài hoa có màu đỏ hoặc xanh lá với hàm lượng chất

xơ cao nhưng chưa được sử dụng như một loại thực phẩm, nó có tính thương mại cao,

nó được trồng tại Ấn Độ, Nigeria và khu vực Nam Mỹ để thu hoạch như một loại sợiđay

Một loại khác, sabdariffa mọc dưới dạng cây bụi với rất nhiều cành Hoa của

loại này mọc từ trong chồi nách, cánh hoa có màu trắng, phần trung tâm có màu đỏ

Đài hoa của loại này sẽ to ra khi cây trưởng thành Sabdariffa chủ yếu được khai thác ở

phần đài hoa và phần chất xơ (Abu, 1997; Morton, 1987)

Về mặt sinh thái học, bụp giấm là loại cây trồng quanh năm, thân thảo, thân câythẳng, hình trụ, màu đỏ và bề mặt trơn láng, thường mọc thành bụi rậm Thân cây cóthể phát triển đến chiều cao 0.5 – 3 m, đài hoa có màu vàng tái đến đỏ và có thể ănđược (Morton, 1987; Brouk, 1975; Purseglove, 1986) Cây mất khoảng ba đến bốntháng chăm sóc để có thể thu hoạch Bên cạnh đó, người ta cho rằng trong tháng đầutiên của việc trồng cây bụp giấm, cần chiếu sáng đủ 13 giờ mỗi ngày để tránh tìnhtrạng ra hoa sớm Bụp giấm thích hợp với khí hậu nhiệt đới, lượng mưa thích hợp vàokhoảng 1500 – 2000 mm/ năm, địa hình khoảng 600 m so với mực nước biển Cây cóthể chịu đựng được thời tiết ẩm nhưng không dưới 21 °C, đặc biệt bụp giấm nhạy cảm

và có thể bị chết dưới điều kiện nhiều sương mù và băng giá Cây cần được trồng ởvùng đất tơi xốp, thoáng khí, thích hợp nhất là hỗn hợp cát và đất sét có bổ sung phân

bón Nó có thể chống chịu được lũ và gió mạnh, nhưng cần nhổ sạch cỏ dại ở nơi trồngchúng (Robert, 2005).

Như đã nêu ở trên, bụp giấm là loài cây chống chịu tốt với những vùng đất cóđiều kiện khắc nghiệt nên nó được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới như Ấn Độ, ẢrậpSauđi, Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Philippines, Việt Nam, Sudan, Ai Cập hayMexico,… (Quezon, 2005; Rao, 1996) Không có một nguồn tài liệu nào chắc chắn vềnguồn gốc của cây bụp giấm, Mat (1985) cho rằng chúng xuất xứ từ Ấn Độ, còn Abu(1997) cho rằng chúng có nguồn gốc từ Ảrập Sauđi Bụp giấm được biết đến với nhiềucái tên bản xứ khác nhau như Roselle trong tiếng Anh, Sorrel trong tiếng Anh và khuvực châu Phi, Mesta trong tiếng Ấn, hay Karkade ở khu vực Trung Đông

Tại Việt Nam, cây này được trồng nhiều ở miền Trung, không kén đất, ưa đấtđồi núi, khí hậu nóng ẩm ở Đông Nam bộ Ở miền Bắc, cây này được trồng thí điểm ởkhu vực các tỉnh Hà Tây, Bắc Kạn và Thái Nguyên Từ đầu thập niên 90 đến nay, câybụp giấm với giống lấy từ Đức được trồng nhiều ở Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai,Bình Dương và Bình Phước (với diện tích khoảng 400 ha) để xuất khẩu

Tại châu Phi, phần hạt được ép lấy dầu (Gabb, 1997) Thịt quả và hạt cũng đượcphơi khô và nghiền thành một loại bột có vị đắng, dùng để bổ sung vào các loại súp vànước chấm trong các bữa ăn gia đình (Morton, 1987) Tại phía bắc Nigeria, hạt bụpgiấm được lên men tạo thành một loại gia vị có tên mungza ntusa Tại Sudan, hạt bụpgiấm được ép lấy dầu, phụ phẩm của quá trình này sẽ được dùng làm thức ăn cho giasúc Ở một số quốc gia, hạt bụp giấm được sử dụng như một loại cà phê và nó cũngđược sử dụng làm thức ăn cho gà (Morton, 1987) Tại Trung Quốc, hạt bụp giấm được

ép lấy dầu để sử dụng Tại Malaysia, hạt bụp giấm được dùng để sản xuất chất tẩy rửa.Tại Myanmar, hạt bụp giấm được dùng để chữa chứng suy nhược cơ thể (Perry, 1980).Tại Đài Loan, người ta tìm thấy tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng và khả năng tăng lực của

9

loại hạt này (Duke, 1983) Nhưng nói chung, những ứng dụng này còn rất nhỏ lẻ và hạtbụp giấm vẫn thường được xem là phế phẩm và bị thải bỏ trong các quá trình sản xuất.

1.2.1 Thành phần hóa học của hạt bụp giấm

Hình 1.3 Hình dạng hạt bụp giấm

Hạt bụp giấm có cấu trúc hình cầu dẹp, với các kích thước trung bình a, b,c nhưtrên hình lần lượt là 5.58, 5.21 và 2.81 mm (Omobuwajo và cộng sự, 2000)

Hạt bụp giấm tại Ai Cập chứa 7.6% ẩm, 34.0% protein, 22.3% béo, 15,3% chất

xơ, 7.0% tro và 0.3% canxi (Samy, 1980) Một nghiên cứu tại Ấn Độ đưa ra số liệu hạtbụp giấm chứa 6 – 8% ẩm, 18 – 22% protein thô, 19 – 22% béo, 5.4% tro, 39 – 42%chất xơ tiêu hóa, 119 – 128 mg Ca, 596 – 672 mg P, 4.0 mg Zn, 3.1 mg Cu, 393 – 396

mg Mg, 0.08 – 0.18 mg Cr, 0.36 – 0.51 mg riboflavin và 0.9 mg nicotinic acid (Rao,1996) Nghiên cứu gần nhất vào năm 2008 của Hainida và cộng sự thực hiện trên hạtbụp giấm trồng tại Malaysia cho bảng 1.2

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt bụp giấm (Hainida và cộng sự, 2008)

Thành phần Hàm lượng

Tổng chất xơ tiêu hóa (g) 18.3Carbohydrate (g) 13.0

Người ta cũng nghiên cứu thành phần các amino acid trong hạt bụp giấm, qua

đó cho thấy hàm lượng protein lên đến 31.02% Hàm lượng lysine tương đương vớikhuyến cáo của FAO Các amino acid được tìm thấy ở một mức hạn chế gồm cóvaline, isoleusine và trytophan, trong khi đó các amino acid chứa lưu huỳnh không bị

giới hạn Hạt bụp giấm thể hiện khả năng tiêu hóa tốt trong điều kiện in-vitro Vì vậy

người ta kết luận rằng hạt bụp giấm có thể được sử dụng như một nguồn protein, bổsung vào các thực phẩm nghèo lysine (El-Adawy, 1994) Tuy nhiên một nghiên cứukhác lại chỉ ra hàm lượng lysine và trytophan cao, trong khi hàm lượng các amino acid

có chứa lưu huỳnh lại bị giới hạn (Rao, 1996) Bảng 1.3 thể hiện thành phần phầnamino acid trong hạt bụp giấm

Bảng 1.3 Thành phần amino acid trong hạt bụp giấm (El-Adawy, 1994)

Amino acid Hàm lượng (%)

và cộng sự, 1975) Ngoài các acid béo chủ yếu, còn có các acid béo khác với hàmlượng thấp xuất hiện trong hạt bụp giấm như: acid myristic, palmitoleic, 13–expoxy–cis–9–octadecenoic (12,13–epoxoliec), sterulic và malvalic Bảng 1.4 thể hiện thànhphần các acid béo trong hạt bụp giấm.

Bảng 1.4 Thành phần acid béo trong hạt bụp giấm (Ahmad và cộng sự, 1979)

Acid béo Hàm lượng (%)

Một loại carbohydrate quan trọng cho quá trình tiêu hóa là chất xơ Chất xơ làphần khó tiêu hóa trong thức ăn có nguồn gốc từ thực phẩm Chất xơ chia làm hainhóm, phụ thuộc vào độ tan của chúng trong nước (Anderson và cộng sự, 1990):

Chất xơ hòa tan, bao gồm pectin, gum, mucilage và một số hemicellulose, dễdàng lên men trong ruột kết tạo khí và một số sản phẩm phụ như nhớt, làm chậm sựchuyển động của thực phẩm qua hệ thống tiêu hóa

Chất xơ không hòa tan, gồm lignin, cellulose và các hemicellulose còn lại,nhóm này thúc đẩy quá trình chuyển động của thực phẩm qua hệ thống tiêu hóa

Hạt bụp giấm rất giàu chất xơ (39 – 42%) (Rao, 1996) Điều này góp phần làmtăng độ cứng của hạt nếu so sánh với hàm lượng chất xơ và độ cứng của các loại hạtkhác như lúa mì, cám gạo, kiều mạch hay một số loại trái cây Bảng 1.5 thể hiện thànhphần chất xơ tổng, chất xơ hòa tan và chất xơ không hòa tan trong hạt bụp giấm

13

Bảng 1.5 Thành phần chất xơ tổng, chất xơ hòa tan, chất xơ không hòa tan trong hạt

bụp giấm (Rao, 1996)

Thành phần Hàm lượng (%)

Chất xơ không hòa tan 28.3 – 30.5

Tỷ lệ chất xơ hòa tan : chất xơ không hòa tan 2.5

Bảng 1.7 Một số thành phần khác trong hạt bụp giấm (Anhwange và cộng sự, 2006)

Thành phần Hàm lượng

Phytate (mg/100g) 5.90 ± 0.23HCN (mg/100g) 0.29 ± 0.20

Nhóm tác giả N Lacroix ở Canada đã nghiên cứu khả năng sản xuất GABA của

chủng Lactococcal được phân lập từ phô mai cũ Các tác giả đã cho thấy rằng trong

tổng số 50 chủng vi sinh vật riêng biệt có trong hai mẫu phô mai, thì có chín vi sinh vật

có thể sản xuất GABA, trong đó ULAAC–A13 và ULAAC–A23 có khả năng sản xuấtGABA lên đến 50 mg/100 ml sữa lên men Nghiên cứu này cho thấy rằng chủng visinh vật sản xuất GABA trong phô mai cứng và phô mai bán cứng với những điều kiệnphổ biến trong việc sản xuất GABA (Lacroix và công sự, 2013)

Bên cạnh đó, nhóm của tác giả Jannoey ở Thái Lan đã nghiên cứu quá trình tíchlũy GABA ở gạo trong suốt thời gian nảy mầm Sự tích lũy GABA trong gạo và lá củanăm giống gạo đã được nghiên cứu trong suốt thời gian nảy mầm Các tác giả cho thấymặc dù các giống gạo khác nhau có hàm lượng acid glutamic khác nhau nhưng hàmlượng GABA trong gạo không khác nhau nhiều (chênh lệch khoảng 0.05) Hàm lượngGABA trong gạo và lá tăng đáng kể trong suốt thời gian nảy mầm Tuy nhiên trong lá

có hàm lượng GABA cao hơn so với hạt gạo (gấp 2 – 3 lần ở tất cả giống gạo) Nghiêncứu cho thấy gạo là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất GABA (Jannoey và cộng

sự, 2010)

15

Ngoài những nghiên cứu trên, nhiều nhóm tác giả cũng đã nghiên cứu về nhữngđiều kiện đặc biệt để làm tăng hàm lượng GABA trong suốt quá trình chuyển hóa.Nhóm của tác giả Shigematsu ở Nhật Bản đã nghiên cứu quá trình chuyển hóa sinh họcacid glutamic thành GABA bằng áp lực cao Kết quả cho thấy tính khả thi của giả thiết

sử dụng công nghệ áp lực cao để thay đổi con đường trao đổi chất của tế bào vi sinhvật và tích lũy cơ chất có lợi (Shigematsu và cộng sự, 2010)

Nhóm của tác giả Lee ở Hàn Quốc đã nghiên cứu quá trình sản xuất GABAbằng glutamate decarboxylase cố định Các tác giả đã phát triển công nghệ sản xuấtGABA sử dụng his – tag thông qua sự cố định của escherichia coli–derived glutamatedecarboxylase (GAD) Dựa vào nghiên cứu hoạt động của enzyme cụ thể và đặc tínhphản ứng, acid glutamic được ưu tiên chọn hơn monosodium glutamate (MSG) để làm

cơ chất chính cho GAD cố định (Lee và cộng sự, 2013)

1.3.2 Ở trong nước

Ở nước ta hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về quy trình sản xuất GABAbằng con đường chuyển hóa sinh học Nổi bật nhất là nhóm nghiên cứu thuộc PhòngThí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein thuộc trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, ĐHQGHN do Trịnh Tất Cường làm trưởng nhóm đã nghiên cứu thành công

quy trình sản xuất GABA bằng cách lên men dịch cám gạo bằng Lactobacillus để ứng

dụng làm thực phẩm chức năng

Có thể thấy GABA có những chức năng sinh lý quan trọng nên rất nhiều côngtrình nghiên cứu trọng tâm vào sự phát triển thực phẩm chức năng có chứa một hàmlượng lớn GABA Tuy nhiên nguồn nguyên liệu để sản xuất GABA ở nước ta chưa thật

sự đa dạng, do đó việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới và những điều kiện thích hợp

để sản xuất GABA dựa trên nguồn nguyên liệu đó là hết sức cần thiết

1.4 Tổng quan về Lactobacillus acidophilus

1.4.1 Giới thiệu về Lactobacillus acidophilus

Phân loại khoa học Lactobacillus acidophilus:

- Loài: Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn gram dương, có dạng hình que, có chiều

dài 1.5 – 6.0 µm, đường kính 0.6 – 0.9 µm Các tế bào vi khuẩn này thường xếp theodạng cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn Khuẩn lạc trong môi trường thạch có kích thước 2– 5 mm, lồi, đục, mịn, bóng và không có sắc tố

1.4.2 Ðặc điểm sinh lý của Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus là loài không tạo bào tử và vi hiếu khí hoặc kỵ khí,

lên men đường thành acid lactic, có thể phát triển ở các môi trường có pH thấp (pH<5)

và phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 37 – 40 °C Nguồn carbohydrate, nitơ, vitamin và

các yếu tố vi lượng như acid oleic, mangan Lactobacillus acidophilus lên men đường

lactose nhưng chậm, có khả năng lên men các loại đường glucose, sucrose, maltose,mannose, esculin, salicin, không lên men arabinose, xylose, rhammose, ribose, sorbitol

Ngoài ra, Lactobacillus acidophilus còn có khả năng tạo ra các bacteriocin.

Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein, do vi khuẩn tạo ra và có khả năng

17

ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác thuộc loài gần với nó Lactobacillus acidophilus có thể sinh tổng hợp ra các loại bacteriocin như lactocin B, lactacin F,

acidocin A và acidocin B

1.4.3 Nơi phân bố

Lactobacillus acidophilus được tìm thấy ở khắp mọi nơi, đặc biệt là trong thực

phẩm: sữa, hạt, ngũ cốc, thịt và cá Chúng được tìm thấy trong đồ uống lên men, trongđường ruột người và trong khoang miệng nhằm giúp cho quá trình tiêu hóa thức ăn

Trong suốt quá trình lên men Lactobacillus acidophilus sản sinh ra lactate và acetate Lactobacillus acidophilus sinh ra acid làm thực phẩm có vị chua, giúp bảo vệ thực phẩm Bên cạnh đó, Lactobacillus acidophilus có thể sử dụng để duy trì mức pH đường ruột thông qua việc sản sinh acid lactic Lactobacillus acidophilus có thể sử

dụng trong duy trì hội chứng viêm ruột, bệnh hen suyễn, sự không dung nạp lactose,

làm giảm cholesterol, tiêu chảy,… Lactobacillus acidophilus còn bổ sung vào thức ăn

chăn nuôi vì nó giúp động vật tiêu hóa thực phẩm thông qua việc sản sinh enzyme

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Hạt bụp giấm

Nguyên liệu được sử dụng trong quá trình nghiên cứu được thu mua tại huyệnTuy Phong, tỉnh Bình Thuận Bụp giấm được bảo quản nguyên hạt trong điều kiện lạnhđông (–19 °C) nhằm hạn chế sự nảy mầm của hạt gây ảnh hưởng đến các thành phầnhóa học trong hạt

2.1.2 Vi sinh vật

Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được cung cấp từ Bộ môn Công

nghệ sinh học, trường đại học Bách Khoa, đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

2.1.3 Chuẩn bị giống cấy

Hoạt hóa giống:

Lactobacillus acidophilus được bảo quản ở dạng thạch nghiêng, do đó, cần phải

hoạt hóa để đưa về điều kiện sinh trưởng ổn định của giống Quá trình hoạt hóa giống

được tiến hành như sau: dùng que cấy lấy một vòng sinh khối Lactobacillus acidophilus từ ống thạch nghiêng cho vào 10 ml môi trường MRS đã tiệt trùng, sau đó

lắc đều môi trường lỏng và cho vào tủ ấm ủ ở nhiệt độ 38 °C trong 24 giờ Lặp lạinhiều lần liên tục cho đến khi 3 lần cuối môi trường hoạt hóa có giá trị OD tương đối

ổn định, đồng thời số tế bào vi sinh vật cũng đạt giá trị ổn định

Chuẩn bị giống cấy:

Lấy một khuẩn lạc trên đĩa petri đã được nuôi cấy sau 48 giờ cho vào 10 mlmôi trường MRS lỏng đã tiệt trùng và mang đi ủ ở 38 °C Sau 24 giờ ủ, canh trườnggiống sẽ được lấy ra và trở thành giống cấy cho các thí nghiệm

19

2.2 Mục đích nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyên liệu và điều kiện lên men lênhiệu suất sinh tổng hợp GABA từ hạt bụp giấm

- Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất sinh tổng hợp GABA

2.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu được trình bày tóm tắt ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Nội dung nghiên cứu

3 Khảo sát điều kiện lên men

- pH

- Nhiệt độ

- Tỷ lệ giống cấy

- Hàm lượng saccharose bổ sung

Hàm lượng GABA(Phản ứng FDNB)

4 Tối ưu hóa Các yếu tố ảnh hưởng đến

hàm mục tiêu

Hàm lượng GABA(Phản ứng FDNB)

5 Khảo sát biến thiên của GABA theo thời gian với

các điều kiện tối ưu

Thời gian Hàm lượng GABA(Phản ứng FDNB)

2.3.1 Khảo sát thành phần hóa học của hạt bụp giấm

Mẫu nguyên liệu: Hạt bụp giấm

Xử lý nguyên liệu: Hạt bụp giấm được xay nghiền thành dạng bột mịn lọt qua rây có

2.3.2 Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu

2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của vỏ

Mẫu nguyên liệu: Bột hạt bụp giấm

Xử lý nguyên liệu:

- Đối với mẫu hạt bụp giấm không loại bỏ vỏ, bột hạt bụp giấm được nghiềnướt với tỷ lệ nguyên liệu và nước là 1:10, sau đó toàn bộ dịch sẽ được xử lý qua cáccông đoạn tiếp theo để chuẩn bị cho quá trình lên men

- Đối với mẫu hạt bụp giấm có loại bỏ vỏ, bột hạt bụp giấm được nghiền ướt với

tỷ lệ nguyên liệu và nước là 1:10, sau đó được lọc qua rây có kích thước lỗ là 71 μm để

21

loại bỏ vỏ Tỷ lệ vỏ thu nhận nằm trong khoảng 35% (khối lượng vỏ khô so với khốilượng bột khô) Dịch sau khi lọc sẽ được tiếp tục xử lý qua các công đoạn tiếp theo đểchuẩn bị cho quá trình lên men.

Cả hai mẫu dịch bụp giấm không loại bỏ vỏ và có loại bỏ vỏ sau khi được xử lý

sẽ được lên men với các thông số cố định sau:

- pH: 6.4

- Nhiệt độ: 38 °C

- Tỷ lệ giống cấy: 10% (v/v)

- Hàm lượng đường bổ sung: 0%

- Thời gian: 24 giờ

2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất béo trong nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu: Bột hạt bụp giấm

Xử lý nguyên liệu:

- Mẫu nguyên béo không vỏ: Được chuẩn bị như ở mục 2.3.2.1

- Mẫu tách béo không vỏ: Bột hạt bụp giấm sẽ được tách béo bằng phương phápSoxhlet trong dung môi petroleum ether với tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:20 trong

8 giờ Bột hạt bụp giấm tách béo được đuổi dung môi ở nhiệt độ phòng, sau đó đượcnghiền ướt với tỷ lệ nguyên liệu : nước là 1:10

- Nghiền ướt: Cả hai mẫu tách béo và không tách béo sẽ được nghiền ướt với tỷ

lệ nguyên liệu : nước là 1:10 và lọc qua rây có kích thước lỗ là 71 μm để loại bỏ vỏ.Dịch bụp giấm sau khi được xử lý sẽ được lên men với các thông số cố định sau:

- pH: 6.4

- Nhiệt độ: 38 °C

- Tỷ lệ giống cấy: 10% (v/v)

- Hàm lượng đường bổ sung: 0%

- Thời gian: 24 giờ

2.3.2.3 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu và nước

Mẫu nguyên liệu: Bột hạt bụp giấm đã tách béo

Xử lý nguyên liệu: Nguyên liệu được xử lý như ở mục 2.3.2.2 với tỷ lệ nguyên liệu :

nước (w/v): 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 Dịch bụp giấm sau khi được xử lý sẽ được lên

men với các điều kiện sau:

- pH: 6.4

- Nhiệt độ: 38 °C

- Tỷ lệ giống cấy: 10% (v/v)

- Thời gian lên men: 24 giờ

- Hàm lượng đường bổ sung: 0%

2.3.3 Khảo sát điều kiện lên men

Sau khi xử lý nguyên liệu, dịch bụp giấm thu được sẽ được tiến hành lên men theo sơ

Lọc

Xác định hàm lượng GABA

Dịch bụp giấm

Hình 2.1 Quy trình lên men

2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH

Mẫu nguyên liệu: Dịch bụp giấm đã tách béo và loại bỏ vỏ với tỷ lệ nguyên liệu và

nước là 1:10

Chỉnh pH: Dịch bụp giấm sau khi được xử lý sẽ được chỉnh pH bằng NaOH 1N và

HCl 1N lần lượt với các giá trị sau: 4; 5; 6; 6.4 (không chỉnh); 7; 8.

Sau khi chỉnh pH dịch bụp giấm sẽ được lên men với các thông số cố định sau:

- Nhiệt độ: 38 °C

- Tỷ lệ giống cấy: 10% (v/v)

- Hàm lượng đường bổ sung: 0%

- Thời gian: 24 giờ

2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Mẫu nguyên liệu: Dịch bụp giấm đã tách béo và loại bỏ vỏ với tỷ lệ nguyên liệu và

- Hàm lượng đường bổ sung: 0%

- Thời gian: 24 giờ

2.3.3.3 Khảo sát tỷ lệ giống cấy

Mẫu nguyên liệu: Dịch bụp giấm đã tách béo và loại bỏ vỏ với tỷ lệ nguyên liệu và

- Hàm lượng đường bổ sung: 0%

- Thời gian: 24 giờ

25

2.3.3.4 Khảo sát hàm lượng đường bổ sung

Mẫu nguyên liệu: Dịch bụp giấm đã tách béo và loại bỏ vỏ với tỷ lệ nguyên liệu và

nước là 1:10

Dịch bụp giấm sau khi xử lý sẽ được bổ sung đường saccharose với hàm lượng lần lượt

là: 0%, 10%, 15%, 20%, 25% (w/w nguyên liệu), sau đó được lên men với các thông

2.4.5 Xác định hàm lượng đường khử

Phương pháp: Chuẩn độ oxy hóa khử với Ferrycyanure (Phụ lục A5)

2.4.6 Xác định hàm lượng đường tổng và tinh bột

Phương pháp: Chuẩn độ oxy hóa khử với Ferrycyanure (Phụ lục A5)

2.5.1 Xử lý số liệu bằng phân tích phương sai ANOVA

Nguyên tắc: Phân tích phương sai là phương pháp phân tích thống kê mà trọng

điểm là phương sai (thay vì số trung bình) nhằm kiểm định sự sai khác giữa các nhóm

Giả thiết Ho : Sự khác nhau giữa các nhóm phân tích chỉ là ngẫu nhiên với mức

ý nghĩa là 5%

Nếu P–value < 0,05 thì có sự khác biệt có nghĩa giữa các nhóm

Nếu P–value > 0,05 thì không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nhóm

Tiến hành: Sử dụng phần mềm Statgraphics

2.5.2 Sàng lọc các yếu tố có ảnh hưởng đến hàm mục tiêu

Nguyên tắc: Bố trí thí nghiệm dựa trên sự tương tác giữa các yếu tố để chọn ra

các yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu

27

Tiến hành: Sử dụng phần mềm JMP 9.0

2.5.3 Tối ưu hóa các thông số bằng qui hoạch thực nghiệm

Tiến hành: Sử dụng phần mềm Modde 5.0 để tối ưu hóa các thông số.

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu

Kết quả khảo sát thành phần hóa học của nguyên liệu được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của hạt bụp giấm

Thành phần Hàm lượng (%)

điều kiện dinh dưỡng cho vi khuẩn Lactobacillus acidophilus phát triển một cách tốt

nhất Do đó, môi trường lên men cần được khảo sát điều chỉnh để tạo điều kiện cho visinh vật phát triển cũng như tạo điều kiện cho quá trình tổng hợp GABA được diễn ratốt nhất

3.2 Khảo sát điều kiện xử lý nguyên liệu

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của vỏ

Quá trình lên men đối với mẫu dịch bụp giấm có vỏ và đã loại vỏ được ghi nhậnsau 24 giờ lên men như sau:

- Mẫu dịch bụp giấm chưa loại bỏ vỏ: Sự phát triển của vi sinh vật được kiểmsoát qua sự thay đổi của giá trị pH Nhưng kết quả cho thấy giá trị pH thay đổi khôngđáng kể (giảm 0.1 đơn vị), đồng thời kết quả đếm khuẩn lạc cũng bằng không Điềunày chứng tỏ không có dấu hiệu của quá trình lên men hoặc quá trình lên men xảy rarất yếu

- Mẫu dịch bụp giấm đã loại bỏ vỏ: pH giảm khoảng 1 đơn vị và số tế bào visinh vật tăng từ 106 lên 107 CFU/ml Đồng thời nồng độ GABA cũng tăng từ 0.42 lên

0.72 g/100 ml Điều này khẳng định vi khuẩn Lactobacillus acidophilus có thể sinh

trưởng trong dịch bụp giấm đã loại bỏ vỏ

29

Nguyên nhân được kiến nghị có thể là do trong vỏ có chứa các thành phần cókhả năng kháng khuẩn dẫn đến vi sinh vật không thể phát triển được trong môi trườngdịch bụp giấm chưa loại bỏ vỏ Tuy nhiên đến nay chưa có công bố nào về khả năngkháng khuẩn của hạt bụp giấm Khi vi sinh vật không phát triển trong môi trường đóthì đồng nghĩa với việc pH không thay đổi và enzyme GAD cũng không được sinh radẫn đến không có sự chuyển hóa acid glutamic thành GABA.

Như vậy dịch bụp giấm đã loại bỏ vỏ được lựa chọn để lên men trong các khảosát tiếp theo

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất béo trong nguyên liệu

Quá trình lên men đối với mẫu dịch bụp giấm chưa tách béo và đã tách béođược thể hiện kết quả ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất béo trong nguyên liệu đến quá trình lên

men tổng hợp GABA

Thông số

Mẫu

Nồng độ GABA (g/ 100ml)

Tổng số tế bào vi sinh vật (log CFU/ml) pH

hàm lượng chất béo chiếm đến 21.82% Do đó, ở mẫu dịch bụp giấm đã tách béo visinh vật phát triển tốt hơn dẫn đến hàm lượng GABA cũng được tạo ra nhiều hơn.

Ngoài ra chất béo cũng cản trở quá trình sinh trưởng và sự trao đổi chất của visinh vật Do đó, ở mẫu bụp giấm chưa tách béo vi sinh vật phát triển yếu dẫn đếnlượng enzyme sinh ra không đủ để chuyển hóa acid glutamic thành GABA

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước (w/v) đến hiệu suấtsinh tổng hợp GABA (g/100 g nguyên liệu), hàm lượng GABA (g/100 ml), tổng số visinh vật và giá trị pH sau 24 giờ lên men được trình bày trong hình 3.1, hình 3.2 vàhình 3.3

31

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước đến hiệu suất sinh tổng hợp GABA

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước đến hàm lượng GABA và tổng số vi

sinh vật sau 24 giờ lên men

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước đến giá trị pH sau 24 giờ lên men

Dựa vào kết quả thu được, nhận thấy, sau 24 giờ lên men thì hàm lượng GABAthu được ở mẫu có tỷ lệ nguyên liệu so với nước ở khoảng 1:10 là cao nhất: 1.16 g/100

ml Tuy nhiên nếu xét trên mức độ tổng hợp GABA trên lượng nguyên liệu ban đầu ởhình 3.1 thì tỷ lệ nguyên liệu so với nước là 1:15 cho kết quả hàm lượng GABA caonhất

Mazur (2011) cho rằng khi gia tăng nồng độ của tiền chất sẽ dẫn đến sự tăngcường của các quá trình phản ứng khử carboxyl Bên cạnh đó, Brown (1976) cho rằng

vi sinh vật chịu ảnh hưởng của sự biến đổi nồng độ thẩm thấu trong môi trường Nồng

độ thẩm thấu trong môi trường có ảnh hưởng sâu sắc đối với vi sinh vật

Như vậy có thể thấy rằng, ở các mẫu có tỷ lệ nước so với nguyên liệu càng cao,hàm lượng chất khô mà đặc biệt là acid glutamic, tiền chất của phản ứng decarboxyltạo ra GABA giảm đi, thì hàm lượng GABA sinh ra cũng thấp Ở mẫu có tỷ lệ nguyênliệu so với nước là 1:5, tuy hàm lượng chất dinh dưỡng khá cao, nhưng điều đó dẫnđến một áp suất thẩm thấu cao, khiến các hoạt động sinh trưởng, tổng hợp enzyme tạoGABA cũng bị ảnh hưởng, dẫn đến hàm lượng GABA sinh ra thấp

Tổng số vi sinh vật ở hai mẫu có tỷ lệ nguyên liệu và nước (w/v) là 1:20 và1:25, tổng số tế bào vi sinh vật là khá thấp so với các mẫu còn lại Điều này được giảithích là do nồng độ cơ chất thấp dẫn đến vi sinh vật không thể phát triển một cách tốtnhất.

Tỷ lệ nguyên liệu và nước (w/v) là 1:10 được chọn làm điều kiện để khảo sát ởcác thí nghiệm tiếp theo

3.3 Khảo sát điều kiện lên men

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của giá trị pH đầu

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của giá trị pH đầu đến hàm lượng GABA (g/100ml), tổng số vi sinh vật (log CFU/ml) và giá trị pH sau 24 giờ lên men được trình bàytrong hình 3.4 và hình 3.5

Hình 3.4 Ảnh hưởng của giá trị pH đầu đến hàm lượng GABA và tổng số vi sinh vật

sau 24 giờ lên men

Hình 3.5 Ảnh hưởng của giá trị pH đầu đến giá trị pH sau 24 giờ lên men

Kết quả ở hình 3.4 cho thấy hàm lượng GABA sinh ra ở mẫu được chỉnh pHban đầu là 6.4 là cao nhất: 1.05 g/100 ml

Ở các mẫu được chỉnh pH ban đầu là 5, 6 và 7, hàm lượng GABA sinh ra thấphơn so với mẫu được chỉnh pH ban đầu là 6.4 Ở các mẫu được chỉnh pH ban đầu là 4

33

và 8, hàm lượng GABA sinh ra là thấp đáng kể so với mẫu được chỉnh pH ban đầu là6.4.

Nghiên cứu của các tác giả Komatsuzaki, N (2005), Tsai, J.S (2006) và Yang,S.Y (2008) cho rằng quá trình sinh tổng hợp GABA bằng con đường lên men chịu ảnhhưởng rõ rệt bởi giá trị pH Li, H (2010), Yang, S.Y (2008) cho rằng enzyme GAD củacác loài vi sinh vật khác nhau là khác nhau, do đó pH thích hợp để quá trình sinh tổng

hợp GABA của các loài vi sinh vật cũng khác nhau Lactobacillus plantarum

DSM19463 tổng hợp các GABA tối đa (59 mM/ h) ở pH 6.0 (Di Cagno, R., 2010),

Lactobacillus paracasei NFRI 7415 tổng hợp GABA cao nhất (210 mM) tại pH 5,0 (Kumar, S., 2000) Lactobacillus brevis GABA 057 chuyển đổi tổng số 10% của

monosodium glutamate (MSG) tạo thành GABA ở pH 4.2 (Soo, I.M.C., 2006)

Lactobacillus lactis cho hàm lượng cao nhất của GABA (7.2 g/ l) ở pH dao động từ

7.5 – 8.0, tuy nhiên, hàm lượng GABA ở pH trên 8.0 giảm xuống rõ rệt, điều đó chỉ ra

rằng Lactobacillus lactis sinh tổng hợp GABA tối ưu ở pH kiềm nhẹ, dao động trong

Như vậy có thể dự đoán rằng, enzyme GAD của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus hoạt động tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp GABA ở giá trị pH khoảng 6.4 Các enzyme phân hủy GABA có trong vi khuẩn Lactobacillus acidophilus hoạt

động tối ưu ở pH 8 trở lên

Số lượng vi sinh vật ở mẫu được chỉnh pH ban đầu là 6.4 sau 24 giờ lên men làcao nhất: 7.49 log CFU/ml Ở mẫu này, sau 24 giờ lên men, pH giảm xuống giá trị 4.5.

Điều này phù hợp với lý thuyết, vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cũng hoạt động tốt

ở pH dưới 5 Đồng thời thấy được rằng, hoạt động của vi sinh vật có ảnh hưởng đếnquá trình sinh tổng hợp GABA

Hình 3.5 cho thấy, sau 24 giờ lên men, pH của tất cả các mẫu đều giảm từ 0.6

đến 1.8 đơn vị Điều này có thể được giải thích rằng Lactobacillus acidophilus là vi

khuẩn lên men lactic đồng hình, nên lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men

đã làm pH thay đổi đáng kể

Như vậy, giá trị pH ban đầu của dịch lên men là 6.4 được chọn làm điều kiện đểkhảo sát ở các thí nghiệm tiếp theo

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men (°C) đến hàm lượng GABA(g/100 ml), tổng số vi sinh vật (log CFU/ml) và giá trị pH sau 24 giờ lên men đượctrình bày trong hình 3.6 và hình 3.7

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng GABA và tổng số vi sinh vật

sau 24 giờ lên men

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến giá trị pH sau 24 giờ lên men

Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau 24 giờ lên men ở nhiệt độ 38 °C, hàm lượngGABA sinh ra là cao nhất: 0.92 g/100 ml

35

Ở các mẫu được lên men ở nhiệt độ 43 °C và 48 °C, hàm lượng GABA sinh ra

là thấp đáng kể so với mẫu được lên men ở nhiệt độ 38 °C

Hàm lượng vi sinh vật của mẫu lên men ở nhiệt độ 38 °C sau 24 giờ là cao nhất:7.26 log CFU/ml Hàm lượng vi sinh vật của các mẫu lên men ở nhiệt độ 43 °C và 48

°C sau 24 giờ là thấp đáng kể so với mẫu lên men ở nhiệt độ 38 °C

Nhiệt độ lên men cũng là một yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất sinh tổnghợp GABA Ngoài ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác sinh học, nhiệt độ còn ảnh hưởngđến trạng thái cân bằng nhiệt động lực học của phản ứng Kim, J.Y (2009) cho rằng,quá trình chuyển hóa tạo GABA đạt hiệu suất cao cần một mật độ tế bào vi khuẩn cao

và cũng cần một nhiệt độ lên men thích hợp Li, H (2010) cho rằng mật độ tế bào phụ

thuộc vào nhiệt độ môi trường Lactobacillus brevis NCL912 tăng trưởng tốt với nhiệt

độ khoảng 35 °C Lactobacillus plantarum DSM19463 tổng hợp GABA tốt nhất (59

mM/ h) ở nhiệt độ từ 30 °C đến 35 °C (Di Cagno, R., 2010) Nói chung, nhiệt độ lênmen trong khoảng 25 °C đến 40 °C cho hiệu suất sinh tổng hợp GABA tốt nhất(Radhika Dhakal, 2012)

Từ đó, có thể thấy rằng, nhiệt độ lên men 38 °C là nhiệt độ thích hợp để hàm

lượng Lactobacillus acidophilus đạt lớn nhất, đồng thời quá trình chuyển hóa tạo

GABA cũng đạt hiệu suất cao nhất Điều này phù hợp với lý thuyết khoảng nhiệt độ tối

ưu để vi khuẩn Lactobacillus acidophilus phát triển tối ưu là 37 – 40 °C Trong phạm

vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vìphản ứng xúc tác nhờ enzyme cũng giống như các phản ứng hóa học nói chung, khinhiệt độ tăng lên 10 °C tốc độ phản ứng sẽ tăng gấp đôi Vì các phản ứng trong tế bàođều tăng cho nên toàn bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và visinh vật sẽ sinh trưởng nhanh hơn Lúc nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thìnhiệt độ càng tăng tốc độ sinh trưởng càng giảm Khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh vật

sẽ chết Khi nhiệt độ quá cao sẽ gây ra sự biến tính của enzym và các protein khác Do

đó mặc dù ở nhiệt độ càng cao các phản ứng xúc tác tiến hành càng nhanh nhưng docác nguyên nhân nói trên mà tế bào bị tổn thương đến mức khó hồi phục và dẫn đếnviệc ức chế sinh trưởng Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp màng sinh chất bị kết đông lại,enzyme cũng ngừng hoạt động Nói chung, nếu vượt quá nhiệt độ tốt nhất đối với visinh vật, chức năng và kết cấu tế bào đều bị ảnh hưởng.

Ở các mẫu được lên men ở nhiệt độ 33 °C và 38 °C, pH sau 24 giờ lên mengiảm đáng kể (1.3 đơn vị) Trong khi đó ở mẫu lên men ở nhiệt độ 43 °C, độ giảm này0.6 đơn vị, còn ở mẫu lên men ở nhiệt độ 48 °C, độ giảm này chỉ còn 0.4 đơn vị Như

vậy có thể thấy rằng, ở các nhiệt độ cao trên 40 °C, vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

không thể phát triển tối ưu, từ đó không thể sinh tổng hợp GABA với một hiệu quả caonhất

Như vậy, nhiệt độ lên men 38 °C được chọn làm nhiệt độ cho các thí nghiệmtiếp theo

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy (% v/v) đến hàm lượng GABA(g/100 ml), tổng số vi sinh vật (log CFU/ml) và giá trị pH sau 24 giờ lên men đượctrình bày trong hình 3.8 và hình 3.9

Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến hàm lượng GABA và tổng số vi sinh vật

sau 24 giờ lên men

37

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến giá trị pH sau 24 giờ lên men

Kết quả thu được cho thấy, sau 24 giờ lên men thì lượng GABA thu được ở mẫu

có tỷ lệ giống cấy là 15% (v/v) là cao nhất: 1.28 g/100 ml Tuy nhiên số lượng vi sinhvật sau 24 giờ của mẫu có tỷ lệ giống cấy là 10% (v/v) là cao nhất

Gomes (1998) đã khảo sát đặc tính sinh lý của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus bằng cách nuôi cấy chúng trên môi trường sữa bò thu nhận từ Nagoya,

Nhật Bản trong 30 giờ ở 37 °C với các tỷ lệ giống cấy khác nhau Kết quả phân tíchcho thấy ở các tỷ lệ giống cấy khác nhau sẽ ảnh hưởng đến các thông số sinh trưởngcủa vi khuẩn Với tỷ lệ giống cấy tăng dần từ 1:10, 1:1 đến 10:1, hàm lượng vi sinh vậtsau 30 giờ nuôi cấy đạt giá trị cao nhất ở tỷ lệ 1:1, với 8.72 log CFU/ml Ở hai mẫu có

tỷ lệ giống cấy 1:10 và 10:1, giá trị đó lần lượt là 8.30 log CFU/ml và 8.42 logCFU/ml Tương tự với hàm lượng acid lactic sinh ra, mẫu có tỷ lệ giống cấy 1:1 chokết quả cao nhất: 1005 mg/g Ở hai mẫu có tỷ lệ giống cấy 1:10 và 10:1, giá trị đó lầnlượt là 752 mg/g và 846 mg/g

Có thể nhận thấy rằng, với cùng một nồng độ dinh dưỡng cố định, các mẫu có tỷ

lệ giống cấy thấp như mẫu 5% và 10% tỷ lệ giống cấy, hoặc mẫu có tỷ lệ giống cấy caonhư mẫu 20% tỷ lệ giống cấy đều không cho kết quả tốt như mẫu 15% tỷ lệ giống cấy

Tỷ lệ giống cấy quá thấp sẽ tạo một điều kiện dinh dưỡng tốt cho vi sinh vật, khiếnchúng đi vào các giai đoạn của quá trình sinh trưởng quá nhanh, từ đó quá trình sinhenzyme tổng hợp GABA không được hiệu quả Tỷ lệ giống cấy quá cao sẽ khiến visinh vật gặp một điều kiện phát triển không tốt, nồng độ dinh dưỡng thấp, các vi sinhvật phải cạnh tranh với nhau, đồng thời chất thải từ chúng tạo ra cũng là một nguyênnhân ức chế quá trình sinh tổng hợp GABA Cụ thể hơn thì trong quá trình sinh trưởng