Luận án tiến sĩ đặc điểm thành thục sinh dục và ứng dụng hormon steroid trong sinh sản nhân tạo cá rô biển (pristolepis fasciata bleeker, 1851)

Mục tiêu của luận án là nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản và các chỉ tiêu sinh lý của cá rô biển, làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng quy trình sản xuất giống nhân tạo đối tượng này

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

PHAN PHƯƠNG LOAN

ĐẶC ĐIỂM THÀNH THỤC SINH DỤC VÀ ỨNG DỤNG HORMON STEROID TRONG

SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ RÔ BIỂN

Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

PHAN PHƯƠNG LOAN

ĐẶC ĐIỂM THÀNH THỤC SINH DỤC VÀ ỨNG DỤNG HORMON STEROID TRONG

SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ RÔ BIỂN

Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS PHẠM THANH LIÊM

TS BÙI MINH TÂM

2016

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn

- Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông Nghiệp – TNTN, Phòng Quản trị Thiết bị, Bộ môn Thuỷ Sản, Trường Đại học An Giang cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi tham gia học tập và triển khai thực hiện nghiên cứu tại trường

- Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học, Phòng Quản lý khoa học cùng tất cả quý Thầy Cô Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại học Cần Thơ đã quan tâm và giúp tôi tham gia và hoàn thành chương trình học tập dành cho nghiên cứu sinh

- Ban Giám đốc, Phòng Quản lý Khoa học - Sở Khoa học & Công nghệ Tỉnh An Giang đã hỗ trợ kinh phí thực hiện một số nội dung trong luận án Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Thanh Liêm và TS Bùi Minh Tâm đã tận tình hướng dẫn về khoa học, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tôi rất biết ơn sự giúp đỡ chân tình của quý Thầy Cô trong và ngoài cơ

sở đào tạo: PGS.TS Nguyễn Tường Anh, ThS Nguyễn Văn Tư, PGS.TS Lam Mỹ Lan, TS Dương Thúy Yên, TS Lý Văn Khánh, TS Lê Quốc Việt, ThS Nguyễn Thị Kim Hà, ThS Lê Công Quyền cùng tất cả quý Thầy Cô trong Khoa Thủy Sản đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu,

và nhiệt tình hỗ trợ tôi trong thời gian tham gia học tập và hoàn thành luận án Xin cảm ơn GS.TS Nguyễn Anh Tuấn, PGS.TS Trương Quốc Phú, TS Phạm Trường Yên, PGS.TS Nguyễn Văn Kiểm, TS Nguyễn Tuần và PGS.TS Đỗ Thị Thanh Hương đã có những góp ý chân thành và sâu sắc các nội dung trong luận án ở Hội đồng bảo vệ luận án cấp cơ sở

Cuối cùng, là lời cảm ơn đến gia đình đã động viên và hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Xin ghi nhận và cảm ơn tất cả mọi người đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ

để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập và nghiên cứu của mình

Xin trân trọng cảm ơn!

TÓM TẮT

Nghiên cứu “Đặc điểm thành thục sinh dục và ứng dụng hormon steroid

trong sinh sản nhân tạo cá rô biển Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851)” được

thực hiện tại Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại học Cần Thơ và Khoa Nông Nghiệp

- Tài Nguyên Thiên Nhiên, Trường Đại học An Giang trong thời gian từ năm 2011-2014 Mục tiêu của luận án là nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản và các chỉ tiêu sinh lý của cá rô biển, làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng quy trình sản xuất giống nhân tạo đối tượng này; đồng thời so sánh tác dụng và xác định loại, liều lượng các hormon steroid (17,20P; 17P và P) với chất kích thích sinh sản thông thường (HCG và LRH-A+DOM) trong sinh sản nhân tạo cá rô biển

Mẫu cá rô biển dùng để nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản được thu ngoài tự nhiên dọc theo tuyến sông Hậu thuộc địa bàn Tỉnh An Giang Cá được đánh bắt từ các đống chà và với các ngư cụ như cào, dớn, lưới bén, lú… của ngư dân Mẫu cá cũng được thu tại các điểm chợ trên địa bàn Định kỳ thu mẫu một lần/tháng và thu khoảng 30 cá thể ở các cỡ khác nhau trong suốt 12 tháng Kết quả nghiên cứu cho thấy, cá rô biển bắt đầu thành thục sinh dục khi đạt chiều dài 11,68 cm Tỷ lệ đực:cái trong mẫu cá rô biển thu ở địa bàn tỉnh

An Giang là 1:1,58 Hệ số thành thục của cá rô biển cái vào mùa sinh sản cao nhất đạt 14,68% và ở cá rô biển đực là 4,75% Mùa vụ sinh sản của cá rô biển chủ yếu tập trung vào các tháng 5, 6, 7, 8 dương lịch Sức sinh sản tương đối trung bình của cá rô biển là 453.314 trứng/kg và sức sinh sản tuyệt đối đạt 41.884 trứng/cá cái

Kết quả nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý cá rô biển cái cho thấy, quá trình phát triển tuyến sinh dục chịu sự tác động bởi nguồn protein từ cơ và gan Hàm lượng vitellogenin ở cá rô biển cao (74,01-148,42 µg ALP/mg protein) và thay đổi theo từng giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục Hàm lượng protein trong

cơ và gan cá rô biển đực trong khoảng từ 22,4-32,4 và 39,3-53,2 mg protein/g mẫu tươi và không chịu ảnh hưởng bởi sự phát triển của tuyến sinh dục

Nghiên cứu nuôi vỗ cá rô biển trong giai lưới đặt trong ao đất với mật độ 0,5 kg/m2 bằng 3 loại thức ăn là cá tạp, thức ăn công nghiệp 35% protein và cá tạp kết hợp thức ăn công nghiệp (tỷ lệ 50%:50% theo khối lượng) Kết quả nghiên cứu cho biết, cá rô biển thành thục sinh dục tốt trong điều kiện nuôi vỗ

và không có sự khác biệt về hệ số thành thục sinh dục khi cá được cho ăn bằng các loại thức ăn trên

Nghiên cứu khả năng gây chín noãn bào cá rô biển bằng 3 loại hormon steroid 17,20P; 17P và P được thực hiện trên cá đã nuôi vỗ thành thục sinh dục

(tuyến sinh dục giai đoạn IV), khối lượng từ 50-100 g/con Cá cái được tiêm 17,20P với liều lượng 3, 4 và 5 mg/kg cá; 17P với liều 7, 10 và 15 mg/kg cá và

P với liều 10, 15 và 20 mg/kg cá Kết quả nghiên cứu xác định được cả 3 loại steroid C21 trên đều gây chín noãn bào cá rô biển; trong đó, 17,20P có hiệu quả cao nhất ở liều 5 mg/kg, 17P ở liều 10 mg/kg và P ở liều 15 mg/kg cá cái với

tỷ lệ noãn bào chín có giá trị lần lượt là 92,22%, 75,55% và 73,33% Nghiên cứu cũng đã chứng minh, cá rô biển khi được kích thích sinh sản trong liều quyết định bằng 17,20P, 17P và P sau liều sơ bộ bằng HCG hoặc LRH-

A3+DOM đều đạt hiệu quả sản xuất; trong đó 17,20P ở liều 5 mg/kg cá cái có hiệu quả nhất với tỷ lệ cá đẻ đạt 86,67%

Quá trình phát triển của cá rô biển giai đoạn phôi đến 30 ngày tuổi chỉ ra rằng; trong điều kiện nhiệt độ dao động từ 27-31oC, pH 6,8-7,0 và hàm lượng ôxy hòa tan từ 5 ppm trở lên thì thời gian phát triển phôi của cá từ 13-14 giờ

Cá mới nở có chiều dài trung bình 1,84±0,02 mm Thời gian cá dinh dưỡng bằng noãn hoàng là 72 giờ; sau khi hết noãn hoàng, cá có chiều dài trung bình 3,17±0,08 mm, cỡ miệng ở 90o là 382,96±56,53 µm Ống tiêu hoá của cá rô biển có thể phân biệt được xoang miệng, thực quản, dạ dày và ruột khi cá được

3 ngày tuổi và ống tiêu hóa phát triển hoàn chỉnh giống cá trưởng thành ở thời điểm 20 ngày tuổi

Nhiệt độ dưới và trên gây chết cá rô biển lần lượt là 15,2-15,7oC và 42,9oC; ngưỡng ôxy và tiêu hao oxygen của cá rô biển có xu hướng giảm dần theo ngày tuổi, ngưỡng ôxy và tiêu hao oxygen dao động trong khoảng từ 0,80

40,3-mg O2/L và 2,34 mg O2/g.giờ (cá 1 ngày tuổi) đến 0,54 mg O2/L và 0,26 mg

O2/g.giờ (cá 30 ngày tuổi) pH cao và thấp gây chết cá rô biển nằm trong khoảng 9,0-9,6 và 3,0-3,4 Độ mặn gây chết của cá rô biển nằm trong khoảng 11,1-11,8‰

ABSTRACT

Study on the "Characteristics of sexual maturity and application of

steroid hormones in artificial propagation of Malayan leaffish Pristolepis

fasciata (Bleeker, 1851)" was carried out at the College of Aquaculture and

Fisheries - Can Tho University and the College of Agriculture and Natural Resources - An Giang University from 2011 to 2014 Main objectives of the study were to investigate the biologically reproductive characteristics and physiological parameters in order to provide basic scientific data for establishing the procedure of artificial seed production of Malayan leaffish, as well as to find out suitable method and dosage of steroid hormones (17,20P, 17P and P) in comparison with traditional reproductive stimulants (HCG and LRH-A+DOM) for induced spawning the fish

Malayan leaffish used for biologically reproductive study was collected from the wild along the Hau River of An Giang province Fish samples were caught from piles of scrub along the river and by a variety of fishing tools such as bottom trawl net, fixed net, gillnet, fykes and traps The samples were also collected in fish markets Thirty fish at different size were collected

monthly for 12 months Results showed that P fasciata reached first sexual

maturity at a length of 11.68 cm The female-male ratio of the samples in An Giang area was 1:1.58 Highest gonado-somatic index (GSI) of female and male fish in spawning season reached up to 14.68% and 4.75%, respectively Main spawning season was in first half of rainy season, from May to August yearly Average relative fecundity of the females was 453,314 eggs/kg and absolute fecundity was 41,884 eggs/female

Results on biologically reproductive characteristics showed that ovary development was affected by protein sources from muscle and liver The concentration of vitellogenin was high, ranged from 74.01 to 148.42 µg ALP/mg protein and varied according to the stages of ovary development The protein concentration in muscle and liver of male fish ranged from 22.4 to 32.4 and from 39.3 to 53.2 mg protein/g, respectively These values were not affected by stage of testis development

For broodstock rearing, breeders were stocked in hapas suspended in earthen ponds at the density of 0.5 kg/m2 and fed with three different types of feed namely trash fish, commercial pellet (containing of 35% crude protein), and the combination of 50% trash fish and 50% commercial pellet It was

found that P fasciata could reach fully sexual maturity in the captive

conditions There was no statistical difference in the GSI of the breeder groups fed with three different types of feed

The study on ability of final oocyte maturation (FOM) induced by three steroid hormones namely 17.20P, 17P and P was carried out on matured female fish (stage IV of gonad development) having body weight of 50-100 g reared in captive conditions The females were injected with 17.20P (3, 4, 5 mg/kg), 17P (7, 10, 15 mg/kg), and P (10, 15, 20 mg/kg), respectively Results revealed that all three types of steroid C21 hormones could induce FOM; of which 17,20P showed highest effectiveness at the dose of 5 mg/kg; 17P at the dose of 10 mg/kg; and P at the dose of 15 mg/kg with a FOM rate of 92.22%, 75.55% and 73.33%, respectively The study also pointed out that successfully induced spawning by using 17.20P, 17P or P after a preliminary injection of HCG or LRH-A+DOM was achieved and satisfied practical production requirements Particularly, the dose of 5 mg/kg of 17.20P was the most effectiveness among steroid treatments with an ovulation rate of 86.67%

The early ontogeny of P fasciata showed that embryonic development

took place about 13-14 hours at water temperature of 27-31oC, pH of 6.8-7.0 and dissolved oxygen concentration of 5 ppm or higher Newly hatched larvae were 1.84±0.02 mm in body length Within 72 hours after hatching, larvae reached 3.17±0.08 mm in mean body length; mouth gape (at angle of 90o) was 382.96±56.53 µm; and yolk was completely consumed Three days post hatching, four parts of digestive tract could be distinguished as buccal pharynx, oesophagus, stomach and intestine The digestive tract reached full function at the day of 20th post hatching

Lower and upper lethal temperatures of P fasciata were 15.2-15.7oC and 40.3-42.9oC, respectively There was a negative relationship between dissolved oxygen threshold and oxygen consumption, and age Dissolved oxygen threshold was of 0.80-0.54 mg /L and dissolved oxygen consumption was of 2.34 mg /g.h (1-day old fish) to 0.26 mg /g.h (30-day old fish) Low and high lethal pH values of the fish were 9.0-9.6 and 3.0-3.4, respectively Lethal salinity of the fish was 11.1-11.8‰

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên

cứu của tôi trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học cấp tỉnh về “Nghiên

cứu kỹ thuật sản xuất giống cá rô biển (Pristolepis fasciata) tại An Giang”

từ nguồn kinh phí của Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh An Giang Tất cả các

số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng công bố trong luận án cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày tháng năm 2016

Tác giả

PHAN PHƯƠNG LOAN

MỤC LỤC

Trang

2.6 Kỹ thuật mô học và các ứng dụng trong nghiên cứu mô học trên cá 35

3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản cá rô biển 45

3.3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý sinh sản cá rô biển 47

3.3.3 Nghiên cứu nuôi vỗ thành thục sinh dục cá rô biển bằng các loại thức ăn

3.3.5.1 Quá trình phát triển phôi, thời gian cá dinh dưỡng bằng noãn hoàng,

3.3.5.2 Nghiên cứu sự phát triển ống tiêu hoá từ giai đoạn ấu trùng đến 30

3.3.5.3 Khả năng chịu đựng của cá giai đoạn ấu trùng đến 30 ngày tuổi đối

4.1 Một số đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển 64

4.1.2 Tỷ lệ đực cái, khối lượng, chiều dài của cá qua các tháng thu mẫu 65 4.1.3 Đặc điểm hình thái tuyến sinh dục cá rô biển cái và đực 67 4.1.3.1 Đặc điểm tuyến sinh dục cái (buồng trứng) 67 4.1.3.2 Đặc điểm tuyến sinh dục đực (buồng tinh) 69 4.1.4 Sự biến đổi giai đoạn thành thục sinh dục cá rô biển đực và cái qua các

4.1.4.1 Sự quan hệ giữa giai đoạn thành thục sinh dục và kích thước cá cái

4.1.4.2 Sự biến đổi giai đoạn thành thục sinh dục cá cái theo thời gian 72 4.1.4.3 Sự quan hệ giữa giai đoạn thành thục sinh dục và kích thước cá đực

4.1.4.4 Sự biến đổi giai đoạn thành thục sinh dục cá đực theo thời gian 75 4.1.5 Sự biến đổi hệ số thành thục (GSI) của cá rô biển cái và đực qua các

4.1.6 Chiều dài thành thục lần đầu của cá rô biển 78

4.1.7 Sức sinh sản và sự biến đổi đường kính trứng của cá rô biển 79 4.2 Một số đặc điểm sinh lý sinh sản của cá rô biển 82 4.2.1 Mối tương quan giữa khối lượng và chiều dài 82 4.2.2 Biến đổi tỷ lệ huyết cầu (Hematocrit), số lượng hồng cầu và thể tích trung bình hồng cầu (MCV) theo các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục

4.2.3 Biến đổi hàm lượng protein trong gan và cơ theo các giai đoạn phát triển

4.2.4 Biến đổi hàm lượng phosphate protein huyết tương (vitellogenin) của cá

rô biển cái qua các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục 89

4.3 Ảnh hưởng của thức ăn nuôi vỗ đến sự thành thục sinh dục cá rô biển 91 4.3.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình nuôi vỗ thành thục sinh dục cá rô biển 91

4.3.2 Sự thành thục sinh dục của cá rô biển trong quá trình nuôi vỗ 93

4.3.2.1 Biến động giai đoạn thành thục sinh dục của cá rô biển cái theo thời gian nuôi vỗ 93

4.3.2.2 Biến động hệ số thành thục sinh dục của cá rô biển cái theo thời gian nuôi vỗ 95

4.3.2.3 Biến động đường kính noãn bào cá rô biển theo thời gian nuôi vỗ 94 4.3.3 Nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá rô biển bằng hormon steroid 97

4.3.3.1 Ảnh hưởng của các loại steroid lên quá trình chín noãn bào cá rô biển 97

4.3.3.2 Kết quả kích thích sinh sản cá rô biển bằng 17,20P; 17P và P trong liều tiêm quyết định với liều sơ bộ bằng HCG 103

4.3.3.3 Kết quả kích thích sinh sản cá rô biển bằng 17,20P; 17P và P trong liều tiêm quyết định với liều sơ bộ bằng LRH-A3+DOM 106

4.3.4 Quá trình phát triển phôi, thời gian cá dinh dưỡng bằng noãn hoàng, kích cỡ miệng và chiều dài cá 109

4.3.4.1 Quá trình phát triển phôi của cá rô biển 109

4.3.4.2 Thời gian cá dinh dưỡng bằng noãn hoàng 111

4.3.4.3 Kích cỡ miệng và chiều dài cá 112

4.4.4 Sự phát triển ống tiêu hoá của cá rô biển giai đoạn ấu trùng đến 30 ngày tuổi 114

4.4.4.1 Sự phát triển về hình thái ống tiêu hoá 114

4.4.4.2 Biến đổi về mô học trong quá trình phát triển của ống tiêu hoá 116

4.4.5 Khả năng chịu đựng của cá giai đoạn ấu trùng đến 30 ngày tuổi đối với một số yếu tố môi trường 125

4.4.5.1 Nhiệt độ cao và thấp gây chết cá 125

4.4.5.2 Ngưỡng ôxy và tiêu hao ôxygen 125

Bảng 3.3 Thử nghiệm đánh giá sự chín noãn bào ở cá rô biển với hormon

Bảng 3.4 Thử nghiệm đánh giá sự chín noãn bào ở cá rô biển với hormon

Bảng 3.5 Thử nghiệm đánh giá sự chín noãn bào ở cá rô biển với hormon

Bảng 3.6 Thí nghiệm kích thích sinh sản cá rô biển bằng 17,20P, 17P và P sau

Bảng 3.7 Thí nghiệm kích thích sinh sản cá rô biển bằng 17,20P, 17P và P sau

Bảng 4.1 Tỷ lệ (%) cá đực và cái cá rô biển qua các tháng thu mẫu 65 Bảng 4.2 Tỷ lệ (%) chiều dài tổng cộng của cá rô biển cái theo giai đoạn thành

Bảng 4.3 Tỷ lệ (%) chiều dài tổng cộng của cá rô biển đực theo giai đoạn thành

Bảng 4.4 Tỷ lệ huyết cầu, số lƣợng hồng cầu và thể tích trung bình hồng cầu ở các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục khác nhau của cá rô biển cái 84 Bảng 4.5 Tỷ lệ huyết cầu, số lƣợng hồng cầu và thể tích trung bình hồng cầu ở các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục khác nhau của cá rô biển đực 84 Bảng 4.6 Hàm lƣợng protein cơ và gan ở các giai đoạn phát triển tuyến sinh

Bảng 4.7 Hàm lƣợng protein cơ và gan ở các giai đoạn phát triển tuyến sinh

Bảng 4.8 Hàm lƣợng Vitellogenin ở các giai đoạn tuyến sinh dục cá rô biển

Bảng 4.13 Kết quả kích thích sinh sản cá rô biển bằng 17,20P; 17P, P trong liều quyết định sau liều sơ bộ bằng (LRH-A3+DOM) 106 Bảng 4.14 Quá trình phát triển phôi của rô biển (nhiệt độ 27-31oC) 110 Bảng 4.15 Thời gian và mức độ giảm đường kính noãn hoàng cá rô biển 112 Bảng 4.16 Tương quan giữa chiều dài cơ thể và cỡ miệng cá rô biển 113 Bảng 4.17 Nhiệt độ (oC) gây chết cá rô biển ở các ngày tuổi khác nhau 125 Bảng 4.18 Ngưỡng ôxy (mg O2/L) và tiêu hao ôxygen (mg O2/g.giờ) của cá rô

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.2 Sơ đồ cơ chế hormon điều khiển sự phát sinh noãn hoàng ở cá 8

Hình 2.3 Cơ chế hormon kiểm soát quá trình phát sinh noãn hoàng ở cá cái 14

Hình 2.4 Cơ chế hormon kiểm soát quá trình thành thục ở cá cái 15

Hình 2.5 Sơ đồ Trục não bộ - tuyến yên - buồng trứng với những hoạt chất tự

nhiên (bên trái) và những chất ngoại sinh (bên phải) có thể gây nên sự chín noãn

Hình 2.6 Các noãn bào của cá ngựa vằn Danio rerio không chín (cột bên trái), đã

chín (cột giữa) và đã rụng (cột bên phải) dưới tác động của các hormone steroid và

chất ức chế 27 27 Hình 2.7 Các chồi vị giác hình thành trên hàm trên (A) và vòm miệng (B) cá ngừ

vây xanh Thunnus orientalis 42 42

Hình 3.3 Hệ thống giai nuôi vỗ cá rô biển bố mẹ 49

Hình 3.4 Vi bụng cá đực (trái) và cá cái (phải) 49

Hình 3.5 Các loại hormon steroid sử dụng trong nghiên cứu 53

Hình 4.1 Hình dáng bên ngoài của cá rô biển đực và cái 65

Hình 4.2 Khối lượng trung bình của cá rô biển qua các tháng thu mẫu 66

Hình 4.3 Chiều dài tổng cộng trung bình của cá rô biển qua các tháng thu mẫu 66

Hình 4.4 Các giai đoạn phát triển của buồng trứng ở cá rô biển cái 68

Hình 4.5 Tổ chức mô học của buồng trứng qua các giai đoạn phát triển 68

Hình 4.6 Các giai đoạn phát triển của buồng tinh ở cá rô biển đực 69

Hình 4.7 Tổ chức mô học của buồng tinh qua các giai đoạn phát triển 69

Hình 4.8 Biến động giai đoạn thành thục sinh dục cá rô biển cái theo thời gian 72

Hình 4.9 Biến động giai đoạn thành thục sinh dục cá rô biển đực theo thời gian 75

Hình 4.10 Biến động hệ số thành thục cá rô biển theo thời gian 77

Hình 4.11 Đường cong thể hiện mối tương quan giữa tỷ lệ thành thục và chiều dài

Hình 4.12 Tương quan giữa sức sinh sản và khối lượng cơ thể cá rô biển cái 80

Hình 4.13 Tương quan giữa sức sinh sản và khối lượng buồng trứng cá rô biển cái

81 Hình 4.14 Tương quan gữa khối lượng (W) và chiều dài (L) cá rô biển cái 82

Hình 4.15 Tương quan gữa khối lượng (W) và chiều dài (L) cá rô biển đực 83

Hình 4.16 Đường kính noãn bào trước và sau khi tiêm hormon P 98

Hình 4.17 Đường kính noãn bào trước và sau khi tiêm hormon 17P 99

Hình 4.18 Đường kính noãn bào trước và sau khi tiêm hormon 17,20P 100

Hình 4.19 Noãn bào chưa chín với túi mầm chưa tan biến (trái) và noãn bào chín

với túi mầm đã tan biến (phải) 101

Hình 4.20 Tỷ lệ noãn bào tiêu biến nhân ở cá được tiêm các hormon steroid với

các liều khác nhau 101

Hình 4.21 Tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở và tỷ lệ sống của cá bột khi sinh sản bằng

hormon steroid sau liều sơ bộ bằng HCG 105 103 Hình 4.22 Tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở và tỷ lệ sống của cá bột khi sinh sản bằng

hormon steroid sau liều sơ bộ bằng LRH-A3+DOM 108

Hình 4.23 Các giai đoạn phát triển phôi của cá rô biển 111

Hình 4.24 Mối tương quan giữa chiều dài cơ thể và cỡ miệng cá rô biển 114

Hình 4.25 Minh họa biến đổi hình thái ống tiêu hóa cá rô biển theo ngày tuổi 115

Hình 4.26 Cá rô biển 4 ngày tuổi (bên trái) và cá 30 ngày tuổi (bên phải) 116

Hình 4.28 Hình cắt dọc cá rô biển 15 ngày tuổi 117

Hình 4.30 Thực quản cắt dọc của cá rô biển 3 ngày tuổi 119

Hình 4.31 Thực quản của cá rô biển 15 ngày tuổi 119

Hình 4.32 Hình dạ dày cắt ngang của cá rô biển 3 ngày tuổi 120

Hình 4.33 Ống tiêu hóa của cá rô biển 20 ngày tuổi 121

Hình 4.34 Dạ dày cắt ngang của cá rô biển 20 ngày tuổi 121

Hình 4.35 Tuyến dạ dày cá rô biển ở 20 ngày tuổi 121

Hình 4.36 Ruột cắt ngang cá rô biển 6 ngày tuổi 122

Hình 4.37 Ruột cắt dọc cá rô biển 7 ngày tuổi 123

Hình 4.38 Ruột cá rô biển 20 ngày tuổi 123

Hình 4.39 Hình cắt ngang ống tiêu hóa ở cá rô biển 9 ngày tuổi 124

Hình 4.40 Trực tràng cắt ngang ở cá rô biển 9 ngày tuổi 124

FPG fish pituitary gland (não thùy thể cá)

FOM final oocyte maturation (sự chín noãn bào cuối cùng)

FSH follicle stimulating hormone (hormon kích thích nang trứng)

GĐTT giai đoạn thành thục

GSI gonadosomatic index (hệ số thành thục)

GnRH gonadotropin-releasing hormone (hormon giải phóng kích dục tố)

GnRH-A gonadotropin-releasing hormone analogue (chất đồng dạng của GnRH) mGnRH-A mammal GnRH-A (chất đồng dạng của GnRH động vật hữu nhũ)

sGnRH-A salmon GnRH-A (chất đồng dạng của GnRH cá hồi)

GRIF gonadotropin releasing inhibiting factor (yếu tố ức chế giải phóng kích

dục tố) GtH gonadotropic hormone (kích dục tố)

GV germinal vesicle (màng nhân hay túi mầm)

GVBD germinal vesicle breakdown (sự tan màng nhân hay túi mầm)

HCG human chorionic gonadotropin (kích dục tố nhau thai người)

IU international unit (đơn vị quốc tế)

KDT kích dục tố

LH luteinizing hormone (hormon hoàng thể hóa)

LHRH/LRH luteinizing hormone-releasing hormone (hormon giải phóng LH)

LHRH-A luteinizing hormone-releasing hormone analogue (chất đồng dạng của

LHRH) MIH maturation-inducing hormone (hormon gây chín)

MIS maturation-inducing steroid (steroid gây chín)

MPF maturation-promoting factor (yếu tố thúc đẩy chín)

PMS pregnant mare serum (huyết thanh ngựa chửa)

SG salmon gonadotropin (kích dục tố cá hồi)

Vtg vitellogenin

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Trong vài thập kỷ gần đây, ngành nuôi trồng thủy sản của Việt Nam có

sự phát triển vượt bậc Việc áp dụng công nghệ nuôi tiên tiến, cùng với quan trắc về bệnh và môi trường được chú trọng đã thúc đẩy ngành nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh mẽ, đặc biệt với các đối tượng tôm biển và cá da trơn Tuy nhiên, có nhiều vấn đề đang được đặt ra cho sự phát triển nuôi trồng thủy sản bền vững là đáp ứng được yêu cầu năng suất ngày càng cao nhưng chất lượng sản phẩm ngày càng tốt về an toàn thực phẩm, phát triển các đối tượng nuôi mới có năng suất cao nhưng vẫn bảo vệ được nguồn lợi các loài bản địa (Nguyễn Quang Linh, 2011)

Ngày nay, nuôi trồng thủy sản nước ta cũng đang đối mặt với tình hình biến đổi khí hậu làm cho trái đất ấm dần lên và mực nước biển dâng cao dẫn đến tình trạng xâm nhập mặn trong các sông ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) ngày càng sâu và điều này ảnh hưởng không nhỏ đến nuôi trồng thuỷ sản nước ngọt Chính vì vậy, việc phát triển đối tượng nuôi mới phù hợp với tình hình ―mặn hóa‖ các nguồn nước ngọt hiện nay cũng là một trong những giải pháp thích ứng với tình hình biến đổi khí hậu Trong các năm qua, ngành thủy sản nước ta đã có nhiều nghiên cứu để phát triển các loài thủy sản nuôi mới, trong đó có các loài cá bản địa có triển vọng về kinh tế (Huỳnh Kim Anh, 2013)

Cá rô biển Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851) là loài cá bản địa đặc

trưng của miền Nam, Việt Nam Đây là loài rộng muối, phân bố cả trong nước ngọt và lợ Người nội trợ ở ĐBSCL thích chọn cá rô biển cho các bữa ăn hàng ngày vì cá có phẩm chất thịt ngon, không có xương giăm Tuy nhiên, trong vài năm gần đây đối tượng này ngày càng trở nên khan hiếm do tình trạng lạm dụng khai thác của ngư dân nên không đủ đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng Giá bán hiện tại trên thị trường của cá rô biển khá cao, từ 120.000-150.000 đồng/kg ở kích cỡ 10-12 con/kg (Phan Phương Loan, 2014) Chính vì vậy, cá rô biển sẽ là đối tượng rất có tiềm năng để phát triển nuôi trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản khắp cả nước trong điều kiện hiện nay

Để có thể đưa cá rô biển trở thành đối tượng nuôi quan trọng trong tương lai thì việc sản xuất ra con giống nhân tạo đủ về số lượng và tốt về chất lượng

là yêu cầu đầu tiên Hiện nay, các công trình nghiên cứu về cá rô biển được công bố còn rất hạn chế, chủ yếu về mô tả đặc điểm hình thái và phân loại (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993; Rainboth, 1996; Fisbase, 2014) Để phát triển nuôi cá rô biển trong tương lai thì cần có nhiều nghiên cứu

sâu hơn về đặc điểm sinh học, đặc biệt về sinh lý sinh sản, về sự phát triển của

cá bột, về các biện pháp thuần dưỡng, nuôi vỗ cá bố mẹ, kích thích sinh sản nhân tạo, ương giống,…

Hiện nay, trong nghiên cứu và thực tế sinh sản nhân tạo các loài cá ở Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng, các chất kích thích sinh sản có nguồn gốc

tự nhiên như kích dục tố trong não thùy thể cá và chế phẩm HCG (Human Chorionic Gonadotropin) hoặc những chất được tổng hợp từ công nghệ sinh học như LHRHa (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone analogue) của Trung Quốc hay sản phẩm tương tự là Buserelin của Đức và Ovaprim của Canada thường được sử dụng (Nguyễn Tường Anh, 1997)

Ngoài những chất kích thích sinh sản trên, một số nghiên cứu sinh sản nhân tạo trong và ngoài nước trên cá cho thấy các hormon steroid C21

có hiệu

quả gây chín và rụng trứng ở quy mô thí nghiệm in vitro hoặc sản xuất Ưu

điểm của việc dùng các hormon steroid như progesteron (P), 17 - hydroxyprogesteron (17P) và 17α, 20β-dihydroxyprogesteron (17,20P) là dễ xác định được chính xác liều lượng, có hoạt tính cao, dễ bảo quản (không bị hư

ở nhiệt độ cao, không bị phân hủy bởi vi khuẩn và nấm) và cho tỷ lệ chín và rụng trứng khá tốt Bên cạnh đó, khi sử dụng các loại hormon steroid trên cá cho tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở cao, tương đương với sử dụng kích dục tố, LHRHa; đặc biệt là cá bố mẹ sau khi sinh sản có thời gian tái thành thục ngắn và chi phí trong sinh sản nhân tạo cá thấp hơn hoặc bằng so với việc dùng các chất kích thích sinh sản khác Vì vậy, nhóm hormon này rất có triển vọng bên cạnh các chất kích thích sinh sản truyền thống trong sản xuất giống cá (Nguyễn Tường Anh, 1999a)

Hiệu quả sử dụng các chất kích thích sinh sản trên các loài cá khác nhau cũng khác nhau Để có cơ sở dữ liệu nhằm đưa các hormon steroid vào thực tiễn sản xuất thì việc so sánh và đánh giá tác dụng gây chín và rụng trứng của chúng

so với các chất kích thích sinh sản thường được sử dụng hiện nay trên một đối tượng cụ thể là cần thiết Điều này cũng nhằm đa dạng hoá chất kích thích sinh sản trong sản xuất giống nhân tạo cá nói chung và cá rô biển nói riêng

Với các lý do trên, đề tài “Đặc điểm thành thục sinh dục và ứng dụng

hormon steroid trong sinh sản nhân tạo cá rô biển Pristolepis fasciata

(Bleeker, 1851)” được thực hiện

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát

Bổ sung dữ liệu khoa học về các đặc điểm sinh học của cá rô biển, về khả năng gây chín và rụng trứng của hormon steroid trên cá rô biển, cung cấp cơ

sở lý luận để phát triển quy trình sản xuất giống nhân tạo và nuôi thương phẩm

cá rô biển; từ đó góp phần đa dạng hóa đối tượng cá nuôi cho vùng Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng và cả nước nói chung

Mục tiêu cụ thể

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản và các chỉ tiêu sinh lý của cá rô biển làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng quy trình sản xuất giống nhân tạo đối tượng này

- So sánh tác dụng các hormon steroid (17,20P, 17P và P) với chất kích thích sinh sản thông thường (HCG và LHRHa+DOM) và xác định loại, liều lượng các hormon steroid trong kích thích sinh sản nhân tạo cá rô biển

1.3 Nội dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển

2 Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý của cá rô biển

3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn nuôi vỗ lên sự thành thục sinh dục của cá rô biển

4 Nghiên cứu xác định loại, liều lượng, phương pháp tiêm thích hợp hormon steroid kích thích cá rô biển chín và rụng trứng

5 Nghiên cứu sự phát triển của cá rô biển từ giai đoạn phôi đến 30 ngày tuổi bao gồm: quá trình phát triển phôi; sự phát triển ống tiêu hóa; xác định một số chỉ tiêu sinh lý như ngưỡng ôxy và cường độ tiêu hao ôxygen, nhiệt độ,

pH, độ mặn

1.4 Ý nghĩa của luận án

Về mặt khoa học, luận án cung cấp các kiến thức cơ bản về các đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển, cung cấp những số liệu khoa học về ảnh hưởng của các loại thức ăn đến sự thành thục sinh dục của cá khi được thuần dưỡng và nuôi trong ao đất Đặc biệt, các nghiên cứu trong luận án đã tìm ra được phương thức sử dụng hormon steroid trong sinh sản nhân tạo cá rô biển Bên cạnh đó, với kết quả nghiên cứu về sự phát triển ống tiêu hoá sẽ góp phần nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá trong quá trình ương giống Những kết luận của luận án sẽ là nguồn dữ liệu khoa học quan trọng góp phần hoàn thiện

quy trình sản xuất giống nhân tạo cá rô biển, tạo ra khả năng cung cấp con giống và góp phần đưa cá rô biển thành một đối tượng nuôi mới đầy tiềm năng

và hiệu quả kinh tế

1.5 Những điểm mới của luận án

Kết quả nghiên cứu của luận án đã có những đóng góp mới về lý thuyết

và ứng dụng trong sản xuất

- Cung cấp các dẫn liệu mới về các đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển như: xác định được chiều dài thành thục sinh dục đầu tiên của cá là 11,68 cm; hệ số thành thục sinh dục (cao nhất ở cá cái là 14,68%, ở cá đực là 4,75%); Sức sinh sản tương đối trung bình của cá rô biển là 453.514 trứng/kg và sức sinh sản tuyệt đối đạt 41.884 trứng/cá cái, mùa vụ sinh sản của cá rô biển tập trung vào các tháng 5, 6, 7 và 8 dương lịch Những dẫn liệu này làm cơ sở khoa học cho việc thuần dưỡng và hoàn thiện quy trình sản xuất giống nhân tạo đối tượng này

- Xác định được điều kiện nuôi cũng như loại thức ăn phù hợp trong việc nuôi vỗ thành thục sinh dục cá rô biển Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, cá rô biển thành thục sinh dục tốt khi được nuôi vỗ trong giai đặt trong ao đất với thức

ăn hoàn toàn là cá tạp, hoàn toàn là thức ăn công nghiệp 35% CP, hoặc kết hợp giữa thức ăn công nghiệp với cá tạp (tỷ lệ 50/50)

- Đã nghiên cứu sử dụng thành công 3 loại steroid là 17,20P; 17P và P để kích thích cá rô biển sinh sản, trong đó 17,20P có hiệu quả cao nhất ở liều 5

mg, 17P ở liều 10 mg và P ở liều 15 mg trên 1 kg cá cái; việc sử dụng các hormon steroid này trên cá rô biển là hoàn toàn mới

- Bên cạnh đó, luận án xác định được thời gian ấu trùng cá rô biển hoàn thiện quá trình phát triển ống tiêu hoá giống cá trưởng thành khi cá được 20 ngày tuổi; cũng như thời điểm cá ăn thức ăn bên ngoài vào ngày tuổi thứ ba, lúc này noãn hoàng chỉ còn một khối nhỏ Những kết quả này góp phần quan trọng trong việc ương giống thành công đối tượng này

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sinh học cá rô biển

2.1.1 Hình thái phân loại

Theo Rainboth (1996); Fishbase (2014) và Itis (2014) cá rô biển có vị trí phân loại như sau:

Loài: Pristolepis fasciata Bleeker, 1851

Cá rô biển có tên tiếng Anh là Malayan leaffish (Fishbase, 2014)

Hình 2.1 Hình thái cá rô biển

Cá rô biển có đầu lớn vừa, dẹp bên Mõm ngắn, nhọn Miệng giữa, rộng ngang, rạch miệng xiên, xương hàm trên kéo dài quá đường thẳng đứng kẻ từ

bờ trước của mắt nhưng chưa chạm đến đường thẳng đứng kẻ qua giữa mắt Răng nhỏ, nhọn Lưỡi ngắn, chót lưỡi hơi nhọn Mắt lớn nằm lệch về phía trên của đầu, gần chót mõm hơn gần điểm cuối nắp mang Phần trán giữa hai mắt cong lồi và nhỏ hơn đường kính mắt Cạnh dưới xương trước mắt có răng cưa nhọn Lỗ mang lớn, cạnh dưới và sau xương nắp mang trước có răng cưa nhỏ nhọn, xương nắp mang có hai gai dẹp Màng mang ở hai bên dính liền với nhau và phủ đầy vảy (Fisbase, 2014)

Cá có màu vàng nâu với 6-8 sọc đen trên cơ thể Thân cá dẹp bên Cuống đuôi rất ngắn, vảy lược phủ khắp thân và đầu Có nhiều vảy nhỏ phủ lên quá ½ gốc tia mềm vi lưng và vi hậu môn và phủ lên một phần gốc vi đuôi Đường bên gián đoạn ở ngang với tia phân nhánh thứ 10 của vi lưng và thụt xuống hai hàng vảy, đoạn sau của đường bên nằm trên trục giữa thân và chấm dứt ở khoảng giữa gốc vi đuôi (Fisbase, 2014)

2.1.2 Phân bố

Cá rô biển phân bố rộng, được tìm thấy ở Thái Lan, Miến Điện, Mã Lai, Lào, Campuchia, ĐBSCL Việt Nam và các quần đảo giữa Ấn Độ - Úc Châu (Kottelat, 1985; Fishbase, 2014)

Dựa trên kiến thức địa phương, Sokheng et al (1999) cho rằng cá rô biển

được tìm thấy phổ biến trong các hồ hơn so với nhánh chính của sông kông, đặc biệt là ở Campuchia Rainboth (1996) cho rằng cá rô biển hiện diện tại nơi nước chảy chậm hoặc nước đứng, bao gồm các hồ Trong dòng sông chính, loài này sống trong khu vực có gỗ và các bụi cây ngập dưới nước; từ đó

Mê-cá di chuyển vào những dòng suối nhỏ lúc bắt đầu mùa lũ Cá rô biển không di

cư theo chiều dọc nhưng có sự di chuyển ngang, từ sông Mê-kông đến các vùng ngập trong mùa lũ và di chuyển ngược trở lại lúc bắt đầu mùa khô Sự di

cư của cá được kích hoạt chủ yếu do sự thay đổi mực nước (Sokheng et al.,

1999)

Cá rô biển là loài cá nước ngọt, có thể sống trong nước lợ, có đặc tính sống đáy, thường bắt gặp ở thủy vực nước chảy chậm hoặc nước tĩnh; chúng sống ở các bụi rậm, nơi có nhiều chà, thực vật thủy sinh; pH từ 7,0-8,5; độ cứng 80-160 ppm, nhiệt độ từ 23-28o

C (Baensch and Riehl, 1991; Kottelat et

al., 1993; Kottelat, 1998; Riede, 2004) Ở Việt Nam, ấu trùng và cá nhỏ được

tìm thấy ở cả sông Tiền và sông Hậu (Nguyen et al., 2002; trích từ Baran et

al., 2007)

2.1.3 Tập tính dinh dƣỡng

Theo Nikolsky (1963), có sự tương quan giữa chiều dài ruột và tính ăn của cá Chiều dài tương đối của ruột (relative length of gut, RLG) là tỉ lệ giữa chiều dài ruột và chiều dài cơ thể (Li/Ls) Theo nhận định của Nikolsky (1963), những loài cá có tính ăn động vật sẽ có RLG <1; cá ăn tạp có RLG=1-

3 và ăn thực vật thì RLG>3 RLG của cá rô biển là 1,96 (Wongtirawatana, 1981) Điều này cho thấy, cá rô biển là loài ăn tạp Thành phần thức ăn được tìm thấy trong dạ dày cá rô biển là thực vật ở hình thức các loài tảo dạng sợi, các loài côn trùng và giáp xác, động vật thân mềm (Rainboth, 1996) Trong đó

động vật thân mềm chiếm khoảng 15-26% thức ăn trong dạ dày

(Wongtirawatana, 1981; Duangsawasdi et al.,1990)

Cá rô biển có các tấm răng hầu trên và dưới dùng để nghiền thức ăn thô

và các sinh vật thức ăn có vỏ cứng Hoạt động ăn mồi xảy ra mạnh nhất lúc 6

giờ sáng và thấp nhất lúc 10 giờ đêm (Duangsawasdi et al., 1990)

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng

Sinh trưởng của cá là quá trình gia tăng về kích thước và tích lũy thêm về khối lượng cơ thể trong sự thay đổi đều đặn của cá Quá trình này đặc trưng cho mỗi loài cá (Nikolsky, 1963) Các kết quả nghiên cứu về sinh trưởng của

cá rô biển trên thế giới và ở Việt Nam rất ít Theo Menon (1999), cá rô biển là loài có kích thước tương đối nhỏ Chiều dài tối đa mẫu cá biết được hiện nay

đối với con đực là 20 cm (Baran et al., 2007)

2.1.5 Đặc điểm sinh sản

Cá rô biển là loài thành thục sinh dục trong năm đầu tiên, kích thước cá

thành thục lần đầu là 12,9 cm (Baran et al., 2007) Mùa vụ sinh sản của cá rô

biển ngoài tự nhiên kéo dài từ tháng 3 đến tháng 10 dương lịch, tập trung chủ

yếu từ tháng 4 đến tháng 6 (Dumrongtripob et al., 1997; Sokheng et al., 1999)

Cá rô biển là loài đẻ trứng nổi; trứng có hình cầu, màu vàng Theo Singhapitukiet and Jermjitpong (1980), đường kính trứng cá rô biển dao động

từ 0,6-0,8 mm Tuy nhiên, theo Krachangdara (1994), đường kính trứng cá rô biển đạt từ 0,85-0,95 mm Trứng nở sau khoảng 22 giờ ở nhiệt độ 28-29oC

(Singhapitukiet and Jermjitpong, 1980; Chumnongsittathum et al., 1992)

Ngoài tự nhiên, cá rô biển tạo bọt trước khi đẻ trứng, bãi đẻ là những nơi có nhiều thực vật thủy sinh (Menon, 1999)

Tóm lại, các thông tin về đặc điểm sinh học của cá rô biển trên thế giới

và ở Việt Nam còn nhiều hạn chế, đặc biệt là sinh học sinh sản Các thông số

về mùa vụ sinh sản, hệ số thành thục, các kết quả về sức sinh sản tương đối, tuyệt đối chưa đầy đủ Để có cơ sở đưa cá rô biển vào thuần dưỡng và nuôi vỗ thành thục sinh dục cần có nghiên cứu về đặc điểm sinh học sinh sản của loài này

2.2 Quá trình phát sinh noãn hoàng (Vitellogenesis)

Vitellogenin (Vtg) là phân tử protein thuộc nhóm glycolipoprotein - tiền chất của noãn hoàng - có ở hầu hết các loài động vật đẻ trứng Quá trình phát sinh noãn hoàng trên cá, cần thiết cho quá trình tạo trứng, bao gồm sự tổng hợp Vtg trong gan, sự vận chuyển Vtg trong máu và sự kết nạp chất này từ máu vào noãn bào Vitellogenin của các loài cá khác nhau thì khác nhau và

thành phần chính của noãn hoàng của cá là các protein dẫn xuất của Vtg,

lipovitellin (Lv) và phosvitin (Pv) (Ohkubo et al., 2004, Sawaguchi et al.,

2005 và Sawaguchi et al., 2006) Theo Nguyễn Tường Anh (1999b) có thể

phát hiện Vtg trong máu cá sau hai giờ được tổng hợp Vitellogenin là một lipophosphoprotein – protein được phosphoryl hóa mạnh và giàu calcium – và

là tiền chất của noãn hoàng Tuy nhiên, trong các nghiên cứu về quá trình phát sinh noãn hoàng, kỹ thuật xác định hàm lượng ALP (alkali-labile phosphoprotein) và calcium thường được dùng như một phương pháp gián tiếp

để đánh giá hàm lượng Vtg trong huyết tương (Verslycke et al., 2002; LV et

al., 2007); trong đó hàm lượng ALP là chỉ dẫn tin cậy hơn (Nagler et al.,

1987; trích bởi Pottinger et al., 2005)

Sự tổng hợp Vtg ở gan cá xương được kiểm soát bởi hormon 17estradiol (E2) (Hình 2.2) và lượng Vtg được tổng hợp tỉ lệ thuận với liều E2được đưa vào cơ thể (Goncharov, 1977; trích bởi Nguyễn Tường Anh, 1999b)

-Hình 2.2 Sơ đồ cơ chế hormon điều khiển sự phát sinh noãn hoàng ở cá

(Follett et al., 1968; trích bởi Nguyễn Tường Anh và Phạm Quốc Hùng, 2011)

Quá trình phát sinh noãn hoàng cũng là một yêu cầu trong quá trình tạo trứng trên giáp xác Trong quá trình này, vitellogenin (Vtg), một tiền chất của protein noãn hoàng chính, vitellin (Vn), được tổng hợp và hấp thụ bởi các noãn bào Trong noãn bào, vitellogenin được biến đổi thành vitellin Vitellin được sử dụng như nguồn dinh dưỡng trong giai đoạn phát triển phôi Ở một số tôm, vitellin và vitellogenin là những phân tử lipoprotein lớn (trọng lượng

phân tử đạt 280–700 kDa) (Okumura, 2004; Chen et al., 1999 được trích bởi Revathi et al., 2012) Hàm lượng Vtg trong dịch máu cũng là chỉ dẫn tốt cho

sự khởi đầu của quá trình phát sinh noãn hoàng ở giai đoạn sớm của quá trình thành thục của buồng trứng Vị trí tổng hợp Vtg ở giáp xác bậc cao có thể là

buồng trứng, tuyến gan tụy hay cả hai (Tsukimura, 2001) Các nghiên cứu của

Lee and Chang (1997) và Titua et al (2006), trên tôm càng xanh tìm thấy Vtg

được tổng hợp trong tuyến gan tụy

Nghiên cứu cơ chế hormon kiểm soát quá trình phát sinh noãn hoàng trên giáp xác bậc cao đã tìm thấy trong tuyến nội tiết cuống mắt (tuyến xoang), sự hiện diện của hormon ức chế tuyến sinh dục (gonad-inhibiting hormone, GIH; cũng được gọi là hormon ức chế buồng trứng ovarian-inhibiting hormone, OIH hay hormon ức chế tổng hợp noãn hoàng vitellogenin-inhibiting hormone, VIH) - một hormon của cơ quan X, cũng như các hợp chất kích

thích tổng hợp noãn hoàng (vitellogenin-stimulating compounds) (Revathi et

al., 2012) Việc cắt mắt ở một thời điểm nào đó có thể làm giảm sự tiết GIH

và làm tăng quá trình tổng hợp Vtg (Wilder et al., 1994) Urtgama et al (2015) nhận thấy hàm lượng GIH trong cuống mắt tôm sú Penaeus monodon

cao khi buồng trứng ở giai đoạn 0 (chưa phát dục) và I Sau đó nồng độ GIH giảm khi buồng trứng phát triển và đạt thấp nhất khi buồng trứng đạt giai đoạn III thành thục sinh dục Các tác giả cũng tìm thấy tương quan nghịch giữa nồng độ GIH và Vtg trong dịch máu cũng như giữa nồng độ GIH trong dịch máu và Vn trong buồng trứng

Theo Pacoli et al (1990) hàm lượng Vtg ở cá nheo Mỹ Ictalurus

punctatus trưởng thành cao hơn cá hậu bị trên 12 tháng tuổi Hàm lượng Vtg

trong máu ở cá cái trước khi sinh sản (30,2 mg/mL) cao hơn so với cá đã sinh sản (3,79 mg/mL)

Ở cá Mrigal, theo nghiên cứu của Maitra et al (2007) thì hàm lượng Vtg

trong máu biến động tỷ lệ thuận với hệ số thành thục và đạt giá trị thấp nhất vào giai đoạn sau sinh sản

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Lệ Hoa (2009) trên lươn đồng (Monopterus

albus) cho biết hàm lượng Vtg trong huyết tương của lươn tăng theo giai đoạn

phát triển của buồng trứng và đạt cao nhất ở giai đoạn V là 6,21 µg ALP/mg protein đối với lươn tự nhiên và 2,4 µg ALP/mg protein đối với lươn nuôi vỗ

Ở cá đối Liza subviridis, hàm lượng Vtg trong máu ở cá cái tăng theo giai

đoạn phát triển của buồng trứng (từ giai đoạn I đến IV) và đạt giá trị cao nhất

ở giai đoạn IV; trong khi ở cá đực thì không có sự khác biệt hàm lượng Vtg ở các giai đoạn phát triển của buồng tinh (Hồ Văn Bình, 2010)

Theo Lý Văn Khánh (2013), hàm lượng phosphate protein huyết tương ở

cá nâu Scatophagus argus tăng lên rõ rệt ở cá có buồng trứng giai đoạn III và

IV so với cá có buồng trứng giai đoạn I Cá nâu có buồng trứng giai đoạn IV

có hàm lượng Vtg cao nhất (3,12 µg ALP/mg protein) và khác biệt có ý nghĩa

thống kê (p<0,05) so với cá có buồng trứng giai đoạn I (1,26 µg ALP/mg protein)

Hàm lượng Vtg trong máu biến đổi theo giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục theo nguyên tắc, hàm lượng Vtg tăng khi tuyến sinh dục phát triển Ngoài ra, hàm lượng Vtg còn biến động theo nhiệt độ và loại thức ăn

King and Pankhurst (2003) nghiên cứu trên cá hồi Salmo salar cho biết,

vào mùa thu thì hàm lượng Vtg trong máu khoảng 35 mg/mL, vào mùa hè

hàm lượng này giảm còn khoảng 10 mg/mL Ở cá chẽm Dicentrarchus labrax

bố mẹ, khi nuôi vỗ bằng 3 nhóm thức ăn là cá tạp; thức ăn công nghiệp có tỷ

lệ lipid chiếm 10%; và thức ăn công nghiệp được bổ sung 22% lipid trong khẩu phần Kết quả nghiên cứu cho thấy, sức sinh sản và hàm lượng Vtg trong máu của cá chẽm khi sử dụng cá tạp cao hơn so với thức ăn công nghiệp đã bổ

sung 10 và 22% lipid (José et al., 1998)

Hàm lượng Vtg trong huyết tương còn biến đổi theo giới tính Trong huyết tương cá cái, hàm lượng Vtg thường cao; trong khi đó ở cá đực, hàm lượng Vtg thường không có hoặc rất thấp, từ 10 đến 100 lần so với cá cái Hàm lượng Vtg ở cá đực chỉ được tìm thấy khi cá ăn thức ăn có chứa hormon

sinh dục cái (Beresford et al., 2011) Ở cá Lampetra fluviatilis Châu Âu, khi

được tiêm hormon estradiol (E2) vào tháng 3, là thời điểm cá chuẩn bị sinh sản, kết quả khảo sát cho thấy trong suốt mùa vụ sinh sản của cá, hàm lượng Vtg trong huyết tương cá cái luôn được duy trì và tăng cao; trong khi đó hàm

lượng Vtg lại không được tìm thấy ở cá đực (Mewes et al., 2002)

Hàm lượng protein trong gan và cơ cá thay đổi theo tuổi, giới tính của cá

Ở cá lóc Channa puntatus đực, protein cơ tăng theo tuổi cá; trái lại, protein

gan cao nhất trong giai đoạn cá sinh sản và suy giảm sau khi cá sinh sản, sau

đó tiếp tục suy giảm theo tuổi cá Trong khi ở cá cái, hàm lượng protein ở cơ

và gan đều gia tăng theo tuổi cá (Rath and Patnaik, 1981)

Okumura et al (1992) đã khảo sát sự thay đổi hàm lượng Vtg trong dịch máu của tôm Macrobrachium nipponense ở giai đoạn sinh sản và không sinh

sản Hàm lượng Vtg trong dịch máu gia tăng (1-9 mg/mL) trong giai đoạn phát sinh noãn hoàng và không thu được trong giai đoạn không sinh sản

Sự biến động về hàm lượng Vtg trên cua Callinectes sapidus cũng được nghiên cứu bởi Lee et al (1996); kết quả cho thấy hàm lượng Vtg tăng dần

trong quá trình phát triển của buồng trứng từ giai đoạn III, IV, V và VI

Revathi et al., (2012) nhận thấy hàm lượng Vtg trong gan tụy và dịch

máu thay đổi trong quá trình phát triển buồng trứng của tôm càng

Macrobrachium rosenbergii Hàm lượng Vtg gan tụy tăng dần từ giai đoạn I -

III và gia tăng mạnh ở giai đoạn IV và sau đó giảm xuống ở giai đoạn V của

sự phát triển buồng trứng Trong khi đó hàm lượng Vtg dịch máu cũng tăng dần từ giai đoạn I - III nhưng giảm ở giai đoạn IV và đạt thấp nhất ở giai đoạn

V của sự phát triển buồng trứng

Kết quả nghiên cứu của Châu Tài Tảo (2009) kết luận rằng hàm lượng

Vtg trong máu ở tôm sú Penaeus monodon cao nhất khi buồng trứng tôm ở

giai đoạn IV, thấp nhất ở giai đoạn I và hàm lượng này tỷ lệ thuận với sức sinh sản của tôm

Urtgam et al (2015) nhận thấy trong quá trình phát triển buồng trứng của tôm sú Penaeus monodon, hàm lượng Vtg dịch máu thấp ở tôm chưa phát dục,

tăng cao hơn ở giai đoạn I, gia tăng có ý nghĩa ở giai đoạn II và duy trì ở mức tương đối cao ở những giai đoạn phát triển sau của buồng trứng Hàm lượng

Vn trong buồng trứng ở mức không phát hiện ở giai đoạn chưa phát dục nhưng gia tăng một cách có ý nghĩa ở các giai đoạn phát triển sau của buồng trứng Hàm lượng Vn cao nhất ở giai đoạn III và hơi giảm ở giai đoạn V (giai đoạn thành thục sau cùng) của buồng trứng

Tóm lại, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng protein trong huyết tương, gan và cơ của cá, trong đó các yếu tố ảnh hưởng đến các chỉ tiêu này nhiều nhất là giới tính, sự phát triển của tuyến sinh dục, tuổi,… Việc theo dõi sự biến đổi các chỉ tiêu này trên cá rô biển trong điều kiện tự nhiên sẽ làm

cơ sở ban đầu trong việc phát triển nuôi vỗ thành thục sinh dục và sinh sản nhân tạo loài cá này

2.3 Vai trò của thức ăn trong nuôi vỗ thành thục sinh dục cá

Trong nuôi vỗ thành thục sinh dục cá thì việc cung cấp nguồn dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng, quyết định đến khả năng sinh sản và chất lượng sản phẩm sinh dục Dinh dưỡng được biết đến như là một yếu tố rất quan trọng trong

sinh sản của cá (Muchlisin et al., 2006) Trong từng giai đoạn phát triển của tuyến

sinh dục, cá có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Theo quy luật phát triển của tuyến sinh dục, trong giai đoạn đầu của quá trình tạo trứng, cá cái cần thức ăn có năng lượng cao, giai đoạn sau cá cần hàm lượng protein cao (Phạm Minh Thành và Nguyễn Văn Kiểm, 2009) Nhìn chung, sức sinh sản và kích thước trứng sẽ tăng

theo kích cỡ cá mẹ (Bromage et al., 1990), nhưng kích thước trứng và số lượng

trứng ở những lần sinh sản khác nhau sẽ khác nhau (Jonsson and Jonsson, 1999) Như vậy, có sự tương quan thuận giữa sức sinh sản và kích cỡ cá (Marteinsdottir and Steinarsson, 1998)

Nhiều nghiên cứu đã khẳng định cá bố mẹ đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng cao, đặc biệt là nguồn vitamin, khoáng vi lượng trong suốt thời kỳ phát triển tuyến

sinh dục (Izquierdo et al., 2000; Phạm Minh Thành và Nguyễn Văn Kiểm, 2009) Nghiên cứu của Chung Lân và ctv (1965) cho biết cá trắm cỏ

Ctenopharyngodon idella bố mẹ, ngoài thức ăn thực vật, nếu bổ sung thêm thức

ăn có nhiều đạm, dầu và vitamin E từ nhộng tằm, đậu nành, bánh khô dầu và mầm thóc thì sức sinh sản tương đối của cá tăng lên gấp đôi Khi nuôi vỗ cá dầy

Rutilus rutilus thiếu vitamin B12 hay cobalt thì cá cái có thể cho ra trứng nhưng

không có khả năng thụ tinh và nở (Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Văn Tư, 2010)

Trong nuôi vỗ, nếu để cá bị đói, thiếu thức ăn, hay cung cấp thức ăn có thành phần dinh dưỡng không phù hợp với đặc tính dinh dưỡng của loài sẽ làm cho cá không thành thục, có hệ số thành thục thấp hoặc buồng trứng có thể bị thoái hóa và tiêu biến mặc dù mọi yếu tố khác của môi trường là thuận lợi (Dương Tuấn, 1981; Phạm Minh Thành và Nguyễn Văn Kiểm, 2009) Chế độ dinh dưỡng tốt có thể làm cho cá phát dục, thành thục và sinh sản sớm (Nguyễn Tường Anh, 2005)

Ở giai đoạn sinh sản, nhu cầu protein của động vật thuỷ sản cao hơn so với giai đoạn sinh trưởng, vì trong giai đoạn này chúng cần sử dụng thức ăn có hàm

lượng protein cao để phát triển tuyến sinh dục (Le Thanh Hung et al., 2000; Trần Thị Thanh Hiền và Nguyễn Anh Tuấn, 2009) Nghiên cứu của Pathmasothy (1985) và Shim et al (1989) chỉ ra rằng khi tăng mức đạm từ 30 lên 40% trong

thức ăn của hầu hết các loài cá nước ngọt thì kích thước và khối lượng buồng trứng cũng tăng cao

Nhu cầu protein của tôm càng xanh ở giai đoạn sinh trưởng khoảng 25-28%, nhưng ở giai đoạn thành thục sinh dục nhu cầu này tăng lên 40% (Trần Thị Thanh Hiền và Nguyễn Anh Tuấn, 2009) Ở mức hàm lượng protein từ 30 đến 40%, thì tốc độ tăng trưởng và khả năng sinh sản ở hầu hết các loài cá sẽ được cải

thiện tốt hơn (Shim et al., 1989; Rasanthi et al., 1997; Al-Hafedh et al., 1999; Sayed et al., 2003; Afzal et al., 2004) Khi nuôi vỗ cá trê phi Clarias gariepinus

El-bố mẹ bằng các loại thức ăn có hàm lượng đạm 30, 35 và 40% thì khối lượng trứng cá đẻ ra tăng theo sự gia tăng hàm lượng đạm trong thức ăn Mặc khác, ở hàm lượng đạm 40% tỷ lệ nở của trứng đạt cao nhất (90,33%) trong khi đó tỷ lệ

nở thấp nhất là ở nghiệm thức cho ăn 30% đạm (84,7%) (Sotolu, 2010) Ở cá rô

phi Oreochromis niloticus, khi nuôi vỗ với các mức hàm lượng protein 25, 30,

35 và 40% ở cùng mức năng lượng (400 kcal/100 g), kết quả cho thấy cá có

sức sinh sản thực tế và sức sinh sản tuyệt đối cao nhất ở mức protein 40%

(El-Sayed et al., 2003) Muchlisin et al (2006) đã thí nghiệm nuôi vỗ cá lăng vàng

Hemibagrus nemurus với 3 mức đạm là 30, 35 và 40% và ở cùng mức năng

lượng là 3,95 KJ/g Kết quả cho thấy, ở mức đạm 35%, cá lăng có tăng trưởng và chất lượng trứng tốt

Trong cùng một loài, nhu cầu đạm của cá cái thường cao hơn cá đực và cá

đực thành thục sinh dục sớm hơn cá cái (Le Thanh Hung et al., 2000) Ở cá da trơn Heterobranchus longifilis bố mẹ khi nuôi bằng thức ăn có các hàm lượng

đạm khác nhau thì ở hàm lượng đạm 35% tốc độ tăng trưởng và thành thục sinh dục của cá đực là tốt nhất; trong khi đó ở cá cái hàm lượng đạm phải là 40%

(Madu et al., 2004)

2.4 Vấn đề sử dụng chất kích thích trong sinh sản nhân tạo ở cá

2.4.1 Cơ chế hormon kiểm soát quá trình tạo trứng ở cá cái

Sự hiểu biết cơ chế tác động của các yếu tố môi trường cũng như các hormon trong quá trình thúc đẩy sự thành thục sinh dục và kích thích hoạt động đẻ trứng ở cá là rất quan trọng, cho phép các cơ sở sản xuất giống cá xây dựng chiến lược sản xuất tốt hơn hoặc có thể cải tiến kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo bằng các loại hormon tổng hợp hoặc chiết xuất nhân tạo

(Phạm Quốc Hùng và ctv., 2014)

Trong quá trình tạo trứng ở cá cái, noãn bào trải qua 2 thời kỳ (phase) cuối mà sự phát triển của chúng chịu sự kiểm soát của hormon: thời kỳ phát sinh/tích lũy noãn hoàng trong các noãn bào (vitellogenesis) và thời kỳ thành thục (maturation) bao gồm 2 quá trình liên tiếp nhau là thành thục/chín (maturation) và rụng trứng (ovulation)

Cơ chế hormon kiểm soát quá trình phát sinh noãn hoàng theo mô hình 2

kiểu tế bào (two-cell type model) của Nagahama et al (1994), Janz (2000) và

Nagahama and Yamashita (2008) có thể được tổng hợp trong Hình 2.3

Khi có sự thay đổi của một số yếu tố sinh thái như mưa, nhiệt độ, dòng chảy, báo hiệu mùa sinh sản sắp đến sẽ kích thích lên các cơ quan cảm giác ngoại biên; tế bào thần kinh của các cơ quan ngoại cảm này sẽ sản sinh ra những xung động; những xung động đó lập tức được truyền về trung khu thần kinh, kích thích vùng dưới đồi thị giác (hypothalamus) phóng thích hormon giải phóng kích dục tố (Gonadotropin releasing hormone, GnRH) GnRH tác động đến tuyến yên (não thùy) dẫn đến quá trình phóng thích kích dục tố, là hormon kích thích nang trứng (Follicle stimulating hormone, FSH) hay GtH-I GtH-I tác động đến nang trứng dẫn đến sự tổng hợp hormon sinh dục (17β-estradiol, E2) E2 kích thích quá trình tổng hợp tiền chất noãn hoàng (Vitellogenin, Vtg) trong gan Sau khi tổng hợp xong Vtg được đưa vào tuần

hoàn máu và được hấp phụ một cách đặc hiệu bởi các noãn bào Ngoài các

GnRH người ta cũng đã chứng minh được trong não bộ cá có yếu tố ức chế sự

tiết kích dục tố là dopamin (DA) (Yaron and Sivan, 2006)

Kích thích môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, mưa,…)

Nang trứng

Androstenedione Testosterone

Sau khi kết thúc quá trình tích lũy noãn hoàng, các noãn bào sẽ đi vào giai đoạn ‗nghỉ‘ và chờ các yếu tố môi trường thuận lợi để tiếp tục phát triển (đi vào thời kỳ thành thục) (Woynarovich and Horváth, 1980)

Khi có điều kiện sinh thái thích hợp, noãn bào khôi phục sự phát triển và

đi vào giai đoạn thành thục dưới sự kiểm soát của hormon

Cơ chế hormon kiểm soát quá trình thành thục noãn bào theo mô hình 2

kiểu tế bào (two-cell type model) của Nagahama et al (1994), Janz (2000) và

Nagahama and Yamashita (2008) có thể được tổng hợp trong Hình 2.4

Kích thích môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, mưa,…)

Hình 2.4 Cơ chế hormon kiểm soát quá trình thành thục ở cá cái

Theo Patino and Sullivan (2002), sự thành thục hay chín (maturaion), thường được gọi là sự chín noãn bào cuối cùng (final oocyte maturation, FOM), mà biểu hiện là sự tan màng nhân hay tan túi mầm (germinal vesicle breakdown, GVBD) Ngày nay sự chín noãn bào cuối cùng được hiểu là sự chín nang trứng (ovarian follicle maturation) bao gồm: (1) năng lực chín của noãn bào (oocyte maturational competence) phụ thuộc kích dục tố, (2) sự tổng hợp hormon gây chín (maturation-inducing hormone, MIH; các hormon gây chín có bản chất là steroid nên thường được viết là MIS, mà ở đa số các loài cá

là 17,20P) được kích thích bởi kích dục tố, và (3) sự khôi phục giảm phân (meiotic resumption) phụ thuộc MIH (hay sự chín nhân (nuclear maturation))

và sự chín tế bào chất (cytoplasmic maturation)

Theo sơ đồ trên (Hình 2.4), quá trình chín noãn bào được kiểm soát/điều hòa bởi 3 chất trung gian (mediator) là kích dục tố (GtH-II), hormon hay steroid gây chín (MIH/MIS) và yếu tố thúc đẩy chín (maturation-promoting factor, MPF); trong đó MIS được xem là chất trung gian của quá trình chín trứng được tạo ra bởi KDT của tuyến yên Tác động của MIS là kích thích quá trình tổng hợp MPF, là protein và chuyên biệt cho từng loài cá, trong các noãn bào để gây nên quá trình chín - sự kiện quan trọng nhất - cùng với hiện tượng rụng trứng dẫn đến sự đẻ trứng (Yaron and Sivan, 2006)

2.4.2 Nguyên lý chung về kích thích sinh sản ở cá

Cơ chế hormon điều khiển sự chín noãn bào cá cái thể hiện ở Hình 2.4 cho thấy, thực chất quá trình đẻ trứng của cá là một hoạt động sinh dục mang tính chất phản xạ không điều kiện Nghĩa là, các yếu tố sinh thái thích hợp cho hoạt động sinh sản sẽ kích thích lên các cơ quan cảm giác ngoại biên và dẫn đến quá trình phóng thích hormon giải phóng kích dục tố (GnRH) và cá đẻ

(David and Claiborne, 2006; Babin et al., 2007; Moore, 2008)

Trong điều kiện nuôi nhốt, các yếu tố sinh thái trong ao, bè không đáp ứng những yêu cầu về sinh sản của cá bố mẹ, nên phải tiêm các chất kích thích sinh sản như não thùy cá, HCG, huyết thanh ngựa chửa, GnRH-A kết hợp dopamine antagonist, các steroid (P, 17P, 17,20P, DOC, DOCA ) vào cơ thể để thay thế một phần hormon nội sinh của trục não bộ - tuyến yên - tuyến sinh dục, và kích thích cá bố mẹ phóng tinh và đẻ trứng (Hình 2.5)

Hình 2.5 Sơ đồ Trục não bộ - tuyến yên - nang trứng với những hoạt chất tự nhiên (bên trái) và những chất ngoại sinh (bên phải) có thể gây nên sự chín

noãn bào và sự đẻ trứng ở cá cái (Nguyễn Tường Anh, 2011)

2.4.3 Các chất kích thích sinh sản đƣợc sử dụng phổ biến trong sản xuất nhân tạo cá giống

Theo Rottmann et al (1991a), có thể sử dụng các chất kích thích sinh sản

sau trong sản xuất giống nhân tạo trên cá:

- Chất chiết não thùy dưới dạng não thùy tươi hay được bảo quản ở nhiệt

độ thấp và não thùy khô (được khử nước và giữ trong acetone);

- Kích dục tố tinh chế, phổ biến là kích dục tố nhau thai (Human Chorionic Gonadotropin, HCG);

Antiestrogen (Clomiphen, Tamoxiphen) Aromatase Inhibitor (Fadrozole, Letrozole)

GnRH-A (LHRH-A,

sGnRH-A, Buserelin)

Dopamine antagonist (Domperidone, Pimozide)

(Ovaprim)

NÃO BỘ Hypothalamus

TUYẾN YÊN

GRIF (Dopamine)

(Não thùy cá, HCG,

PMS)

Steroid (17,20P; 17P; Progesterone

Gonadotropin

- Hormon giải phóng kích dục tố, chẳng hạn của động vật hữu nhũ (mammalian Luteinizing Hormone-Releasing Hormone, LHRH) hay những chất đồng dạng với hormon giải phóng kích dục tố (LHRH analog, LHRH-A);

- LHRH-A kết hợp với các chất khóa dopamin (dopamine blockers); và

- Các steroids

Cho đến nay các chất kích thích sinh sản được sử dụng phổ biến trong sản xuất giống nhân tạo trên cá là não thùy thể cá, HCG và GnRH-A

a) Não thùy thể cá (Fish pituitary gland, FPG)

Não thùy đã được sử dụng để kích thích nhiều loài cá sinh sản từ rất sớm, đặc biệt trên nhóm cá chép (Woynarovich and Horváth, 1980; Jhingran and

Pullin, 1985; Delince et al., 1987; Horváth et al., 2015) và trên cá trê (Marte, 1989; Peteri et al., 1992) Tuyến não thùy cá sản xuất và dự trữ kích dục tố

(GtH), có vai trò quan trọng trong sự rụng trứng của cá cái và tiết tinh của cá đực Khi tiêm cho cá, GtH của FPG sẽ tác động trực tiếp lên buồng trứng và buồng tinh cá nhận và làm gia tăng hàm lượng GtH trong máu dẫn đến cá đẻ

(Rottmann et al., 1991a) Não thùy được thương mại hóa thường là của cá

chép (common carp) và cá hồi (salmon) Khi sử dụng, não thùy khô (được bảo quản trong acetone) được nghiền nhỏ và pha với nước muối sinh lý (NaCl 5‰); vị trí tiêm là xoang bụng hay cơ lưng Liều lượng thường được tính bằng

mg não thùy/kg cá

Việc sử dụng FPG có thuận lợi là có hiệu quả kích thích sinh sản trên nhiều loài cá Những khó khăn trong sử dụng FPG kích thích cá sinh sản có thể bao gồm khó chuẩn hóa về liều lượng do phụ thuộc vào tuổi, giới tính và tình trạng thành thục của cá cho cũng như cách thu và bảo quản não thùy, giá thành cao và khả năng cung cấp não thùy không ổn định, hy sinh và làm giảm giá trị thương phẩm cá cho não thùy (Marte, 1989)

b) Kích dục tố nhau thai người (Human chorionic gonadotropin, HCG)

Kích dục tố nhau thai người do màng đệm thai (Chorion) tiết ra có chức

năng duy trì thể vàng ở người mang thai (Corpus luteum of pregnancy) Thể

vàng ở người mang thai được HCG kích thích sinh tổng hợp Progesterone - hormon có tầm quan trọng đặc biệt với chức năng duy trì cấu trúc và sự hoạt động của dạ con, làm tuyến sữa lớn lên và phát triển, và một chức năng khác

là ức chế tuyến yên tiết ra kích dục tố, làm gián đoạn chu kỳ kinh nguyệt của người phụ nữ mang thai (Nguyễn Tường Anh, 1999b)

HCG tương tự với các kích dục tố của cá nên khi được sử dụng sẽ tác động lên nang trứng của cá cái, làm cho nang trứng sản xuất ra yếu tố gây chín (hormon steroid C21) và yếu tố gây rụng trứng (làm vỡ nang trứng, chẳng hạn hormon Prostaglandin và enzyme protease) giúp noãn bào thoát ra ngoài Trứng cá chín và rụng bình thường theo ống dẫn trứng ra môi trường nước, gặp tinh trùng và được thụ tinh ở đó HCG là chất kích thích sinh sản được sử dụng rộng rãi, có hiệu quả tốt với nhiều loài cá Thuận lợi của việc sử dụng HCG để kích thích cá sinh sản so với não thùy là có thể chuẩn hóa về liều lượng và giá thành thấp hơn (Marte, 1989) Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng cần phải được bảo quản ở nhiệt độ thấp, dưới 25oC (Nguyễn Tường Anh, 2005) Liều lượng thường dùng là 1.000 đến 6.000 UI (đơn vị quốc tế) cho 1

kg cá tùy theo loài Theo Marte (1989), tổng liều HCG gây rụng trứng hiệu quả trên nhóm dễ kích thích sinh sản như nhóm cá chép Trung Quốc là 2.000

IU/kg nhưng đối với cá khó kích thích sinh sản như cá trê vàng (Clarias

macrocephalus) là 3.000-4.500 IU/kg cá cái Thời gian hiệu ứng cũng thay đổi

theo loài cá Theo Marte (1989), những cá khó kích thích sinh sản như

Pangasianodon hypophthalmus sẽ rụng trứng sau 10-12 giờ khi được tiêm

HCG và những cá dễ kích thích sinh sản như nhóm cá chép Trung Quốc (mè trắng, mè hoa và trắm cỏ) sẽ rụng trứng sau 6-8 giờ khi tiêm não thùy hay HCG

c) Chất đồng dạng của hormon giải phóng kích dục tố (Gonadotropin Releasing Hormone Analogue, GnRH-A)

GnRH-A là những chất tổng hợp tương tự hormon giải phóng kích dục tố của hypothalamus Do các loài động vật có xương sống khác nhau có GnRH khác nhau nên các GnRH-A cũng khác nhau Hiện nay trong nghề cá người ta thường dùng 3 loại GnRH-A: mGnRH-A và Buserelin là 2 chất đồng dạng GnRH của động vật có vú và sGnRH-A là chất đồng dạng GnRH của cá hồi Đối với cá, trong 3 loại GnRH-A trên thì mạnh nhất là sGnRH-A vì chúng có

ái lực thụ thể cao nhất (Nguyễn Tường Anh, 2011) Ovaprim (biệt dược cho cá

đẻ của Canada) là hỗn hợp của 2 hoạt chất gồm 20 μg sGnRH-A và 10 mg Domperidone (DOM) trong 1 mL propylen glycol Hiện nay, LRH-A (mGnRH-A) do Trung Quốc sản xuất được sử dụng phổ biến do có ưu điểm là giá rẻ, sử dụng có hiệu quả với nhiều loài cá, tính đặc hiệu cho loài chỉ thể

hiện ở mức hoạt tính (Lin et al., 1988) Ngoài ra, việc sử dụng GnRH-A tổng

hợp có thể loại bỏ việc lan truyền các bệnh truyền nhiễm so với FPG và HCG (Podhorec and Kouril, 2009) Một ưu điểm khác của việc sử dụng GnRH-A là giảm stress và những ảnh hưởng phụ gây chết cá bố mẹ sau sinh sản của nhiều

loài cá nuôi nước ngọt (Peng et al., 1994) Tuy nhiên, khi sử dụng GnRH-A

cho cá đẻ thì thời gian tái phát dục của cá bố mẹ dài hơn, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ

nở thường thấp hơn so với các loại chất kích thích sinh sản khác (Nguyễn Tường Anh, 2005) Trong phần lớn báo cáo khoa học về kích thích cá sinh sản trong thập kỷ 1980s, liều GnRH-A thay đổi từ 50 đến 100 µg/kg thể trọng Hiện nay, các liều được khuyến cáo của GnRH-A cho nuôi trồng thủy sản là từ 10-50 µg/kg thể trọng tùy theo loài cá, chất đồng dạng và kiểu xử lý (Yousefian and Mousavi, 2011) Theo Marte (1989), tổng liều LRH-A gây rụng trứng hiệu quả trên nhóm dễ kích thích sinh sản như nhóm cá chép Trung Quốc là 50-75 µg/kg Thời gian hiệu ứng của những cá khó kích thích sinh sản

như Pangasianodon hypophthalmus sẽ rụng trứng sau 10-12 giờ khi được tiêm

LRH-A và những cá dễ kích thích sinh sản như nhóm cá chép Trung Quốc (mè trắng, mè hoa và trắm cỏ) sẽ rụng trứng sau 8-12 giờ khi tiêm LRH-A kết hợp chất kháng dopamin

2.4.4 Các steroid C 21 gây chín noãn bào cá và ứng dụng

a) Khái niệm về steroid

Steroid là những hợp chất hữu cơ phức tạp mà trong phân tử chứa các nguyên tố C tạo thành 4 mạch vòng, ba mạch có 6 đỉnh và một mạch có 5

đỉnh Chữ steroid bắt nguồn từ chữ stereos (solid) của Hy Lạp có nghĩa là

―rắn‖ hay ―cứng‖ Có thể lý do của sự đặt tên như thế do các chất steroid thường không tan trong nước, nóng chảy và phân hủy ở nhiệt độ cao (Nguyễn

Tường Anh và ctv., 2011)

Trong cơ thể động vật, tồn tại dưới dạng steroid là cholesterol (modified steroid), vitamin nhóm D, các acid mật, các hormon sinh dục, các hormon của tuyến vỏ thượng thận, hormon ecdysone gây biến thái và lột xác ở côn trùng

và giáp xác

b) Các steroid C 21 gây chín noãn bào cá

Những nghiên cứu trên cá trong những năm gần đây cho thấy các steroid sinh dục của nhóm động vật này giữ vai trò quan trọng trong cơ chế hormon tham gia vào quá trình biệt hoá giới tính, điều hoà sự phát triển tuyến sinh dục, đặc biệt là sự tạo noãn hoàng, sự thành thục, tập tính sinh sản (Nguyễn Tường Anh, 1999b) Trong đó, các hormon có 21 cacbon trong khung phân tử (C21

)

có khả năng gây chín noãn bào (Maturation Inducing Hormone, MIH hay Maturation Inducing Steroid, MIS): đó là các hormon của sự mang thai và hormon của tuyến vỏ thượng thận

c) Nghiên cứu sử dụng hormon C 21 gây chín noãn bào trên cá

Trên thế giới, việc nghiên cứu sử dụng hormon steroid C21

để gây chín noãn bào và rụng trứng trên cá được tiến hành từ rất sớm Cho đến nay, các hormon C21 được chứng minh có khả năng gây chín noãn bào và rụng trứng cá

là progesterone (P), 17α hydroxyprogesterone (17P), 17α,20β dihydroxyprogesterone (17,20P), dẫn xuất của hormon tuyến vỏ thượng thân

như deoxycorticosterone acetate (DOCA) (Nguyễn Tường Anh và ctv., 2011) Progesterone là hormon kích thích cá chạch Misgurnus fossilis và cá tầm

Acipenser stellatus chín và rụng trứng (Kirshenblat, 1961; Goncharov, 1969;

trích bởi Nguyễn Tường Anh, 1999b) Dettlaff and Davydova (1979) đã phát hiện ra tác dụng gây chín của P trên noãn bào cá tầm và bề mặt noãn bào bắt đầu nhạy cảm với progesterone trước khi nang trứng nhạy cảm với kích dục

tố, và tính nhạy cảm này được duy trì cả khi nang trứng bắt đầu thoái hoá, mất khả năng phản ứng với kích dục tố tuyến yên

Ngoài ra, còn một số nghiên cứu sử dụng P để kích thích sự tan biến túi

mầm in vitro của cá thơm Plecoglosus altivelis, cá hồi Oncorhynchus rhodurus,

cá hồi Salmo gairdneri và cá vàng Carassius auratus (Nagahama et al., 1983),

cá chốt Mystus vittatus (Upahyaya and Haider, 1986), cá rô hu Labeo rohita, cá mrigal Cirrhinus mrigala và cá Catla catla (Haider and Inbaraj, 1989); cá chép

Cyprinus carpio (Xakun and Gureeva-Preobrazhenskaya, 1975); cá Fundulus heteroclitus (Wallace and Selman, 1980); cá Heteropneustes fossilis (Goswami

and Sundararaj, 1974) Trong số các hormon steroid có khả năng gây chín noãn bào cá ở qui mô sản xuất, P đã được ứng dụng có hiệu quả trên cá chép (Popov and Budarin, 1976; trích bởi Lê Văn Dân và Nguyễn Tường Anh, 2008)

Như vậy, progesterone đã được chứng minh là có hiệu quả ở nhiều loài

cá, mặc dù tác dụng kích thích của nó có thể là một kết quả của sự chuyển hoá thành chất kích thích mạnh hơn, hơn là sự kích thích trực tiếp (Nagahama, 1997)

17,20P là steroid gây chín trứng ở nhiều loài cá và trong nhiều trường hợp

là steroid mạnh nhất đối với noãn bào nhiều loài cá thuộc các bộ khác nhau (Scott and Canario, 1987; Haider and Inbaraj, 1989) Haider (1990) một lần nữa khẳng

định ở cá chốt Mystus vittatus, 17,20P là steroid gây ra sự tan biến túi mầm hiệu quả nhất Hơn thế nữa, những nghiên cứu in vitro và in vivo trên cá trê vàng

Clarias macrocephalus đã chứng minh rõ ràng rằng 17,20P được tạo ra ở cá cái

khi được tiêm kích dục tố (Suzuki et al., 1987; 1989) Đối với cá hồi

Oncorhynchus rhodurus (Nagahama and Adachi, 1985); cá trê vàng Clarias