Nghiên cứu chiết xuất hóa học, dược lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng và kháng nấm bệnh của quả cây du trà (camellia (sp ) họ theaceae nhằm làm thuốc hạn chế sinh s

Chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản bộ khoa học và công nghệ báo cáo kết quả nghiên cứu Đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất hoá học, dược lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng v

Chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản

bộ khoa học và công nghệ

báo cáo kết quả nghiên cứu

Đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất hoá học, dược lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng v

kháng nấm bệnh của quả cây du trà (Camellia (Sp.)

họ Theaceae) nhằm làm thuốc hạn chế sinh sản, thuốc phụ khoa góp phần phục vụ mục đích bảo vệ

sức khoẻ sinh sản phụ nữ & KHHGĐ”

Mã số đề tài: 511402 Giai đoạn: 2002-2005 Thuộc chương trình nghiên cứu KHCBNN

Chủ nhiệm đề tài: GS TSKH Phạm Trương Thị Thọ

6126

29/9/2006

hà nội - 2006

Cán bộ tham gia đề tài 511402

STT Họ và tên Học vị Cơ quan Nhiệm vụ

1 Phạm Trương Thị Thọ GS.TSKH Viện dược liệu Chủ nhiệm đề

tài

2 Đinh Thị Thuyết Dược Sĩ “ Phân tích

4 Nguyễn Thị Phương Dược Sĩ “ Tiêu chuẩn

5 Nguyễn Minh Phương Bác Sĩ “ Sinh hoá

8 Nguyễn Duy Thuần TS Viện phó VDL

9 Nguyễn Minh Châu DS Viện Dựoc liệu

Theo dõi quản

lý đề tài

10 Trần Thu Hà Thạc Sỹ Viện Phụ sản

11 Nguyễn Thanh Thuỷ Y sỹ Viện Phụ sản

Thử tác dụng (test invitro)

12 Trần Lưu Vân Hiền PGS TS Viện y học dân tộc

Thử tác dụng (test invivo)

Độc tính mãn,

độc tính sinh sản

15 Lê Thị Phương Bác sỹ Viện da liễu TW Thử kháng

nấm

16 Lê Thị Anh Đào PGS TS ĐHSP Hà Nội

17 Nguyễn Minh Tú TS ĐHBK Hà Nội

Đào tạo sinh viên, thạc sỹ

Mục lục

Số

TT

1 Lời nói đầu – Giới thiệu vấn đề 1 -2

2 Các kết quả nghiên cứu

- Tác dụng của hoạt chất Sf lên tinh trùng (Test invitro)

- Tác dụng hoạt chất Sf lên tinh trùng (Test invivo)

- Xét nghiệm vi thể

- Liều độc LD50, liều độc bán trường diễn

- Tác dụng kháng nấm

10 -14 15- 18

19 – 21

21 -22 22- 26

5 C Thăm dò nghiên cứu dạng bào chế 26- 27

12 Bài báo thứ nhất “Contribution to the study on chemistry and

biological activity of Saponin extracted from the seed of Du Tra

tree growing in Vietnam”

10th Asian Chemical Congress, 10 ACC

8th Eurasia Conference on Chemical Sciences Eu As C2S – 8

52- 57

13 Luận văn sinh viên Phạm Quang Huy ĐHSP 6/2003: “Bước

đầu tìm điều kiện tối ưu để tách saponin từ cây Sở dầu

(Camellia oleifera Abel) Bảo vệ ngày 10/6/2003 tại ĐHSP HN

đạt xuất sắc

58

14 Luận văn Thạc sĩ ĐInh Ngọc Thức, ĐHSP tháng 11 năm 2003:

“Bước đầu nghiên cứu một số thành phần hoá học cây Sở Dỗu

Nghệ An (Camellia drupifera (Lour) Pierre Bảo vệ ngày

10/11/2003 tại ĐHSP HN đạt loại giỏi

59

15 The biological subsstance extracted from Camellia sp growing

in Vietnam.Tạp chí dược liệu tập 9 số 6 2004 trang 185-187

60- 63

16 Tác dụng hoạt chất Sf từ 1 loài Camellia (sp.) lên tinh trùng

người

Những vấn đề nghiên cứu cơ bản ttrong khoa học sự sống

Hội nghị toàn quốc 2004 28.10.2004 Học viện Quân Y

64- 68

17 Bản số liệu gốc phân tích tinh dịch Thử tác dụng Sf (test in

vitro)

69- 85

18 Phân tích tinh dịch; so sánh với tác dụng của nước muối sinh lý;

tinh dịch + nước muối sinh lý; tinh dịch + nước muối sinh lý

+hoạt chất

86- 118

19 Study of spermicical effect in vitro on human spermatozoa and

in vivo á locally applied in the vagina of rat and reproductive

toxicity of the active product Sf extracted from Camellia sp –

Theacea growing in Vietnam”

RSCE 2005 (Regional Symposium on Chemical Engineering)

New Trends in Technology Towards Subtainable Development

Proceedings, November 30 – December 2, 2005 pp 346-353

119-

128

20 Nghiên cứu tác dụng diệt tinh trùng và độc tính sinh sản của

hoạt chất Sf tách được từ quả Du Trà Camellia sp họ Theacea

Lời nói đầu

I Giới thiệu vấn đề

Cho đến nay, đã có nhiều tài liệu giới thiệu cây thuốc Việt Nam dưới nhiều hình thức phong phú và sinh động Song, chưa có tài liệu nào đề cập riêng đến các cây thuốc có tác dụng hạn chế sinh sản một cách có hệ thống theo kinh nghiệm dân gian và trên cơ sở nghiên cứu khoa học và cũng cho đến nay chưa có một dạng thuốc hạn chế sinh sản nào thích hợp, được bào chế từ nguồn dược liệu sẵn

có trong nước

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu đề tài "Sàng lọc cây thuốc có tác dụng kế hoạch hoá gia đình" của Uỷ ban Quốc gia dân số kế hoạch hoá gia đình - năm 1996-1997; Đề tài: "Sàng lọc các cây thuốc hạn chế sinh sản nam và nữ" thuộc chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản nhà nước năm 1999-2000 từng phần các kết quả đã được báo cáo tại Hội nghị Châu á lần thứ 9 về cây thuốc, hương liệu và các hợp chất thiên nhiên khác (ASOMPS IX) tổ chức tại Hà Nội năm 1998; Hội nghị khoa học và công nghệ hoá hữu cơ lần thứ 1 ở Quy Nhơn năm 1999; Hội thảo sinh học Quốc tế ở Hà Nội năm 2001 Một số kết quả đã được giới thiệu trên các tạp chí trong nước Chúng tôi đã tập hợp các kết quả đó lại, kết hợp với việc siêu tầm các bài thuốc theo kinh nghiệm dân gian một cách chọn lọc và tham khảo các công trình nghiên cứu của nước ngoài, để biên soạn cuốn "101 cây thuốc với sức khoẻ sinh sản phụ nữ" (NXB KHKT 2002)

Từ 101 cây thuốc, chúng tôi đã chọn 1 cây có tính khả thi nhất làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài Đó là cây Dutrà(trà mai, chè dầu, sở) tên khoa học là

Camellia drupifera (lour ) Piere Camellia obifera C Abel họ Theaceac Cây Dutrà

là một trong vài loại cây được chọn làm đối tượng trồng rừng phòng hộ (trong 5 triệu ha rừng) để chống xói mòn và phủ xanh đồi trọc Cho đến nay, diện tích rừng Dutrà lên đến 7500 ha, tập trung ở các tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hoá, Nghệ An- Rừng đã khép tán và cho thu hoạch Mùa thu hoạch từ tháng 9 -

12 hàng năm Một ha rừng Dutrà 1 vụ có thể cho thu hoạch từ 4 - 5 tấn quả Một tấn quả cho khoảng 240 kg dầu béo và khoảng 500 kg bã khô dầu Thực tế, đa số người trồng rừng chưa biết tận dụng khai thác nguồn tài nguyên này, nên còn đói nghèo, có khi còn chặt phá rừng làm ảnh hưởng đến môi trường Nói đến Dutrà người ta nghĩ ngay đến việc khai thác dầu béo từ quả của nó, nhưng phần bã khô

dầu còn lại sau khi ép dầu chưa được tận dụng, có nơi người ta vứt bừa bãi bã khô dầu xuống ao hồ để giết cá, điều đó làm ô nhiễm môi trường nước nuôi tôm

Theo một số tài liệu tham khảo trong và ngoài nước cho biết, trong dầu béo

có chứa 1 lượng Saponin, do đó dầu cần phải xử lý mới ăn được Trong bã khô dầu cũng có chứa một hàm lượng Saponin tương đối cao, nhưng chưa có tài liệu nào giới thiệu rõ và chứng minh đầy đủ tác dụng hạn chế sinh sản của nó

Chính vì vậy, chúng tôi đã đề xuất đề tài:"Chiết xuất hoá học, dược lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng và kháng nấm bệnh của quả cây Dutrà (một

loài Camellia- Họ Theaceac) nhằm làm thuốc hạn chế sinh sản, thuốc phụ khoa,

góp phần phục vụ mục đích bảo vệ sức khoẻ sinh sản phụ nữ & KHHGĐ

Đề tài thuộc chương trình nghiên cứu KHCBNN - Hướng khoa học tự nhiên Mã số đề tài 511402 - giai đoạn 2002 - 2005

Đề tài khoa học cơ bản nêu trên đã được Hội đồng khoa học ngành Hoá học, Hội đồng khoa học tự nhiên đánh giá kết quả thực hiện loại : Đạt

II Các kết qủa nghiên cứu

A- Những nghiên cứu về hoá học

1- Phân tích sàn lọc sơ bộ hoá thực vật bã khô dầu Dutrà

Dùng các phản ứng định tính với các thuốc thử đặc hiệu để xác định các nhóm chất hoá học có trong bã khô dầu quả Dutrà Kết quả ghi ra ở bảng

Bảng1: Các nhóm chất hoá học trong bã khô sở

Nhóm chất Thuốc thử Kết quả

Ankaloit Flavonoit Tanin Cumanrin Glucozit tim Saponin Sterol

Dragendoff Xianidin FeCl3Axít & Kiềm Keller-Kliani Tạo Bọt Liberman-buchardart

- + + + +

-

- + +

- Kết quả thử định tính cho thấy trong bã khô sở Dutrà có chứa chủ yếu là Saponin, Flavonoit, Tanin

2- Sơ đồ chiết bã khô Dutrà theo độ phân cực của dung môi

a/ Khảo sát phân đoạn1: Phân đoạn n-hexan này có chứa nhiều lipít và

nhiều axít béo tự do: Dung dịch làm mất màu nước Brôm, chứng tỏ trong dịch chiết có các axít béo không no, điều đó phù hợp với các tài liệu về dầu sở là các gluxrít của axít oleic, linoléic, stearic

b/ Khảo sát phân đoạn 2 (CHCL 3 ): Phân đoạn 2 được xử lý qua sắc kí cột

SiO2 Hệ dung môi theo tỉ lệ tăng cực dần ở phân đoạn thứ 19, Hệ dung môi CHCl3 : MeOH (9:1) thu được một chất, chất này kết tinh lại trong axêton, màu vàng sáng - điểm nóng chảy đC = 2600 - 2620

* Sắc kí trên lớp mỏng SiO 2

Hệ dung môi CHCl3 : MeOH (3:1)

thuốc hiện 1/ Vanilin/H2SO4

2/ Boric acid/oxalic acid

Sắc kí đồ hiện 1 vết rõ màu vàng cam Rf = 0,44 - Chất được ký hiệu Kf

Sắc ký đổ cho thấy phân đoạn 2 này có chứa nhóm các chất flavonoit

Chất ký hiệu Kf có Rf tương đương với nhóm này

b'/ Xác minh cấu trúc hoạt chất Kf từ phân đoạn CHCl 3 của bã Dutrà

Bằng các phương pháp vật lý hiện đại như: Hồng ngoại (IR); Phổ tử ngoại (UV); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H NMR); Phổ DEPT-90; Phổ DEPT-

135 Phổ 2 chiều HMQC và HMBC đã xác định được chất Kf chiết được từ phân

đoạn CHCl3 của bã Dutrà là một flovonol có tên là Kaempherol tên IUPAC là 3, 5,

7 - Trihydroxy - 2-(4 - Hidroxy phenyl)-4H-1-Benzopyran -4-one

Công thức cấu tạo như sau: C15H10O6 m/z = 286

Theo vài tài liệu tham khảo Kaempherol có khả năng kháng ung thư vú, chống hoại tử do nọc rắn độc gây ra

(Phụ lục số 15 trang 60 - 63)

c/ Khảo sát phân đoạn 3: Phân đoạn MeOH

Phân đoạn 3 được xử lý như sau:

Dung dịch MeOH → thu hồi MeOH → cặn còn lại hoà tan với Butanol bão hoà nước → cất dung môi đến cạn → hoà tan lại bằng MeOH → rửa bằng axêton : ête (5:1) → thu được hỗn hợp Saponin → tinh chế→ saponin sạch ký hiệu S3

* Các phản ứng đặc trưng của Saponin (S 3 ) chiết xuất từ bã Dutrà

1/ Phân biệt hai loại Saponin: Tritecpen và Steroit

- Hoà tan 5 mg chất S3 trong 5ml cồn loãng vào 2 ống nghiệm cao 25 cm ống thứ 1 độ pH = 13, ống thứ 2 độ pH = 1

- Lắc mạnh 2 ống nghiệm như nhau trong 1 phút - Bọt nhiều và bền vững ở ống thứ 2 (môi trường axit) chứng tỏ - saponin là loại Saponin tritecpen

2/ Chỉ số bọt: Chỉ số bọt của Saponin được tính theo công thức :

x75

Vòng phá huyết của Saponin S3 từ bã Dutrà

4/ Khảo sát hoạt chất Saponin S 3 từ bã Dutrà

Saponin S3 có màu vàng nâu nhạt, tinh thể mịn, sáng đẹp, mùi hắc S3 tan tốt

(4:1), tan tốt trong nước nóng, ít tan trong nước lạnh, không tan trong ete đầu CHCl3, C6H6, n-hexan

Sắc ký lớp mỏng trên SiO2

Hệ dung môi CHCl3 : MeOH : H2O

65 : 35 : 10

Cho Rf = 0,45 - 0,47 ở vị trí Rf 0,44 luôn có vết màu vàng kèm theo với

nóng chảy khó xác định Từ 1860 bắt chảy, kéo dài đến 2300 - 2400 thì phồng lên

và caramen hoá Điều đó thể hiện S3 không phải là một chất mà là một nhóm chất

có nhiều mạch đường phức tạp dưới dạng tritecpen oligoglycosides

cho thấy S3 có chứa cả Cacbon bậc 1, 2, 3, 4 Như vậy đây là những chất rất phức tạp Việc nghiên cứu cấu trúc hoá học của S3 đang được tiếp tục tiến hành với luận

án thạc sĩ năm 2006

(Phụ lục số14 trang 59)

5/ Nghiên cứu qui trình chiết xuất hoạt chất có tác dụng sinh học Sf từ bã

khô dầu quả Dutrà

Trong nghiên cứu dược liệu để làm thuốc, việc nghiên cứu cấu trúc hoá học hoạt chất là một việc làm rất cần thiết để chứng minh tính khoa học, hiện đại và từ

đó góp phần giải thích bản chất cơ chế tác dụng của thuốc Do đó, việc nghiên

cứu cơ bản phải thực hiện đến mức tối đa có thể Song, trong thực tế, tuỳ loại thuốc, người ta thường chiết không phải đơn chất mà là hỗn hợp hoạt chất, để hiệu suất cao tác dụng hiệp đồng và hiệu quả kinh tế cao

- Trên cơ sở đó chúng tôi đã xây dựng quy trình chiết tách hỗn hợp Saponin - flavonoil ("Sf") từ bã Dutrà

6/ Qui trình chiết tách hỗn hợp Saponin - Flavonoit "Sf" từ bã khô dầu

Hoà tan với nBuOH bão hoà nước

Hoà lại với MeOHDịch MeOH

Dịch đặc MeOH

Cất quay chân không

Cất quay chân khôngDịch đặc MeOH

Tủa với axêton: etê (5:1)

Tinh chế Hoạt chất "Sf" sạch

Hỗn hợp thô "Sf"

Dịch MeOH

Các thông số của hoạt chất "Sf" từ bã khô dầu

Hoạt chất "Sf" có tinh thể vô định hình màu vàng nâu non- Hiệu suất đạt 10%

phồng lên và caramen hoá Hỗn hợp chất "Sf" cho qua cột đảo pha, chất mang là

LH20 Dung môi rửa là MeOH Sắc ký số cho thấy, hỗn hợp chất "Sf" gồm có 2 nhóm chất rõ rệt Mỗi nhóm chất có thể có từ 2 - 3 chất

* Hỗn hợp chất "Sf" không qua cột đảo pha làm SKCM trên SiO2

Hệ dung môi CHCl3 : MeOH : H2O

65 : 35 : 10

Thuốc hiện:

- Vanilin/H3PO4

- Axit bonic/oxalic ặ viết flvonoit màu vàng rõ ở phía dưới

Hoạt chất "Sf" thuỷ phân trong môi trường H2SO4 1M và chạy sắc ký lớp mỏng SiO2

- Với hệ dung môi: Toluen: EtOAc: H2O (9 : 1 : 0,1)

- Thuốc hiện là Vanilin/H3PO4

Sau thủy phân Trước thủy phân

Sắc kí đó cho thấy có thể có từ 5 -8 Sapogenin Đối chứng là oléanolic acid) Kết quả sắc ký trên cho thấy hỗn hợp hoạt chất "Sf" chứa hai nhóm chất riêng lẻ đi kèm theo nhau: nhóm Sapogenin và nhóm flavonoit Mỗi nhóm có thế chứa từ 2 - 3 chất Từ nhóm flavonoit đã tách riêng được một chất Đó là kaemferol Thành phần hóa học nhóm Saponin và nhóm flavonoit còn lại đang tiếp tục nghiên cứu trong công trình thạc sĩ vào cuối năm 2006

B- Những nghiên cứu dược lý

I- Tác dụng của hoạt chất Sf lên tinh trùng người (test invitro)

(thực hiện tại Bệnh viện Phụ sản Trung Ương)

Mục đích của thí nghiệm là xác định xem ở nồng độ nào khoảng thời gian nào thích hợp để hoạt chất Sf ức chế được tinh trùng, làm cho tinh trùng không tiến tới nhanh, dừng lại tại chỗ, không hoạt đọng được và chết Điều đó bảo đảm tinh trùng không còn khả năng tiếp cận được với trứng, không còn khả năng gây thụ thai

1- Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

a/ Hoạt chất Sf: Hoạt chất Sf chích được từ bã khô dầu quả cây Du trà (Camillia

(Sf)- họ Theaceae)có tinh thể vô định hình màu nâu nhạt với các chỉ tiêu chất lượng xác định

b/ Tinh trùng: tinh trùng được lấy từ 17 người đàn ông khoẻ mạnh bình thường,

được sử lý và thí nghiệm theo tài liệu của tổ chức Y tế Thế giới (WHO)

c/ Phương pháp tiến hành: lấy hoạt chất Sf pha loãng với nước muối sinh lý thành

các nồng độ khác nhau, trộn đều với một lượng tương đương (0,5 ml) tinh dịch người, sau đó dùng kính hiển vi quang học quan sát tác dụng của hoạt chất lên hoạt

động của tinh trùng

2- Kết quả thí nghiệm và phân tích số liệu

a/ kết quả thí nghiệm: kết quả phân tích tinh dịch theo các chỉ tiêu và mức độ:

chỉ tiêu 1: tỉ lệ sống của tinh trùng% trước và sau khi tiếp súc với hoạt chất

Sf

chỉ tiêu 2: Độ di động của tinh trùng ở 4 mức độ :

mức độ A (%) : độ di động của tinh trùng tiến tới nhanh

mức độ B (%) : độ di động của tinh trùng tiến tới chậm

mức độ C (%) : độ di động của tinh trùng không tiến tới

mức độ D (%) : tinh trùng không di động, hoặc di động tại chỗ

chỉ tiêu 4: khoảng thời gian tiếp xúc:

thời gian trước khi dùng thuốc ( chừng): 0 phút

thời gian tiếp súc sau khi dùng thuốc: 1’, 5’, 10’

chỉ tiêu biến đổi hình dạng sang (%)

(xem bản số liệu gốc- phần phụ lục số 7 , trang 40- 56)

b- phân tích số liệu-vấn đề nghiên cứu là sự sai khác giữa số tinh trùng ban đầu chưa kịp tiếp súc với hoạt chất Sf, so sánh với tinh trùng sau khi tiếp súc với hoạt chất Sf ở các chỉ tiêu và mức độ xem xét có ý nghĩa thống kê hay không?

Bài toán đưa về tính toán 2 (phương sai), (độ lệch chuẩn) và chỉ ttiêu Student t theo trị trung bình tác dụng

c- Kết quả tính toán: chọn 2 chỉ tiêu ra 2 mức độ có tác dụng quyết định để iiii

1-chỉ tiêu tỉ lệ sống của tinh trùng (%)

2-chỉ tiêu tinh trùng tiến tới nhanh

ở mức độ A: tinh trùng tìm tới nhanh %

ở mức độ D: tinh trùng di dộng tại chỗ % Mọi cá thể được quan sát 2 lần:

Bảng 4: kết quả tính toán chỉ tiêu student của các quá trình nghiên cứu thí

nghiệm so với t tra bảng

0.25 mg/ml

1

1 mg/ml

3 0.25 mg/ml

1

1 mg/ml

t=11,33 t=10,78

t=4,55 t=4,33

t=12,77 t=12,50 Với bậc tự do n-1 = 14

Ngoài các chỉ tiêu tính toán trên, chỉ tiêu hình dạng, tinh trùng có thay đổi hay không sau khi tiếp súc với hoạt chất Sf cùng với phần minh chứng thêm cho tác

dông cựa hoỰt chÊt nộy- Thay cho tÝnh toịn chóng tềi ệở chôp ờnh hừnh thÓ tinh trỉng tr−ắc vộ sau khi tiạp sóc vắi hoỰt chÊt Sf

Hình 1 Hình 2 Hình 3

Hình 1: Hình dạng ban đầu bình thýờng của tinh trùng

Hình 2: sau khi gặp hoạt chất Sf, tinh trùng bị ức chế di động và kết đám

Hình 3: Tinh trùng bị biến dạng ở đầu và chết

Cịc kạt quờ nộy ệở ệ−ĩc bịo cịo tỰi héi nghỡ toộn quèc 2004 vÒ nghiến cụu cể bờn trong khoa hảc sù sèng - ậỡnh h−ắng y d−ĩc hảc- Hảc viỷn quẹn y d−ĩc hảc- Hảc viỷn quẹn y 28.10.2004- Hộ Néi

Phô lôc sè 16 trang 64 -68

II Chụng minh thếm tịc dông cựa hoỰt chÊt Sf

ậÓ khỬng ệỡnh thếm tịc dông cựa hoỰt chÊt Sf lến tinh trỉng ng−êi, chóng tềi tiạp tôc thÝ nghiỷm thếm 13 mÉu tinh dich phẹn theo 3 nhãm, dùa theo chử tiếu

ậé di ệéng: - A: tiạn tắi nhanh

- B: tiạn tắi chẺm

- C: khềng tiạn tắi

- D: khềng di ệéng 1/ nhãm tinh dỡch + n−ắc muèi sinh lý 0,9% ( 6 mÉu)

2/ Nhãm tinh dỡch + n−ắc muèi sinh lý 0,9 % +hoỰt chÊt Sf (12 mÉu)

3/ nhãm tinh dỡch +hoỰt chÊt Sf (14 mÉu)

TÊt cờ găm 32 thÝ nghiỷm ệÓ so sịnh

Trến sể ệã biÓu diÔn theo 3 nhãm x 2 lẵn thÝ nghiỷm

Qua sơ đồ thấy rõ rằng: ở nhóm thứ nhất: tinh dịch + NaCl 0,9%

- Nước muối sinh lý chỉ có tác dụng hoà tan vào tinh dịch va không

có tác dụng gì đến ứu chế sự hoạt động của tinh trùng

ở nhóm thứ 2 gồm tinh dich + NaCl 0.9% và

ở nhóm thú 3 gồm tinh dịch +hoạt chất Sf thấy rất rõ vai trò của hoạt chất Sf ở đây

- chỉ số A% tiến tới rất nhanh và tiến tới chậm bằng 0

- chỉ số C% không tiến tới bằng 0

- chỉ số D% không di động là 100%

Điều đó khẳng định tác dụng mạnh mẽ của hoạt chất Sf

(số liệu phụ lục 18 trang 86 -118 )

So sánh tác dụng diệt tinh trùng chuột và người của Saponin

Du trà với alkylphenylalcolether [3]

Thuốc Nồng độ Tinh trùng chuột cống Tinh trùng người

mg/ml 20’’ 3’ 5’ 10’ 20’ 20’’ 3’ 5’ 10’ 20’ Saponin

Du trà

1,0 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,0313 0,0157

Elcohol ether

1,0 0.5 0,25 0,125 0,0625 0,0313 0,0157

-

-

- + + + - + + + + + + + + + + + + + + +

-

- + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Chú thích : - không có tinh trùng hoạt động

+ có tinh trùng hoạt động

III Tỏc dụng diệt tinh trựng của hoạt chất Sf lên động vật thí nghiệm

1-Tác dụng của hoạt chất Sf trên động vật thí nghiệm ( test invivo )

1.1 Thử tỏc dụng diệt tinh trựng của hoạt chất "S f " dưới dạng thuốc đặt õm đạo ở chuột cống trắng cỏi (phụ lục 22 trang 136 - 141)

Cỏch tiến hành:- lựa chọn chuột cống trắng cỏi cú khả năng sinh sản được chứng minh và chia thành 2 lụ: lụ chứng và lụ thử thuốc, mỗi lụ gồm 30 con,

lụ thứ 3 gồm 15 chuột cống trắng đực cú khả năng sinh sản, được chứng minh để giao phối Kết quả thực nghiệm được trỡnh bày ở bảng 1

Bảng 1 Tỏc dụng của thuốc diệt tinh trựng "S f " đặt õm đạo trờn sự sinh sản ở chuột cống trắng cỏi

Lụ đối chứng: ghộp đụi chuột cỏi

với chuột đực từ 8 giờ sỏng, kiểm

tra tế bào õm đạo và tinh trựng,

nếu cú tinh trựng coi như chuột đó

thụ tinh ngày thứ nhất Mười ngày

sau khi ghộp đụi và kiểm tra thấy

cú tinh trựng õm đạo, mổ chuột

cỏi để kiểm tra và đếm số vị trớ

làm tổ ở hai bờn sừng tử cung rồi

đúng vết mổ lại Đến ngày thứ 18

mổ chuột cỏi lần thứ hai Đếm số

bào thai ở hai bờn sừng tử cung

.Theo dừi cỏc lứa chuột con đẻ ra

Lụ đối chứng

Số v ị trớ làm tổ (mổ lần 1)

Số bào thai (mổ lần 2)

TT Trọng lượng

trỏi

Sừng phải

Sừng trỏi

Sừng phải

Lứa

đẻ,

số con

Lô thử thuốc

Lô thử thuốc:- Liều thuốc

thử là 5mg trong 0,1ml dịch

trợ/1chuột Ghép đôi chuột

cái với chuột đực từ 8 giờ

sáng, kiểm tra tế bào âm

đạo và tinh trùng, nếu có

tinh trùng thì tiến hành đặt

thuốc với liều như trên Cứ

1 giờ đặt một lần đặt liên

tục trong ngày có tinh trùng

ở âm đạo ( khoảng 5-6 lần)

Ngày thứ 10 mổ chuột

Kiểm tra và đếm số vị trí

làm tổ của trứng và sự phát

triển của bào thai như ở lô

đối chứng Nếu không có

sự làm tổ ở hai bên sừng tử

cung thì có thể kết luận:

thuốc có tác dụng tiêu diệt

tinh trùng ở âm đạo chuột

cống trắng cái sau sự giao

phối với chuột đực

Số v ị trí làm

tổ (mổ lần 1)

Số bào thai (mổ lần 2) TT

Trọg lượng

tổ ở hai bên sừng

tử cung

KẾT LUẬN:

Ở lô chứng chuột mẹ thụ thai bình thường, các bào thai phát triển bình thường,

số con đẻ ra từ 5-9 con, ở lô thử thuốc: không có trứng làm tổ ở hai bên sừng tử cung, chứng tỏ thuốc có tác dụng diệt tinh trùng ở âm đạo chuột cống trắng cái

1.2 Nghiên cứu sự phục hồi khả năng sinh sản của chuột cống trắng cái sau khi ngừng dùng hoạt chất "S f " đặt âm đạo (phụ lục 23 trang 142 )

Tiến hành khảo sát xem chuột cống trắng cái sau khi ngừng dùng hoạt chất "Sf"

có phục hồi khả năng sinh sản bình thường hay không

Chuột cống trắng cái sau khi diệt tinh trùng với liều thực nghiệm (5mg/chuột/ngày)và có kết quả ngừa thai thì ngừng dùng thuốc Cho chuột nghỉ ngơi 2 tháng để chuột khoẻ lại bình thường rồi cho giao phối trở lại (theo quy trình WHO)

Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 2

Bảng 2 Sự phục hồi khả năng sinh sản của chuột cống trắng cái sau khi ngừng dùng hoạt chất "S f " đặt âm đạo

Chuột thử

Sau 2 th áng cho cho chuột giao phối

Tinh trùng

NHẬN XÉT KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM :- sau khi thuốc có tác dụng diệt

tinh trùng ở âm đạo chuột cống trắng cái, ngừng dùng thuốc Cho chuột nghỉ ngơi 2 tháng để chuột khoẻ rồi cho giao phối lại Trong số 17 chuột thử nghiệm