Nghiên cứu ưng dụng công nghệ sản xuất vacxin AND đa chủng gumboro phòng bệnh cho gà

Chủng G202, phân lập năm 1987 tại Việt Nam, thuộc nhóm 4/Serotype I Lê Thanh Hoà, 1992; 2003a; Lê trong chương trình vacxin, chúng ta bắt buộc cần phải xem xét tính thích hợp của loại hì

VKHCNVN VCNSH

Bé KHOA HäC

Vµ C¤NG NGHÖ

VIÖN KHOA HäC Vµ C¤NG NGHÖ VIÖT NAM

VIÖN C¤NG NGHÖ SINH HäC

-

Bộ khoa học và công nghệ

39 Trần H−ng Đạo – Hà Nội

Viện kh và cn việt nam

18 Hoàng Quốc Việt – Hà Nội

-

Viện công nghệ sinh học

BáO CáO Tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài KC.04.29

NGHIÊN CứU ứng dụng công nghệ Sản xuất vacxin adn đa chủng gumboro

Báo cáo tổng kết

A.2 Danh sách những người thực hiện đề tài và phân công

công việc

4

A3 Các nội dung đang ký thực hiện theo hợp đồng 6

B1 tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nước 8

B1.3 Các serotype và phân nhóm độc lực của virus Gumboro 9 B1.4 Sinh học phân tử hệ gen của virus Gumboro 9

B1.6 Nguyên lý thiết kế vacxin ADN và phương thức sử dụng 13

B1.8 Các thành phần kích ứng gen và miễn dịch 16

B1.9.2 Vai trò của vị trí và các tế bào tiếp nhận ADN vacxin 21

B2 tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước 23

D1 Kết quả thu thập nguyên liệu và thiết kế giống gốc 32 D1.1 Kết quả thu thập mẫu và tiếp truyền bệnh phẩm 32

D1.1.2 Kết quả tiếp truyền virus Gumboro trên phôi và gà mẫn cảm 33 D1.2 Kết quả phân tích và chọn lọc chủng đại diện 34

D1.2.2 Các plasmid vector sử dụng trong nghiên cứu vacxin ADN 38

D1.3 Kết quả thiết kế plasmid giống gốc pG-VP2 42

D1.3.2 Thu nhận khung plasmid pcDNA3.1 (+) 43

D1.3.5 Kết quả kiểm tra khung đọc và phân tích thành phần gen VP2 45 D1.4 Kết quả thiết kế plasmid giống gốc pG-A 48

D1.4.2 Tách gen kháng nguyên VP2-4-3 và nối vào pcDNA3.1 (+) 50

D1.4.3 Kết quả kiểm tra khung đọc và phân tích thành phần gen VP2 51

D2.1 Qui trình công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng Gumboro 53 D2.2 Qui trình kiểm định và sử dụng vacxin ADN đa chủng Gumboro 59 D2.3 Sản phẩm plasmid giống gốc và vacxin (đơn và đa chủng) 63 D3 Kết quả kiểm nghiệm biểu hiện gen và miễn dịch vacxin 65

D3.1 Kết quả kiểm nghiệm biểu hiện gen VP2 trong hệ thống E Coli 65

D3.2 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin bằng ELISA 67

D3.2.2 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin quy mô phòng thí nghiệm

D3.3.4 Kết quả công cường độc kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin 79

D4.1 Danh sách giải mã gen VP2 và phân đoạn A 85 D4.2 Danh sách đăng ký bản quyền ngân hàng gen 86

D5.2 Danh sách xuất bản sách và chương sách 88

F Nhận xét và đánh giá kết quả đạt được của đề tài 92

Phụ lục báo cáo tổng kết

Phụ lục I: Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu

vacxin ADN

Phụ lục II: Một số phương pháp huyết thanh học sử dụng trong kiểm nghiệm miễn dịch vacxin ADN

Phụ lục III: Một số hình ảnh hoạt động của đề tài

Phụ lục IV: Tài liệu cơ bản phục vụ nghiên cứu đề tài

Mục lục hình

Mục lục bảng

Tóm tắt báo cáo

Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease - viết tắt là IBD) là một bệnh cấp tính, có khả năng lây lan rất cao ở gà con 2-6 tuần tuổi, gây chết với tỷ lệ khá cao, từ 10-30% Số còn lại còi cọc, chậm lớn, dễ phát bệnh, bị suy giảm miễn dịch.Virus Gumboro có hệ gen gồm 2 phân đoạn ARN là phân đoạn A và B Phân đoạn A gồm 3 gen hợp nhất VP2-4-3 và gen VP5 Gen VP2 mã hoá protein kháng nguyên VP2 đồng thời cũng

là yếu tố gây bệnh của virus Tuy có vacxin nhược độc (chủng virus đã làm giảm

độc lực) sản xuất từ giống virus nhập từ nước ngoài, nhưng ở nước ta, mức độ bảo

hộ miễn dịch không ổn định do tính kháng nguyên giữa vacxin và virus gây bệnh

có mức độ đồng nhất không đồng đều Đề tài KC.04.29: “Nghiên cứu ứng dụng

công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng Gumboro phòng bệnh cho gà” được tiến

hành với mục tiêu tổng thể là nghiên cứu ứng dụng thêm một loại vacxin thế hệ mới, đa dạng hoá vacxin Gumboro ở quy mô nhỏ và đánh giá hiệu quả bảo vệ trên

đàn gà thử nghiệm

Để thực hiện được mục tiêu trên, đề tài cần thiết kế được plasmid biểu hiện tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên VP2 từ nhiều chủng Gumboro chọn lọc khác nhau của Việt Nam, sản xuất và thu nhận được ADN tinh khiết làm nguồn nguyên liệu thử nghiệm vacxin ADN đa chủng, ổn định, chất lượng đạt điều kiện quy định OIE/WHO và triển khai thử nghiệm vacxin ADN, kiểm tra an toàn, vô trùng và hiệu lực đảm bảo tiêu chuẩn của OIE/WHO quy định Đề tài đã sử dụng các phương pháp sinh học phân tử trong thiết kế plasmid tái tổ hợp (RT-PCR, dòng hoá, giải trình trình tự, chọn lọc tách ADN tái tổ hợp), các phương pháp kiểm tra giống và vacxin (an toàn, vô trùng, hiệu lực), các phương pháp huyết thanh học (ELISA) xác định bảo hộ miễn dịch

Trong 2 năm thực hiện, đề tài đã thu nhận được hơn 90 mẫu virus cường độc gây bệnh từ 3 miền (Bắc, Trung, Nam), 3 mẫu vacxin và đã thu nhận và phân tích

vùng “siêu biến đổi” (474 bp) của gen VP2, từ đó chọn lọc các chủng có kháng

nguyên đồng nhất theo nhóm của từng vùng địa lý Trên cơ sở đó, đã phân lập và lưu giữ toàn bộ gen VP2 trong 15 plasmid trung gian (pCR2.1TOPO), từ nguồn gen này đã thiết kế được 15 plasmid gốc (pG-VP2) chứa toàn bộ gen VP2 và một số

plasmid gốc (pG-A) chứa toàn bộ phân đoạn A, làm nguyên liệu chọn giống sản xuất vacxin ADN và tiến hành nghiên cứu xây dung 2 bộ Quy trình: i) Quy trình công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng tại Việt Nam; ii) Quy trình kiểm định và

sử dụng vacxin ADN đa chủng tại Việt Nam

Sử dụng giống gốc chứa gen VP2 (pG-VP2), đề tài đã sản xuất được 100.000 liều vacxin đơn chủng cho 5 chủng chọn lọc (20 àg ADN/liều đơn chủng), khi phối hợp với nhau, được 20.000 liều đa chủng (100 àg ADN/liều đa chủgn) để làm vacxin đa chủng thử nghiệm Đề tài đã sử dụng 30.000 liều đơn chủng (6.000 liều đa chủng) để tiến hành thử nghiệm và bố trí 5 đợt kiểm tra miễn dịch ở miền Bắc và miền Trung Kết quả triểm tra bằng ELISA (kit IDEXX của Mỹ) cho thấy vacxin có bảo hộ miễn dịch tương đối tốt (79-96%) có kháng thể ở tuổi gà 35-56 ngày tuổi), nhưng hàm lượng kháng thể chỉ duy trì dưới 3 tháng Về bản quyền, đề tài đã đăng ký 11 bản quyền bao gồm 10 chuỗi gen VP2 và một chuỗi gen VP2-34-

3 (phân đoạn A) của Việt Nam trong Ngân hàng gen Đề tài cũng góp phần đào tạo nghiên cứu sinh, 1 cao học, 8 sinh viên tốt nghiệp và xuất bản 10 công trình, bài báo và các chương sách (2 quyển đã in và 1 quyển bản thảo)

Đánh giá chung, đề tài đã hoàn thành nhiệm vụ đề ra, đã có đủ số lượng plasmid gốc chứa gen VP2, đã xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất

và kiểm định vacxin, đã sản xuất vacxin theo yêu cầu đã đăng ký và bước đầu thử nghiệm hiệu lực của vacxin Đề tài mở hướng và định hướng nghiên cứu loại hình vacxin ADN lần đầu tiên ở Việt Nam Tuy nhiên, do tình hình cúm gà nặng nề trong các năm 2004-2005 ảnh hưởng đến tiến độ và phạm vi nghiên cứu của đề tài, một phần do tiến độ cấp kinh phí, một phần do thời gian hạn định cho nghiên cứu một loại vacxin rất ngắn nên diện thử nghiệm vacxin chưa được rộng hơn và các phương pháp kiểm tra miễn dịch chưa được áp dụng nhiều hơn (ví dụ: cần công cường độc để thử thách hiệu lực) Mặt khác cũng cần so sánh vacxin ADN sản xuất

từ plasmid giống gốc chứa toàn bộ phân đoạn A (pG-A) với vacxin ADN từ giống gốc chứa toàn bộ gen VP2 (pG-VP2), để chọn lọc nguồn giống thích hợp

Đề tài đã hoàn thành tất các nội dung đăng ký với mức độ đạt hoặc vượt, tuy còn một vài điểm cần bổ sung khảo sát Đề tài đã mở hướng triển khai ứng dụng vacxin ADN có triển vọng tại Việt Nam

Báo cáo tổng kết thực hiện đề tài

kc.04.29

Tên đề tài:

“Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng Gumboro

phòng bệnh cho gà”

A thông tin về đề tài

A1 chủ nhiệm đề tài và cơ quan chủ trì đề tài

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Thanh Hoà

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính

Điện thoại: (4)7567297; (4)7564391 (CQ)/ (4)8525566 (NR); Mobil: 0912336855

Fax: (4)8363144

Email: im-ibt@hn.vnn.vn, imibtvn@gmail.com

Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Địa chỉ cơ quan: 18 Đường Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội – Việt Nam

Thời gian thực hiện: 24 tháng (01/01/2004 – 31/12/2005)

Kinh phí được cấp: 1.900 triệu (một nghìn chín trăm triệu)

và khảo sát tính đặc hiệu của chúng

Phân tích biến đổi gen VP2 và tạo dòng ổn định Nghiên cứu lắp ráp plasmid tái tổ hợp phân đoạn VP2, từ các chủng đại điện đ−ợc chọn lọc, để làm plasmid gốc

Nghiên cứu chuyển nạp plasmid gốc vào các dòng tế bào chuẩn, giữ giống gốc

Nghiên cứu kỹ thuật tinh sạch ADN plasmid làm vacxin

Bố trí thử nghiệm vacxin ở các cơ sở thí nghiệm

Tổng kết đề tài, hội nghị và xuất bản

NCVC

Liên hiệp Khoa học sản xuất CNSH và MT Viện Công nghệ sinh học

Phụ trách nhánh chính

Sản xuất vacxin quy mô nhỏ, đánh giá hiệu lực

III Nguyễn Thị Kim Cúc TS,

NCVC

Phòng Vi sinh phân tử Viện Công nghệ Sinh học

Sản xuất lô lớn, kiểm tra tiêu chuẩn an toàn vô trùng hiệu lực của vacxin Xây dựng quy trình an toàn

danh sách những người thực hiện đề tài và phân công công việc(tiếp)

Học hàm học vị

Phụ trách nhánh

Sưu tập và tạo các loại tế bào chủ thích hợp, cung cấp tế bào để sản xuất vacxin

Viện Công nghệ Sinh học

Phụ trách nhánh

Thiết kế plasmid gốc chứa gen VP2 phân lập từ các chủng Gumboro ở tỉnh Thừa Thiên – Huế Thử nghiệm liệu pháp vacxin (chất mang, bổ trợ, phương pháp sử dụng)

Viện Công nghệ Sinh học

Phụ trách nhánh

Phân lập gen VP2 từ các chủng Gumboro ở các tỉnh phụ cận Hà Nội và thiết kế plasmid gốc cho sản xuất vacxin ADN

Phương, Viện Chăn nuôi

Phụ trách nhánh

Khảo nghiệm vacxin ở miền Bắc

VIII Đinh Thị Bích Lân TS Trung tâm Tài nguyên MT

và CNSH, Đại học Huế

Phụ trách nhánh

Thu nhận các chủng virus Gumboro từ mỗi vùng

địa lý khác nhau tại Việt Nam Kiểm tra lâm sàng bệnh tích và tiếp truyền lấy mẫu bệnh phẩm Khảo nghiệm vacxin ở miền Nam

A3 các nội dung đăng ký thực hiện theo hợp đồng

Gồm 6 mục công việc cần thực hiện tập trung trong 2 nhóm chính:

NHóM I: (thu thập nguyên vật liệu thiết kế giống vacxin)

Mục 1: Thu thập mẫu bệnh phẩm và khuôn ARN virus Gumboro

1 Thu thập, phân lập virus gây bệnh Gumboro (30 mẫu x 3 vùng địa lý, các miền Bắc-Trung-Nam , tổng cộng 90 mẫu)

2 Tiếp truyền virus trên gà mẫn cảm đảm bảo nguồn nguyên liệu, thu giữ giống virus

3 Thiết kế các đoạn mồi cơ bản và tổng hợp 50 loại mồi

4 Nghiên cứu tách chiết ARN tổng số của các chủng virus

Mục 2: Thu nhận, phân tích vùn g “siêu biến đổi”, phân tích chọn lọc chủng

5 Thiết kế các loại primer cho phản ứng RT-PCR vùng “siêu biến đổi” của gen VP2

và khảo sát tính đặc hiệu của chúng

6 Thiết kế các loại primer cho gen VP2 và phân đoạn A, phân tích biến đổi gen VP2

ở vùng “siêu biến đổi” và tạo dòng ổn định, chọn lọc chủng thích hợp.

Mục 3: Thu nhận gen kháng nguyên và thiết kế plasmid gốc

7 Nghiên cứu thực hiện phản ứng RT-PCR thu nhận gen VP2 (1,4 kb) và phân đoạn

11 Sưu tập và tạo các loại tế bào chủ thích hợp (dòng tế bào chủ ổn định)

12 Nghiên cứu chuyển nạp plasmid gốc vào các dòng tế bào chuẩn, giữ giống gốc (dòng tế bào tái tổ hợp chứa plasmid gốc)

NHóM II: (Sản xuất, kiểm nghiệm và thử nghiêm vacxin)

Mục 4: Nghiên cứu sản xuất vacxin

13 Nghiên cứu các điều kiện lên men, nhân ADN plasmid tái tổ hợp từ plasmid gốc (ADN plasmid chứa gen VP2 hoặc phân đoạn A để làm vacxin)

14 Nghiên cứu kỹ thuật tinh sạch ADN plasmid chứa gen VP2 hoặc phân đoạn A để làm vacxin, kiểm tra an toàn, vô trùng

15 Sản xuất lô vacxin quy mô nhỏ và lớn (yêu cầu cần đạt: 100.000 liều vacxin), thử nghiệm liệu pháp vacxin (chất mang, bổ trợ, phương pháp sử dụng), bố trí thử nghiệm vacxin ở trại thí nghiệm, đánh giá hiệu lực

Mục 5: Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất, kiểm nghiệm vacxin

16 Xây dựng quy trình sản xuất, kiểm nghiệm, sử dụng vacxin

17 Bố trí khảo nghiệm ở địa phương tại miền Bắc và miền Trung

1 Plasmid giống gốc pG-VP2 (15 plasmid)

2 Plasmid giống gốc pG-A (15 plasmid)

3 Vacxin ADN đơn chủng (100.000 liều (20àg ADN/liều)) và phối hợp đa chủng (5 chủng) là 20.000 liều (100àg ADN/liều) phòng bệnh Gumboro

4 Các công trình khoa học được đăng trên các tạp chí chuyên ngành (8 trong nước,

4-5 quốc tế)

5 Các kết quả đào tạo đại học và sau đại học (6 cử nhân, 1-2 cao học, 1-2 nghiên cứu sinh)

6 Đăng ký bản quyền và công bố trong Ngân hàng gen

7 Báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo

b tổng quan tài liệu

B1 Tổng quan tài liệu tình hình nghiên cứu ngoài nước

B1.1 Giới thiệu bệnh Gumboro

Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease - viết tắt là IBD) là một bệnh cấp tính, có khả năng lây lan rất cao ở gà con 2-6 tuần tuổi, gây chết với tỷ lệ khá cao, từ 10-30% Số còn lại còi cọc, chậm lớn,

dễ phát bệnh, do vậy, khi bị bệnh, thông thường cần phải tiêu diệt cả đàn gà Mỗi năm,

ước tính 35 tỷ USD thiệt hại do IBDV gây ra đối với chăn nuôi gà thế giới (Lukert và Saif, 1997) Do có sức đề kháng rất mạnh với điều kiện thiên nhiên cũng như các yếu

tố vật lý và hoá học, nên virus lưu hành rộng rãi Đích tấn công của IBDV là các cơ quan tổ chức Lympho - đặc biệt là túi Fabricius (có kích thước bằng hạt lạc, cấu tạo múi, nằm ở dưới hậu môn) – cũng như các loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch, trước hết là Lympho B và đại thực bào Các bệnh tích đặc trưng chủ yếu là túi Fabricius sưng

to (2-3 lần), thủy thũng, xung huyết, xung quanh túi có thẩm dịch, sau 3-4 ngày bị teo dần và sau 1 tuần chỉ còn 1/3 kích thước ban đầu Bệnh tích cũng biểu hiện ở sự xuất huyết cơ lườn và đùi do các sản phẩm và độc tố trong quá trình sinh bệnh gây tắc mạch máu, mao quản, gây hoại tử tế bào và xuất huyết thẩm dịch Khi bị huỷ hoại, các cơ quan và tế bào có thẫm quyền miễn dịch không thực hiện đầy đủ chức năng đáp ứng miễn dịch, do vậy, gia cầm trở nên bị suy giảm nghiêm trọng về miễn dịch (immunosuppression) Mọi chương trình vacxin khác, không hoặc kém phát huy hiệu lực do hệ miễn dịch của gà bị thiểu năng bởi tác hại của IBDV (Lukert và Saif, 1997) Mức độ suy giảm miễn dịch phụ thuộc vào độc lực của virus, thời gian và nơi xâm nhập của IBDV vào cơ thể gà, nếu bị nhiễm dưới 3 tuần tuổi hoặc càng sớm, thì gà càng bị hậu quả suy giảm miễn dịch nặng nề (Lukert và Saif, 1997)

B1.2 Chẩn đoán Gumboro

Ngoài các phương pháp chẩn đoán IBDV cổ điển như nuôi cấy trong phôi gà, gà con mẫn cảm, môi trường tế bào xơ phôi gà, mổ khám toàn thân và xem bệnh lý túi Fabricius, nhiều phương pháp mới ngày càng hoàn thiện dần được áp dụng như kính hiển vi điện tử; miễn dịch huỳnh quang; khuếch tán trên thạch AGP, miễn dịch hấp phụ enzym ELSA, trung hoà virus VN (virus neutralization); dò ADN bổ sung (cDNA probe); hợp lai ADN không phóng xạ và nhiều phương pháp khác (OIE:

http://www.oie.int/;Lukert và Saif, 1997) Gần đây, do nhu cầu cần chẩn đoán nhanh

để giảm thiệt hại, hơn nữa, do lợi thế là hệ gen IBDV đã được giải trình toàn bộ, nên

các nghiên cứu chẩn đoán sinh học phân tử dựa trên phản ứng PCR ngược (RT-PCR)

được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả kinh tế to lớn (Jackwood và Jackwood, 1997; Liu và cs, 2001; Lê Thanh Hoà, 2003a,b)

B1.3 Các serotype và phân nhóm độc lực của virus Gumboro

Virus gây bệnh Gumboro là virus ARN 2 sợi dương, thuộc nhóm Birnavirus (Avibirnavirus) trong họ Birnaviridae, được Cosgrove phát hiện và phân lập đầu tiên tại Gumboro, địa hạt Sussex bang Delaware của Mỹ (Cogrove, 1962) Ngày nay, IBDV gây bệnh ở hầu hết các vùng chăn nuôi tập trung trên thế giới, với hàng trăm biến chủng khác nhau, nhưng tất cả thuộc về 2 serotype: Serotype I và Serotype II, trong đó Serotype I có mức độ độc lực và tính gây bệnh cao; Serotype II không có ý nghĩa lớn về dịch tễ học (Lukert và Saif, 1997) Các chủng virus Gumboro thuộc Serotype I bao gồm

4 nhóm chính: i) nhóm cổ điển (classical) (Cosgrove, 1962); ii) nhóm biến đổi (variant) phát hiện từ 1984-1985 (Rosenberger và cs, 1985); iii) nhóm nhược độc (attenuated),

và iv) nhóm độc lực rất cao (very verulent), xuất hiện từ 1987-1988, gây chết gà với tỷ

lệ 30-70% (Van Der Berg và Meulemans, 1991) Chủng đầu tiên do Cosgrove phân lập thuộc nhóm 1/Serotype I Tuy không biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trầm trọng, các chủng thuộc nhóm biến đổi (variant) tồn tại lâu trong gà, gây suy giảm miễn dịchnghiêm trọng ở đàn gà Vacxin của nhóm này khó bảo hộ cho các chủng gây bệnh thuộc nhóm khác (Snyder và cs, 1992) Các chủng độc lực rất cao (vvIBDV) phát hiện

đầu tiên ở Bỉ, Anh, Hà Lan, tiếp đó ở tất cả mọi nước châu âu, châu Phi, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan và các nước Đông - Nam á, trong đó có Việt Nam (Liu và cs, 2001;Sun và cs, 2003; Lê Thanh Hoà, 2003a) Trong 15 năm nay, sự biến

đổi phức tạp về đặc tính gây bệnh và chủng giống đã làm phức tạp hoá dịch tễ học và chương trình vacxin phòng chống Gumboro (INCO Report, 1999) Chủng G202, phân lập năm 1987 tại Việt Nam, thuộc nhóm 4/Serotype I (Lê Thanh Hoà, 1992; 2003a; Lê

trong chương trình vacxin, chúng ta bắt buộc cần phải xem xét tính thích hợp của loại hình vacxin nhập ngoại với các chủng cường độc gây bệnh trong một quốc gia, sao cho

sử dụng có hiệu quả (INCO Report, 1999)

B1.4 Sinh học phân tử hệ gen virus Gumboro

Hệ gen của virus Gumboro chứa axit ribonucleic (ARN) gồm 2 phân đoạn A và

B móc vào nhau (Hình B-1) Phân đoạn A bao gồm một tổ hợp (một khung đọc mở)

gồm các phân đoạn gen kế tiếp nhau có trách nhiệm tổng hợp các loại protein VP2, VP3, VP4 và VP5; phân đoạn B tổng hợp protein VP1

Hình B-1 Sơ đồ minh hoạ hệ gen của virus Gumboro và quá trình tổng hợp protein cấu trúc Ghi chú: Hệ gen virus Gumboro bao gồm 2 phân đoạn (A và B), trong đó phân đoạn B mã hoá cho 1 loại protein (VP1); phân đoạn A mã hoá cho protein VP5và một protein chung, sau khi đ−ợc phân cắt sẽ cho 3 loại protein sản phẩm độc lập bao gồm VP2, VP3 và VP4 (xem Lê Thanh Hoà, 2003a )

Phân đoạn A có độ dài khoảng 3200 nucleotid, mã hoá cho một protein chung (VP2-4-3) sau đó đ−ợc phân cắt thành các protein VP2; VP4 và VP3 riêng biệt và protein VP5 có phân tử l−ợng 17 kDa VP1 là protein có hoạt tính enzyme protein ARN-polymerase VP2 là protein vỏ, đ−ợc mã hoá bởi đoạn gen có độ dài khoảng 1350

protein chung (108 kDa )

VP2a (45-50 kDa ) VP3 -4 (55-60 kDa )

Dịch m∙

Ph ân cắt giai đoạn 1 Tiền protein

VP2b (40-45 kDa ) VP4 (28 kDa ) VP3 (30-32 kDa )

protein chung (108 kDa )

VP2a (45-50 kDa ) VP3 -4 (55-60 kDa )

Dịch m∙

Ph ân cắt giai đoạn 1 Tiền protein

VP2b (40-45 kDa ) VP4 (28 kDa ) VP3 (30-32 kDa )

nucleotid trong phân đoạn A của hệ gen, thuộc loại hình kháng nguyên ts specific), kích thích sinh kháng thể trung hoà VP2 có độ bảo tồn cao ở hai đầu 5’ và 3’

(type-về thành phần nucleotid và thành phần axit amin, nhưng lại có một vùng khoảng gần

500 nucleotide ở chính giữa của gen rất thay đổi trong các chủng khác nhau, nên được

gọi là vùng “siêu biến đổi” Trong vùng “siêu biến đổi”, một dãy bao gồm khoảng 150 axit amin (vị trí 206 đến 350 của VP2) gọi là epitope có cấu trúc vòm không gian đặc

biệt, chịu trách nhiệm kích thích và kết hợp với kháng thể tương ứng (Bayliss và cs,

1990, Lê Thanh Hoà, 2003a) Vùng “siêu biến đổi” này quyết định tính độc lực và tính

kháng nguyên của virus, do vậy, được chọn để so sánh định type, chẩn đoán, giám

định, lập phả hệ các chủng virus cường độc Gumboro và nghiên cứu vacxin tái tổ hợp (Yamaguchi và cs, 1996; Scherbacova và cs, 1998; Chang và cs, 2002) (Hình B-1)

B1.5 Vacxin phòng bệnh

Vacxin ứng dụng phòng chống bệnh Gumboro gồm 2 loại: vacxin truyền thống (vacxin vô hoạt, vacxin nhược độc sống) thuộc thế hệ cũ, và vacxin thế hệ mới bao gồm các loại vacxin tái tổ hợp chứa ADN gen kháng nguyên hoặc sản phẩm protein kháng nguyên (Jackwood và Jackwood, 1997; Lukert và Saif, 1997; Chang và cs,

2002) Có rất nhiều chương trình phòng bệnh sử dụng các loại vacxin Gumboro khác nhau ở từng nước, từng vùng bị nhiễm phụ thuộc dịch tễ bệnh và loại gia cầm nuôi dưỡng, nhưng chương trình vacxin đều dựa vào nguyên tắc:

1 Cung cấp nguồn kháng nguyên để hệ miễn dịch thu nhận và kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể (IgG) có tác dụng trung hoà virus gây bệnh

2 Hàm lượng kháng thể thu nhận được phải đảm bảo bảo hộ miễn dịch, cho dù thu nhận từ gà mẹ (miễn dịch thụ động) hoặc do gà con tạo ra (miễn dịch chủ động)

3 Phải bảo hộ miễn dịch trong giai đoạn 2-6 tuần tuổi là lúc gà dễ bị virus tấn công và gây bệnh

Các loại vacxin thế hệ cũ đã được sử dụng rộng rãi bao gồm: vacxin nhược độc

sống và vacxin vô hoạt (Lukert và Saif, 1997) Vacxin nhược độc sống (live

attenuated) có 3 loại phân biệt theo mức độ độc lực là thấp, trung bình và cao Loại

vacxin nhược độc có độ độc thấp không gây suy giảm miễn dịch, loại trung bình và cao gây teo túi Fabricius và ảnh hưởng hệ miễn dịch của gà nếu dùng trước độ tuổi 2 tuần Vacxin có độ độc thấp sử dụng cho gà bố mẹ, loại trung bình và cao sử dụng cho gà thịt (OIE: http://www.oie.int/) Thế mạnh của vacxin nhược độc là gây miễn dịch tốt,

thế yếu là dễ tăng độc lực trở thành cường độc (lại độc) và trở thành nguy cơ tàng

nhiễm (Lukert và Saif, 1997, Lê Thanh Hoà, 2003a) Vacxin vô hoạt (inactivated)

dạng nhũ dầu được tạo ra để gây miễn dịch cho gà mẹ nhằm cung cấp kháng thể thụ

động cho gà con đảm bảo bảo hộ miễn dịch trong 2 tuần đầu sau khi nở (OIE:

http://www.oie.int)

Các loại vacxin thế hệ mới đã được thử nghiệm thành công và ứng dụng trong

thực tế bao gồm: vacxin dưới nhóm (subunit vaccine), vacxin tái tổ hợp có vectơ truyền

(vectoral vaccine), vacxin virus Gumboro không có lõi (VLP; virus-like particle

vaccine), và vacxin ADN (DNA vaccine) Tóm lược: 1) Vacxin dưới nhóm là tái tổ

hợp gen kháng nguyên của virus Gumboro vào palssmid biểu hiện, sản xuất trong hệ thống nấm men (Fahey và cs, 1991), hệ thống baculovirus và tế bào côn trùng (Dybing

và Jackwood, 1998), tách chiết polypeptit kháng nguyên bằng công nghệ (in vitro) bổ

sung chất bổ trợ rồi làm vacxin; 2) Vacxin tái tổ hợp có vectơ truyền là phân lập và

tái tổ hợp gen kháng nguyên vào một loại virus làm nhiệm vụ dẫn truyền như virus Herpes gà tây (Darteil và cs, 1995), virus Adeno (Sheppard và cs, 1998), virus đậu gà (Shaw và Davison, 2000), Semliki Forest virus (Phenix và cs, 2001), virus vacxin Marek (Tsukamoto và cs, 2002); và đưa vào cơ thể làm vacxin; 3) Vacxin virus Gumboro không có lõi là tạo nên hệ thống vectơ tái tổ hợp toàn bộ gen kháng nguyên,

gen cấu trúc và sản xuất chúng trong hệ thống tế bào thích hợp để chúng lắp ghép tạo

nên vỏ virus Gumboro, nhưng không chứa ARN hệ gen (VLP; virus-like particle)

(Fernandez và cs, 1998; Lee và cs, 2003); 4) Vacxin ADN là tái tổ hợp gen kháng

nguyên vào một loại plasmid vectơ biểu hiện, chuyển nạp vào tế bào E coli, sản xuất

ADN plasmid, tách chiết và tinh sạch để làm vacxin (Fodor và cs, 1999; Chang và cs, 2002; Chang và cs, 2003; Kim và cs, 2004; Sun và cs, 2005)

Vacxin thế hệ mới tạo ra bằng cả 4 hướng nói trên tỏ ra có hiệu quả thực tế phòng chống bệnh Gumboro tại nhiều nước trên thế giới (Chang và cs, 2002; Chang và

chủng GP40 và D78 ứng dụng có hiệu quả cao tại Hungary (Fodor và cs, 1999; Kim và

được ứng dụng thành công tại Mỹ (Chang và cs, 2002; Chang và cs, 2003; Sun và cs,

2005) Vacxin ADN chứa toàn bộ VP2-4-3 (phân đoạn A) có hiệu lực vacxin tốt hơn vacxin ADN chỉ chứa duy nhất gen VP2, có thể do polypeptide kháng nguyên lúc tổng

hợp được gấp khúc và tạo cấu trúc không gian giống như vỏ virus có trong tự nhiên, tức

là có cấu trúc giống như VLP Vacxin ADN phòng chống Gumboro được tiêm vào cơ hoặc/và vào bụng một vài lần (2-3 lần) lúc 1-2 ngày, lúc 1 tuần và lúc 2 tuần tuổi cho hiệu quả miễn dịch cao nhất (Fodor và cs, 1999; Chang và cs, 2002) Vacxin ADN phòng bệnh Gumboro đã được đăng ký bản quyền chính thức ở Mỹ, và được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới (Aboud-Pirak và cs, 2002)

B1.6 Nguyên lý thiết kế vacxin ADN và phương thức sử dụng

Việc đưa một chuỗi nucleotid của gen kháng nguyên vào một loại plasmid biểu hiện (expression vector), rồi sử dụng toàn bộ ADN của plasmid tái tổ hợp này để gây miễn dịch đã được nghiên cứu từ đầu những năm 1990 (Tang và cs, 1992) và sử dụng thành công như là một loại vacxin thế hệ mới phòng chống có hiệu quả nhiều bệnh truyền nhiễm (Robinson và Pertmer, 2000) Do vacxin ADN có ưu thế là dễ dàng trong thiết kế, đơn giản trong sản xuất, tiện lợi trong sử dụng, và cho miễn dịch đáp ứng yêu cầu, trong 5 năm gần đây, với mục đích bảo vệ con người và động vật, đã có hàng chục loại vacxin ADN được thiết kế, thử nghiệm, một số đã sử dụng tiền lâm sàng (preclinical trial) đối với hầu hết các đối tượng, bao gồm virus, vi khuẩn, ký sinh trùng

và thậm chí cả prion (Chattergoon và cs, 1998; Robinson và Pertmer, 2000) Đã có ít nhất 50 loại vacxin ADN virus; 9 loại vacxin ADN vi khuẩn; 9 vacxin ADN ký sinh trùng và prion, đã được thống kê và phân tích trong bài tổng quan về vacxin ADN của

Robinson và Pertmer (2000)

Vacxin ADN là sản phẩm của quá trình chọn lọc, phân lập gen kháng nguyên,

thiết kế vectơ và kết nối chúng thành một tổ hợp gọi là plasmid vectơ tái tổ hợp,

chuyển nạp vào tế bào vi khuẩn thích ứng, tách chiết ADN và tinh sạch, rồi sử dụng ADN plasmid tái tổ hợp như là một loại chế phẩm làm vacxin trên đối tượng là người

và động vật (Babiuk và cs, 2002) Plasmid làm khung cho vectơ tái tổ hợp trong thiết

kế vacxin ADN phải là một plasmid biểu hiện (expression vector), mà về nguyên tắc, ngoài các thành phần cần có của một plasmid hoạt động, phải bố trí một promotor rất

mạnh, đủ để thực hiện chức năng biểu hiện gen protein kháng nguyên gài vào sau nó,

được sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotide promotor lấy từ cytomegalovirus (Robinson và Pertmer, 2000) Trong vectơ biểu hiện protein, cần có thêm các tiểu phần

trợ giúp khác, trước hết là tiểu phần tín hiệu poly-A gắn vào sau chuỗi gen kháng

nguyên tái tổ hợp, sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotide có chức năng gắn tín hiệu

poly–A của gen β-globin của thỏ (rabbit β-globin polyadenylation signals) hoặc của gen hocmôn sinh trưởng bò (bovine growth hormone polyadenylation sequence, ký hiệu là BGH)

Về nguyên tắc, vacxin ADN có thể chứa đơn gen (mono-cistronic) hoặc đa gen (multi-cistronic) hoặc đa phân đoạn epitope (poly-epitope) hoặc chứa thêm cả gen của

các thành phần kích ứng miễn dịch, trong đó có chuỗi CpG (Wang và cs, 2003), gen

kích thích và điều hoà miễn dịch có nguốn gốc là cytokine, ví dụ IL-2 (Liu và cs,

2005) Một trong những yêu cầu cực kỳ quan trọng khi thiết kế tổ hợp biểu hiện gen kháng nguyên trong plasmid khung làm vacxin ADN là phải đưa được chuỗi Kozak

(GCG/GCC) vào trước bộ mã ATG của gen kháng nguyên (Kozak, 1987, 1997) Hai

phương thức cơ bản đưa vacxin ADN vào cơ thể là phương pháp tiêm vào trong da

hoặc cơ (đơn giản là phương pháp tiêm, injection), và phương pháp bắn xuyên da và cơ (đơn giản là phương pháp bắn gen, gene gun delivery) (Fynan và cs, 1993), có ảnh hưởng mang tính chất quyết định đến cơ chế và loại hình đáp ứng miễn dịch, và do vậy, quyết định hiệu lực của vacxin (Robinson và Pertmer, 2000) Phương pháp tiêm thường

hướng tới đáp ứng miễn dịch có vai trò chủ đạo của tế bào Th1 (helper T cell type 1),

và phương pháp bắn gen lại hướng tới đáp ứng miễn dịch có vai trò chủ đạo của tế bào Th2 (helper T cell type 2) Vacxin ADN được pha trong môi trường đệm là muối

(saline), ví dụ, NaCl hay PBS (Phosphat Buffer Saline), tiêm với liều lượng từ 10 àg

đến 1 mg, bắn gen với liều 0,2 àg đến 20 àg (Robinson và Pertmer, 2000), liều như vậy

chứa khoảng 10 11-13 plasmid vectơ tái tổ hợp, đủ để kích thích miễn dịch Về an toàn và vô trùng cho một vacxin ADN, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 1998) quy định là không chứa ADN nhân vi khuẩn, ARN ngoại lai, protein lẫn tạp, độc tố endotoxin trên hàm lượng cho phép (Prazeres và cs, 1999)

B1.7 Vector biểu hiện gen kháng nguyên

Vacxin ADN thực chất là một loại chứa plasmid làm vector đã được sử dụng trong tái tổ hợp gen kháng nguyên của một loại vi sinh vật gây bệnh nào đó mà chúng

ta cần phòng chống; có thể là vi khuẩn hay virus, hay các tác nhân gây bệnh khác Hiện nay một số loại vacxin ADN thành công chủ yếu là vacxin ADN chứa gen kháng nguyên có nguồn gốc từ hệ gen virus

Rõ ràng bản chất của một plasmid làm khung cho vector trong thiết kế vacxin

ADN phải là một plasmid biểu hiện (expression vector), mà theo nguyên tắc phải có

một promotor rất mạnh và thích hợp với tế bào chủ, đủ để thực hiện chức năng protein

kháng nguyên gài vào sau nó (Robinson và Permer, 2000)

Hình B-2 Cấu trúc khung của plasmid vector và mô tả mô hình tái tổ hợp gen kháng nguyên để làm plasmid gốc sản xuất vacxin ADN (khung pcDNA3.1 của Invitrogen, Mỹ)

Promotor được sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotid lấy từ cytomegalovirus (CMV) Thực chất đó là promotor điều hòa gen sớm (immediate early promotor) của virus CMV Trong vector biểu hiện protein ngoài promotor, cần có các tiểu phần trợ

giúp khác, trước hết là tiểu phần tín hiệu poly-A gắn vào sau chuỗi gen kháng nguyên

tái tổ hợp Sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotide có chức năng gắn tín hiệu poly–A của gen β-globin của thỏ (rabbit β-globin polyadenylation signals) hoặc của gen hocmôn sinh trưởng bò (bovine growth hormone polyadenylation sequence, ký hiệu là BGH) (Hình B-2) Tính tích cực trong biểu hiện cũng như mức độ biểu hiện của ARN thông tin gen kháng nguyên còn có thể được tăng cường bằng cách chuyển đổi việc sử dụng các bộ mã từ tế bào nhân sơ (prokaryotic codon usage) sang các bộ mã của tế bào nhân chuẩn (eukaryotic codon usage) (Andre và cs, 1998)

Hệ vector biểu hiện có thể tái tổ hợp đơn gen (mono-cistronic) hoặc đa gen (multi-cistronic) Trong trường hợp tái tổ hợp nhiều gen, có thể đó là hai gen cùng biểu

hiện sản phẩm protein kháng nguyên, hoặc một gen biểu hiện protein kháng nguyên, còn gen kia biểu hiện protein có tính chất kích thích và điều hòa miễn dịch có nguồn gốc cytokine

B1.8 Các thành phần kích ứng gen và miễn dịch

B1.8.1 Chuỗi Kozak kích ứng biểu hiện gen

Một số nucleotid nằm trực tiếp ngay trước bộ mã khởi đầu (ATG) của gen trong vùng sao chép thành ARN thông tin cùng với gen, có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình nhận biết của ribosome ở tế bào, đặc biệt là ở tế bào nhân chuẩn, đối với ARN thông tin đó (Kozak, 1987; 1997) Chuỗi Kozak đơn (GCC) hay (GCG) trực tiếp trước bộ mã

ATG; hoặc chuỗi Kozak hợp nhất (GCCAUGG), trong đó AUGG là các nucleotid đầu tiên của một gen, được chứng minh là có khả năng kích ứng biểu hiện gen cao hơn nhiều lần so với một gen đơn thuần không có các chuỗi Kozak này Nếu được thiết kế lặp hay nói cách khác, thiết kế chuỗi Kozak kép (GCCGCC) hay (GCCGCCGCC), thì gen chịu ảnh hưởng điều hòa của chúng có biểu hiện mạnh hơn Trong nhiều trường hợp, để tăng cường biểu hiện gen, đặc biệt ở động vật, việc thiết kế nucleotid ở chuỗi dẫn sau bộ mã ATG của một gen tái tổ hợp cũng cần phải điều chỉnh để tuân thủ quy

luật này Người ta gọi đây là quy luật Kozak Cụ thể, có một số quy luật Kozak trong

thiết kế biểu hiện gen như sau:

i) Cần có chuỗi GCC hoặc GCG trước bộ mã ATG của gen;

i) Cần có chuỗi GCCAUGG trước và ngay phần đầu của gen;

i) Cần có chuỗi 2x/3x(GCC) trước bộ mã ATG của gen;

i) Tại vị trí -3 cần có nucleotid gốc purin, nếu không, thì cần có Guanine (G)

ở vị trí thứ +4 (Lee và cs, 1997)

Vai trò của chuỗi Kozak càng đặc biệt quan trọng, nếu được thiết kế vào một gen có nguồn gốc vi sinh vật bậc thấp (prokaryotic gen) để biểu hiện trong hệ thống tế bào nhân chuẩn (eukaryotic cell) Do vậy, trong thiết kế cần kèm theo chuỗi Kozak để tăng cường khả năng biểu hiện gen mới cho sản phẩm với hàm lượng cao

B1.8.2 Chuỗi CpG kích ứng miễn dịch

Hiệu lực của một vacxin ADN, ngoài yếu tố kích thích miễn dịch mạnh của protein kháng nguyên (thành phần chính của vacxin ADN), còn có vai trò của một số thành phần khác có vai trò kích thích trong quá trình đáp ứng miễn dịch, hay còn gọi là

các thành phần kích ứng miễn dịch

Một trong các thành phần đó phải kể đến chuỗi CpG CpG là cấu trúc thành

phần của hệ gen vi khuẩn, một loại hình cấu trúc ngắn thường gặp (microsatellite), kể cả bắt gặp chúng trong hệ gen động vật bậc cao, trước hết là ở người (Krieg và cs,

1998) Nét đặc trưng nhất phân biệt motif CpG của người, thuộc tế bào nhân chuẩn (eukaryote) và CpG của vi khuẩn thuộc tế bào nhân sơ (prokaryote), là CpG của người

và động vật bị metyl hóa (methylation), còn ở vi khuẩn CpG không bị metyl hóa và xuất hiện trong hệ gen vi khuẩn với tần suất gấp hàng chục đến hàng trăm lần so với số lượng CpG trong hệ gen động vật bậc cao Như vậy, rõ ràng CpG phải có một vai trò nhất định, nên cấu trúc lặp thuộc motif CpG như thế này mới được bảo tồn qua tiến hóa

và được lưu giữ lại trong hệ gen của tế bào bậc thấp và bậc cao

Ngày nay, CpG biết đến có hai loại, xét về mặt chức năng:

- CpG kích thích (CpG-S: CpG-stimulatory): có cấu trúc chuỗi nucleotid đặc

biệt, có thành phần là -UUCGYY-, có chức năng kích thích miễn dịch bẩm sinh của cơ thể, theo cơ chế tự bảo vệ Trước hết chúng có vai trò kích thích tạo ra các sản phẩm cytokine thuộc loại hình TH1 (T-Helper cells type 1) và hoạt hóa tế bào tua (dendritic

cells, DC), loại tế bào có vai trò trung gian trong trình diện kháng nguyên cho các tế

bào có thẩm quyền miễn dịch (Sumida và cs, 2004; Krieg và cs, 1998)

- CpG trung hòa (CpG-N: CpG-neutralizing): là chuỗi CpG có thành phần –

CGCGCG-, có chức năng đối ngược với CpG-S, nghĩa là cản trở miễn dịch bẩm sinh của cơ thể, tạo điều kiện hỗ trợ vi sinh vật xâm nhập Loại hình CpG-N thường gặp trong hệ gen của người gấp 2-5 lần so với CpG-S (Krieg và cs, 1998)

Hai loại hình CpG-S và CpG-N hoạt động trong quá trình kích thích miễn dịch theo một cơ chế điều hòa qua lại, kính thích và kìm hãm, hay còn gọi là cơ chế feed-back, một cơ chế vốn có của bất kỳ hệ thống hoạt động protein có hoạt tính cao nào trong cơ thể

Tái tổ hợp chuỗi CpG-S và CpG-G vào cấu trúc của vacxin ADN là thao tác không thể thiếu được để thiết kế một vacxin ADN có hiệu ứng kích thích miễn dịch cao (Krieg và cs, 1998) và thông thường, chuỗi CpG của plasmid làm khung sử dụng cho kiến tạo vacxin ADN đã được thiết kế từ trước Vấn đề là ở chỗ, cần có bao nhiêu cấu trúc lặp CpG cho mỗi loại hình, sao cho ảnh hưởng của cơ chế feed-back không theo chiều tác dụng kìm hãm miễn dịch (Klinman và cs, 1997)

Những dẫn chứng sau đây cho thấy cần thiết phải thiết kế đúng số lượng và loại hình CpG, để chúng ta có thể có được loại vacxin ADN có vai trò kích thích cả hai loại

đáp ứng miễn dịch: miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào Ví dụ, một plasmid vector được bố trí 245 cấu trúc lặp CpG, trong đó 134 là CpG-N Nếu có 56 CpG-N đột biết trong số 134 CpG-N này thì vacxin ADN này kích thích miễn dịch dịch thể, tức là kích thích sinh kháng thể dịch thể gấp 2 lần, và có đến 30 – 40% tế bào Lympho-T được biệt hóa thành tế bào Tc (Tc: cytotoxic T) Nếu cho thêm 16 cặp CpG-

S vào vector nói trên, hàm lượng kháng thể dịch thể được kích thích sinh ra tăng gấp 6 lần, nhưng mức độ kháng thể tế bào Tc không thay đổi Nếu cho cặp CpG-S lên đến con số 50 cặp, thì hàm lượng kháng thể dịch thể vẫn không tăng hơn, nhưng lượng Tc sinh ra nhiều hơn, đến 55% tổng số tế bào Lympho-T được sinh ra, qua xét nghiệm miễn dịch

Như vậy CpG-S có một giới hạn trong hiệu ứng kích thích miễn dịch dịch thể Giả thuyết cho việc tăng số lượng CpG-S kìm hãm hàm lượng kháng thể dịch thể sinh

ra là do các chuỗi này cùng kích thích sinh ra interferon (IFN) thông qua TH1 và interferon tác dụng làm giảm biểu hiện gen kháng nguyên của vacxin ADN Như vậy CpG là cần thiết bố trí vào vacxin ADN như là một thành phần bổ trợ thuộc thế hệ mới (bổ trợ bằng công nghệ gen), nhưng không nhất thiết chính xác và kỹ lưỡng về số lượng và cấu trúc, mà chỉ cần sự có mặt của chúng trong cấu trúc plasmid làm vacxin ADN là đủ (Wang và cs, 2003)

B1.9 Miễn dịch học của vacxin ADN

B1.9.1 Vai trò của tế bào tua (DC) xử lý ADN kháng nguyên

Vacxin ADN có ưu thế tạo nguồn kháng nguyên lâu bền, hàm lượng đủ để các

tế bào trình diện kháng nguyên (APC: antigen presenting cells) tiếp nhận và giới thiệu cho các loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch tương ứng đó là Lympho-B hay/hoặc Lympho-T APC luôn luôn ở trong trạng thái hoạt động và tập thể Lympho-B/Lympho-

T cũng luôn luôn ở trong trạng thái chịu tác động để biệt hóa thành các tế bào tham gia tích cực quá trình đáp ứng miễn dịch một cách lâu bền

Một đặc trưng cơ bản nhất của miễn dịch học vacxin ADN là sự tạo ra “trí nhớ miễn dịch” được tận dụng một cách có hiệu quả (Robinson và Pertmer, 2000), cũng

như cơ chế linh hoạt trong sử dụng tế bào tua nang (follicular dendritic cells = FDC)

để duy trì và trình diện nguồn kháng nguyên đối với tế bào Lympho-B đã được biệt hóa (Sumida và cs, 2004) FDC thuộc loại nguồn gốc không tủy xương (non-bone marrow derived cells), chúng là những tế bào tương tác miễn dịch đặc hiệu của Lympho-B để sản sinh kháng thể dịch thể (Ada, 2001)

Hình B-3 Biệt hóa tế bào tua trong tham gia miễn dịch của vacxin ADN

Ghi chú: DC non có thể tiếp nhận kháng nguyên là ADN gen kháng nguyên để tự sản xuất

hoặc protein kháng nguyên do tế bào da và cơ sản xuất để trưởng thành trở thành DC thẩm quyền miễn dịch hoạt động trong miễn dịch học của vacxin ADN

Với phương pháp tiêm vacxin ADN hòa tan trong dung môi nước sinh lý hay

đệm phosphate (PBS), bằng cả hai cách: hoặc vào cơ hoặc vào nội bì, tế bào tua (dendritic cells) được phát hiện là loại hình tế bào chủ yếu tiếp nhận ADN, chuyển tải

Tế bào nguồn từ tủy xương

DC trưởng thành trỡnh diện kháng nguyên

Tế bào nguồn từ tủy xương

DC trưởng thành trỡnh diện kháng nguyên

và cưu mang ADN của vacxin, cũng như làm vai trò giới thiệu kháng nguyên (Casares

và cs, 1997; Kutzler và Weiner, 2004) Có khoảng 0,4% tế bào tua xuất hiện trong hệ bạch huyết, được phát hiện có mang antigen sau khi vacxin ADN được đưa vào cơ thể bằng phương pháp tiêm cơ (Casares và cs, 1997) Giả sử có 15.000 đến 40.000 tế bào tua tồn tại trong một hạch lympho, như vậy phải có ít nhất 60 – 160 tế bào tua chịu tác

động của kháng nguyên trở thành tế bào trình diện kháng nguyên (APC)

Tế bào tua DC tham gia tích cực vào quá trình đáp ứng miễn dịch của vacxin ADN, dưới 3 chức năng: i) DC trực tiếp thu nhận ADN gen kháng nguyên từ vacxin ADN, thông qua thụ thể TLR-9 (toll-like receptor 9) và biến nạp chuyển thành tế bào sản xuất kháng nguyên và trình diện kháng nguyên lên bề mặt thông qua MHC lớp 1

và MHC lớp 2 (Hình B-3); ii) DC thu nhận và tóm bắt sản phẩm protein kháng nguyên

từ tế bào khác, trước hết là từ tế bào cơ và tế bào biểu bì ở da đang sản xuất protein kháng nguyên và bị chết do thay tế bào trong giai đoạn phân chia, chúng giải phóng protein kháng nguyên cho DC tóm bắt Từ nguồn kháng nguyên này, DC lãnh vai trò trình diện kháng nguyên chéo (cross presentation) và duy trì chúng tồn tại như một loại hình tế bào tham gia chuyển tải kháng nguyên trong miễn dịch vacxin ADN; iii) Tế bào DC non trực tiếp phản ứng biến nạp với ADN của vacxin và CpG oligonucleotide trong cấu trúc vacxin ADN, chúng không chuyển đổi thành tế bào sản xuất protein kháng nguyên mà kích thích DC non trưởng thành và trở thành một nhóm tế bào miễn dịch kích ứng hợp tác với Lympho-T

Như vậy, DC là loại hình tế bào quan trọng nhất trong quá trình xử lý và chuyển tải kháng nguyên trong miễn dịch vacxin ADN (Kutzler và Weiner, 2004; Sumida và

nguyên, có trách nhiệm trực tiếp:

i) Tổng hợp một lượng lớn phân tử MHC trên bề mặt để làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên;

ii) Sản xuất chemokine để điều hòa DC và Lympho-T;

iii) Chăm lo các thụ thể chemokine, ví dụ điều hòa thụ thể CCR7, tăng sinh DC

và định vị trong hạch chuẩn bị tiếp nhận kháng nguyên;

iv) Giải phóng cytokine IL-12 hoạt hóa tế bào diệt tự nhiên NK (natural killer)

và định hướng Lympho-T chuyên hóa thành TH1;

v) Biểu hiện và trình diện các phân tử hướng dụ Lympho-T (T cell adhesion) và sản phẩm kích hoạt Lympho-T Sản phẩm kích hoạt phần lớn định vị trên bề

mặt DC là lectin type C như DC-SIGN (type II membrane-spanning C-type

lectin), họ hàng thụ thể của yếu tố hủy hoại khối u (TNF/TNF-R) như CD40

và TRANCE-R và nhiều phân tử thuộc họ hàng B7 như CD86

Với miễn dịch thông thương, mở đầu miễn dịch thường có vai trò tiên quyết của

đại thực bào, nhưng trong miễn dịch vacxin ADN, tế bào tua DC hoàn toàn thay thế và

đa dụng hơn và đây là nét đặc sắc của giai đoạn khởi phát miễn dịch sau khi tiêm ADN vacxin vào cơ thể

B1.9.2 Vai trò của vị trí và các tế bào tiếp nhận ADN vacxin

Da và cơ là hai vị trí tiếp nhận ADN của vacxin ADN và vai trò của chúng tại vị trí tiếp nhận chi phối loại hình và tiến triển miễn dịch trong giai đoạn tiếp theo

Da chịu trách nhiệm chính đối với phương pháp đưa vacxin ADN vào bằng cách bắn gen, còn cơ chịu trách nhiệm chính đối với vacxin ADN bằng phương pháp tiêm

Có cả hai phương thức khởi đầu miễn dịch: vừa sản sinh kháng thể dịch thể, tức là chuyển đổi Lympho-B thành tương bào; vừa sản sinh kháng thể tế bào, tức là chuyển

đổi lympho-T thành tế bào độc Tc (cytotoxic T cells)

Hình B-4 Cơ chế xử lý gen kháng nguyên trong tế bào tiếp nhận (tua, keratinocyte và cơ) quyết định đáp ứng miễn dịch trong miễn dịch học của vacxin ADN

Tại vị trí đó, tính quyết định miễn dịch thể hiện: i) Những loại tế bào nào xung quanh vị trí tiếp nhận sẽ tiếp xúc, thu nhận và chuyển tải ADN vacxin; ii) Loại hình tế bào miễn dịch nào, TH1 hay TH2 (Helper T cell type 1 or type 2) tham gia vào đáp ứng

Tế bào tua dendritic cell

CTL (Tế bào gây độc Tc)

Protein kháng nguyên xử lý và trỡnh diện lên bề mặt cho MHC-II thực hiện phản ứng

miễn dịch trung gian tế bào

mRNA

ADN gen kháng nguyên

Th (Tế bào lympho-T trợ giúp)

Protein kháng nguyên xuất khỏi tế bào được MHC-I xử lý cho đáp ứng

miễn dịch dịch thể

Tế bào tua dendritic cell

CTL (Tế bào gây độc Tc)

Protein kháng nguyên xử lý và trỡnh diện lên bề mặt cho MHC-II thực hiện phản ứng

miễn dịch trung gian tế bào

mRNA

ADN gen kháng nguyên

Th (Tế bào lympho-T trợ giúp)

Protein kháng nguyên xuất khỏi tế bào được MHC-I xử lý cho đáp ứng

miễn dịch dịch thể

miễn dịch; iii) Cân bằng hay thiên lệch về miễn dịch dịch thể (sản sinh kháng thể hòa tan) hay miễn dịch trung gian tế bào (sản sinh kháng thể tế bào Tc) (Hình B-4)

Trong trường hợp bắn gen, tại vị trí đưa ADN vào, có một số lượng lớn tế bào

keratin (keratinocyte) tiếp nhận nguồn ADN gen kháng nguyên (ADN vacxin), chịu

trách nhiệm chuyển đổi, biệt hóa để sản xuất kháng nguyên Trong trường hợp tiêm

vacxin ADN, thì có một số lượng lớn tế bào cơ (myocyte) tiếp nhận ADN gen kháng

nguyên và biệt hóa thành tế bào sản xuất protein kháng nguyên, vừa có thể làm nhiệm

vụ thu nhận protein kháng nguyên từ các tế bào trên để trình diện đến các tế bào có

thẩm quyền miễn dịch Lympho-B hay Lympho-T (Kutzler và Weiner, 2004) (Hình

B-4 )

Vị trí tiếp xúc với ADN vacxin cũng quyết định hình thành kháng nguyên theo

dạng liên kết tế bào (không hòa tan) hoặc theo dạng tự do, thẩm xuất ngọai bào (dạng

hòa tan) Đối với phương pháp tiêm vào cơ, nếu đáp ứng miễn dịch do TH1 chủ động thì nguồn kháng nguyên được sản xuất ra tồn tại dưới dạng liên kết tế bào và không hòa tan; nếu do TH2 chi phối, thì kháng nguyên được tổng hợp ở dạng hòa tan Đối với phương pháp bắn gen, TH2 là loại hình chính chủ động quá trình đáp ứng miễn dịch và nguồn kháng nguyên tổng hợp được cho chúng sử dụng ở cả hai dạng: không hòa tan (liên kết tế bào) và hòa tan thẩm dịch ngoại bào (Sumida và cs, 2004)

B1.9.3 Nguyên tắc tạo miễn dịch của vacxin ADN

Sự tồn tại của kháng nguyên và sự xuất hiện của kháng thể vừa tổng hợp, lồng vào nhau trong thời gian ít nhất 2-3 tuần, nhưng chúng không trung hòa nhau do ở các

vị trí khác nhau: kháng nguyên nằm trong trung tâm mầm của hạch lympho ở trên bề mặt DC thuộc hệ bạch huyết, còn kháng thể tồn tại trong hệ tuần hoàn do các tế bào Lympho-B biệt hóa (gọi là tương bào) ở ngoại vi sản xuất (Robinson và Pertmer,

2000) Nguồn kháng thể trung hòa, cho dù mới được tổng hợp, hoặc tiếp thu thụ động

do mẹ truyền sang, hay thừa hưởng từ lần đưa vacxin trước đó, vẫn không ảnh hưởng

đến kháng nguyên Chính vì vậy, vacxin ADN có lợi thế là sử dụng lúc nào cũng được

và trong nhiều trường hợp, chỉ cần một lần sử dụng vacxin ADN vẫn đảm bảo nguồn kháng nguyên đủ để cho quá trình đáp ứng miễn dịch lâu bền (Babiuk và cs, 2002)

Một vấn đề có tính chất nguyên tắc cần phải chú trọng, là hiệu lực mà một vacxin ADN có thể đem lại còn cao hơn, thậm chí hàng chục lần, nếu áp dụng biện

pháp tăng cường miễn dịch, nhờ chất bổ trợ (truyền thống hoặc phân tử), cách bao

gói ADN vacxin, và phương thức sử dụng (một lần hay nhắc nhở) Sử dụng chuỗi

Kozak (tăng cường biểu hiện gen) trong thiết kế plasmid gốc, liposome (bổ trợ truyền thống); CpG, cytokine (bổ trợ phân tử) (Liu và cs, 2005), đưa vacxin vào thêm 1-2 lần (nhắc nhở) là những phương pháp đang thực hiện với hầu hết các loại vacxin ADN

đang thử nghiệm và sử dụng hiện nay (Babiuk và cs, 2002)

Vấn đề an toàn phân tử, một thế yếu lớn nhất của vacxin ADN là tuy cơ chế

tạo miễn dịch đã được sáng tỏ, nhưng câu hỏi lớn luôn vẫn đặt ra là liệu gen kháng

nguyên ngọại lai có nhập vào (intergration) trong hệ gen của người và động vật được

hưởng vacxin ADN hay không? Cho đến nay, chưa có bằng chứng nào về sự nhập gen của ADN ngoại lai có trong vacxin vào hệ gen của đối tượng hưởng vacxin (Babiuk và

hình động vật, và một số lần được thăm dò trên người tình nguyện (Robinson và Pertmer, 2000) Đối với động vật, hầu hết các loại vacxin ADN, qua thử nghiệm cho bảo hộ miễn dịch tốt, đã được OIE/WHO cho phép sử dụng trong các chương trình vacxin phòng chống bệnh ở động vật rộng rãi (Watts và Kennedy, 1999; Bubiuk và cs,

2002)

B2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, bệnh Gumboro được chính thức phát hiện từ những năm 1980 dựa vào triệu chứng, bệnh tích, dịch tễ học (Bitay và cs, 1984) Từ đó đến nay, bệnh xảy ra ngày càng trầm trọng và mang tính chất toàn diện trên toàn quốc, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm (Nguyễn Tiến Dũng, 1989; 1996) Nhiều tác giả cho rằng nguyên nhân gây bệnh Gumboro tại Việt Nam và bùng nổ mạnh trong vòng 20 năm qua là do nhập con giống tàng trữ virus từ nhiều nguồn khác nhau từ nước ngoài vào (Nguyễn Tiến Dũng, 1996; Lê Thanh Hoà, 2003a,b) Hiện nay quần thể virus gây bệnh Gumboro tại Việt Nam rất đa dạng và lẫn tạp nhiều chủng loại khác nhau của nhiều vùng địa lý trên thế giới (To và cs, 1999) Đặc tính phân tử và biến đổi gen kháng nguyên VP2 đã bước đầu được nghiên cứu và xem xét mối quan hệ gây nhiễm

và phả hệ, nguồn gốc của nhiều chủng Gumboro phân lập ở nước ta (To và cs, 1999; Lê

rất lớn, nhất là ở các tỉnh phía Bắc, có lẽ do sự xuất hiện toàn cầu của một chủng rất cường độc và xâm nhập vào nước ta Trong giai đoạn này, một chủng virus Gumboro

ký hiệu G202 có độc lực cao đã được phân lập và gần đây đã được giám định phân tử

một cách chính xác (Lê Thanh Hòa và cs, 2002) Nhiều trại gà đã phải hủy bỏ toàn

đàn, bỏ trống chuồng nuôi, chờ biện pháp ngăn chặn dịch bệnh Chỉ riêng xí nghiệp gà giống Phúc Thịnh (Đông Anh), năm 1988, bệnh xảy ra rất nặng làm chết 55.467 gà trên tổng số 222.615 con, chiếm tỷ lệ 24,9% (Nguyễn Đăng Khải, 1988) Trong những năm 1989-1995, tình hình bệnh Gumboro không ngừng gia tăng, gà nuôi công nghiệp

ở Việt Nam thuộc các giống khác nhau đều bị bệnh (Phan Văn Lục, Trần Thị Liên,

1998) Nếu như năm 1989, tỷ lệ đàn gà nhiễm bệnh là 19,23% thì đến năm 1995 tăng lên 90,31% trong tổng số đàn gà được kiểm tra (Phương Song Liên, 1996) Tuy có nhiều phương pháp tổng hợp đã được áp dụng trong phòng chống kể cả chương trình vacxin rộng rãi, nhưng bệnh Gumboro vẫn là một trong những bệnh có tỷ lệ nhiễm cao nhất: 56,98% (Lê Văn Năm, 1997; Nguyễn Tiến Dũng, 1996) Một trong những nguyên nhân quan trọng là việc vệ sinh tẩy uế không được triệt để, virus Gumboro có sức đề kháng cao với điều kiện tự nhiên, cho nên bệnh tồn tại và lưu hành rộng rãi, cũng như vacxin nhập ngoại có nguồn kháng nguyên không hoàn toàn tương ứng với các chủng gây bệnh của Việt Nam (Nguyễn Tiến Dũng, 1996;Lê Thanh Hoà, 2002; Lê Thanh Hoà, 2003a,b)

Cho đến khi đề xuất đề tài nghiên cứu vacxin ADN Gumboro (thời điểm 2003),

đã có nhiều nghiên cứu về Gumboro ở Việt Nam, nhưng chủ yếu tập trung về các

hướng nghiên cứu dịch tễ bệnh, chẩn đoán và nghiên cứu ứng dụng vacxin thế hệ

cũ bao gồm khảo sát dịch tễ bệnh, điều tra mức độ nhiễm bệnh và hướng phòng chống,

phân lập giám định virus gây bệnh và biến đổi bệnh lý, phân lập giám định phân tử, phương thức chẩn đoán bằng bệnh lý học vi thể, chẩn đoán bằng huyết thanh học sử dụng phản ứng khuếch tán trên thạch AGP (agar gel precipitation), sử dụng phản ứng trung hoà (virus neutralization), xác định hàm lượng kháng thể sau khi tiêm vacxin Gumboro và giám định phân tử và phân nhóm phả hệ virus gây bệnh Nhiều nghiên cứu

về sản xuất vacxin nhược độc sống nhập nộinuôi cấy trên tế bào(Đái Duy Ban, 1991),

thử nghiệm một số vacxin ở Việt Nam (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 1993), sản xuất vacxin Gumboro đông khô 2512 (Trần Thị Liên và Trần Khâm, 1999), tạo vacxin vô hoạt nhũ dầuvàkiểm tra an toàn hiệu lực và thử nghiệm sử dụng trên gà đẻ trứng(Đái

phòng chống đã được xúc tiến mạnh mẽ, phần nào hạn chế thiệt hại của bệnh, nhưng Gumboro vẫn xảy ra chưa khống chế được một cách triệt để, và vẫn là mối đe doạ to lớn Một trong những nguyên nhân lớn nhất vẫn là chưa thực sự sử dụng đúng loại

vacxin thích hợp, vacxin lại đơn chủng, vacxin sống có mức độ “lại độc” cao, vacxin

vô hoạt cho miễn dịch chưa đều, virus cường độc gây bệnh đa dạng và chương trình vacxin cho gà mẹ, gà con và gà dò chưa đúng chủng loại và lịch trình phù hợp

Cho đến khi thực hiện đề tài này, ở Việt Nam, chưa có bất kỳ một công trình nào nghiên cứu vacxin ADN nói chung, và vacxin ADN ứng dụng phòng chống bệnh Gumboro nói riêng Tuy nhiên, đã có những nghiên cứu phân tử được tiến hành

bao gồm chẩn đoán, giám định, đặc tính phân tử và nguồn gốc phả hệ của các chủng virus Gumboro phân lập tại Việt Nam (To và cs, 1999; Ghazi Amer và cs, 2001; Lê

kháng nguyên VP2 là đối tượng được sử dụng nghiên cứu về mối quan hệ di truyền quần thể bằng các phương pháp sinh học phân tử từ nhiều chủng phân lập tại nhiều vùng địa lý khác nhau của Việt Nam (To và cs, 1999; Lê Thanh Hoà, 2003b) Tất cả những dữ liệu cơ bản về sinh học phân tử virus Gumboro ở Việt Nam, trước hết là

những nghiên cứu có tính chất hệ thống về biến đổi epitope, tái tổ hợp gen VP2 và

phân đoạn A của To và cs (1999);Lê Thanh Hoà và cs (2002); Lê Thanh Hoà (2002a);

mới, đặc biệt là vacxin ADN có nguồn gen từ các chủng Gumboro phân lập tại Việt Nam (Lê Thanh Hoà, 2003a) Epitope kháng nguyên của các chủng cường độc phân

lập tại Việt Nam có đặc tính biến đổi phức tạp, qua khảo sát bước đầu về phân tử cho

thấy chưa hoàn toàn tương ứng với epitope vacxin nhược độc hiện đang dùng, hơn nữa,

xuất hiện sự đa nhiễm nhiều chủng cường độc trên một cá thể, nên vacxin đơn chủng khó bảo hộ miễn dịch (Lê Thanh Hòa, 2003b; 2004)

Cho đến nay, trên thế giới và trong nước có nhiều loại vacxin phòng bệnh Gumboro bao gồm vacxin nhược độc cũng như vô hoạt, dùng cho gà các lứa tuổi khác nhau, cho nhiều vùng có tính chất dịch tễ khác nhau, và cho gà nuôi với mục đích khác nhau (Lukert và Saif, 1997) Vấn đề là ở chỗ nên chọn loại vacxin nào, sử dụng ở thời

điểm nào, sao cho hệ miễn dịch của gia cầm được bảo vệ không bị virus cường độc tấn công, và nếu có bị xâm nhập, thì virus không gây bệnh được (INCO-CD, 1999) Phòng chống bệnh chưa đạt hiệu quả cao do sử dụng không hoặc chưa đúng loại vacxin (do Gumboro có nhiều biến chủng và kháng nguyên thay đổi), do vacxin kém chất lượng vì bảo quản kém, và phương thức sử dụng chưa đúng (Phan Văn Lục và Trần Thị Liên,

nhưng có tác dụng phụ là gây suy giảm miễn dịch làm ảnh hưởng đến hiệu quả các

chương trình vacxin phòng chống các bệnh nguy hiểm khác ở gia cầm Mặt khác, trong quá trình sử dụng ở các vùng lưu hành bệnh, virus vacxin nhược độc Gumboro được cảnh báo là có khả năng tăng cường độc lực và trở nên gây bệnh (OIE:http://www.oie.int/) (Lê Thanh Hòa, 2003a; 2004)

Để phòng bệnh truyền nhiễm, đặc biệt một số bệnh do virus gây ra, chiến lược tiên quyết vẫn là sử dụng các chế phẩm vacxin nhằm tạo miễn dịch cho cơ thể (miễn dịch bị động hay chủ động).Từ những năm 1990, ở Việt Nam đã nghiên cứu ứng dụng thành công một số loại vacxin sống và vô hoạt Do tính phức tạp của biến động kháng nguyên, do bị chi phối bởi nhiều chủng gây bệnh từ nhiều nguồn gà nhập từ nước ngoài vào, đa nhiễm nhiều chủng trên một cá thể, và trao đổi gà giống các miền trong cả nước, quần thể virus gây bệnh Gumboro ở Việt Nam trở nên hỗn hợp xét về góc độ phân tử, mà vacxin đơn chủng nhược độc và các loại vacxin đơn giá cổ điển khác, không hoặc kém phát huy hiệu quả (Nguyễn Tiến Dũng, 1996; Lê Thanh Hoà, 2003a,b) Theo phương hướng phát triển đàn gia cầm (chủ yếu là gà) ở nước ta, tiến tới

đạt 300 triệu con trong giai đoạn 2006-2010, Gumboro trở nên một bệnh vẫn còn nan giải và thách thức, do vậy, việc tìm kiếm các phương pháp phòng chống mới, kể cả ứng dụng vacxin tái tổ hợp phân tử, trong đó có vacxin ADN là có tính cấp thiết, thực tiễn

2 Ada, G (2001) Vaccines and vaccination N Engl J Med, 345:1042-1053

3 Andre S, Seed B, Eberly J Schraut W and Hass J (1998) Increased immune response elicited by DNA vaccination

with a systhetic gp120 sequence with optimzed codon usage J Virol., 72:1497-1503

4 Babiuk, L.A., Babiuk, S.L and Baca-Estrada, M.E (2002) Novel vaccine strategies Adv Virus Res 58:29-80

5 Bayliss, C.D., Spies, U., Shaw, K., Peters, R.W., Papageorgiou, A., Muller, H and Boursnell, M.E.G (1990) A comparison of the sequences of segment A of four infectious bursal disease virus strains and identification of a

variable region in VP2 Journal of General Virology, 71, 1303-1312

6 Casares, S., Inaba, K., Brumeanu, T.D., Steinman, R.M., and Bona, C.A (1997) Antigen presentation by dendritic

cells after immunization with DNA encoding a major histocompatibility complex class II–restricted viral epitope J

Exp Med 186:1481-1486

7 Chang, H.C., Lin, T.L and Wu, C.C (2003) DNA vaccination with plasmid containing various fragments of large

segment genome of infectious bursal disease virus Vaccine, 21(5-6):507-13

8 Chang, H.C., Lin, T.L., Wu, C.C (2002) DNA-mediated vaccination against infectious bursal disease in chickens

Vaccine 20(3-4):328-35

9 Chattergoon, M, Boyer, J, Weiner, D.B (1998) Genetic immunzation: a new era in vaccines and immunune

therapeutics FASEB J 11:753-63

10 Cosgrove, S.D (1962) An apparently new disease of chickens - avian nephrosis Avian Dis 6:385–389

11 Darteil, R; Bublot, M.; Laplace, E.; Bouquet, J.F.; Audonnet, J.C and Riviere, M (1995) Herpesvirus of turkey recombinant viruses expressing infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 immunogen induce protection against

an IBDV virulent challenge in chickens Virology: 211, 481-490

12 Dybing, J.K and Jackwood D.J (1998) Antigenic and immunogenic properties of baculovirus-expressed infectious

bursal disease viral proteins Avian Diseases, 42, 80-91

13 Fahey, K.J., Erny, K and Crooks, J (1989) A conformational immunogen on VP2 of infectious bursal disease virus

that induces virus neutralizing antibodies that passively protect chickens Journal of General Virology 70,

1473-1481

14 Fernadez Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J and P.Rodriguez, J F (1998) Expression of ORF A1 of

infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles J Gen Virol 79(5):1047-1054

15 Fodor, I., Horvath, E., Fodor, N., Nagy, E., Rencendorsh, A., Vakharia, V.N., Dube, S.K (1999) Induction of protective immunity in chickens immunised with plasmid DNA encoding infectious bursal disease virus antigens

Acta Vet Hung 47(4):481-92

16 Fynan, E.F., Webster, R.G., Fuller, D.H., Haynes, J.R., Santoro, J.C., Robinson, H.L (1993) DNA vaccines:

protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene gun inoculations Proc Natl Acad Sci USA 90:11478-82

17 INCO-DC Report: “Acute infectious bursal disease in poultry, epidemiology of the disease: basis of virulence and improvement of vaccination” Brussels, Belgium, (22-23.10.1999)

18 Jackwood, D J and R J Jackwood (1997) “Molecular identification of infectious bursal disease virus strains”

Avian Dis 41(1): 97-104

19 Klinman DM, Yamshchikov G and Ishigatsubo Y (1997) Contribution of CpG motifs to the immunogenicity of

DNA vaccine J Immunol 158: 3635-3639

20 Kozak M: Atlest six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells J Mol

Biol 1987, 196:947-950

21 Kozak M: Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not

generally affected by the nucleotides in position +5 and +6 EMBO J 1997, 16:2482-2492

22 Krieg AM, Yi A-K, Schorr J and Davis HL: The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines Trends Microbiol

structural protein VP2 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 9(7):1234-7

25 Lee AH, Suh YS, Sung JH, Yang SH and Sung YC (1997) Comparison of various expression plasmids for the

induction of immune response by DNA immunization Mol Cells, 7:495-501

26 Liu, H.J., Huang, P.H et al (2001) "Molecular characterisation of very virulent infectious bursal disease viruses in

Taiwan." Res Vet Sci 70(2):139-47

27 Lukert P.D and Saif Y.M (1997) Infectious bursal disease In: Diseases of Poultry, Tenth Edition, Calnek B.W.,

ed Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, 721-738

28 Phenix, K V., Wark, K et al (2001) "Recombinant Semliki Forest virus vector exhibits potential for avian virus

vaccine development." Vaccine 19(23-24): 3116-23

29 Prazeres, D.M.F., Ferreira, G.N.M., Monteiro, G.A., Cooney, C.L and Cabral, J.M.S (1999) Review: Large-scale

production of pharmaceutical-grade plasmid DNA for gene therapy: problems and bottlenecks TIBTECH,

17:169-174

30 Robinson, H.L and Pertmer, T.M (2000) DNA vaccines for viral infections: basic studies and applications Adv

Virus Res 55:1-74

31 Sambrook, J and Russell, D.W (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd Edition, Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, NY

32 Scherbacova, L.O., Lomakin, A.I., Borisov, A.V., Drygin, V.V and Gusev, A.A (1998) Comparative analysis of

VP2 gene variable region of infectious bursal disease virus Mol Gen Microbiol Virol 1, 35-40

33 Shaw, I., and Davison, T.F (2000) Protection from IBDV-induced bursal damage by a recombinant fowlpox

vaccine, fpIBD1, is dependent on the titre of challenge virus and chicken genotype Vaccine 18(28):3230-41

34 Sheppard, M., Werner, W., Tsatas, E., McCoy, R., Prowse, S and Johnson., M (1998) Fowl adenovirus recombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induces protective immunity against bursal disease

Archives of Virology, 143:915-930

35 Snyder, D.B., Vakharia, V.N and Savage, P.K (1992) Naturally occurring-neutralizing monoclonal antibody

escape variants define the epidemiology of infectious bursal disease virus in the United States Archives of Virology

127, 89-101

36 Sumida SM McKay PF, Truitt DM, Kishko MG, Arthur JC, Seaman MS, Jackson SINH S¶N, Gorgone DA, Lifton

MA, Letvin NL, Barouch DH (2004) Recruitment and expansion of dendritic cells in vivo potentiate the immunogenicity of plasmid DNA vaccines J Clin Invest 114(9):1334-1342

37 Sun JH, Yan YX, Jiang J, Lu P (2005) DNA immunization against very virulent infectious bursal disease virus with

VP2-4-3 gene and chicken IL-6 gene J Vet Med B Infect Dis Vet Public Heath 52(1):1-7

38 Sun, J.H., Lu, P et al (2003) "Sequence and analysis of genomic segment A and B of very virulent infectious

bursal disease virus isolated from China" J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 50(3):148-54

39 Tang, D.C., Devit, M and Johnston, S.A (1992) Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune

response Nature (London) 356:152-4

40 To, H., Yamaguchi, T., Nguyen, N.T., Nguyen, O.T., Nguyen, S.V., Agus, S., Kim, H.J., Fukushi, H and Hirai, K (1999) “Sequence comparison of the VP2 variable region of infectious bursal disease virus isolates from Vietnam.”

J Vet Med Sci 61(4): 429-432

41 Tsukamoto, K., Kojima, C., Komori, Y., Tanimura, N., Mase, M., Yamaguchi, S (1999) Protection of chickens against very virulent infectious bursal disease virus (IBDV) and Marek's disease virus (MDV) with a recombinant

MDV expressing IBDV VP2 Virology 257(2):352-62

42 Wang X, Jiang P, Deen S, Wu J, Liu X, Xu J (2003) Efficacy of DNA vaccines against infectious bursal disease

virus in chickens enhanced by coadministration with CpG oligodeoxynucleotide Avian Dis 47(4):1305-12

43 Watts, A.M and Kennedy, R.C (1999) DNA vaccination strategies against infectious diseases Int J Parasitol

29:1149-1163

44 WHO Expert Committee on Biological Standardization (1998) WHO Technical Report Series No 878, World Health Organization, Geneva, Switzerland

45 Yamaguchi, T., Ogawa, M., Inoshima, Y., Miyoshi, M., Fukushi, H and Hirai, K (1996) Identification of

sequence changes responsible for the attenuation of highly virulent Infectious bursal Disease Virus Virology

223:219-223

Trong nước:

1 Đái Duy Ban (1991) Vacxin Gumboro nhược độc sản xuất tại Việt Nam Báo cáo tổng kết trình bày tại Tiểu ban

Chăn nuôi Thú Y, Bộ Nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm (5.1991)

2 Đái Duy Ban, Phạm Công Hoạt, Phan Thanh Phượng (1998) Độ an toàn và hiệu lực của vacxin vô hoạt nhũ dầu

Gumboro sản xuất ở trong nước Tạp chí Sinh học, 20:41-44

3 Bitay Zoltan, Trần Minh Châu, Dương Công Thuận (1984) Phát hiện bệnh Gumboro ở gà công nghiệp, Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y, tr 28-31

4 Ghazi Ktab Amer, Ian G Marceadie, Đinh Duy Kháng, Đái Duy Ban (2001) Xác định trình tự gen VP2 của virút

gây bệnh Gumboro ( IBVD) ở Việt Nam Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 8(4):36-41

5 Lê Thanh Hoà (1992) Sách: “Bệnh Gumbôrô, suy giảm miễn dịch ở gia cầm” Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội,

Việt Nam (89 trang)

6 Lê Thanh Hoà (2002) Đặc tính phân tử của các chủng virut Gumboro cường độc Việt Nam qua khảo sát chuỗi gen kháng nguyên VP2 Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú Y, 9(4):6-14

7 Lê Thanh Hoà (2003a) Sách: “Sinh học phân tử virus Gumboro: nghiên cứu ứng dụng tại Việt Nam” Nhà xuất bản

Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam (260 trang)

8 Lê Thanh Hoà (2003b) Bước đầu khảo sát nguồn gốc và phả hệ virus cường độc Gumboro phân lập ở Hà Nội và vùng phụ cận Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú Y, 10(3):6-13

9 Lê Thanh Hòa (2004) Biến đổi phân tử của epitope gen kháng nguyên VP2 ở một số chủng virus cường độc

Gumboro phân lập tại Việt Nam Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 9(4)6-13

10 Lê Thanh Hoà, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Bích Nga, Đái Duy Ban (2002) Giám định sinh học phân tử virus

Gumboro Việt Nam sử dụng phản ứng PCR ngược (RT-PCR) đối với chuỗi gien kháng nguyên VP2 Tạp chí Khoa

học và Công nghệ, 40(5):1-8

11 Lê Văn Năm (1997) Gumboro – bệnh SIDA ở gà Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội

12 Nguyễn Đăng Khải (1998) Bệnh Gumboro ở gia cầm Thông tin Thú Y, tháng 10/1988

13 Nguyễn Tiến Dũng (1989) Bệnh Gumboro ở gà và tình hình dịch bệnh ở Việt Nam Tạp chí Khoa học kỹ thuật

Nông nghiệp, 2:104-109

14 Nguyễn Tiến Dũng (1996) Nhìn lại bệnh Gumboro ở Việt Nam Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 3(1):94-98

15 Phương Song Liên (1996) “Nghiên cứu dịch tễ bệnh Gumboro của gà công nghiệp ở một số tỉnh phía Bắc Việt

Nam” Luận án Phó tiến sĩ Khoa học Nông nghiệp

16 Phạm Công Hoạt, Đoàn Thanh Hương, Lê Kim Xuyến, Đái Duy Ban (2001) Độ dài miễn dịch và hàm lượng kháng

thể thụ động ở gà con của gà mẹ được tiêm vaccine Gumboro vô hoạt nhũ dầu Việt nam Tạp chí Sinh học, 3:64–68

17 Phan Văn Lục (1997) Nhìn lại tình hình nhiễm bệnh ở đàn gà công nghiệp nước ta và hướng nghiên cứu giải quyết

Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 4(2):9-12.

C Các phưong pháp nghiên cứu chính

1- Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm để phân lập chủng virus Gumboro

(Theo quy định của OIE: http://www.oie.int/)

2- Phương pháp tiếp truyền virus trên gà mẫn cảm thu nhận túi Fabricius, bảo quản giống virus

(Theo quy địnhcủa OIE: http://www.oie.int/)

3- Phương pháp tách chiết và tinh sạch ARN hệ gen của virus Gumboro

ARN hệ gen đã được tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp sử dụng TRIZOL (Chomczynski và Sacchi, 1987) theo hướng dẫn của Hãng GIBCO/BRL và phương pháp sử dụng QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN Inc) Đo hàm lượng ARN bằng quang phổ (Spectrophotometer)

4- Phương pháp RT-PCR và phân tích kiểm tra thành phần “siêu biến đổi “ gen kháng nguyên VP2

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp PCR ngược (RT-PCR) một bước (one-step RT-PCR) của hãng Qiagen (QIAGEN Inc), bao gồm 2 giai đoạn: giai đoạn chuyển đổi biến ARN thành ADN (phản ứng RT) và nhân đoạn gen cần sử dụng (phản ứng PCR)

5- Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu tái tổ hợp làm vacxin ADN

Mồi đặc hiệu đã được là đoạn ADN ngắn (17-30 nucleotide) sử dụng từng cặp, cho phản ứng PCR hoặc RT-PCR Trong chuỗi nucleotide cả mồi, chúng tôi đã bố trí các điểm cắt của enzyme giới hạn để thao tác nối sản phẩm vào vectơ biểu hiện

6- Phương pháp thu nhận một phần hoặc toàn bộ gen VP2; một phần hoặc toàn

bộ phân đoạn A của Gumboro bằng phản ứng PCR ngược (RT-PCR)

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp RT-PCR 1 bước hoặc phản ứng PCR kết tiếp

để thu các đoạn gen và nối lại với nhau

7- Phương pháp thiết kế plasmid gốc chứa sản phẩm gen của từng chủng Gumboro

Plasmid gốc là pcDNA3.1(+) (Invitrogen Inc.) được chuyển nạp vào tế bào DH5α Khi thao tác tái tổ hợp, plasmid gốc pcDNA3.1(+) được cắt bằng các enzym giới

hạn thích hợp (EcoRI và NotI); các sản phẩm PCR phân đoạn hệ gen cũng được cắt

bằng các enzyme tương ứng và chúng được nối lại với nhau để tạo plasmid vectơ chứa gen kháng nguyên (gọi là plasmid giống gốc), đó là pG-VP2 (chứa gen VP2), đó là pG-VP2 (chứa gen VP2) và pG-A (chứa phân đoạn A)

Theo Sambrook và Russell (2001)

10- Phương pháp chuyển nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ

Theo Sambrook và Russell (2001)

11- Phương pháp chọn lọc plasmid tái tổ hợp

Theo Sambrook và Russell (2001)

12- Phương pháp tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp và kiểm tra sản phẩm

Theo phương pháp hấp thụ màng cột (spin column) của hãng QIAGEN Inc (Mỹ)

13- Phương pháp kiểm tra chuỗi gen phân tích thành nucleotide và amino acid

Sau khi chọn được plasmid tái tổ hợp có chứa ADN ngoại lai, tiến hành giải trình trình tự để kiểm tra thành phần nucleotide và amino acid của gen kháng nguyên

được tái tổ hợp vào Phân tích, so sánh đối chiếu, phải cần các chương trình máy tính chuyên biệt như SeqEd1.03; MacVector8.2; AssemblyLIGN1.9; GENEDOC2.5; MEGA3.1 và nhiều chương trình tin-sinh học khác

14- Phương pháp biểu hiện protein sản phẩm

Đã sử dụng plasmid pET và tế E coli (BL21(DE3)) biểu hiện protein tái hợp

Vp2 và kiểm tra theo Sambrook và Russell (2001)

15- Phương pháp tinh khiết ADN plasmid tái tổ hợp và kiểm tra các chỉ tiêu tinh sạch

Tinh sạch plasmid bằng phương pháp cột lọc sử dụng các bộ kit của hãng QIAGEN (Qiaprep Mini và Mega Kit); hoặc/và kỹ thuật alkaline (Sambrook và Russell 2001), đảm bảo độ tinh sạch và sạch endotoxin

16- Phương pháp chọn lọc chất mang ADN plasmid tái tổ hợp

Thử nghiệm chất mang (PBS) theo phương pháp ở Chang và cs (2002; 2003),

đúng tiêu chuẩn OIE/WHO quy định

17- Phương pháp đưa ADN plasmid (vacxin ADN) vào gà thí nghiệm

Sử dụng phương pháp của Chang và cs (2002; 2003) là tiêm vào cơ ngực (cơ ức)

18- Phương pháp kiểm tra vô trùng và an toàn

Kiểm tra nấm, vi khuẩn, hàm lượng các hoạt chất ngoại lai Kiểm tra mức độ chịu đựng của gà thí nghiệm đối với liều vacxin

19- Phương pháp chọn lọc gen VP2 và phân đoạn A các chủng vacxin nhược độc hiện sử dụng tại Việt Nam

Phân nhóm, chọn lọc, phân lập và tái tổ hợp vào các plasmid khung để làm giống gốc

20- Phương pháp bố trí thí nghiệm vacxin ở phòng thí nghiệm và ở quy mô nhỏ

Gà mẫn cảm được chia lô, bố trí thí nghiệm theo dõi theo quy định (OIE/WHO)

Đưa vacxin, kiểm tra an toàn, vô trùng, hiệu lực và điều chỉnh cho phù hợp

21- Phương pháp kiểm tra hiệu lực vacxin

+ Kiểm tra hàm lượng kháng thể trung hoà IgG bằng phương pháp ELISA

Sau khi đưa vacxin vào cơ thể gà một thời gian (vài tuần), định kỳ lấy máu, kiểm tra kháng thể bằng phương pháp ELISA (kit của hãng IDEXX, Mỹ)

+ Kiểm tra miễn dịch bằng phương pháp tiêm nhắc nhở (2 lần)

Miễn dịch 2 lần bằng vacxin, rồi kiểm tra mức dộ miễn dịch bằng các phương pháp ELISA đã trình bày

+ Kiểm tra độ dài miễn dịch theo thời gian

Tiêm vacxin đa chủng lúc 1 và 14 ngày tuổi, lấy máu ở 1, 35, 56 và 77 ngày tuổi

để kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng ELISA

(Phương pháp chính sử dụng cho từng nội dung nghiên cứu được mô tả trong phần Báo

cáo kết quả thực hiện nội dung nghiên cứu đó Phương pháp cơ bản về sinh học phân

tử và huyết thanh học được giới thiệu trong Phụ lục I và II)

D Báo cáo các kết quả đạt được

D1 Kết quả thu thập nguyên liệu và thiết kế giống gốc

D1.1 Kết quả thu thập mẫu và tiếp truyền bệnh phẩm

D1.1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm Gumboro

Túi Fabricius có kích thước bằng hạt đỗ/lạc (tùy tuổi gà), có cấu tạo hình múi khế, nằm ngay dưới hậu môn Mẫu bệnh phẩm là túi Fabricius của gà mắc bệnh Gumboro đã được chẩn đoán là bị mắc bệnh bằng cách xem xét các triệu chứng lâm sàng và qua kiểm tra các bệnh tích đặc trưng của bệnh Sau đó, túi Fabricius được thu nhận và bảo quản ở nhiệt độ lạnh để chuyển về phòng thí nghiệm

Đây là cơ quan chứa nhiều virus nhất, có bệnh tích đặc trưng là sưng to, dễ cấu,

dễ bục, có nhiều dịch thẩm xuất màu vàng sáng giữa túi và màng bọc ngoài, khi cắt ra

có thể có xuất huyết điểm trên niêm mạc túi Với bệnh tích đặc trưng như vậy, chỉ cần 1mg túi cũng đủ cung cấp một lượng virus Gumboro đủ để tách chiết ARN của hệ gen thực hiện nghiên cứu phân tử Tại phòng thí nghiệm, túi Fabricius được bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi sử dụng

Trong nhiều trường hợp bệnh phẩm chứa ít virus, cần thiết phải tiếp truyền virus Gumboro qua phôi hoặc/và gà mẫn cảm Mục đích tiếp truyền là nhân virus có trong bệnh phẩm lên để có nguồn nguyên liệu nghiên cứu, chủ yếu thực hiện tiếp truyền trên phôi (thu phôi hoặc nước trứng có trong xoang niệu mô) hoặc sau khi gây bệnh gà mẫn cảm rồi thu túi Fabricius có bệnh tích đặc trưng

Kết quả thu mẫu:

i) Đã thu được 90 mẫu bệnh phẩm chứa virus Gumboro cường độc từ các vùng

địa lý khác nhau, bao gồm:

Các tỉnh phía Bắc: Hà Nội (các vùng Thanh Trì, Gia Lâm, Đông Anh), Hải

Dương, Hưng Yên, Hà Tây

Các tỉnh miền Trung: Thừa Thiên-Huế (nhiều vùng), Quảng Trị

Các tỉnh phía Nam: Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bình Dương, Tiền

Giang, Đồng Tháp, Long An, Tây Ninh, Sóc Trăng

ii) Chúng tôi cũng đã thu được các mẫu vacxin chứa virus Gumboro nhược độc bao gồm vacxin trong nước sản xuất và vacxin nhập từ nước ngoài vào

Vacxin trong nước: Vacxin nhược độc Gumboro do Công ty thuốc Thú y Trung

ương II (NAVETCO) sản xuất

Vacxin nước ngoài: Vacxin nhược độc Gumboro chứa chủng 2512 (Mỹ) và

vacxin nhược độc chứa chủng Blue (Mỹ)

D1.1.2 Kết quả tiếp truyền virus Gumboro trên phôi và gà mẫn cảm

Xử lý bệnh phẩm trước tiếp truyền

Túi Fabricius bệnh phẩm thu từ gà bệnh đang được bảo quản ở -20°C (chứa

virus cường độc Gumboro) được cắt thành miếng nhỏ cho vào cối nghiền nhuyễn với

nước sinh lý theo tỷ lệ 1:1 (1g túi trong 1ml nước sinh lý) Huyễn dịch được bổ sung

thêm penicillin (1000UI/ml) và streptomycin (1mg/ml) để diệt vi khuẩn và chloroform

với tỷ lệ 1/10 để diệt virus mẫn cảm với chloroform Huyễn dịch được đông tan 3 lần ở

-20°C để virus được giải phóng hoàn toàn ra khỏi tế bào, sau đó ly tâm với tốc độ 5000

vòng/phút trong 10 phút Bỏ cặn, thu dịch nổi Đây chính là huyễn dịch chứa virus

(viral supernatant) dùng để tiếp truyền

Kết quả tiếp truyền vào phôi gà 9-10 ngày tuổi

Sử dụng trứng gà có phôi khoảng 9-10 ngày tuổi, phát triển tốt Soi trứng đánh

dấu buồng hơi, đầu thai Sát trùng vỏ trứng bằng cồn Iốt 5%, đục lỗ ở đỉnh buồng hơi,

tiêm mỗi phôi 0,2 ml huyễn dịch có chứa virus Gumboro vào xoang niệu mô, hàn kín

bằng parafin nóng chảy, tiếp tục ấp trứng ở 37oC Soi trứng lúc 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ

sau khi gây nhiễm, ghi lại số phôi bị chết ở các giờ và mổ khám kiểm tra bệnh tích

phôi Thu nước trứng của phôi sau 72 giờ tiêm truyền, bệnh tích đặc trưng xuất huyết

trên phôi (Bảng D-1)

Bảng D-1 : Bố trí gây nhiễm và kết quả tiếp truyền virus cường độc Gumboro phân lập

tại Bình Dương trên gà và phôi mẫn cảm bằng phương pháp kiểm tra bệnh tích và phản

Dương tính (+)

Âm tính (-)

4 4 Lô gà gây nhiễm* 5

2 2 Lô phôi gây nhiễm** 10

Ghi chú: *Đánh giá bệnh tích túi Fabricius; **Đánh giá bệnh tích xuất huyết phôi Phản ứng RT-PCR

thực hiện với tất cả mẫu gây nhiễm (gà và phôi); # Chỉ thực hiện RT-PCR với 1 mẫu đối chứng đại diện của gà và

của phôi

Kết quả tiếp truyền virus Gumboro qua gà mẫn cảm

Gà mẫn cảm được xác định là gà không có kháng thể Gumboro bằng phản ứng

khuếch tán trong thạch (AGP = Agar Gel Precipitation) (Phụ lục II)

Lấy 0,2 ml huyễn dịch chứa virus nhỏ vào mắt, mũi, hậu môn cho gà mẫn cảm 3

tuần tuổi Nhỏ làm 2 lần, mỗi lần cách nhau 3 giờ Lô đối chứng không gây nhiễm

Kiểm tra gà thường xuyên ở các khoảng thời gian 24, 48 và 72 giờ sau gây nhiễm Sau

3 ngày, quan sát triệu chứng lâm sàng và giết mổ để kiểm tra bệnh tích túi Fabricius Dựa vào triệu chứng và đặc biệt là bệnh tích của túi Fabricius trên gà mẫn cảm đã tiếp truyền để xác nhận sự có mặt của virus Gumboro Thu túi Fabricius nguyên vẹn có bệnh tích đặc trưng và cất giữ ở -20°C, cho đến khi sử dụng (Bảng D-1)

D1.2 Kết quả phân tích và chọn lọc chủng đại diện

D1.2.1 Bố trí nghiên cứu chọn lọc chủng cung cấp nguồn gen

D1.2.1.1 Chọn gen kháng nguyên

Gen VP2 trong phân đoạn A của hệ gen virus Gumboro có vùng "siêu biến đổi"

được chọn làm đích phân tích và chọn lọc chủng có thành phần kháng nguyên phù hợp

Cặp mồi GF-GR bám ở hai đầu vùng "siêu biến đổi", nhân đoạn VP2 cho sản phẩm có

độ dài 474 nucleotide Với cặp mồi GF-GR, chúng tôi thực hiện phản ứng RT-PCR

vùng "siêu biến đổi" với tất cả mẫu bệnh phẩm thu thập, giải trình trình tự và phân tích

thành phần nucleotide và amino acid của đoạn gen VP2 này

Hình D-1. Sơ đồ thu nhận vùng "siêu biến đổi" hoặc toàn bộ gen VP2, 2 nửa phân

đoạn A (SegA1 và SegA2) bằng phản ứng RT-PCR và minh họa vị trí các gen trong phân đoạn A và B của virus Gumboro

Sau khi phân tích, sàng lọc và chọn được các chủng có thành phần gen VP2

đồng nhất (về epitope kháng nguyên trong vùng "siêu biến đổi") theo từng nhóm làm

GVF(Kz1) GVF(Kz2)

GVF(Kz1) GVF(Kz2)