Phân tích và xác định các đặc điểm hóa học đặc trưng của dược liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa

Kết quả ứng dụng “vân tay” hoá học đã được xác định trong định tính dược liệu, có thành phần trong một số chế phẩm thuốc đông dược đang lưu hành, cho thấy, các đặc điểm vân tay dược liệu

Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

phân tích và xác định các đặc điểm

hóa học đặc tr−ng của d−ợc liệu

phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa

Chủ nhiệm đề tài: dscki Nguyễn kim bích

Cơ quan chủ trì đề tài : Viện D−ợc Liệu

6265

28/12/2006

Phần A: Tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài

1 Kết quả nổi bật của đề tài :

Đề tài đã xây dựng được phương pháp và kỹ thuật có tính chất thường qui để xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu phù hợp với đối tượng chưa xác định thành phần hoạt chất, phục vụ có hiệu quả cho công tác tiêu chuẩn hoá về mặt xây dựng phép thử định tính hoá học dược liệu

Các dược liệu chọn làm đối tượng nghiên cứu gồm có 20 dược liệu sau :

Kết quả hình ảnh các sắc ký đồ xác định các đặc điểm đặc trưng dạng

“vân tay” hoá học của 20 dược liệu, được trình bày dưới dạng atlas ( hình ảnh

in màu) cùng với các phương pháp xác định, là tài liệu tham khảo bổ ích áp dụng trong phân tích và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, phục vụ kiểm tra và

đánh giá chất lượng nguyên liệu và sản phẩm thuốc từ dược liệu

Kết quả xác định các đặc điểm vân tay của dược liệu (bằng kỹ thuật SKLM) đã thể hiện được ứng dụng có hiệu quả trong định tính phân biệt chống nhầm lẫn hoặc giả mạo dược liệu, như : phân biệt Cỏ nhọ nồi với Sài

đất, Dây đau xương với Dây ký ninh , ô dược với ô dược nam, ô dược với rễ sim ( giả mạo), Lức (Sài hồ nam ) với Sài hồ ( Sài hồ bắc), Mộc hương với Nam mộc hương Kết quả đã góp phần minh hoạ cho các đặc điểm ” vân tay”

đã xác định là đặc trưng cho dược liệu

Kết quả ứng dụng “vân tay” hoá học đã được xác định trong định tính dược liệu, có thành phần trong một số chế phẩm thuốc đông dược đang lưu hành, cho thấy, các đặc điểm vân tay dược liệu, đã được ứng dụng có hiệu quả

để định tính phát hiện sự có mặt của dược liệu đó, trong thành phẩm thuốc gồm hỗn hợp đa thành phần dược liệu Kết quả các đặc điểm vân tay của dược liệu đã được xác định là cơ sở và định hướng cho việc khảo sát xây dựng phương pháp định tính dược liệu trong chế phẩm

Các kết quả vân tay hoá học của 20 dược liệu nghiên cứu trong đề tài sẽ góp phần bổ sung tư liệu về định tính trong các chuyên luận dược liệu của DĐVNIII

Các kết quả xác định vân tay hoá học của dược liệu đã góp phần xây dựng mô hình thiết lập kho dữ liệu về “ dấu vết” hoá học các dược liệu nói chung, áp dụng trong kiểm nghiệm, thẩm định, đánh giá tính đúng của dược liệu

2 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt

a Tiến độ : Đề tài thực hiện trong 2 năm, song còn gặp khó khăn trong việc

lấy mẫu một số dược liệu và tìm kiếm thành phẩm thuốc đông dược phục vụ cho nghiên cứu và khảo sát, nên tiến độ bị kéo dài hơn so với qui định

b Thực hiện mục tiêu nghiên cứu : Thực hiện đầy dủ các mục tiêu đề ra

c Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương

Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương

Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu

d Đánh giá việc sử dụng kinh phí :

Tổng kinh phí được cấp 150 triệu

Đã quyết toán xong

đối với các đối tượng dược liệu khác Trên cơ sở khai thác sâu hơn khả năng phân tích bằng kỹ thuật SKLM, đặc biệt là kỹ thuật hiện đại như TLC Scanner một kỹ thuật đã được áp dụng có hiệu quả trong phân tích định tính và định lượng dược liệu nhưng vẫn còn mới mẻ ở VN, góp phần tích cực trong việc xây dựng phương pháp phân tích phục vụ cho nghiên cứu, tiêu chuẩn hoá, thẩm định và kiểm nghiệm dược liệu

Phần B: nội dung chi tiết kết quả nghiên cứu

I Đặt vấn đề

Hiện nay nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu, phục vụ phòng và chữa bệnh ở nước ta cũng như các nước trên thế giới có xu hướng ngày càng gia tăng

Việt Nam có tiềm năng phát triển dược liệu Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, nước ta có nguồn tài nguyên động thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Cộng đồng các dân tộc Việt Nam vốn có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng các cây thuốc để điều trị bệnh và bồi bổ sức khoẻ Với phương châm kế thừa vốn cổ truyền của y học dân tộc, xây dựng một nền y học hiện đại và đại chúng, đến nay nhiều mặt hàng thuốc có nguồn gốc từ thảo dược đã được sản xuất và lưu hành rộng rãi trên cả nước, phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Tính đến năm 2002 cả nước có 257 cơ sở được cấp giấy phép sản xuất dược liệu và đông dược với tổng số 1617 mặt hàng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu, chiếm gần 1/3 số mặt hàng thuốc sản xuất trong nước [1] Theo đó nhu cầu cung cấp nguồn nguyên liệu dược liệu phục

vụ cho sản xuất và chữa bệnh theo y học cổ truyền ước tính 50.000 tấn/ năm[1]

Đi đôi với việc sử dụng và lưu hành dược liệu và thuốc có nguồn gốc dược liệu với số lượng lớn như vậy, vấn đề quản lý chất lượng thuốc đặc biệt là quản lý chất lượng dược liệu, để đảm bảo sử dụng thuốc an toàn và hiệu quả, luôn là câu hỏi được đặt ra cho Ngành và còn nhiều bức xúc cần được tháo gỡ

và giải quyết Tình trạng dược liệu lưu thông trên thị trường không rõ nguồn gốc, thiếu sự kiểm soát về chất lượng còn phổ biến, do vậy dược liệu đem sử dụng và sản xuất có chất lượng không ổn định, kém chất lượng và dễ bị nhầm lẫn hoặc bị giả mạo Trước xu thế chuẩn bị hội nhập khu vực và thế giới, trước nhu cầu cấp bách phải nâng cao chất lượng thuốc được sản xuất trong nước, một vấn đề đặt ra cho ngành dược là phải sử dụng nguồn nguyên liệu dược liệu làm thuốc với chất lượng ổn định và dược liệu phải được tiêu chuẩn hoá

về nhiều mặt

Vấn đề tiêu chuẩn hoá dược liệu là nội dung quan trọng trong quản lý chất lượng dược liệu và đã được quan tâm thảo luận nhiều nhất tại diễn đàn hoà hợp thuốc thảo dược gọi tắt là FHH ( Forum for harmonization of herbal medicines ) của các nước trong khu vực Tây thái bình dương, được tổ chức tại Tokyo tháng 5 năm 2002 Tại diễn đàn này đã thống nhất qui định tiêu chuẩn hoá dược liệu về các mặt : đúng, tốt và tinh khiết [1]

Để đảm bảo chất lượng dược liệu đạt yêu cầu về các mặt như đã nêu, các chỉ tiêu kỹ thuật thể hiện trong các tiêu chuẩn dược liệu luôn có xu hướng đòi hỏi ngày càng chặt chẽ và phải được nâng cao, do vậy các phép thử

được xây dựng để đánh giá cũng đòi hỏi phải đươc cải tiến, trong số đó gồm

có phép thử định tính hoá học có liên quan đến đánh giá tính đúng, góp phần quan trọng đáng kể trong việc kiểm tra và đánh giá chất lượng dược liệu Theo báo cáo về “ sự bổ sung và sửa đổi trong DĐTQ 2005” tại diễn đàn FHH tháng 5/2005 [59], các số thống kê về phép thử định tính hoá học trong các chuyên luận dược liệu của DĐTQ 2005 cho biết, các phép thử định tính bằng phương pháp SKLM gồm có 342 trong tổng số 531 phép thử hoá học, chiếm 64% và đã tăng thêm về số lượng so với DĐTQ 2000 là 114 phép thử, các phép thử khác như phép thử vật lý và phản ứng hoá học là 172 chiếm 32%, số lượng tăng hơn so với DĐTQ 2000 là 9 , phép thử định tính bằng phương pháp SKLCA đã được bổ sung là 5 Các con số nói trên cho thấy, phép thử định tính bằng phương pháp SKLM chiếm tỷ cao và có xu hướng tăng hơn hẳn so với

đã nêu cho thấy, phương pháp định tính SKLM chiếm tỷ lệ thấp, trong khi đó các phương pháp định tính bằng phản ứng hoá học trong ống nghiệm chiếm tỷ

lệ đáng kể và vẫn còn nhiều chuyên luận chưa có phép thử định tính, xác định

đặc trưng về hoá học Hầu hết trường hợp này đều rơi vào các đối tượng dược liệu chưa xác định được thành phần hoạt chất, thậm chí, kể cả các dược liệu có thể đã được biết thành phần hoạt chất hoặc thành phần hoá học đặc trưng, nhưng chưa có điều kiện xác định, do chưa có chất đối chiếu.Trước thực trạng như đã nêu và trước xu thế chuẩn bị hội nhập, dược liệu có chất lượng phải

đạt tiêu chuẩn của khu vực, việc xây dựng các chỉ tiêu đánh giá chất lượng dược liệu liên quan đến định tính xác định đặc trưng hoá học, cần thiết phải

được cải tiến và nâng cao cho phù hợp với xu thế chung, góp phần từng bước nâng cao khả năng kiểm tra và đánh giá chất lượng dược liệu, phục vụ cho công tác quản lý chất lượng dược liệu và chế phẩm thuốc từ dược liệu ngày một tốt hơn Để đáp ứng một phần yêu cầu đó , đề tài đã được thực hiện với

tiêu đề : Phân tích và xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hoá

Mục tiêu của đề tài như sau :

1 Xây dựng được phương pháp, kỹ thuật phân tích một số thành phần hoá học đặc trưng, coi như là dấu vết hoá học của khoảng 20 dược liệu, trong danh mục thuốc thiết yếu, chưa xác định được hoạt chất Xác định nhận biết các dược liệu này bằng kỹ thuật so sánh “ dấu vết” trên

2 Sử dụng các “ dấu vết” hoá học trên vào kiểm nghiệm chất lượng dược liệu và một số thành phẩm có chứa dược liệu tương ứng đang lưu hành trên thị trường

3 Góp phần xây dựng mô hình thiết lập kho dữ liệu về “ dấu vết” hoá học các dược liệu nói chung để áp dụng trong kiểm nghiệm thuốc

II Tổng quan

2.1 Tổng quan đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu

Đối với dược liệu, bên cạnh phương pháp nhận dạng bằng kỹ thuật hiển

vi , phương pháp phát hiện liên quan đến thành phần hoá học, từ lâu cũng đã

được áp dụng và ngày càng trở nên có hiệu quả trong việc nhận dạng, phân biệt và chống nhầm lẫn dược liệu

Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học, các phương pháp phân tích với kỹ thuật hiện đại, đặc biệt là các kỹ thuật sắc ký đã không ngừng được cải tiến và áp dụng có hiệu quả trong nghiên cứu, chiết tách và phân tích xác định các thành phần hóa học của cây thuốc Nhờ đó, nhiều chất mới đặc trưng cho cây thuốc đã được phát hiện, phục vụ nhu cầu nghiên cứu thuốc mới và góp phần nâng cao tiêu chuẩn hoá chất lượng dược liệu và thuốc thảo mộc Với mục đích trên, các kỹ thuật sắc ký như SKLCA, SKLM, SKLM hiệu năng cao, SKK, SKK- KP, điện di mao quản đã và đang được áp dụng phổ biến ở các quốc gia như Mỹ, các nước thuộc cộng đồng chung châu Âu và một số nước châu á như Trung quốc , ấn độ Trong đó, xác định vân tay dược liệu bằng kỹ thuật SKLM và SKLCA đã được áp dụng để nhận biết, theo dõi và

đánh giá chất lượng dược liệu Ví dụ, dựa vào hình ảnh vân tay SKLM của cây thuốc để nhận biết và phân biệt giữa các loài [30]; dựa vào sắc ký đồ vân tay SKLCA có thể xác định được vùng trồng của Xuyên khung [19], Khương hoạt

[28]; đánh giá chất lượng Hoàng liên chân gà (Coptidis rhizome) dựa vào đặc

điểm vân tay SKLM của protoberberin alcaloid [54]; áp dụng vân tay hoá học xác định sự thay đổi thành phần hoá học của Trạch tả trong quá trình chế biến [69] Tuy nhiên các kỹ thuật được áp dụng trong phân tích phục vụ tiêu chuẩn hoá dược liệu và các chế phẩm thuốc thảo mộc, cần có các yếu tố đáng quan tâm khác, như điều kiện kinh tế, trang thiết bị, khả năng áp dụng của mỗi đối tượng dược liệu

Trong các chuyên luận dược liệu và chế phẩm thuốc đông dược của dược điển DĐTQ 2000 gồm có các kỹ thụât sắc ký được áp dụng trong các phép thử định tính và định lượng như SLKM, SKLCA và SKK Trong đó kỹ thuật SKLM được áp dụng cho định tính chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các chỉ tiêu định tính liên quan đến hoá học Cụ thể, theo thống kê về phép thử định tính dược liệu bằng phương pháp vật lý và hoá học có 228 phép thử định tính bằng pp SKLM trong tổng số 403 phép thử, chiếm 56% Trong khi đó, các chỉ tiêu định tính dược liệu bằng phương pháp SKLM ghi trong DĐVNIII chiếm

tỷ lệ còn thấp, cần thiết phải được xây dựng và bổ sung.Trước khi đi vào vấn

đề xây dựng phương pháp phân tích, cần tìm hiểu rõ khái niệm về đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu và các yêu cầu có liên quan

Khái niệm về đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu bao hàm đặc trưng của hợp chất thiên nhiên nói chung, không chỉ giới hạn là các thành phần hoạt chất Who đã định nghĩa về chất đặc trưng ( characterizing compound) như sau : “ Một thành phần chất tự nhiên có trong một bộ phận

của cây có thể được dùng để đảm bảo cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó, không nhất thiết là hoạt chất” [70]

Tổ chức y tế thế giới WHO hướng dẫn đánh giá hiệu lực và an toàn của thuốc

có nguồn gốc từ thảo mộc đã qui định chỉ tiêu đánh giá chất lượng dược liệu

về mặt hoá học, như sau: “ Phải mô tả các phép thử vật lý và hoá học được tiến hành để xác định các thành phần hoá học của cây và mô tả sắc ký đồ của phân

đoạn hoạt chất hoặc chất đặc trưng Nếu không phải xác định một hỗn hợp các

chất đặc trưng (dấu vân tay) của cây thuốc” [70]

Điều đó có nghĩa là:

* Chỉ tiêu định tính phát hiện thành phần hoá học đặc trưng hay một

hỗn hợp các chất đặc trưng của dược liệu bằng phương pháp sắc ký là một yêu

cầu cần thiết và được thực hiện để đánh giá chất lượng dược liệu đó

* Các đặc điểm hoá học đặc trưng của một dược liệu được thể hiện có thể là đặc trưng của một hoạt chất, một hợp chất, hoặc là đặc trưng của một nhóm hoạt chất hay một hỗn hợp các chất của dược liệu đó Một hỗn hợp các chất đặc trưng cho dược liệu còn gọi là “ dấu vân tay “ của dược liệu đó

* Các qui định đặc trưng hoá học của dược liệu được thực hiện với yêu cầu ở hai mức khác nhau, đó là : xác định chất đặc trưng và xác định hỗn hợp các chất đặc trưng để nhận biết Trong đó, yêu cầu xác định đặc điểm hoá học dưới dạng “vân tay” của một hỗn hợp các chất chiết được từ dược liệu, là yêu cầu tối thiểu phải được áp dụng cho định tính dược liệu, đặc biệt là đối tượng khi chưa xác định được thành phần hoạt chất

Thông thường, các phép thử định tính dược liệu bằng phương pháp sắc

ký, trong các chuyên luận dược liệu của các dược điển như DĐTQ 2000, DĐVNIII thể hiện đánh giá định tính dược liệu theo hai cách: Cách thứ nhất, dùng chất chuẩn để đối chiếu và phát hiện Các chất chuẩn này có thể là thành phần hoạt chất hoặc một chất đại diện đặc trưng của dược liệu Ví dụ như

rutin trong Hoa hoè, palmatin trong Hoàng đằng, brucin trong Mã tiền Cách

thứ hai, dùng một hỗn hợp chất hay nhóm chất được chiết ra từ dược liệu làm

đối chiếu Trên thực tế các phép thử đánh giá theo cách thứ nhất là ở mức cao

hơn, nhưng còn bị hạn chế do trở ngại phải có chất chuẩn để đối chiếu Một số chất đặc trưng dùng làm đối chiếu đã được qui định cụ thể trong một số chuyên luận dược liệu của DĐVNIII để đánh giá, nhưng trên thực tế còn khó kiếm Ví dụ, catalpol trong Địa hoàng, jasminoidin trong Dành dành, turberostemonin trong Bách bộ Chính vì vậy, các đối tượng dược liệu trên

đã được qui định áp dụng cả hai cách : hoặc dùng chất đối chiếu, hoặc dùng dịch chiết của dược liệu đó làm đối chiếu (áp dụng trong trường hợp không có chất chuẩn) Các trường hợp qui định tương tự như vậy còn phổ biến đối với các dược liệu đã biết thành phần hoạt chất, ví dụ như Bình vôi, Cà độc dược,

Đại hoàng Như vậy, có thể nói, xây dựng phương pháp xác định đặc điểm

đặc trưng của dược liệu dưới dạng xác định đặc trưng của một nhóm chất là cần thiết phục vụ cho tiêu chuẩn hoá, áp dụng phổ biến cho các dược liệu, kể

cả các đối tượng đã được biết thành phần hoạt chất hoặc chất đặc trưng

Các trường hợp định tính dùng dịch chiết dược liệu thay thế cho một chất làm đối chiếu như đã nêu ở trên, thể hiện mối tương quan giữa chất đặc trưng và nhóm chất đặc trưng; các đặc điểm đặc trưng của thành phần chất cũng thể hiện là đặc trưng của nhóm chất, bao gồm có chất đặc trưng đó Có thể nói, đánh giá đặc trưng của một nhóm chất đại diện dùng thay thế như đã

nêu là cơ sở để đánh giá chất đặc trưng đó Điều này có ý nghĩa trong việc tìm

và xác định đặc trưng của nhóm chất sẽ căn cứ theo hướng tìm hoạt chất hoặc chất đặc trưng đã được biết của dược liệu

Mặt khác, khi dùng một nhóm chất chiết từ dược liệu, làm đối chiếu thay thế cho một chất, phương pháp chiết hay còn gọi là xử lý mẫu phải được tiến hành theo hướng chiết được tối đa chất đặc trưng đã được xác định của dược liệu đó Ví dụ tetrahydropalmatin là thành phần hoạt chất chính đã được qui định làm chất đối chiếu trong phép thử định tính Bình vôi; atropin và scopolamin được qui định trong định tính Cà độc dược Do vậy việc xử lý mẫu của các dược liệu này đã được thực hiện theo hướng chiết alcaloid, để dịch chiết thu được có tỉ lệ thành phần hoạt chất như đã nêu đạt tối đa Jasminoidin

là một thành phần đặc trưng của dược liệu Dành dành, thuộc nhóm iridoid glycosid, đã được qui định làm chất đối chiếu trong phép thử định tính, do vậy dịch chiết dược liệu đã được xử lý theo hướng chiết glycosid với dung môi

methanol [4] Như vậy, phương pháp chiết hay xử lý mẫu dược liệu là một

trong các yếu tố có ảnh hưởng đến kết quả xác định “vân tay”nhóm chất của một dược liệu, cần được quan tâm khảo sát

Đặc điểm hoá học đặc trưng của một chất hoặc của một nhóm chất được

thể hiện về các mặt như sau :

Đặc trưng về màu sắc : Được biểu thị bằng các màu dưới ánh sáng thường

hoặc màu phát quang dưới UV366nm, do bản chất tự nhiên của thành phần chất hoặc do được tạo thành sau phản ứng hoá học với các loại thuốc thử đặc trưng ( thể hiện trên sắc ký đồ SKLM )

Tìm đặc điểm đặc trưng này phụ thuộc vào việc khảo sát lựa chọn thuốc thử thích hợp để phát hiện

Đặc trưng về vị trí của vết hoặc của các pic tạo thành trên sắc ký đồ : Được

biểu thị bằng các giá trị Rf ( SKLM) hoặc giá trị thời gian lưu TR (SKLCA, SKK) của vết, các vết hoặc pic, các pic trên sắc ký đồ

Tìm đặc trưng về vị trí của vết hoặc pic ta phải tiến hành khảo sát hệ dung môi sắc ký ( hay còn gọi là pha động ) thích hợp để tách các thành phần phân tích

Tỷ lệ này còn phụ thuộc vào phương pháp chiết và xử lý mẫu, do vậy cũng cần

được quan tâm

Bởi vậy, các yếu tố có liên quan và ảnh hưởng đáng kể đến kết quả xác

định các đặc điểm đặc trưng của dược liệu bằng phương pháp sắc ký gồm có : Phương pháp xử lý mẫu, hệ dung môi sắc ký (pha động) và phương pháp phát hiện Các yếu tố này cần được quan tâm và khảo sát khi tiến hành xây dựng phương pháp xác định đặc điểm đặc trưng hoá học dưới dạng “vân tay” của dược liệu Bên cạnh đó còn có yếu tố ảnh hưởng khác cũng cần được quan tâm như : pha tĩnh được áp dụng của các kỹ thuật sắc ký ( SKLM, SKLCA, SKK) ; dung lượng mẫu áp dụng sắc ký, nhiệt độ

2.2 Các phương pháp xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu

Như đã trình bày ở phần trên, tiến hành xác định đặc điểm hoá học đặc trưng của một dược liệu, đặc biệt là đối tượng dược liệu chưa xác định được hoạt chất, đồng nghĩa với việc xác định đặc điểm đặc trưng dạng vân tay nhóm chất của dược liệu đó Vì thế, việc tìm hiểu khái niệm về các nhóm chất,

sự phân loại và đặc diểm của nhóm chất là cần thiết cho việc khảo sát phương pháp xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất đó

2.2.1 Nhóm chất của cây thuốc

Các thành phần hoá học của cây thuốc hay của dược liệu nhìn chung

đều được phân loại thành các nhóm chất, việc phân tích và xác định các thành phần đó đều dựa trên cơ sở xác định nhóm chất của nó Sự phân loại thành nhóm chất theo nhiều cách khác nhau, ví dụ theo nguồn gốc sinh tổng hợp, theo tính chất hoà tan và theo sự có mặt của nhóm chức quyết định tính chất của nhóm chất Chẳng hạn, các chất thuộc nhóm phenolic có tính chất ưa nước

và có nguồn gốc từ acid shikimic (aromamatic precursor shikimic acid), gồm có: phenol- phenolic acid, phenylpropanoid, flavonoid,anthocyanin, xanthon- stilben và các chất màu quinol Các terpenoid có tính chất thân dầu, sinh tổng hợp từ isopentenyl pyrophosphat, gồm có tinh dầu, diterpenoid, triterpenoid , steroid và carotenoid Các hợp chất chứa nitơ có tính kiềm, được phát hiện bằng phản ứng với thuốc thử ninhydrin hoặc đragendorff [38]

Theo Bài giảng dược liệu [6] [8], đã phân loại các hợp chất trong cây thành các các nhóm chính như : tinh dầu, alcaloid , anthranoid, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycoside tim, các mono và diterpen glycosid , glycosid cyanogenic, đường , các acid hữu cơ Trong số đó có một số nhóm chất còn được xếp vào nhóm glycosid do công thức của các chất thuộc nhóm này phần lớn ở dạng gắn đường như anthranoid, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycoside tim, các mono và diterpen glycosid , glycosid cyanogenic

Theo H Wagner và S Bladt [30] đã phân loại các thành phần hoạt chất của cây thuốc thành các nhóm chất để phát hiện chúng bằng phương pháp SKLM gồm có các nhóm chính như sau : alcaloid , anthraglycosid, arbutin,

glycosid tim, các chất đắng (bitter principles), lignan, flavonoid, acid phenolcarbocylic, saponin, tinh dầu, coumarin , valepotriat

Theo J.B Harborne [38] đã phân loại các hợp chất chất tự nhiên của thực vật nói chung được tổng quát theo sơ đồ 2.1

Tuy nhiên, việc phân thành các nhóm chất dù theo cách nào cũng chỉ mang tính chất tương đối, do tính chất hoá học đa dạng của hợp chất thiên nhiên, một chất thuộc nhóm chất này có khi cũng được xếp vào nhóm khác

Ví dụ welderolacton có trong Cỏ nhọ nồi và Sài đât có thể xếp vào nhóm isoflavonoid, hoặc cũng có thể được xếp vào nhóm coumarin [8], solasodin

được xếp vào nhóm alcaloid cũng có khi thấy được xếp vào nhóm saponin steroid Thành phần cucurbitacin thuộc nhóm triterpen có phổ biến trong hạt

của các cây thuộc họ Cucurbitaceae, được xếp vào nhóm chất đắng, cũng có

khi được xếp vào nhóm saponin [8] [30]

Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến một số nhóm chất chính có liên quan và có thể áp dụng được trong phân tích định tính bằng

kỹ thuật thông dụng như SKLM, gồm các nhóm chất như sau : alcaloid, terpenoid ( tinh dầu, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid), terpenoid glycosid ( iridoid glycosid, saponin), anthranoid, flavonoid, coumarin, acid phenolcarboxylic, lignan, đường và acid amin Phần trình bày các nhóm chất dưới đây mang tính chất giới thiệu, góp phần tìm hiểu thêm về khái niệm của từng nhóm chất và các thành phần của nhóm chất Sự phân loại của các phân nhóm , về tính đa dạng và phức tạp của các thành phần chất và nhóm chất, là cơ sở tạo nên các đặc điểm đặc trưng riêng của các thành phần chất trong tự nhiên Các tính chất có liên quan đến phương pháp chiết, tách và phát hiện nhóm chất sẽ được trình bày ở các phần tiếp sau

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng quát

phân loại các thành phần nhóm chất trong cây

- Phenol và Phenolic acid

- Coumarin

- Acid hydroxycinnamic (Acid phenolcarboxylic )

- Chất màu quinon : benzoquinon , aphtaquinon, anthraquinon ( anthranoid)

- Tinh dầu ( mono và sesquiterpen )

- Diterpenoid

Triterpen Steroid Saponin

- Triterpenoid và Steroid

Glycosid tim Terpenoid

- Carrotenoid

- Các acid có trong cây

- Acid béo và lipid

- Alkan và các hydrocacbon liên quan

- Polyacetylen

Acid hữu cơ, chất béo và hợp chất liên quan

2.2.1.1 Hợp chất phenolic [8][30][38]

a Coumarin

Coumarin là những dẫn chất benzo- α pyron có cấu trúc C6 – C3 Cho

đến nay đã có trên 200 chất được biết và đã được phát hiện có trong 27 họ Có thể phân loại coumarin thành các nhóm chính như sau :

- Coumarin đơn giản hay còn gọi là coumarin không ngưng tụ ( non – condensed coumarins) : thường có các nhóm OH hoặc OCH3 được thế ở vị trí C-6, C-7, có khi được thế ở C-5, C-8 Chất điển hình : Umberlliferon

(Angelicae radix) , scopoletin ( Scopoliae radix)

- Furamo coumarin:

Các chất thuộc nhóm này có thêm một vòng furan được gắn ở vị trí C-6

và C-7 (psoralen) hoặc ở C-7 và C- 8 (angelicin) Chất điển hình : Imperatorin,

begapten, angelicin ( Angelicae, Imperatoriae radix)

p-Các dẫn xuất của pinoresinol và syringaresinol là thành phần hoạt chất

đựơc phát hiện có trong vỏ thân Đỗ trọng Cortex Eucommiae Tangsenoid I và syringin là các lignan có trong rễ Đảng sâm (Radix Codonopsis pilosulae)

Eleutheroside E, Eleutheroside B (Syringin) là thành phần chính có trong rễ

của cây Eleutherococcus senticosus MAXIM (Araliaceae)

c Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp ở thực vật Phần lớn các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc phenyl của các nhân benzo -

γ pyron (chromon) benzo dihydro - γ pyron , benzo dihydropyran (chroman)

và benzo pyrylium Hiện nay có khoảng trên 4000 chất đã được xác định cấu trúc.trong đó flavon và flavonol với nhóm thế là OH và /hoặc OCH3 chiếmtỉ lệ lớn Hầu hết các flavonoid là các chất phenolic

Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hoá của mạch 3 carbon gồm có : Euflavonoid là các gốc flavonoid

có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3 và neoflavonoid

có gốc ở vị trí C-4

Ngoài ra còn phân biệt các biflavonoid là những flavonoid dimmer, triflavonoid được cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan

- Euflavonoid gồm có các nhóm anthocyanidin, flavan, flavan3.ol, flavan 4.ol,

flavan 3,4 diol, flavanon, 3 hydroxy flavanon, flavon ,flavonol, dihydro chalcon, chalcon, auron

* Anthocyanidin: Là sắc tố rất phổ biến trong thực vật, tạo các màu đỏ hoặc xanh trong môi trường acid hoặc kiềm trong cây, hầu hết các sắc tố này

đều ở dạng glycosid (anthocyanin) nằm trong dịch tế bào

* Flavan 3-ol: Catechin và các đồng phân của nó entcatechin, epicatechin, ent epicatechin, cũng như gallocatechin và các đồng phân gặp tương đối phổ biến trong thực vật, ví dụ như trong lá Trà Tanin ngưng tụ (proanthocyanidin) là dẫn xuất flavon 3-ol ở dạng dimer, trimer, tetramer,

pentamer Ví dụ theasinensin A, B, C, D, F, G có trong một loại trà Camellia

sinensis

* Flavon: Apigenin và luteolin là 2 flavon hay gặp nhất trong cây Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, những flavon có nhóm thế OH hoặc OCH3 thì hiện nay đã biết trên 300 chất Những flavon ở dạng glycosid

có trên 460 chất, ngoài ra còn biết hơn 45 chất flavon ở dạng sulfat

* Flavonol: Là một nhóm lớn, trong cây các flavonol tồn tại dưới dạng glycosid là chủ yếu, đã biết trên 900 chất flavonol glycosid, các aglycon phổ biến được biết là kaemferol, quercetin, myricetin… Một số flavonol glycosid

có mạch đường được acyl hoá, cũng có một số chất dưới dạng sulfat

* Chalcon: Là những chất có màu vàng, trong môi trường kiềm dễ chuyển thành màu cam hay màu đỏ, dễ nhận biết, thường có trong họ cúc Chất đại diện: butein

- Isoflavonoid : Gồm nhiều nhóm khác nhau như isoflavan, isoflavan-

3-ene, isoflavan- 4-ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan…Trong đó isoflavon chiếm tỷ lệ lớn nhất trong số các nhóm của isoflavonoid với trên 360 chất đã được biết Isoflavonoid thường gặp trong họ

đậu Favaceae Chất điển hình : Daizein, purearin có trong sắn dây Pueraria

thomsoni (Favaceae)

- Neoflavonoid : Chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật ví dụ

brazilin có trong thân cây Tô mộc Caesalpinia sapan L.(Caesalpiniaceae)

thường gặp trong cây Một số chất đại diện : Acid salicylic, acid gallic, acid protocatechic Các acid gallic và acid protocatechic thường có ở dạng tự do và dạng ester

hydroxycinnamic Chất đại diện : acid ferulic, acid caffeic, acid p- coumaric… Acid caffeic có trong Cà phê, Actisô và nhiều cây khác , còn gặp dưới dạng ester với acid quinic như acid chlorogenic và isomer của nó như acid isochlorogenic Các acid chlorogenic là các thành phần phổ biến hay gặp trong cây, ngoài ra còn gặp dưới dạng dẫn xuất với đường như caffeoylglucose, orobauchin….Acid ferulic có ở dạng tự do và dạng ester

trong gôm của các cây họ hoa tán, acid ferulic cũng được phát hiện có trong Xuyên khung

e Anthranoid

Anthranoid nằm trong nhóm lớn thuộc chất màu quinon là những sắc tố

được tìm thấy chủ yếu trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao Căn cứ vào số vòng thơm dính thêm vào nhân quinon mà người ta sắp xếp thành benzoquinon , naphtaquinon, anthraquinon

Anthranoid ( anthraquinon ) được chia thành 2 nhóm lớn: nhóm phẩm nhuộm và nhóm nhuận tẩy.Trong phạm vi phân tích cây thuốc nhóm nhuận tẩy được quan tâm nhiều , những chất thuộc nhóm này thường có 2 nhóm OH dính ở vị trí 1,8 và ở vị trí 3 thường là nhóm CH3, CH2OH, CHO hoặc COOH Người ta hay gặp các dẫn chất có cùng một cấu trúc, chỉ khác nhau ở mức độ oxy hóa C-3 trong cùng một loài Ví dụ trong Đại hoàng, Chút chít, Thảo quyết minh thì có mặt cả 3 chất: Chrysophanol, aloe emodin và rhein Những dẫn chất anthranoid khi ở trong thực vật có thể tồn tại dưới dạng ôxy hoá (anthraquinon) hoặc dạng khử (anthron, anthranol)

Trong cây anthranoid tồn tại dưới dạng aglycon và dạng gắn đường Dạng gắn đường chủ yếu là O-glycosid, liên kết glycosid thường gặp ở vị trí C-1, C-8, hoặc C-6-OH, dạng C-glycosid chỉ xuất hiện ở nhóm anthron với liên kết C-C thường ở C-10 (barbaloin), hoặc vừa C- glycosid vừa O – glycosid như aloinosid, cả 2 chất này đều có trong Lô hội

Dẫn chất anthranoid trong cây đôi khi còn gặp dưới dạng dimmer như

hipericin: có trong cây Hipericum Perforatum Ararobinol có trong cốt khí

muồng, senosid A, B, C có trong Phan tả diệp, cassiamin (dianthraquinon )

thường gặp trong chi Cassia

2.2.1.2 Terpenoid [6] [8] [30] [38]

Terpenoid là những chất có cấu tạo từ các isopren C5 H8.và chúng được phân loại dựa theo số isopren có trong công thức gồm có các thành phần như sau : Monoterpen 2 đơn vị (C10) , sesquiterpen 3 đơn vị (C15), diterpen 4 đơn vị(C20),triterpen 6 đơn vị (C30), carotenoid 8 đơn vị (C40)

Các terpenoid còn được xếp thành nhóm theo tính chất bay hơi như tinh dầu

là những mono và sesquiterpen bay hơi (C10 – C15), đến nhóm diterpen bay hơi kém (C20), cuối cùng là các nhóm không bay hơi

a.Monoterpen và sesquiterpen ( tinh dầu ):

Một số chất đại diện : Các dẫn xuất của monoterpen như limonen có trong

tinh dầu vỏ chanh Citrus limonia Osbeck, citronelal, geraniol có trong tinh dầu Sả Citronelle java Menthol có trong tinh dầu Bạc hà Mentha arvensisL,

M piperita L Cineol trong tinh dầu của cây Tràm Melaleuca leucadendron L

Camphor có trong tinh dầu cây Long não Cinnamomum camphora (L), Nees

et Eberm (Lauraceae) Các dẫn chất của sesquiterpen như: β.Zingilberen, areurcumemen, β.farnesen có trong tinh dầu Gừng: Zingiber officinale Rose (Zingiberaceae) Artemisinin có trong Thanh hao Artemiasia annua L (Asteraceae)

Các thành phần bay hơi có trong tinh dầu, ngoài các thành phần dẫn chất mono và sesquiterpen có thể có các thành phần bay hơi khác là các dẫn chất nhân thơm chiếm tỷ lệ cao ví dụ như aldehyd cinnamic của tinh dầu Quế

cinnamomum cassia Nees et BI (Lauraceae) Eugenol có trong tinh dầu của

Hương nhu: Ocimum sametum L hoặc Ocimum gratissium L (Lamiaceae)

b Mono và diterpenoid glycosid

Trong cây,thành phần monoterpenoid glycosid được gặp nhiều nhất là nhóm iridoid, cho đến nay đã được biết đến trên 600 chất Khung cơ bản gồm một vòng xyclopantan nối với một vòng hydropyran Các iridoid thường gặp

trong các họ Scrophulariaceae như Sinh địa, Huyền sâm, Rubiaceae như Dành dành, lá lông mơ, Plantaginaceae như Mã đề, và một số họ khác

* Secoiridoid : Gentiopicrim trong Long đởm

- Diterpenoid glycosid : gặp giới hạn trong một số loài ví dụ : Darutosid trong Hy thiêm, neo-andrographolid trong Xuyên tâm liên, steviosid có trong

Cỏ ngọt

c triterpenoid và steroid:

Triterpenoid chia thành 4 nhóm chính: Triterpen (true triterpen ) , steroid, saponin và glycosid tim Các triterpen thường có vị đắng nên còn

được xếp vào nhóm chất đắng ví dụ, các limonoid, quassinoid là các triterpen

có phổ biến trong họ Rutaceae, Meliaceae, Simaroubaceae Các triterpen tự

nhiên có thể tồn tại dưới dạng tự do hoặc glycosid, ví dụ chandravadana, momordicosid k, l, F1 , F 2, G và I là các glycosid triterpenoid có trong quả

Mướp đắng Momordica charantia L

Sterol trước đây chủ yếu được quan tâm như là những chất hocmon của

động vật (như hocmon nội tiết,…) Trong những năm gần đây, số lượng nhóm chất này được phát hiện trong cây tăng lên nhiều Chất điển hình sitosterol (β sitosterol) stigmasterol và campesterol Những sterol này có thể xuất hiện dưới dạng tự do hoặc glycosid

d Saponin:

Saponin được phát hiện có trong trên 70 họ Phần lớn các saponin có trong cây thuốc dưới dạng triterpen glycosid và một số dạng steroid saponin Phần gắn đường có thể được nối qua nhóm OH ở vị trí C3-OH (monodesmosidic saponin) một số ít trường hợp phần đường gắn qua 2 nhóm

OH hoặc qua một nhóm OH và một nhóm carboxyl của aglycon (bisdesmosidic saponin)

Saponin triterpenoid được chia thành 2 phân nhóm gồm : Saponin triterpenoid pentacyclic ( có cấu trúc 5 vòng ) và saponin triterpenoid tetracyclic (4 vòng) Trong nhóm có cấu trúc 5 vòng lại được chia thành các nhóm nhỏ gồm có : olean, ursan, lupan và hopan, trong đó nhóm olean chiếm phần lớn trong số các saponin triterpenoid trong tự nhiên Phần aglycon của nhóm olean thường là dẫn chất của 3-β hydroxy olean 12-ene còn gọi là β amyrin, ví dụ : acid oleanolic, hederagenin, gypsogenin Các saponin nhóm ursan ,ví dụ như asiaticosid có trong Rau má và Ngũ gia bì chân chim và betulinic thuộc nhóm lupan cũng có trong Rau má Nhóm saponin triterpenoid có cấu trúc 4 vòng được chia thành 3 nhóm gồm có: damaran, lanostan, cucubitan Đại diện nhóm damaran là các saponin của Nhân sâm, ví

dụ, ginsengnosid Rx(x = a,b,c,d,e, f,g,h ) Phần lớn các saponin thuộc nhóm

cucurbitan gặp trong họ Cucurbitaceae như dihydro cucubitacin và cucubitacin glucosid có trong rễ cây Bryonia alba L (Cucubitaceae) Hầu hết

các saponin triterpenoid có hoạt tính phá huyết, mức độ mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào cấu trúc và nhóm chức thay thế

Saponin steroid được chia thành các nhóm:

Nhóm spirostan: Các sapogenin sarsasapogenin , smilagenin, tigogenin, diosgenin, hecogenin…

Nhóm furostan :Sarsaparillosid, avenacosidA ( bidesmosid)

Nhóm aminofurostan : Jurubin có trong Solanum paniculatum

Nhóm spirosolan : Solasonin có trong cây Cà úc Solanum laciniatum

Nhóm solanidan : Solanin có trong mầm khoai tây

Các chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan ,solanidan đều có chứa Nitơ, mang tính alcaloid, dưới dạng glycosid còn được gọi là glycoalcaloid

2.2.1.3 Alcaloid [6]

Alcaloid là hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật,đôi khi có trong động vật, thường có lực tính rất mạnh và cho phản ứng hoá học với tính chất chung của alcaloid

Hiện nay đã biết khoảng 6000 alcaloid từ hơn 5000 loài, hầu hết ở thực

vật bậc cao, tập trung ở một số họ như trúc đào(Apocynaceae) 800 chất, thuốc phiện (Paraveraceae) gồm 400 chất, họ đậu (Fabaceae) gần 500 alcaloid, họ cam( Rutaceae) 300 alcaloid, họ hành (Liliaceae) 250 alcaloid, họ cà (Solanaceae) 200 chất và các họ khác như thuỷ tiên (Amaryllidaceae), họ mã tiền (Logamiaceae), họ cúc (Asteraceae), họ thầu dầu (Euphobiaceae).Có những họ có tới trên 50% số loài có chứa alcaloid như : Ramunculaceae,

Berberidaceae, Papaveraceae

Rất ít trường hợp trong cây chỉ có một alcaloid duy nhất mà thường là hỗn hợp nhiều alcaloid, trong đó thành phần alcaloid chính có hàm lượng cao

và các alcaloid phụ có hàm lượng thấp hơn Trong cây, alcaloid ít khi ở dạng

tự do mà tồn tại ở dạng muối của các acid hữu cơ như citrat, tactrat, malat, oxalat, acetat đôi khi ở dạng muối của acid vô cơ tan trong dịch tế bào ở

một số ít trường hợp kết hợp với đường tạo ra dạng glycoalcaloid như Solanin,

solamacgin, trong cây cà lá xẻ (Solanum lacianatum)

Alcaloid thường được phân loại tuỳ theo cấu trúc của nhân, gồm 3 nhóm chính: alcaloid không có nhân dị vòng, alcaloid có nhân dị vòng và alcaloid có nhân khác ( nhân sterol và terpen) Alcaloid không có nhân dị vòng như ephedrin có trong Ma hoàng, leonurin có trong ích mẫu Các alcaloid có các nhân khác như : solanin , solamacgin là các alcaloid có cấu

trúc steroid có trong Cà lá xẻ Solanum lacianatum Ait (Solanaceae) Aconitin

là 1 loại alcaloid có cấu trúc diterpen có trong ô đầu Ngoài ra, còn có cấu trúc khác như tuberostemonin có trong Bách bộ

Các alcaloid có nhân dị vòng được phân loại tiếp thành các nhóm có kiểu khung dị vòng khác nhau:

- Dẫn xuất nhân pyrrol hoặc pirrolidin

- Dẫn xuất nhân pyridin hoặc piperidin như nicotin trong thuốc lá,

arecolin trong hạt cau (semen Arecae)

- Dẫn xuất tropan: Scopolamin trong Cà độc dược

- Dẫn xuất của nhân quinolin: quinine, quinidin trong vỏ Canhkina

- Dẫn xuất isoquinolin

- Dẫn xuất của quinolizidin: spactein trong Sarothamnus scoparius

- Dẫn xuất nhân indol

- Dẫn xuất nhân imidazol: pilocapin trong Pilocarpus jaboprandi

- Dẫn xuất nhân purin: cafein, theophylin, theobromin

- Dẫn xuất của quinazolin:

- Dẫn xuất của nhân acridin: rutacridon, arborinin trong Ruta

graveolens

- Dẫn xuất của nhân pyrrolizin

Trong số các nhóm dẫn xuất này có 2 nhóm isoquinolin và indol, được sử dụng nhiều trong điều trị nên được phân loại tiếp thành nhiều phân nhóm

Dẫn xuất isoquinolin gồm 9 phân nhóm : Cấu trúc tetrahydroisoquinolin, benzylisoquinolin, ptalidisoquinolin, protoberberin, protopin, aporphin, morphinan, benzphenanthridin, emetin.Ví dụ : Papaverin (thuộc benzylisoquinolin),noscapin (thuộc ptalidisoquinolin), morphin, coddein và thebain (morphinan) là các thành phần có trong nhựa thuốc phiện Berberin (protoberberin ) có trong Hoàng liên Emetin , cephelin (thuộc

emetin) có trong Ipeca

Dẫn xuất indol gồm 6 phân nhóm: Cấu trúc indolalkylamin, physostigmin, β carbolin, ergolin, strychnin và các alcaloid nhân indol có cấu

trúc phức tạp ở các cây thuộc chi Catharanthus, ví dụ : các alcaloid có cấu trúc ergolin, có trong cựa loã mạch., cấu trúc strychnin có trong chi Strychnos

2.2.1.4 Acid amin

Các acid amin có phổ biến trong hệ thực vật và động vật nói chung là thành phần cấu tạo protein, ngoài ra trong hệ thực vật còn có các thành phần acid amin không thuộc nhóm cấu tạo protein “ non-protein” acid ví dụ :

azetidine2- carboxylic acid là thành phần đặc trưng có trong một số cây thuộc

họ Liliaceae Một số thành phần acid amin có tác dụng trị sán như curcubitin (

amino-3-carboxy-3-pyrolidin) có trong hạt bí ngô, acid kainic có trong tảo

Diginea simplex Agardh, acid quisqualic có trong hạt cây Sử quân tử [8]

Saussureamin A, B,C,D,E là các thành phần aminoacid- sesquiterpen có tác dụng sinh học đã được phát hiện trong rễ Mộc hương [77]

2.2.1.5 Đường

Đường trong cây được phân loại thành 3 nhóm căn cứ theo kích thước của phân tử gồm có: monosaccharid (ví dụ glucose, fructose), oligosaccharid và polysaccharid Oligosaccharid được tạo thành bỏi sự ngưng tụ của 2 hay vài

đơn vị monosaccharid, ví dụ như sucrose.Polysaccharid gồm có nhiều và tạo thành một chuỗi dài đơn vị monosaccharid, thành phần này chỉ được tách và phát hiện dưới dạng sản phẩm thuỷ phân bằng kỹ thuật sắc ký thông thường như SKLM, sắc ký giấy [38]

2.2.2 Các phương pháp định tính phát hiện

Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi xin giới thiệu một số phương pháp

và kỹ thuật có liên quan đến xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng dạng

“vân tay” nhóm chất của dược liệu, gồm có các phương pháp sắc ký như SKLM, SKLCA, SKK Phương pháp định tính bằng phản ứng hoá học được

giới thiệu để tham khảo

2.2.2.1 Phương pháp định tính bằng phản ứng hoá học

Là phương pháp định tính dựa vào phản ứng hoá học của một số nhóm chất với thuốc thử tạo thành các sản phẩm kết tủa hoặc có màu đặc trưng, còn

được gọi là phương pháp định tính trong ống nghiệm Thuốc thử thường được

áp dụng phát hiện một số nhóm chất của dược liệu, được tóm tắt ở bảng 2.1 Phương pháp định tính trong ống nghiệm có tính chất sơ bộ , tính chất

đặc trưng chỉ giới hạn ở một số nhóm chất (như đã trình bày ở bảng 2.1) Phản ứng màu tạo thành để phát hiện nhóm chất đôi khi còn bị hạn chế, khó phát hiện bởi sự ảnh hưởng của các thành phần nhóm chất khác có trong dược liệu Trong phạm vi đề tài, chúng tôi không tiến hành khảo sát xác định đặc điểm hoá học đặc trưng bằng phương pháp định tính ống nghiệm, phương pháp

được nêu chỉ mang tính chất giới thiệu để so sánh

Bảng 2.1 : Định tính các nhóm chất hoá học của dược liệu bằng phương pháp định tính trong ống nghiệm

T

1 Flavonoid

Phản ứng cyanidin Phản ứng với dd FeCl3 5%

Phản ứng với kiềm

Sản phẩm có màu hồng Sản phẩm màu xanh tím Sản phẩm có màu vàng

đậm hoặc vàng cam

2 Alcaloid

Phản ứng với TT Mayer Phản ứng với TT Dragendorff Phản ứng với TT Bouchardat

Có tủa trong trong môi trường acid và tan / kiềm

loại tanin pyrogalic loại tanin catechic

8 Đường khử Phản ứng với TT Fehling Tủa có màu

9 Acid hữu cơ Phản ứng với dd Na2CO3 Có bọt khí

10 Chất béo Hơ trên giấy lọc

2.2.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Là phương pháp tách các chất trên hai pha trong đó pha động là chất lỏng gồm các dung môi và pha tĩnh là chất rắn thông thường là silicagel được tráng trên bản mỏng

Các yếu tố liên quan đến phương pháp : Khi tiến hành phân tích bằng

kỹ thuật sắc ký trên bản mỏng cũng như các kỹ thuật sắc ký cột, có 3 yếu tố chính liên quan đến phương pháp đó là pha tĩnh, pha động và cách phát hiện Kết quả phân tích phụ thuộc nhiều vào các yếu tố trên Thêm vào đó, còn có các yếu tố ảnh hưởng khác, như phương pháp chuẩn bị mẫu hay còn gọi xử lý mẫu và lượng chấm mẫu, cần được lựa chọn cho phù hợp với từng đối tượng

phân tích Các yếu tố này sẽ được trình bày kỹ hơn ở phần phương pháp nghiên cứu

Pha tĩnh:

Hiện nay, có nhiều loại pha tĩnh đã được sử dụng để tách các nhóm chất bởi kỹ thuật này Một số pha tĩnh thông dụng đã được áp dụng định tính các dược liệu, có ghi trong các dược điển như : Silicagel G F254 Merck, silicagel

H, polyamid, cellulose…

Bên cạnh đó, một số loại pha tĩnh khác đã được sản xuất với công nghệ cao, góp phần nâng cao hiệu quả phân tích, như bản mỏng hiệu năng cao HPTLC, Lichrospher Si 60 F254 Một số pha tĩnh dưới dạng bản mỏng pha

đảo HPTLC plates RP-2, RP-8, RP-18 mở rộng khả năng tách tốt đa số các thành phần từ rất kém phân cực như dầu béo và các chất thơm, đến rất phân cực như các thành phần có tính acid và bazơ, các cặp ion Bản mỏng HPTLC plates NH2 đã được dùng để tách và phát hiện một số chất đường, catecholamin, steroid hormon và các acid của hoa quả, đạt hiệu quả cao

Trên thực tế, sự lựa chọn pha tĩnh còn phụ thuộc vào mục đích phân tích

và hiệu quả kinh tế Pha tĩnh được áp dụng phổ biến hiện nay là Silicagel G F254 Merck bản tráng sẵn, có thể áp dụng phân tích đối với hầu hết các thành phần nhóm chất Pha tĩnh loại này đã được chọn áp dụng cho phân tích dược liệu của đề tài

1050 C trong 1 giờ trước khi sử dụng Ví dụ, để tách các thành phần kém phân cực của tinh dầu , các dung môi và hệ dung môi kém phân cực đã được dùng như chloroform hoặc toluene : ethylacetat ( 93 : 7 ), ( 95 : 5) và pha tĩnh cần

được hoạt hoá Ngược lại để tách các thành phần phân cực như các glycosid, cần các hệ dung môi có thành phần phân cực và pha tĩnh không đòi hỏi mức

độ hoạt hoá cao ,ví dụ như các hệ dung môi đã được áp dụng tách glycosid đã nêu ở phụ lục 3 Theo nguyên tắc lựa chọn hệ dung môi thích hợp như đă nêu , cho thấy, nhiều pha động với thành phần dung môi và tỉ lệ khác nhau có thể

được áp dụng để tách các chất cần phân tích Thành phần hệ dung môi có khi

có thêm một tỷ lệ nhất định các dung môi có tính acid hoặc kiềm, với mục

đích làm tăng hiệu quả tách các chất cần phân tích Chẳng hạn, các hệ dung môi được áp dụng tách các alcaloid thường có thêm thành phần kiềm như amoniac hoặc diphenylamin và các hệ dung môi tách các flavonoid thường có thêm acid, như acid acetic, acid formic ( xem phụ lục 3) Tuy nhiên, có

trường hợp ngoại lệ, chẳng hạn, có thể tách berberin (alcaloid) với hệ dung môi có thành phần acid, hay tách acid glycyrrhetic ( saponin) trong rễ Cam

thảo (Liquiritiae radix) với hệ dung môi kiềm ( xem phụ lục 3 )

Trên thực tế, đã có nhiều hệ dung môi đã được áp dụng trong phân tích các thành phần chất và nhóm chất của dược liệu và các chế phẩm Một số hệ dung môi được giới thiệu để tham khảo, đã được áp dụng tách một số thành phần chất và nhóm chất trong dược liệu cũng như chế phẩm, với pha tĩnh chủ yếu là SilicagelG, như đã được ghi ở phụ lục 3

Phương pháp phát hiện:

Khác với các kỹ thuật sắc ký cột, một trong số ưu thế nổi bật của kỹ thuật SKLM là khả năng phát hiện phong phú các thành phần, nhóm chất của dược liệu Bên cạnh khả năng phát hiện dựa vào đặc điểm tự nhiên, vốn có màu hoặc phát quang của thành phần phân tích, sự phát hiện dựa vào các phản ứng hoá học của các thành phần chất và nhóm chất với các loại thuốc thử khác nhau, tạo ra các sản phẩm dẫn xuất có màu hoặc có phát quang màu đặc trưng, đã góp phần đáng kể trong việc tìm và phát hiện các thành phần đặc trưng cho dược liệu và các chế phẩm bởi kỹ thuật này Bên cạnh đó, thuốc thử

được áp dụng để phát hiện các thành phần chất rất phong phú Hiện nay đã có trên 250 thuốc thử các loại [26] [30] [40], trong đó gồm có thuốc thử phát hiện nhóm chất, ví dụ : thuốc thử Dragendorff dùng để phát hiện alcaloid nói chung ; 4-nitroanilin diazo hoá phát hiện các hợp chất phenolic ; thuốc thử Ninhydrin phát hiện các acid amin và các amin bậc 1; thuốc thử α- naphthol/ acid sulfuric phát hiện đường…Thuốc thử phát hiện nhóm chức như : thuốc thử dinitrophenylhydrazin phát hiện nhóm chức aldehyd và keton; thuốc thử Fast blue salt phát hiện nhóm chất phenol… Thuốc thử phát hiện theo cấu tạo của công thức như : thuốc thử EP (4- dimethyl aminobenzaldehyd/ acid acetic/ acid phosphoric ) phát hiện terpenoid có cấu trúc khung kiểu azulen thường cho màu xanh đặc trưng; thuốc thử Van Urk để phát hiện các dẫn xuất của vòng indol ( các secale alcaloid ); thuốc thử Libermann- Burchard phát hiện các triterpen và steroid Hơn nữa, các phản ứng tạo màu cũng thể hiện khác nhau giữa các chất thuộc cùng một nhóm chất, khi phun cùng một loại thuốc thử , góp phần tạo nên các đặc điểm đặc trưng cho từng thành phần chất trên sắc ký đồ Chẳng hạn như, các thành phần của tinh dầu cho các màu sắc khác nhau từ màu xanh- xanh tím- tím – tím đỏ với thuốc thử vanilin / acid sulfuric, các thành phần thuộc nhóm flavonoid cho các vết có phát quang khác nhau từ màu lục – vàng – vàng cam với thuốc thử NP/ PEG hoặc acid boric/ acid oxalic trên sắc ký đồ… Một số thuốc thử phổ biến đã được áp dụng phát hiện các thành phần chất và nhóm chất được ghi ở phụ lục 4

2.2.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ( SKLCA)

Là phương pháp sắc ký phân bố (pha đảo là chủ yếu), trong đó pha

động là một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi có độ phân cực thích hợp, còn pha tĩnh chứa trong cột là chất lỏng phủ trên một chất mang dạng rắn hay một chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với một nhóm hữu cơ

Pha tĩnh:

Gồm các tiểu phân silica gel mà trên bề mặt của nó được bién đổi bằng liên kết hoá học, mà trong số đó liên kết kiểu octadecylsilan là phổ biến, được dùng nhiều nhất, ngoài ra, kiểu octylsylan cũng được sử dụng Các nhóm liên kết này làm thay đổi tính chất tách cuả cột còn gọi là cột pha đảo Các loại cột pha đảo được sử dụng phổ biến hiện nay như Lichrospher RP18 [4] [57] Pha tĩnh trên thực tế thường cố định, chỉ thay đổi cột pha tĩnh trong trường hợp cần thiết và có yêu cầu riêng biệt

Pha động :

Là các hệ dung môi có độ phân cực thích hợp với đối tượng cần phân tích, việc lựa chọn pha động thích hợp cho mỗi đối tượng cần phân tích là yếú

tố cần thiết phải được tiến hành khảo sát Để góp phần làm tăng hiệu quả tách

đối với từng đối tượng phân tích cụ thể, đôi khi thành phần pha động có bổ sung thêm các dung dịch đệm, tạo môi trường PH thích hợp hoặc/ và tỷ lệ thành phần pha động được khảo sát, thay đổi theo chương trình gradient thích hợp

Phát hiện :

Detector UV là phổ biến để phát hiện các chất có khả năng hấp thụ tử ngoại và khả kiến như các thành phần thuộc nhóm hợp chất phenolic,

flavonoid, anthranoid, lignan, coumarin, alcaloid

Các yếu tố có liên quan khác:

Khác với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng có pha tĩnh chỉ dùng một lần, không

đòi hỏi việc xử lý mẫu khắt khe, loại sắc ký cột rửa giải này, việc xử lý mẫu thích hợp trước khi đưa vào cột là một yêu cầu cần thiết phải được quan tâm khảo sát để vừa đảm bảo phân tích đạt hiệu quả, đồng thời bảo vệ cột Bên cạnh đó, các yếu tố khác cũng có ảnh hưởng đến kết quả phân tích cần được quan tâm khảo sát cho phù hợp như : lượng mẫu áp dụng cho sắc ký, tốc độ dòng, kích thước cột

Ưu điểm của kỹ thuật SKLCA là có khả năng tách tốt các thành phần của nhóm chất với độ phân giải cao Hiện nay kỹ thuật này đã được áp dụng nhiều trong phân tích dược liệu và chế phẩm, đặc biệt là các đối tượng có thành phần hoạt chất đã biết và cần được xác định Ví dụ , các phép thử định lượng được áp bằng kỹ thuật SKLCA ghi trong các chuyên luận dược liệu DĐTQ 2005 gồm có 171 trong tổng số 281 các phép thử định lượng, chiếm 60,8% và chiếm 89% ( 171/ 192 ) trong số các phép thử định lượng bằng các phương pháp sắc ký [59]

Định tính dưới dạng xác định “ vân tay “nhóm chất của một dược liệu

được áp dụng bởi kỹ thuật có khả năng tách tốt này, thông thường căn cứ vào xác định thành phần hoạt chất hoặc chất đặc trưng của nhóm chất và cần thiết phải có chất chuẩn để đối chiếu và xác định Kết quả xác định vân tay bằng kỹ thuật SKLCA có thể là cơ sở để so sánh đánh giá chất lượng dược liệu không chỉ về mặt định tính mà còn về mặt định lượng, thông qua kết quả đo pic của thành phần chất cần xác định Bên cạnh đó, trong một số trường hợp, dựa vào

tỷ lệ diện tích hay chiều cao pic các thành phần đặc trưng của dược liệu, giúp

ta có thể phân biệt được các loài trong cùng chi Ví dụ, căn cứ vào sự khác nhau đặc trưng của hai thành phần hoạt chất của Khương hoạt là notopterol và

nodakenin, nhờ đó có thể phân biệt được giữa hai loài Notopterigium Incisum

và N Forbessi, trong đó, notopterol chiếm tỷ lệ cao ở loài thứ nhất, ngược lại

nodakenin chiếm tỷ lệ cao ở loài thứ hai [28]

Với đối tượng dược liệu chưa xác định thành phần hoạt chất, việc xác

định dạng “vân tay” của một nhóm chất bởi kỹ thuật SKLCA, phục vụ cho tiêu chuẩn hoá dược liệu, còn bị hạn chế Trên thực tế, phép thử định tính dược liệu bằng kỹ thuật SKLCA chưa có ghi trong DĐTQ 2000 và mới bổ sung 5 phép thử trong DĐTQ 2005 [59]

Xác định “vân tay” nhóm chất của dược liệu trong trường hợp này sẽ

được thực hiện theo hướng tìm thành phần hoạt chất đã được biết có trong dược liệu đó Theo cách này, đề tài đã thử nghiệm kỹ thuật SKLCA áp dụng xác định “ vân tay” nhóm chất alcaloid bay hơi của dược liệu Xuyên khung và xác định thành phần lignan của Đỗ trọng, phối hợp với kỹ thuật SKLM để nhận biết các nhóm chất cần xác định như đã nêu , so sánh và đánh giá chất lượng dược liệu thông qua kết quả của tổng các pic đo được

2.2.2.4 Phương pháp sắc ký khí và sắc ký khí khối phổ (SKK, SKK-KP)

Sắc ký khí là phương pháp tách trong đó pha động là chất khí ( khí mang ) và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn, hoặc chất lỏng phủ trên một chất mang tính trơ dạng rắn, hoặc một film lỏng phủ đều trên thành phương pháp sắc ký khí dựa trên cơ chế hấp phụ và phân bố

Các yếu tố liên quan khác :

Nhiệt độ cột được khảo sát ở một giá trị không đổi hoặc được thay đổi theo một chương trình qui định, phù hợp với đối tượng phân tích, sao cho các thành phần được tách tốt trên sắc ký đồ Bên cạnh đó, các yếu tố ảnh hưởng khác cũng cần được quan tâm như nhiệt độ buồng tiêm, nhiệt độ cổng detector, xử lý mẫu, lượng tiêm mẫu

Phương pháp sắc ký khí được áp dụng hiệu quả trong phân tích các thành phần chất bay hơi được của dược liệu và chế phẩm, như tinh dầu

Cũng giống như SKLCA, phương pháp SKK có khả năng tách tốt các thành phần với độ nhạy cao, do vậy, phương pháp phân tích sẽ không đạt hiệu quả nếu không có chất chuẩn để đối chiếu và xác định

Ngày nay, kỹ thuật sắc ký khí gắn với detector khối phổ (skk - Kp), đã góp phần mở rộng khả năng phát hiện thành phần chất tách được trên sắc ký

đồ, thông qua đối chiếu với phổ khối chuẩn của các chất có trong ngân hàng khối phổ.Với khả năng này skk - Kp sẽ có hy vọng tìm và phát hiện các thành phần đặc trưng thuộc nhóm chất bay hơi được của dược liệu

Đề tài đã thử nghiệm áp dụng kỹ thuật skk - Kp trong định tính thành phần bay hơi được, có trong dược liệu ô dược

2.2.3 Phân tích sàng lọc hoá học dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Đối với một đối tượng phân tích là dược liệu đã được biết thành phần

hoạt chất hoặc chất cụ thể đặc trưng, việc định tính phát hiện dược liệu trong trường hợp này sẽ chủ yếu căn cứ vào các thành phần chất đã được biết của dược liệu và thông thường có chất chuẩn hoặc chất đối chiếu để xác nhận Hơn nữa trong trường hợp như vậy, việc phân tích các dược liệu không chỉ dừng ở mức đánh giá định tính mà có thể xác định định lượng, một khi có chất

chuẩn làm đối chiếu

Đối với đối tượng phân tích là dược liệu chưa biết rõ hoặc chưa xác định thành phần hoạt chất và chất đặc trưng cụ thể, việc phân tích xác định các thành phần hóa học đặc trưng của dược liệu dưới dạng tìm và xác định đặc

điểm đặc trưng của nhóm chất Tiến hành xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất gồm 2 bước chính như sau :

Bước 1 : Tiến hành phân tích sơ bộ xác định các thành phần hoá học của dược liệu dưới dạng nhóm chất hay còn gọi là phân tích sàng lọc hoá học của dược liệu đó Kết quả phân tích sàng lọc sẽ cho biết thành phần hoá học của dược liệu khảo sát thuộc loại nhóm chất gì và có bao nhiêu nhóm chất

được phát hiện Mặt khác, cung cấp các thông tin liên quan làm cơ sở cho việc khảo sát tiếp theo xác định đặc điểm đặc trưng của nhóm chất, như hệ dung môi tách nhóm chất, các đặc điểm đã được phát hiện, tỷ lệ nhóm chất được phát hiện

Bước 2 : Được tiến hành khảo sát điều kiện phân tích, áp dụng cho từng

đối tượng nhóm chất, đã được phát hiện sơ bộ từ kết quả phân tích sàng lọc của dược liệu đó Khảo sát về các yếu tố, các thông số tạo nên tính đặc trưng của nhóm chất như : hệ dung môi sắc ký, phương pháp phát hiện và các yếu tố

có liên quan khác như: phương pháp chiết mẫu , pha tĩnh, lượng chấm mẫu Các phương pháp xác định sơ bộ nhóm chất của dược liệu hay chế phẩm thuốc nguồn gốc thảo mộc đã được biết gồm có: phương pháp phân tích bằng phản ứng hoá học trong ống nghiệm và phương pháp sắc ký lớp mỏng

Kết quả phân tích hoá học trong ống nghiệm với nội dung như đã giới thiệu ở bảng 2.1 cũng cho biết thông tin sơ bộ về các nhóm chất được phát hiện, gồm nhóm chất gì và có bao nhiêu nhóm được phát hiện của dược liệu đó Tuy nhiên, không cho ta biết các thông tin về thành phần nhóm chất được tách trên sắc ký đồ

Với mục đích áp dụng kỹ thuật phân tích sàng lọc SKLM vào việc khảo sát xác định các thành phần hoá học đặc trưng của các dược liệu đã đăng ký của đề tài, chúng tôi xin giới thiệu phương pháp “ phân tích sàng lọc SKLM dược liệu và thuốc có nguồn gốc từ thảo mộc, chưa được biết thành phần hoạt chất “ đã được nêu lên bởi các tác giả H Wagner, S Bladt [30] để tham khảo Phương pháp được trình bày tóm tắt như sau :

Pha tĩnh : Silicagel G F 254

Hệ dung môi SKLM được áp dụng cho phân tích sàng lọc gồm có 5 loại hệ

dung môi như sau :

- HDM.1 : Ethylacetat : methanol : nước ( 100 : 13,5 : 10 ) : Để phân tích các thành phần phân cực ( glycosid ) như alcaloid, anthraglycosid, arbutin, glycosid tim, flavonoid, phenolcarboxylic acid, saponin,

- HDM.2 : Toluen : ethylacetat (93 :7): Để phân tích các thành phần kém phân cực ( aglycon), như tinh dầu, terpen , coumarin, các chất đắng, valepotriat, các acid kém phân cực

- HDM.3 : Toluen : ethylacetat : diethylamin ( 70 : 20 : 10) : Phân tích

- TT4: Thuốc thử natural product/ polyethylen glycol ( NP/ PEG)

- TT5: Thuốc thử vanilin – acid sulfuric hoặc anisaldehyd – acid sulfuric

- TT6: Thuốc thử acid hydrochloric- acid acetic

- TT7: Thuốc thử Berlin blue

Phương pháp đánh giá kết quả phân tích được tóm tắt ở bảng 2.2

Mô hình phân tích sàng lọc nêu trên sẽ được tham khảo để áp dụng cho phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu đã đăng ký trong đề tài này Tuy nhiên, việc vận dụng một số hệ dung môi tách và thuốc thử để phát hiện nhóm chất có điều chỉnh cho phù hợp với mục đích tìm “ vân tay ” hoá học của dược liệu Cụ thể ,một số nhóm chất là hoạt chất không phổ biến, đã có thuốc thử riêng biệt và đặc trưng để phát hiện như glycosid tim, arbutin, valepotriat sẽ không đề cập đến ở phần phân tích sàng lọc Thêm vào đó, một số nhóm chất phổ biến có thể áp dụng xác định đặc điểm đặc trưng cho dược liệu cần được bổ sung như : acid amin và đường

Bảng 2.2 : Phương pháp đánh giá kết quả phân tích sàng lọc hoá học dược liệu và thuốc nguồn gốc thảo dược theo tác giả H Wagner S Bladt

Các nhóm chất

được phát hiện trên sắc ký đồ

- Phát quang màu khác nhau / uv 366nm

ắ Coumarin

HDM 1 TT 2 - Màu hồng đến đỏ / vis ắ Glycosid tim

HDM 1 TT 7 - Màu xanh / vis ắ Arbutin

đặc biệt đối với đối tượng chưa xác định thành phần hoạt chất

Ngoài vấn đề nêu trên, phương pháp phân tích sàng lọc dược liệu còn

có ý nghĩa trong việc khảo sát nghiên cứu hoá thực vật và các nghiên cứu khác liên quan đến thành phần hoá học của dược liệu

III Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Chọn đối tượng nghiên cứu

Các dược liệu làm đối tượng nghiên cứu phải đạt các yêu cầu như sau:

- Dược liệu nằm trong danh mục thuốc thiết yếu y học cổ truyền do Bộ

- Dược liệu dễ bị nhầm lẫn hoặc giả mạo

- Dược liệu có thể được sử dụng thay thế bằng một hoặc nhiều vị dược liệu khác

Căn cứ vào các yêu cầu như đã nêu ở trên chúng tôi đã lựa chọn 20 dược liệu làm đối tượng nghiên cứu của đề tài này gồm có :

Chọn mẫu dược liệu nghiên cứu và khảo sát.

Các mẫu dược liệu khảo sát gồm có các loại như sau :

Mẫu dược liệu nghiên cứu : Là các mẫu dược liệu được thu hái để đảm bảo

xác định đúng tên khoa học Số lượng mẫu được lấy tối thiểu là 2 mẫu, tại các thời điểm thu hái khác nhau, để đảm bảo tính khách quan của mẫu nghiên cứu Các mẫu sau khi được thu hái đã được xử lý theo đúng qui định để đảm bảo chất lượng Kết quả xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu sẽ căn cứ vào các mẫu nghiên cứu này Các mẫu dược liệu này được coi như là mẫu đối chiếu trong phép thử định tính dược liệu Ký hiệu các mẫu nghiên cứu là C2.1; C2.2; C2.3

Các mẫu dược liệu được áp dụng để so sánh và phân biệt với dược liệu nghiên cứu, gồm có:

* Mẫu dược liệu có cùng tên gọi : Là các mẫu dược liệu được mua trên

thị trường, có đặc điểm hình thái giống với dược liệu nghiên cứu, số lượng mẫu khảo sát là 3-5 mẫu Các mẫu dược liệu này được coi như là mẫu thử

được áp dụng so sánh với mẫu đối chiếu ( mẫu nghiên cứu ) để đánh giá định

tính dược liệu khảo sát Ký hiệu của các mẫu cùng tên gọi mua trên thị trường

là S3.1; S3.2; S3.3

* Mẫu dược liệu dùng thay thế : Gồm các dược liệu như ô dược (Bắc),

Sài hồ (Bắc), Đảng sâm ( Bắc ), Nam mộc hương…là các mẫu được mua trên thị trường, trong đó có một số mẫu của 2 vị là ô dược (Bắc) và Sài hồ (Bắc )

được mua từ Trung Quốc Số lượng mẫu khảo sát tối thiểu là 2 mẫu

* Mẫu dược liệu dễ bị nhầm lẫn hoặc giả mạo được áp dụng để phân

biệt như Sài đất ( dễ nhầm lẫn với Cỏ nhọ nồi), dây Ký ninh ( dễ nhầm lẫn

với dây Đau xương), rễ Sim ( nhầm lẫn hoặc giả mạo với ô dược) Các mẫu thuộc loại này gồm có cả mẫu được thu hái để so sánh và phân biệt, số lượng mẫu tối thiểu là 2 mẫu

* Một số mẫu dược liệu khác có cùng nguồn gốc với dược liệu nghiên

cứu, thuộc các bộ phận khác nhau của cùng một cây như : Tang diệp , Tang chi, hay Mã đề, đã được bổ sung, được áp dụng so sánh và phân biệt với Tang bạch bì hay Xa tiền tử, nhằm làm sáng tỏ thêm các đặc điểm hoá học đặc trưng đã được xác định của các dược liệu nghiên cứu có trong đề tài

Danh sách tên khoa học của các dược liệu nghiên cứu và dược liệu được

áp dụng để phân biệt, được ghi ở Phụ lục 1

Danh sách số lượng mẫu nghiên cứu và mẫu mua trên thị trường được

áp dụng khảo sát, có ghi thời gian và nơi thu hái hoặc mua , được ghi ở phụ lục 2

3.1.2 Xác nhận tên khoa học( tên loài) của các mẫu dược liệu làm đối tượng nghiên cứu

- Tiến hành kiểm chứng xác định tên khoa học của các mẫu dược liệu nghiên cứu, căn cứ vào 2 yếu tố, đó là dựa vào hình thái thực vật và đặc

điểm vi phẫu và soi bột của dược liệu

* Kiểm chứng hình thái thực vật xác định tên loài theo các bộ thực vật chí hiện có và các tài liệu khác về cây thuốc Việt Nam, được thực hiện bởi các nhà thực vật học, Khoa tài nguyên cây thuốc, Viện Dược Liệu

* Xác định các đặc điểm vi phẫu của dược liệu được tiến hành dựa theo các mô tả về đặc điểm vi phẫu và soi bột của dược liệu đó trong chuyên luận dược liệu của DĐVNIII

- Một số đối tượng dược liệu nghiên cứu có tên khoa học/ tên loài không thống nhất với qui định ghi trong DĐVNIII (Đảng sâm, ô dược), cần

được nghiên cứu tiếp Do vậy, các đặc điểm hình ảnh vi phẫu và bột dược liệu

của các đối tượng này đã được lưu giữ lại

3.2 Trang thiết bị và hoá chất thí nghiệm

- Hệ thống máy chụp ảnh sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng CAMAG RESPONSTAR3 – DOCUMENTATION

- CAMAG HEATER ( máy sấy SKLM )

- Tủ sấy Binder

- Máy sắc ký lỏng cao áp Hitachi UV-VIS L 7420

- Cột LiChrispher 100 RP 18 ( 250.4mm, 5 àm)( cột SKLCA)

pp SKLM

Kết quả : Gồm các nhóm chất đ∙ đ−ợc phát hiện

Khảo sát tìm đặc điểm

đặc tr−ng của từng nhóm chất

3.3.1 Phân tích sàng lọc hoá học dược liệu bằng phương pháp SKLM

Xác định sơ bộ các thành phần hoá học của dược liệu được dựa trên cơ

sở phân tích các thành phần nhóm chất chính của dược liệu như sau :

Tinh dầu và các thành phần terpenoid kém phân cực khác

Alcaloid

Coumarin

Anthranoid

Flavonoid và các acid phenolcarbocylic

Saponin và các terpenoid (glycosid )

Amino acid

Đường và oligosaccharid

Phương pháp tiến hành gồm các bước như sau:

a Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký :

Với mục đích phân tích sàng lọc, dung môi được chọn là loại có thể chiết được đa số các thành phần nhóm chất cần phân tích của dược liệu , dung môi thông thường được dùng là methanol Phương pháp chiết được tiến hành như sau:

1 gam ( lá ) đến 2 gam (thân, rễ hoặc thân rễ ) dược liệu đã được tán nhỏ, được chiết với methanol tỉ lệ 1 g/10 ml bằng cách đun hồi lưu trên cách thuỷ 30 phút, gạn lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà cắn thu được trong 2ml methanol được dùng làm dung dịch chấm sắc ký

b Pha tĩnh :

Lớp mỏng silicagel G F254 Merck bản tráng sẵn, là loại thông dụng đã

được áp dụng để tách hầu hết các thành phần nhóm chất

Lượng chấm mẫu thông thường là 10 - 15 àl, riêng đối với định tính phát hiện alcaloid với thuốc thử dragendorff có khả năng phát hiện thấp, cần lượng chấm lớn hơn, từ 20- 30 àl

d Hệ dung môi SKLM

Các hệ dung môi được lựa chọn để tách các thành phần nhóm chất,

được áp dụng trong phân tích sàng lọc hoá học dược liệu, gồm 5 hệ dung môi,

được sắp xếp theo thứ tự tách các thành phần nhóm chất từ kém phân cực đến phân cực như sau :

- HDM 1: Toluen : ethyl acetat ( 95 : 5)

- HDM 2: Toluen: ethyl acetate: acetone: acid formic ( 5 : 2 : 2 : 1 )

- HDM 3: Ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước ( 10 : 1 : 1: 2 )

HDM2 : Tách phần lớn các acid phenolic, coumarin, anthranoid và flavonoid dưới dạng aglycon, các terpenoid có nhóm chức acid

HDM3:Tách các thành phần flavonoid, anthranoid, coumarin, phenolcarbocyclic acid, dưới dạng glycosid

HDM 4 : Tách các thành phần saponin , terpenoid dạng glycosid

( iridoid , các steroidglycosid ), alcaloid

HDM5 : Được áp dụng tách các thành phần acid amin, đường và các thành phần phân cực khác

4 đã được sử dụng tách các thành phần saponin và một số alcaloid.[61]; hệ 5 thông dụng để phân tích phát hiện thành phần acid amin và đường[16] [75]

- TT2: Acid boric – acid oxalic : Phát hiện các thành phần flavonoid, anthranoid, coumarin, phenolcarbocyclic acid thường có các màu phát quang khác nhau

- TT3: Kali hydroxid / ethanol : Phát hiện anthranoid, coumarrin

- TT4: Dragendorff : Phát hiện alcaloid

- TT5: Ninhydrin : Phát hiện các acid amin và amin bậc 1

- TT6: α.Naphthol – acid sulfuric : Phát hiện đường

Nhận xét :

* Các loại thuốc thử nêu trên đều là các thuốc thử thông dụng đã được

áp dụng để phát hiện sơ bộ các nhóm chất

* Đã sử dụng thuốc thử acid boric – acid oxalic dễ kiếm thay thế cho thuốc thử NP/PEG để phát hiện các thành phần flavonoid, anthranoid, coumarin, phenolcarbocyclic acid

* Phản ứng màu tạo thành của các thành phần chất thuộc mỗi nhóm chất cũng thể hiện khác nhau với cùng một loại thuốc thử , tạo nên tính đa dạng và đặc trưng của từng nhóm chất cần xác định

Tiến hành xác định và phân loại thành nhóm chất của dược liệu theo phương pháp phân tích sàng lọc SKLM đã xây dựng, được tóm tắt ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Tóm tắt phương pháp phân tích sàng lọc SKLM xác định các nhóm chất trong dược liệu

Hệ dung

môi

SKLM

Thuốc thử phát

hiện

Các đặc điểm

được phát hiện trên sắc ký đồ

Các nhóm chất

được phát hiện trên sắc ký đồ

HDM 1 TT1

Các vết có màu sắc khác nhau từ màu xanh đến tím và đỏ

Tinh dầu và các terpenoid nói chung

TT2

Các vết thường có phát quang dưới UV 366nm

Flavonoid, coumarin , acid phenolic

Các thành phần flavonoid, coumarin , anthranoid và acid phenolcarboxylic dưới dạng glycosid

TT3 Các vết thường có màu

vàng cam đến đỏ

Anthranoid dưới dạng glucosid

TT1

các vết thường có màu

từ tím xanh đến tím đỏ

Saponin và các thành phần terpenoid dưới dạng gắn đường khác

TT6 các vết có màu xanh tím Đường và oligosaccharid

f Kết quả phân tích sàng lọc

Kết quả phân tích sàng lọc hoá học của dược liệu bao gồm :

- Tên nhóm chất đã được phát hiện (alcaloid, anhtranoid, flavonoid, terpenoid ), số lượng nhóm chất được phát hiện từ dược liệu

- Cung cấp các thông tin có liên quan cho việc xác định các đặc điểm

đặc trưng của của nhóm chất như : Hệ dung môi tách nhóm chất thuộc hệ phân cực hay kém phân cực, đặc điểm màu sắc của vết tạo thành trên sắc ký

đồ, tỉ lệ các thành phần đã được phát hiện đó nhiều hay ít… là cơ sở cho định hướng tìm hệ dung môi tách thích hợp, lựa chọn thuốc thử đặc trưng, phương pháp chiết mẫu và lượng mẫu phù hợp

3.3.2 Phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu

Phân tích xác định các đặc điểm đặc trưng của dược liệu chưa xác định hoạt chất dựa trên cơ sở xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất

Tiến hành khai thác tìm và xác định các đặc điểm đặc trưng dạng “vân tay” nhóm chất của dược liệu gồm có :

- Khảo sát xác định “vân tay” của các nhóm chất, đã được phát hiện sơ

bộ từ kết quả phân tích sàng lọc của dược liệu : Sau khi đã nhận biết một số nhóm chất của dược liệu thông qua kết quả phân tích sàng lọc, bước tiếp theo

là tiến hành khảo sát kỹ hơn điều kiện phân tích từng nhóm chất cụ thể đó Tiến hành khảo sát và xây dựng các thông số có liên quan đến xác định đặc

điểm đặc trưng của nhóm chất như : cách xử lý mẫu, lượng mẫu, loại pha tĩnh, hệ dung môi sắc ký, cách phát hiện và thuốc thử phát hiện; sao cho thành phần của nhóm chất được thể hiện trên sắc ký đồ là đặc trưng cho dược liệu

- Tiến hành khai thác thêm các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất theo hướng tìm thành phần hoạt chất hoặc chất cụ thể đặc trưng đã được biết có trong dược liệu khảo sát (nếu có) Theo cách này đã áp dụng trong một số trường hợp cụ thể, khi thành phần chất cụ thể cần tìm đó được biết có tính chất

đặc trưng riêng biệt ngoài tính chất chung của nhóm chất, ví dụ , áp dụng xác

định vân tay nhóm chất theo hướng tìm thành phần stilben glycosid trong Hà thủ ô, căn cứ vào các đặc điểm đặc trưng riêng biệt của nó ( có phát quang và cho màu đặc trưng với thuốc thử acid phosphomolipdic/ acid sulfuric) để xác

định; xác định vân tay nhóm chất theo hướng tìm pinoresinol glycosid trong

đỗ trọng, tìm alcaloid bay hơi có trong Xuyên khung… Xác định đặc điểm

đặc trưng của nhóm chất theo hướng tìm thành phần hoạt chất hoặc chất cụ thể này sẽ góp phần bổ sung khả năng tìm và xác định xác điểm đặc trưng nhóm chất của dược liệu đó

3.3.2.1 Phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ( SKLM)

Tiến hành khảo sát xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất có trong dược liệu, gồm có khảo sát các yếu tố liên quan đến xây dựng một phép thử định tính “vân tay” nhóm chất như sau :

a Pha tĩnh :

Silicagel G F 254 Merck, bản tráng sẵn được hoạt hoá ở nhiệt độ 105 0

C trong 1 giờ trước khi sử dụng

b Xử lý mẫu (chuẩn bị mẫu chấm sắc ký):

Một trong những ưu điểm của kỹ thuật SKLM là loại sắc ký mở có pha tĩnh là các bản mỏng chỉ dùng một lần do vậy việc xử lý mẫu không đòi hỏi khắt khe như các loại sắc ký cột khác Dịch chiết dược liệu áp dụng cho phân tích bằng phương pháp SKLM thông thường nhất vẫn là dịch chiết methanol Tuy nhiên trong một số trường hợp cần thiết ta có thể áp dụng dịch chiết với

các dung môi khác có độ phân cực khác nhau, với mục đích làm giàu thành

phần nhóm chất cần phân tích và loại bớt tạp chất gây cản trở cho việc tách

và phát hiện nhóm chất đó

Căn cứ vào các nhóm chất đã được định hướng xác định “vân tay” của mỗi dược liệu, thu được từ kết quả phân tích sàng lọc nhóm chất như đã nêu ở trên , tiến hành lựa chọn cách xử lý mẫu phù hợp với nhóm chất cần xác định của dược liệu đó , trong số các dịch chiết dược liệu như đã nêu dưới đây

ư Dịch chiết methanol:

1 gam là đến 2 gam thân, rễ, hoặc thân rễ dược liệu đã được tán nhỏ,được chiết với methanol tỷ lệ 1g/10ml bằng cách đun hồi lưu trên cách thuỷ khoảng

30 phút, gạn lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà cắn thu

được trong 2 ml methanol, được dùng làm dung dịch chấm sắc ký

ư Dịch chiết với các dung môi khác : n.hexan, etherethylic, chloroform

* Dịch chiết n hxan, ether ethylic và dịch chiết chloroform thường

được áp dụng trong phân tích các thành phần kém phân cực như tinh dầu, terpenoid dạng genin, coumarin và anthranoid dạng aglycon ví dụ : Dịch chiết etherethylic được áp dụng xác định thành phần anthranoid của dược liệu Ba kích, dịch chiết n.hexan xác định thành phần kém phân cực của Cỏ nhọ nồi…

* Dịch chiết ethylacetat thường được áp dụng trong phân tích các thành

phần thuộc nhóm flavonoid, anthranoid, các acid phenolcarboxylic với mục

đích làm giầu thêm các thành phần phân tích nói trên và loại bớt các thành phần tạp phân cực hơn tan đươc trong methanol gây trở ngại cho triển khai sắc

ký Một số dược liệu có trong đề tài đã được tiến hành xử lý mẫu dưới dạng dịch chiết ethylacetat như : Bồ công anh, Cẩu tích

ư Dịch chiết phân đoạn :

Dịch chiết phân đoạn được tiến hành dựa trên nguyên tắc chiết phân bố lần lượt với các dung có độ phân cực khác nhau từ kém phân cực đến phân cực Cách tiến hành : Dược liệu sau khi chiết với methanol như đã nêu ở mục dịch chiết methanol, phần cắn sau khi làm bay hơi hết methanol được hoà vào 5ml nước và tiến hành chiết bằng cách lắc lần lượt với các dung môi từ kém phân cực(n.hexan, etherethylic, chloroform)đến phân cực( ethylacetat, n.butanol) Gạn lấy phần các dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà cắn thu được trong methanol làm dung dịch chấm sắc ký

Dịch chiết phân đoạn được áp dụng trong một số trường hợp với mục

đích loại tạp ví dụ như dịch chiết phân đoạn chloroform trong định tính đỗ trọng dùng để loại chất nhựa gây cản trở cho quá trình sắc ký; làm giàu thành phần nhóm chất cần phân tích và định hướng phát hiện thành phần đặc trưng của dược liệu theo tài liệu đã công bố, ví dụ : Dịch chiết phân doạn ethylacetat của Hà thủ ô, mục đích định tính thành phần stilben glycoside, là thành phần

hoạt chất được nói đến có trong Hà thủ ô; dịch chiết phân đoạn ethylacetat của

Đảng sâm với định hướng định tính lignan

ư Dịch chiết chloroform trong môi trường kiềm:

Cách tiến hành : 3 gam ( lá) đến 5gam ( rễ, thân rễ) dược liệu được làm

ẩm bằng 2- 3ml dung dịch amoniac 25%, được lắc với 50ml chloroform, thời gian 2-3 giờ Gạn lọc lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà cắn thu được trong 1ml methanol được dùng làm dung dịch chấm sắc ký, lượng chấm 20 - 30àl

Dịch chiết chloroform trong môi trường kiềm được áp dụng phân tích

đa số các thành phần alcaloid Dược liệu được tiến hành chiết theo cách này,

áp dụng định tính alcaloid của Dây đau xương

ư Dịch chiết methanol- nước :

Được áp dụng trong phân tích các thành phần đường acid amin và các thành phần phân cực khác

Cách tiến hành : 2 gam ( lá) hoặc 3 gam ( rễ, thân rễ) dược liệu được

đun hồi lưu trên cách thuỷ với 25ml hỗn hợp methanol và nước tỷ lệ 4: 1 Gạn , lọc lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà cắn thu được trong 2ml hỗn hợp dung môi trên và được dùng để chấm sắc ký Lượng chấm 10-

15 àl

ư Dịch chiết thu được bằng phương pháp cất kéo hơi nước :

Cách tiến hành theo phương pháp định lượng tinh dầu trong dược liệu như đã ghi trong D ĐVN III ( phần phụ lục 9.2) Định lượng tinh dầu trong dược liệu

ư Dịch chiết thu được từ sản phẩm thuỷ phân :

Trong một số trường hợp tiến hành xác định đặc điểm hoá học đặc trưng của một nhóm chất dưới dạng sản phẩm thuỷ phân thành genin của nó,

tỏ ra có hiệu quả trong định tính phát hiện dược liệu Phương pháp thuỷ phân các glycosid thường được tiến hành bằng cách đun sôi dung dịch chế phẩm trong môi trường chứa acid hydrocloric hoặc acid sulfuric 10%, thời gian từ

30 phút cho đến 1 giờ, tuỳ thuộc vào bản chất của từng loại glycosid

Phương pháp đă được áp dụng thuỷ phân anthranoid trong dược liệu Thảo quyết minh với cách tiến hành như sau :

2g dược liệu đã được tán nhỏ, được chiết với methanol theo phương pháp như đã ghi ở mục 3.3.1.a Hoà cắn thu được trong 10ml nước và 1ml acid hydrocloric, đun trên cách thuỷ 30 phút, làm lạnh, chiết bằng cách lắc với 20ml ether ethylic, gạn lấy phần dịch ether ethylic và làm bay hơi hết dung môi Hoà cắn thu được trong 1ml chloroform, được dung dịch chấm sắc ký

định tính thành phần anthranoid dạng aglycon

c Khảo sát lựa chọn hệ dung môi sắc ký

Tiến hành khảo sát lựa chọn hệ dung môi sắc ký cho phù hợp đối với mỗi nhóm chất đã định hướng xác định đặc trưng của dược liệu

Nguyên tắc lựa chọn hệ dung môi tách được tiến hành theo qui tắc tam giác của Egon Stahl [26]

Thực tế, có nhiều loại hệ dung môi được tham khảo áp dụng tách các thành phần của nhóm chất ( xem phụ lục 3) Các hệ dung môi chủ yếu đã được

áp dụng khảo sát xác định đặc điểm đặc trưng của nhóm chất từ dược liệu, thuộc nội dung của đề tài, đã được tóm tắt ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Các hệ dung môi SKLM, được áp dụng khảo sát xác định các

đặc điểm hoá học đặc trưng dạng “vân tay” nhóm chất của dược liệu

Khảo sát

1 Alcaloid Toluen: ethylacetat ( 95 : 5)

Chloroform : methanol : ammoniac 25%

( 75 : 25 : 2,5) Ethylacetat: acid acetic : acid formic : nước (10 : 1: 1: 1)

Mộc hương Tang bạch bì Dây đau xương

( 1:1: 1 ) lấy pha trên Toluen : ethylacetat ( 95 : 5 ), ( 9: 1), ( 4 :1 ) Toluen: ethyl acetat: aceton: acid formic (1 5: 2 : 2 : 1) (10: 2 : 2 : 1) (5: 2 : 2 : 1) Chloroform : ethanol: acid acetic (95: 5: 1) Chloroform : methanol ( 90: 10)

Chloroform: aceton: acid formic(75: 16,5: 8,5)

Ethylacetat: toluen : acid formic : nước ( 100 : 5 : 10 :10 )

Ethylacetat: : methanol: nước: acid acetic ( 100: 10: 10 : 1)

Ethylacetat: n.butanol : acid formic : nước ( 5: 3: 1: 1 )

n propanol: toluen : acid acetic: nước (25: 20: 10: 10 )

N butanol : acid acetic : nước (5 : 1 : 4 )

Hà thủ ô

Đỗ trọng

Bồ công anh

Ba kích

Nhóm chất Hệ dung môi Tên dược liệu

khảo sát

7 Đường Chloroform : methanol : nước ( 70 : 30 : 4)

Ethylacetat : acid acetic : nước (2 : 1 : 1) Isopropanol: acid acetic : nước (4 :1 : 1) N.butanol : acid acetic : nước (4 :1 :5) Propanol : ethylacetat : nước : acid acetic (4 : 3 : 2: 1)

( 97 : 3 ), ( 95 : 5), ( 90 : 10) Toluen: ethyl acetat: aceton: acid formic (10 : 2 : 2 :1)

Toluen: ethylacetat: acid formic( 90 : 10 : 1)

Mộc hương, Nga truật

25 : 5), (70 : 30 : 5)

Chloroform : methanol : nước : acid acetic khan

( 70 : 30 : 4 : 1 ) Ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước (10 :1 : 1 : 2,5)

Chloroform : acid acetic khan : methanol : nước ( 64 : 32 :12 : 8 )

Ethylacetat : ethanol : nước : ammoniac25%

Ethylacetat : methanol : nước (80 : 20 : 10) N.butanol: ethanol : nước : amoniac 25%

d Phát hiện và thuốc thử phát hiện

Phương pháp phát hiện các đặc điểm đặc trưng của dược liệu theo

hướng tìm các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất được tóm tắt ở bảng 3.3

B¶ng 3.3 Ph−¬ng ph¸p ph¸t hiÖn c¸c nhãm chÊt ®−îc ¸p dông trong

- Quan s¸t d−íi ¸nh s¸ng th−êng

3 Anthranoid, -

- Kali hydroxyd / ethanol

- Acid boric – acid oxalic

- NP / PEG

- Quan s¸t/ UV366nm tr−íc khi phun TT

- Quan s¸t d−íi ¸nh s¸ng th−êng

- SÊy1050 C, quan s¸t d−íi UV 366nm

- Quan s¸t d−íi UV 366nm

- Kali hydroxyd / ethanol

- Acid boric – acid oxalic

- NP / PEG

- Quan s¸t/ UV366nm tr−íc khi phun TT

- Quan s¸t/ UV366nm

- SÊy1050C / UV366nm

- Quan s¸t /UV366nm

- Mµu

Mµu xanh dÕn vµng

- nt

- nt

5 §−êng - α Naphthol/ acid sulfuric

- Anillin- diphenylamin- acid phosphoric

- Anillin acid phosphoric

- Anisaldehyd/acidsulfuric

- Tetrazolium blue

- SÊy 100 -1050 C quan s¸t/ ¸nh s¸ng th−êng

- Quan s¸t/ UV366nm

- nt

- Quan s¸t d−íi ¸nh s¸ng th−êng

- Mµu

- Nitroanlin diazo hoá

- Fast blue salt

- α,α-Dipyridyl- sắtIIIclorid

- Vanilin - acid sulfuric

- Quan sát dưới ánh sáng thường

- Vanilin - acid sulfuric

- Vanilin- acid phosphoric

- Antimon trichlorid

- Sấy100-1050 C

- nt

- nt

- Sấy100-1050 C /

ánh sáng thường và UV366nm

- Vanilin- acid phosphoric

- DMAB/ acid sulfuric 40%

- DMAB / acid clohydric

-Sấy100-1050C/ánh s thường và UV366nm

- nt

- nt (ánh sáng thường)

- nt

- Sấy15-1200C/ ánh s thường và UV366nm

- Sấy ≤ 800C hoặc không sấy

Các loại thuốc thử khác đã được áp dụng phát hiện thành phần chất và nhóm

chất, tham khảo thêm phụ lục 4

e Kết quả xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu

Trình bày kết quả xác định các đặc điểm hoá học dặc trưng của mỗi

dược liệu, được thể hiện bằng các hình ảnh sắc ký đồ, cùng với các điều kiện

sắc ký đã được khảo sát và xác định, gồm có : hệ dung môi sắc ký, phương

pháp phát hiện (phát hiện và thuốc thử phát hiện), phương pháp chuẩn bị mẫu

chấm sắc ký và lượng chấm mẫu

f Đánh giá kết quả và nhận xét

Đánh giá và nhận xét kết quả xác định đặc điểm hoá học đặc trưng của

dược liệu thông qua kết quả thu được từ hình ảnh sắc ký đồ

3.3.2.2 Xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu bằng phương pháp khác

a Phương pháp sắc ký lỏng cao áp

Tiến hành khảo sát áp dụng kỹ thuật SKLCA trong việc xác định đặc

điểm đặc trưng của 2 đối tượng dược liệu đỗ trọng và xuyên khung gồm các bước như sau :

ư Đối tượng xác định :

* Tiến hành khảo sát xác định đặc điểm vân tay hoá học của Đỗ trọng theo hướng xác định thành phần lignan, là một trong số các thành phần hoạt chất chính đã được biết có trong Đỗ trọng, trong đó thành phần chính là pinoresinol diglucosid.Thành phần này đã được qui định định lượng bằng phương pháp SKLCA để đánh giá chất lượng dược liệu[57]

* Tiến hành khảo sát xác định đặc điểm vân tay hoá học của Xuyên khung theo hướng xác định thành phần alcaloid bay hơi, là thành phần hoạt chất có trong dược liệu Xuyên khung, trong đó thành phần chính là tetramethyl pyrazin Thành phần này đã được đánh giá định lượng bằng phương pháp SKLCA [24] [41] [47]

ư Khảo sát các điều kiện sắc ký

Tiến hành khảo sát các yếu tố liên quan đến phương pháp phân tích sắc ký: xử

lý mẫu, lựa chọn pha tĩnh, khảo sát lựa chọn pha động và phương pháp phát hiện

ư Kết quả phân tích

Kết quả xây dựng được một phép thử xác định định tính và bán định lượng thành phần nhóm chất đã khảo sát, gồm có :

ư Chuẩn bị mẫu sắc ký: Lấy chính xác khoảng 0,5g bột dược liệu cho vào

bình soxhlet, chiết hồi lưu cách thủy trong 4 giờ với n hexan Cô dịch chiết n hexan đến cạn Hòa cắn trong 2 ml n Hexan Lọc qua màng lọc Supelco (13mm x0.45 àm)

ư Điều kiện phân tích:

Cột sắc ký khí DB- 5 MS (30 m x 0.25mm ID)

Khí mang He

Tỉ lệ m/z từ 40 - 250