Bước đầu xây dựng chương trình xử lý và kế hoạch hóa thực nghiệm hóa học hữu cơ ths hóa học

Hiện nay phương pháp nhuộm phát hiện cacboxylesteraza mà cụ thể là a-naphtylacetate esteraza ANAE được ứng dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm huyết học để chẩn đoán dòng tế bào tro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRUỒNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN

TRẦN VÃN TÍNH

BƯỚC DẦU NGHIÊN CỨU MỘT sô CHẤT ẢNH

HƯỞNG VÀ ĐIỀU KIỆN HOẠT DỘNG TỐI UỊJ CỦA ENZYM

CACBOXYESTERAZA ở BẠCH CẦU NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NHUỘM HOẮ HỌC TẾ BÀO

LUẬN ÁN THẠC SỸ KHOA HỌC HOÁ HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HOÁ HỌC HŨU cơ

MÃ SỐ: 01 -04-02

•, -HUM :■ Ví í

Hướng dẫn khoa học: PGS.TSKH Nguyến Đình Triệu

TS Nguyễn Anh Trí

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AdCMV: AdenoCytoMegaloVirus

ANAE: a-naphtylacetate

CE: CacboxyEsteraza

CPT-11: 7-ethyl-10-[l-piperidino-l-piperidino] carbonyloxy-camptothecin

ELISA: Enzym - Linked ImmunoSorbent Assay - Kỹ thuật hấp thụ miễn

dịch gắn enzym

FAB: French-American-Bristish - Bảng phân loại Pháp -Anh - Mỹ

FACEES: Fatty Acid 2-CloroEthyl Este Synthase

FPIA: Fluorescen Polary Immuno Assay - Kỹ thuật miễn dịch phân cực

huỳnh quang

hCE-1: human CarboxyEsterase -1

hCE-2: human CarboxyEsterase -2

IC50: Inhibitory Concentration 50% - Nồng độ ức chế 50%

LD50: Lethal dose 50% - Liều gây chết 50%

LDL: Low Density Lipoprotein

LVS: Lovas tatin

mARN: message Acid RiboNucleic - ARN thông tin

NCBI: National Center Biotechnology Information - Trung tâm thông tin

kỹ thuật sinh học Quốc gia

PC: Paclitaxel-2-ethylCarbonate

PCR: Polimerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi enzym polime

MỤC LỤC

ĐẬT VẤN ĐỀ 1

('HƯƠNG 1: TổNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1- Cacboxylesteraza: Danh pháp, phân bố, cấu trúc, sinh tổng hợp, chức năng sinh lý và bệnh lý trong cơ thể 3

1.1.1- Danh pháp và phân bố của cacboxylesteraza 3

1.1.2- Cấu trúc của ANAE 5

1.1.3- Sinh tổng hợp ANAE 6

1.1.4- Chức năng sinh lý và bệnh lý của ANAE trong cơ thể 8

1.1.5- ứng dụng của ANAE trong y học 12

1.2- Cơ chế, điều kiện tối ưu và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết este của ANAE 16

1.2.1- Cơ chế và điều kiện tối ưu xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết este của ANAE 16

1.2.2- Các chất ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết este của ANAE 19

1.3- Các phương pháp xác định ANAE 21

1.3.1- Phương pháp phá vỡ tế bào 22

1.3.2- Phương pháp không phá vỡ tế bào hay hoá học tế bào 25

1.3.3- Những ưu và nhược điểm của hai phương pháp phân tích 27

1.3.4- ứng dụng toán học và tin học trong nghiên cứu enzym 28

CHUƠNG 2: Đối TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 32

2.1- Đối tượng 32

2.2- Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1- Mô hình nghiên cứu: 32

2.2.2- Phương pháp nghiên cứu 33

2.3- Vật liệu, phương tiện và kỹ thuật nghiên cứu 38

2.3.1 - Chuẩn bị 38

2.3.2- Kỹ thuật 39

CHUƠNG 3: KẾT QUẢ 42

3.1- Kết quá về tối ưu hoá hình học bằng phương pháp tính lượng tử gần đúng 42

3.1.1- Các tham số vể mật độ điện tích electron và cấu trúc lập thể 42

3.1.2- Kết quả về nãng lượng, nhiệt hình thành phân tử (kcal/mol) 49

3.2- Kết quả về tối ưu hoá thực nghiệm theo phương pháp đơn hình 53

3.3- Kết quả về các chất có ảnh hưởng tới hoạt động xúc tác của ANAE 57

3.3 L- Kết quả tiêu bản đối chứng: 57

3.3.2- Nhóm halogen và kim loại nặng: 57

3.2.3- Nhóm các chất vitamin và kháng sinh: 58

3.3.4- Nhóm các chất bảo vệ thực vật và thuốc bảo quản: 59

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 63

4.1 - Tối ưu hoá hình học 63

4.1.1- Về mật độ điện tích electron: 63

4.1.2- Về mặt năng lượng: 64

4.1.3- Về mặt cấu trúc lập thể: 66

4.2- Về tối ưu hoá thực nghiệm theo phương pháp đơn hình 67

4.2.1- Về nhiệt độ 67

4.2.2- Về pH 68

4.2.3- Về thời gian 68

4.2.4- Về nồng độ cơ chất: 68

4.3 - Về ảnh hướng của các chất hoá học 69

4.3.1 - Về ảnh hưởng của muối natri halogenua và các ion kim loại 69

4.3.2- Về ảnh hưởng của các kháng sinh và vitamin 70

4.3.3- Về ảnh hưởng của các chất bảo vệ thực vật và chất bảo quản 70

CHUÔNG 5: KÊT LUẬN 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

PHỤ LỤC 1: CẤU TRÚC BẬC MỘT mARN CỦA ANAE 94

PHU LỤC 2: TÊN GỌI VÀ CÔNG THÚC CỦA MỘT số CHAT sử DỤNG TRONG ĐỀ TÀI 97

PHU LUC 3: DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN cứu TRONG ĐỀ TÀI 98

ĐẶT VẤN ĐỂ

Cacboxvlesteraza bạch cầu là một enzym thuỷ phân liên kết este của axit cacboxvlic

với ancol (E.c 1.1.1), đây là một enzym không đổng nhất gồm nhiều isoenzym, được tổng

hợp sinh học trong ribosom ở nguyên sinh chất và lưới nội mô Chức năng sinh lý của

esteraza là thuỷ phân các dị nguyên như vi khuẩn, độc tố và trong quá trình chuyển hoá của

tế bào tức là tham gia vào các chức năng khác nhau của tế bào bạch cầu Vì vậy đối với

mỗi loại bạch cầu khác nhau thì có chứa cacboxylesteraza khác nhau, có khả năng xúc tác

phản ứng thuỷ phân cho một cơ chất tuỳ thuộc vào chức năng của nó Sự khác nhau này có

thể phát hiện bằng các cơ chất, chất ức chế, chất hoạt hoá hay thay đổi điều kiện môi trường

như pH, nhiệt độ, chất cố định Nhiều loại enzym được phát hiện và phân loại nhờ các kỹ

thuật ức chế và hoạt hoá như: Phát hiện esteraza bạch cầu týp A và B nhận được nhờ chất ức

chế bằng hợp chất photpho hữu cơ: týp A không bị ức chế còn týp B thì bị ức chế Ngoài ra

nghiên cứu sự ức chế và hoạt hoá còn cho phép hiểu sâu hơn về cơ chế hoạt độne của các

enzym, tác dụng, ảnh hưởng của các chất đưa vào cơ thể một cách chủ động hay vô tình

như: dược phẩm, thuốc trừ sâu, hoá chất Việc nghiên cứu các chất ức chế và hoạt hoá đã

trở thành đề tài đang rất được quan tâm và thường xuyên được đăng tải trên các tạp chí khoa

học Đúng như giáo sư Kaphalia khoa Y học của Trường Đại học tổng hợp Texas đã viết

trên tạp chí "Hoá học độc chất" tháng 2/1997 như sau: "Việc nghiên cứu các chất ức chế,

hoạt hoá và các thực nghiệm độc chất về enzym là Iihữnq cơ sà khoa học nền tảng giúp chúng

ta nắm vững được 11 quyên nhân bệnh sinh các bệnh của con người" [79].

Hiện nay phương pháp nhuộm phát hiện cacboxylesteraza mà cụ thể là

a-naphtylacetate esteraza (ANAE) được ứng dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm huyết

học để chẩn đoán dòng tế bào trong bệnh ung thư máu và là một tiêu chuẩn để xếp loại thể

bệnh theo FAB Ngoài ra, HW Macedo và c.s (1991) dùng phương pháp nhuộm hoá học tế

bào ANAE để phát hiện sự giảm tế bào lymphocytes T ớ các bệnh nhàn phong và so sánh

với phương pháp phát hiện marker bằng kháng thể đơn dòng đã đi đến kết luận: phương

pháp nhuộm ANAE phát hiện số lượng tế hào lvmphocytes T tuy không đặc hiệu bằng kỹ

thuật miễn dịch song đây là một kỹ

thuật tin cậy, kinh tế, không đòi hỏi máy móc đắt tiền và có thể đáp ứng được nhu cầu chẩnđoán và điều trị [98 ].

Về mặt chất lượng của kỹ thuật đòi hỏi phải đạt được tính đặc hiệu tức là phải pháthiện được đúng enzym esteraza, giữ nguyên vị trí của chúng như khi tế bào còn sóng tạithời điểm nghiên cứu Vì vậy kỹ thuật phát hiện esteraza là một kỹ thuật khó, như trên đãtrình bày kỹ thuật chịu sự tác động của rất nhiều yếu tố như: nhiệt độ chất cố định, thờigian bán huỷ, nồng độ cơ chất, tác dụng của các chất ức chế và hoại hoá dễ dẫn đến kếtquả sai khác với cấu trúc tổ chức esteraza trong bạch cầu như khi tế bào còn đang sống TạiViệt Nam hiện mới chỉ có một vài phòng thí nghiệm triển khai kỹ thuật này ứng dụng vàoviệc phân loại dòng tế bào ung thư máu Nhưng kết quả nhuộm có sự sai lệch về độ đặc hiệu

so với kỹ thuật marker cần điều chỉnh tới 26,19% [10] Nguyên nhân sai lệch này có thể là

do kỹ thuật nhuộm cúa chúng ta chưa đạt được độ nhạy theo yêu cầu của kỹ thuật trongphân loại bạch cầu của FAB dẫn tới nhận định sai kết quả VI vậy vấn đề mà chúng ta quantâm là phái tìm cách nâng cao chất lượng nhuộm giúp cho việc chấn đoán chính xác cácbệnh dùng đến kỹ thuật nhuộm ANAE Xuất phát từ những điều trình bày trên đây chúng tôiquyết định chọn đề tài:

“Bước đầu nghiên cứu một số chất ảnh hưởng và điều kiện hoạt động tối ưu của enzym cacboxyesterciza ở bạch cầu người bằng phương pháp nhuộm hoá học tê bào”

Vói mục tiêu:

- Tìm hiểu cơ chế động học của phản ứng nhuộm ANAE thông qua các tham số lượng

tử từ đó rút ra các điều kiện tối ưu, các yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến phản ứng

- Tìm điều kiện tối ưu về mặt thực nghiệm cho phản ứng nhuộm ANAE bạch cầu

- Xem xét ảnh hưởng của nhóm halogen và kim loại nặng, thuốc kháng sinh, thuốc trừsâu, chất bảo quản đối với hoạt động của ANAE bạch cầu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1- CACBOXYLESTERAZA: DANH PHÁP, PHÂN Bố, CẤU TRÚC, SINH TổNG HỢP, CHỨC

NĂNG SINH LÝ VÀ BỆNH LÝ TRONG cơ THỂ.

Cucboxvlesteraza bạch cầu là một enzym nằm trong nhóm enzym cacboxylesteraza nên

mọi nghiên cứu về enzym này cấn phải dựa trên các hiểu biết cơ bản về cacboxylesterazu

nói chung.

1.1.1- Danh pháp và phân bô của cacboxylesteraza

Danh pháp:

Cacboxyesteraza (CE) là enzym thuỷ phân liên kết este của axit cacboxylic và

ancol Cũng như các enzym khác CE có nhiều tên gọi khác nhau Trong tế bào CE được tìm

ra đầu tiên bởi Gomori (1952) bằng phương pháp nhuộm hoá học tế bào ở tế bào bạch cầu

monocytes và macrophages vì thế còn gọi là monocytes/macrophages esteraza [20, 29] Sau

đó người ta thường gọi tên và phân loại enzym bằng cách lấy tên cơ chất đặc hiệu của

enzym cộng thêm đuôi aza Nhưng do CE có khả năng thuỷ phân rất nhiều loại cơ chất khác

nhau (19 cơ chất) vì thế nó còn được gọi là esteraza không đặc hiệu [36] Tuy vậy

a-naphtylaxetat là một cơ chất đặc hiệu thường được sử dụng trong nghiên cứu nhất vì vậy để

gọi theo tên cơ chất CE còn được gọi là alpha naphtyl acetat esteraza (ANAE) Khi nghiên

cứu về cấu trúc của tâm hoạt động và cơ chế thuỷ phân người ta thấy rằng vị trí xúc tác cho

phản ứng cắt đút liên kết este nằm trên gốc serin nên đôi khi người ta còn gọi là serin

esteraza Sau này để thống nhất tên gọi cho các enzym nói chung Hội Hoá sinh quốc tế

(UIC) đã đưa ra cách phân loại dựa trên các loại phản ứng và cơ chế phản ứng Như vậy

nhóm enzym này có tên gọi chính thức là cacboxyesteraza và nằm trong nhóm một của hệ

thống các enzym thuỷ phân (E.c.3.1.1.1) Tuy vậy việc sử dụng tên gọi enzym theo cơ chất

sẽ giúp chỉ rõ các isoenzym đặc hiệu đối với cơ chất đang nehiên cứu, cho nên trong đề tài

này chúng tôi vẫn sử dụng danh pháp thường được gọi trong các y văn là alpha naphtol

acetate esterase (ANAE).

Về phân bở:

Các công trình công bố gần đây đã cho thấy rằng ANAE có mặt ở hầu hết các mỏtrong CO' thế người Hàm lượng ANAE cao nhất là trong các tế bào thực bào, sau đó đến tếbào gan, ruột, dạ dày, phổi, tiền liệt tuyến, tuỵ và ít nhất là trong não [96, 145, 168] Bên

cạnh đó B Yan và c.s (1994) bằng kỹ thuật Western immunoblotting đã không thấy có hoặc

có rất ít ARN thông tin (mRNA) của ANAE týp B trong các tế bào tuyến sinh dục, phổi, não

và tim [185] Ở gan G.c Budd và c.s bằng kỹ thuật đo hình thái và định lượng phát xạ đồhiển vi điện tử đã tìm thấy 64- 67% vùng gan có ANAE dương tính [145] Hàm lượng củaANAE phân bố rất khác nhau trong các mô tuỳ thuộc vào chức năng và nhiệm vụ của mô đóđối với cơ thể

Đối với các tế bào máu, tùy thuộc vào từng dòng tế bào và giai đoạn trưởng thành

mà sự phân bố này cũng khác nhau Trong các dòng bạch cầu thì các tế bào đơn nhân thựcbào như dòng monocytes, macrophages có hàm lượng ANAE lớn nhấl sau đó đến dòng bạchcầu đoạn trung tính, ít nhất là đòng hồng cầu và dòng lymphocytes [1 17, 122, 155] Đặc

biệt tế bào huỷ cốt bào thì cho phản ứng ANAE dương tính rất mạnh (JR Connor và c.s

-1995) [39] Một điều cần lưu ý là trong các giai đoạn phát triển của các dòng tế bào thì các

tế bào trung gian thường có hàm lượng ANAE lớn hơn các tế bào đẩu dòng và các tế bàotrưởng thành Khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử tiêu bản nhuộm hoá học tế bào, RM

Hoedemakers và c.s (1995) đã cho rằng hàm lượng ANAE tỷ lệ với kích thước của tế bào

[67] Như vậy sự có mặt của ANAE là để đảm nhiệm chức năng của tế bào trong cơ thể nên

nó có the có trong tế bào này mà lại không có trong tế bào khác Ví dụ như dòng bạch cầumonocyles có nhiệm vụ thực bào nên nó cần có một hàm lượng ANAE lớn hơn các dòng tếbào khác để đảm nhiệm chức nâng thuỷ phân chống lại các dị nguyên xâm nhập từ bênngoài vào [84]

Trong tế bào thì sự phân bố ANAE cũng rất khác nhau ở các bộ phận của tế bào.Đối với bạch cầu hàm lượng ANAE cao nhất tại màng tế bào, các tiểu bào quan, dịch bàotương và ít nhất là dịch nhân Nơi dự trữ và phóng thích ANAE nhiều nhất là lưới nộinguyên sinh chất, máy golgi, lysosom [92, 128, 190] Bằng kính hiển vi quang học và kính

hiển vi điện tử, ML Buart và c.s (1988) đã chứng minh

AN AE có mặt ở mặt ngoài của màng bào tương và trên mặt ngoài bao quanh thân tế bào

Kurloff Còn M Frage và c.s (1991) khi phân tích ảnh tán xạ ngược (Ì)LU kscattered) và ảnh

của các electron thứ cấp (secondary electron) thấy rằng trong các tế bào lymphocytes ANAE

tập trung chủ yếu ở các màng và các hạt trong bào tương của tế bào [30] Các công trình

công bố gần đây đã cho thấy hầu hết các ANAE liên kết với màng tế bào [17, 33, 49]

1.1.2- Cấu trúc của ANAE

ANAE là một enzym thuộc loại serin eseraza tức là có tâm hoạt động được cấu tạo

bởi ba axit amin Ser-His-Asp/Glu [182] Đây là một nhóm enzym không đồng nhất về mặt

cấu trúc Các công trình công bố gần đây đã cho thấy trong các tổ chức khác nhau thì ANAE

có cấu trúc khác nhau Kích thước của enzym vào khoảng 2-3 Ả Trọng lượng phân tử từ

19.500 đến 180.000 dantol Bằng kỹ thuật sắc ký cột sephadex Kaphalia và c.s ị1997) đã xác

định được ANAE trong microsome của tế bào mỡ gồm hai phần một phần có trọng lượng

phân tử là 60 kDa và phần kia là 180 kDa Phần 180 kDa là một trimer và bị ức chế bởi

diisopropyl florophotphat tức là nó thuộc loại B esteraza [79] về mặt điện tích thì ANAE là

một enzym mang điện tích âm và các isoenzym nằm trong vùng đẳng điện (pl) từ 5,5-6,1

[146, 180] Nhiều isoenzym có tính đặc hiệu khá cao cho từng dòng tế bào và có thể coi nó

như một giá trị tham chiếu để nhận dạng dòng tế bào SM Ginac và c.s (1996) bằng phương

pháp điện di đã tìm ra 5 isoenzym của ANAE đặc hiệu cho các dòng tế bào máu khác nhau:

Monocytesl/Monocytes2 tìm thấy trong các tế bào dòng monocytes, Myl/My2 trong tế bào

dòng tuỷ, bệnh đa u tuỷ, dòng hồng cầu, và dòng tiểu cầu, Lyml/Lym2 trong tế bào

lymphocytes và cuối cùng là Und trong dòng tế bào chưa biệt hoá [59] Có thể khẳng định

ANAE là một nhóm enzym không đổng nhất trong các tế bào khác nhau cũng như trong các

bào quan khác nhau thì ANAE cũng khác nhau Ớ tế bào thận chuột thì ANAE có hai

isoenzym [22] cs Scott và c.s, bàng phương pháp điện di đã thu được ANAE tinh khiết

nhờ kỹ thuật săc ký các mảnh lưới nội nguyên sinh chất từ các tế bào dòng tuỷ và tìm ra hai

isoenzym của ANAE Hai isoenzym này thường có mặt trong tế bào ở cả hai dòng bach cầu

đoạn và monocytes Sự khác biệt của hai isoenzym là khác nhau về sự ức

chế hởi nhiệt độ và NaF [45] Trong các lysosom của tế bào monocytes, HJ Radzun và c.s

đã tìm ra 5 isoenzym đặc hiệu cho các vùng đẳng điện khác nhau Theo ngân hàng dữ liệu

cấu trúc enzym của Trung tâm Thông tin kỹ thuật sinh học Quốc gia Hoa Kỳ ( NCtìỉ) bằng

kỹ thuật Northern blot năm 1991, S.Munger và c.s đã giải mã mARN tinh khiết chiết xuất từ

tế bào monocytes và đã tìm ra cấu trúc bậc một của ANAE gồm 503 axit (Xin xem phẩn phụ

lục ỉ) Trên bản đồ gen người ANAE bạch cầu được mã hoá trên nhiễm sắc thể thứ 16 [105].

Trọng lượng phân tử là 60 kDa và bị ức chế bởi diisopropyl florophotphat nồng độ 2 mM.Tác giả cũng đã thấy rằng có sự giống nhau đến 90% về cấu trúc của ANAE bạch cầu vớiANAE ở microsome cứa tế bào gan ANAE tế bào gan có cấu trúc gồm 507 axit amin và tâmhoạt động cũng gồm Ser - His - Asp [95, 113] Các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn đangtiếp tục được nghiên cứu Khi phân tích gen lambda mã hoá ANAE của tế bào gan, T

Langmann và c.s (1997) nhận thấy chúng gồm một trimer, xếp chồng lên nhau với mỗi đoạn

dài khoảng 30 kb và được làm thành 14 cầu ngoại có chiều dài từ 39 đến 379 bp [88, 150].Song vị trí mà các nhà khoa học quan tâm hơn cả là vùng trung tâm hoạt động của enzym.Tất cả các ANAE đều có tâm hoạt động bao gồm một

gốc nucleophil là Ser, một gốc bazơ His và một gốc axit Asp Ổ một số isoenzym củaANAE thì gốc axit Asp được thay bằng Glu [185, 186]

1.1.3- Sinh tổng họp ANAE

Bản chất của ANAE là protein nên nó cũng được tổng hợp như các protein khác.Quá trình tổng hợp diễn ra trong các ri bosom Các ribosom này thường được gắn với màng

lưới nội nguyên sinh Lưới nội nguyên sinh (reticuloendothelium) là một hệ thống ống nhỏ

xuyên qua toàn bộ tế bào và đặc biệt phát triển trong các tế bào chế tiết cao như tế bào gan

nó chiếm tới 70% Lưới nội nguyên sinh là một trong những thành phần của màng nhân, ởđây nó biệt hoá thành các lỗ nhân, do đó nhân có thể liên hệ gần như trực tiếp với nguyên

sinh chất Tại đây ARN thông tin (mARN) sau khi sao chép thông tin di truyền từ ADN ở

trong nhân đi qua một cách dễ dàng và tiến tới các ribosom có gắn với màng của lưới nộinguyên sinh chất để tổng hợp ra enzym Các lỗ này cũng gặp ở một số màng sinh ra từ lướinội nguyên

sinh gọi là màng cửa sổ, những màng này tập trung khá nhiều trong nguyên sinh chài CácmARN cũng có thể đi qua các lỗ này mà vào nguyên sinh chất để gắn vào ribosom tự dotrong nguyên sinh chất Quá trình tổng hợp ANAE được diễn ra tại các ribosom gắn vớimàng của lưới nội nguyên sinh chất là chủ yếu mARN của bạch cầu monocytes và

macrophage để tổng hợp ANAE bao gồm 1766 bases (S.Munger- 1991) Sự sao mã di truyền

từ ADN sang mARN trong tế bào monocytes bắt đầu từ vùng Spl [87]

Quá trình tổng hợp ANAE được điều chỉnh bởi các hormon tăng trưởng và các chấtnội tiết tố của cơ thể Điều này được chứng minh là quá trình tổng hợp isoenzym ANAE làES-4 được điều chỉnh bởi thyroxin là một nội tiết tố của tuyến giáp Các tiền hormon sinhdục như: Demethasone gây kìm hãm quá trình sao mã của mANR dẫn tới làm giảm quá trìnhtổng hợp một số isoenzym ANAE, còn testosteron thì kích thích tổng hợp ANAE [43, 54,

70, 140, 189] Các isoenzym chịu sự điều chỉnh của các hormon này được gọi là ANAE phụthuộc hormon sinh dục ANAE-29 là một isoenzym điển hình cho nhóm này, quá trình tổnghợp ANAE-29 tại các mô phụ thuộc vào nồng độ của testosterol trong huyết tương [178].Trong bệnh đái đường hàm lượng ANAE trong tuyến thượng thận thường giảm rõ rệt RD

Duan và c.s (1993) cho rằng sự thiếu hụt insulin đã gây cảm ứng ức chế tổng hợp ANAE

trong tuyến thượng thận [47]

Cũng như các quá trình sinh học khác việc tổng hợp ANAE được kích thích bởi phảnứng cảm ứng đối với cơ chất đặc hiệu của từng isoenzym HA Van Lith và c.s thấy rằng quátrình tổng hợp ANAE trong huyết tương và ruột tăng lên khi tăng chế độ ãn dầu dừa, dầuoliu và dầu ngô ở những người bị bệnh đái đường Tác giả cho rằng có sự tăng này là do có

sự cảm ứng đối với cơ chất của các isoenzym của ANAE [173] Sau khi tổng hợp ANAEđược vận chuyển vào lưới nội nguyên sinh chất, từ đây ANAE tiếp tục được đưa vàolysosom, ty lạp thể và chủ yếu là gắn với mặt trong của màng tế bào [114] Ngoài ra có rấtnhiều loại thuốc gây ức chế hay làm tăng sự tổng hợp ANAE trong bạch cầu như:hexametylen bisaxetamit làm tăng ANAE trong tế bào ung thư dòng tuỷ chưa biệt hoá U-

937 [20]

1.1.4- Chức năng sinh lý và bệnh lý của ANAE trong cơ thể

Như trên ta đã biết ANAE có thể xúc tác cho phản ứng thuỷ phân các este của axitcacboxylic và ancol Các este này có thể là các aliphatic, este vòng thơm, amit thơm Đây làmột phản ứng phổ biến trong mọi tế bào đặc biệt trong việc chuyến hoá các chất nội, ngoạisinh Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tính đa dạng trong hoạt động xúc tác của ANAE ởcác tế bào khác nhau [91, 146] ANAE tham gia chủ yếu vào các chức năng sinh lý sau:

1.1.4.1- Chức năng chuyên hoá:

ANAE tham gia vào rất nhiều các phản ứng như chuyển hoá các chất dinh dưỡng, chuyển hoá thuốc, điều hoà sinh tổng hợp

Đối với chuyển hoá glucozơ: ANAE tham gia vào các chu trình Krebs sinh năng

lượng, chu trình xitric để tạo axyl-coA, điều hoà chuyển hoá lipit và nhiều chu tình chuyểnbon khác [l5??] Trong chuyển hoá glucoza, ANAE xúc tác cho phản ứng thuỷ phânaxylglycerol hay axyl-Co A tao thành axit tương ứng để hình thành chất vận chuyển glucozavào chu trình Krebs tạo nãng Iượrig cho tế oào [92, 109]

Đối với chuyển hoá lipit: T Tsujita và c.s (1994) cho rằng ANAE có vai trò quan

trọng trong việc chuyển hoá và tổng hợp các lipit phức tạp ANAE thuỷ phân các triaxylglyxerol, axyl-CoA mạch dài tạo thành gốc axyl kết hợp với ancol hoặc cholesterol hìnhthành các este Tốc độ các gốc axyl kết hợp với ethanol nhanh gấp khoảng 25-30 lần so với

H20 [123, 166, 167] HA Vanlith và c.s (1993) thấy rằng hàm lượng ANAE tăng lên trong

huyết thanh của những người ăn kiêng hoàn toàn cholesterol Nguyên nhân của sự tăng này

là nhằm hấp thu tối đa lượng cholesterol có trong thức ăn ở ruột [168, 174] Một sốisoenzym của ANAE như ES-4 tham gia trực tiếp vào chu trình tổng hợp axit béo bằng phảnứng thuỷ phân axyl-CoA [184, 189]

Đối với chuyển hoá ancol đưa từ ngoài vào: BS Kaphalia và c.s (1997) phát hiện

ANAE trong mô mỡ tham gia vào khâu đầu của quá trình tổng hợp sinh học các este củaaxit béo mạch dài nội bào và ancol đưa từ ngoài vào [79, 165] ANAE đóng vai trò thuỷphân các este nội bào để giải phóng axit béo mạch dài từ đó dưới tác dụng của các enzym

tổng hợp este của 2-cloroetyl với axit béo (FACEES) và

enzym lổng hợp este của oroetyl với axit béo (FAEES) xúc tác phản ứng este hoá các axit

này với ancol đưa từ ngoài vào Bằng phương pháp dùng kháng thể đa giá Ihỏ T Tsujita và

c.s ( Ị 9 9 2 ) đã thấy rằng tỷ lệ ANAE tham gia vào chuyển hoá ancol trong mô IĨ1Ỡ 86%, gan23%, phổi 62%, tinh hoàn 82% [165] Nhưng trong các mô khác như dạ dày, gan, tuỵ lànhững mô có chứa nhiều ANAE thì ancol lại làm giảm hoạt tính của enzym Nhờ thực

nghiệm in vitro, B Stem và c.s (1996) đã thu được kết quả: với nồng độ etanol 5% sẽ làm

giảm hoạt tính ANAE của các tế bào gan 10%, trong tế bào dạ dày là 20% và trong tế bàotuỵ tới 46% [157] Nhiều tác giả cho rằng hệ ba enzym này đóng vai trò quan trọng trongcác bệnh mãn tính gây ra bởi rượu ở những người nghiện rượu như bệnh: thoái hoá thể kínhtrong gan những người nghiện rượu [79, 158, 165] Như vậy ANAE có vai trò quan trọngtrong chuyển hoá các ancol đưa từ ngoài vào

Đối với chức năm của hê thần kinh: Trong tế bào thần kinh ANAE có mặt trong lưới

nội nguyên sinh chất và xúc tác cho phản ứng thuỷ phân tạo temocapril, axetate là các chất trung gian dẫn truyền tín hiệu thần kinh [21, 63, 109]

p-nitrophenyl-Như vậy ANAE có khả năng tham gia vào một số chu trình quan trọng trong cơ thểnên một số tác giả còn cho rằng sự thay đổi nồng độ của ANAE có ảnh hưởng đến kích cỡ

và thói quen ăn uống của một số loài MC Fossi và c.s (1996) thấy rằng có sự liên quan chật

chẽ giữa hàm lượng ANAE trong máu với kích thước và thói quen ăn uống của một số loàichim Các loài chim có kích thước nhỏ thì có hàm lưọng ANAE cao và thường là những loàikhông ăn thịt và ngược lại [52]

Chức năng chuyển hoá thuốc: ANAE có khả năng tham gia vào chuyển hoá thuốc

đặc biệt là các tiền được (được để cập kỹ hơn ở phần ứng dụng ANAE), phân huý các sản

phẩm chuyển hoá thuốc trung gian độc đối với cơ thể [15, 183] Bên cạnh đó nó cũng lànguyên nhân giảm hoạt tính và tác dụng của nhiều loại thuốc khác nhau

1.1.4.2- Chức năng thải độc bảo vệ cơ thê:

ANAE đóng vai trò quan trọng trong việc thải độc đối với cơ thể [14, 67] Chứcnăng này được giới hạn bởi nồng độ ANAE thấp trong huyết thanh và trong tế

hào Khi bị nhiễm độc ANAE trong các tế bào bạch cầu thường bị giảm mà biểu h i ệ n trênkính hiển vi quang học là giảm các hạt đặc hiệu của tế bào bạch cầu Sự giám này thườngthấy trong các công nhân làm ngành than, hoá chất bảo vệ thực vật Ị107] Sự tăng ANAEtrong máu đặc biệt là isoenzym ANAE-S có nguồn gốc từ gan là dấu hiệu của sự ngộ độc[187] Các hợp chất ngoại lai đặc biệt là các hợp chất có chứa photpho hữu cơ là những độc

tố đối với cơ thể nhưng đồng thời cũng là chất ức chế đối với ANAE Cơ chế của sự ức chếnày sẽ được trình bày trong phần sau Sự kết hợp của ANAE với loại hợp chất này mangtính không thuận nghịch vì thế nó làm cho mất hoạt tính và phức hợp enzym-độc chất nhanhchóng bị loại ra khỏi cơ thể [36, 146, 163] Đối với tế bào thần kinh các isoenzym củaANAE được coi như hàng rào máu - não bảo vệ hệ thống thần kinh trung ương đối với các

hợp chất este hoặc amit có hại xâm nhập vào não [109, 112, 184] Pindel và c.s (1999) đã

cho răng ANAE có vai trò quan trọng trong việc thải độc, phân huỷ và làm giảm hàm lượngcác chất ma tuý trong cơ thể người [130] Nó phân cắt các nhóm benzoyl của cocain vànhóm axetyl của 4-metylumbelliferyl axetat, heroin và 6- monoaxetylmorphin để tạo thànhcác sản phẩm cuối cùng là morphinglucoronat đào thải ra ngoài nước tiểu Quá trình thuỷphân này chủ yếu diễn ra tại các mô có khả năng sản xuất và dự trữ ANAE cao như gan,huyết tương, thận Trong các isoenzym của ANAE thì hCE-2 có ái lực đối với các chất matuý cao hơn so với các isoenzym khác [130] ANAE còn tham gia chuyển hoá các nicotinthuốc lá, quá trình này phụ thuộc vào tương tác giữa nhóm kị nước của enzym cũng như cấutrúc lâp thể và các dạng chuyển hoá trung gian của nicotin [48]

1.1.4.3- Chức năng miễn dịch:

ANAE đóng vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch chống lại các dị nguyênbảo vệ cơ thể [87] Shiotsuki và c.s dùng lipopolysaccharide của vỏ vi khuẩn E coli tiêmvào tổ chức lymphocytes sau 6 giờ nồng độ của isoenzym của ANAE là hCE-1 và hCE-2tãng lên rõ rệt Như vậy các dị nguyên như vỏ vi khuẩn, các độc tố chính là các chất cảmứng kích thích quá trình tổng hợp ANAE trong tế bào Trong tế bào bạch cầu ANAE thamgia trực tiếp vào việc thuỷ phân các dị nguyên xâm nhập vào cơ thể

Cơ chế của quá trình thực bào với sự tham gia của ANAE đã được s Yokota và c.s

( Ị 9 9 3 ) phát hiện qua thí nghiệm sau: tiêm leupeptin cho chuột với liều 2 mg / 100 g trọng

lượng, sau 20 phút tất cả các lysosom và ty lạp thể của tế bào bạch cầu được bao quanh một

màng kép của lưới nội chất Những màng này dương tính với ANAE Sau một thời gian (40

tới 60 phút) xuất hiện rất nhiều các không bào thực bào chứa leupeptin Lúc đầu bao quanh

các không bào là một lớp màng kép của lưới nội nguyên sinh chất sau đó lớp màng kép mất

đi và thay thế bằng một màng đơn Và trong lớp màng đơn này ANAE vẫn dương tính Tácgiả đã cho rằng quá trình thực bào bắt đầu hình thành không bào từ lưới nội nguyên sinhchất trong đó có chứa các kháng nguyên, lysosom, ty lạp thể; sau đó màng của lysosom, tylạp thể và lưới nội nguyên sinh chất kết hợp với nhau dẫn đến thoái biến chỉ còn một màng

có bủn chất là màng của lysosom Chính tại lysosom này các enzym đã được phóng thích để

ly giải các kháng nguyên lạ xâm nhập vào cơ thể trong đó có ANAE [192] B Sternby và c.s

(1991) khi nghiên cứu hoạt tính của ANAE trong các tế bào ruột bị tổn thương do nhiễm

trùng cũng thấy ANAE tăng cao (165% so với chuẩn) và giảm chí còn 32% ở giai đoạn

cuối Tác giả cho rằng sự tăng ANAE trong giai đoạn đầu nhằm tăng khả năng thuý phâncác vi khuẩn và độc tố của chúng, còn ở giai đoạn sau giảm đi là để tránh sự thuỷ phân cácchất cần thiết hàn gắn vết thương do nhiễm trùng gây ra [84]

1.1.5- Úng dụng của ANAE trong y học

A N A E tìíịùV nav được ứng íluniị rộng rãi trong ngành V học ở cả lĩnh vực chan đoán vù diều trị.

Trong lĩnh vực chẩn đoán:

Chẩn đoán bênh lý huyết hoc :

Trong các dòng tế bào máu thì dòng monocytes/macrophages, lymphocytes T cóhoạt tính ANAE cao hơn so với các tế bào khác Nhờ đặc điểm này mà các nhà hu vết học

có thể sử dụng nó như một công cụ hữu ích dùng trong việc xác định các dòng tế bào trong

bệnh ung thư máu Hội các nhà huyết học của Anh-Pháp-Mỹ ( F A B ) đã đưa ra cách phân

loại ung thư máu dựa trên những đặc điểm về hình thái, hoá tế bào, miễn dịch và di truyềntrong đó nhuộm phát hiện ANAE thực sự là một chỉ số tham chiếu quan trọng giúp phân

biệt ung thư máu thể M - 4 và M - 5 với các thể khác (bảng 7.7 - trang 13) Đó là các thể

ung thư hỗn hợp dòng tuỷ - monocytes

( M 4 ) và dòng monocytes ( M 5 ) Ở các thể này ANAE dương tính rất mạnh nhưng ở thể

M-5 thì bị ức chế bỏ'i NaF [16] Bằng cách nhuộm có sử dụng chất ức chế là NaF chúng ta có

thể chẩn đoán phân biệt được đó là ung thư dòng monocytes hay các dòng khác (clònf>

hồiìíỊ cầit, tuy ) Ngoài ra, sử dụng kỹ thuật nhuộm ANAE còn cho phép xác định số

lượng tế bào lymphocytes T trong máu điểu này sẽ giúp ích rất nhiều cho việc chẩn đoáncác bệnh giảm tế bào lymphocytes T như bệnh phong [98]

Trong chẩn đoán pháp ỵ :

Ngày nay hoá mô và hoá học tế bào ngày càng được ứng dụng vào công tác pháp y

và được coi như những tài liệu mang tính pháp qui dùng để tham chiếu trong công tác thi

hành pháp luật Theo w Dachun và c.s (1992), thì việc sử dụng kỹ thuật xác định ANAE

trong các mô tổn thương để xác định thời gian chết cũng như đặc điểm tổn thương rất có giátrị và có độ chính xác cao với a=0,01 ANAE giảm dần tại các mô bị chết theo thời gian vàtổn tại tối đa là 4 giờ sau khi chết Dựa vào đường cong động học của quá trình giảm này

mà có thể tính được thời gian chết của mô tổn thương [41]

Tuý Mail Hoá học tế

bào

Miễn dịch Di

truyềnM-4

■Nếu <5.107L TBmonocytes

thì phải kèm theo lysozymetrong huyết tưong tăng vàhoá học tế bào dòngmonocytes (+)

PER (+) SD(+) ANCE(+) ANAE(+)

CD13(+)CD15(+)CD33(+)HLA-DR (+)CD14(+)

t(9;11)(p22;q23)

PER (+) SD(+) ANCE(+) ANAE(+)

CD13(+)CD15(+)CD33(+)HLA-DR (+)CD14(+)

t(16;16)inv(16)

PER (-/+) SD(-/+) ANCE(-) ANAE(+) và bị ứcchế bằngNaF

CD13(+)CD15(+)CD33(+)HLA-DR (+)CD14(+)

t(9;11)(p22;q23)

PER (-/+) SD(-/+) ANCE(-) ANAE(+) và bị ứcchế bằngNaF

CD13(+)CD15(+)CD33(+)HLA-DR (+)CD14(+)

t(8;16)(pll:pl3)

Ghi chú : TB: tế bào; HC: hồng cầu; PER: nhuộm peroxydaza; SD: nhuộm sudan B;

Trong chấn íỉoán dôc chất :

E.Heymann ( 1 9 9 9 ) đã giới thiệu hai phương pháp định lượng photpho hữu cơ nhờ

kỹ thuật ức chế ANAE [66] Cả hai phương pháp đều dựa vào việc thêm một lượng mẫuchưa biết nồng độ photpho hữu cơ vào hỗn hợp phản ứng chứa enzym ANAE tinh khiết và

cơ chất đặc hiệu Do bị ức chế làm cho tốc độ phản ứng giảm đi so với mẫu chuẩn từ đó tìm

ra được nồng độ photpho Với kỹ thuật này cho phép xác định được photpho hữu cơ ngay cả

khi hàm lượng rất nhỏ (cỡ 0,1 nmoỉ paraoxon) và có giá trị trong lĩnh vực độc chất bởi vì

rất nhiều thuốc trừ sâu có chứa photpho hữu cơ

Trong lĩnh vục điều trị:

Từ những năm 1990, một hướng nghiên cứu mới sử dụng phương pháp kết họpenzym - tiền dược - liệu pháp gen đạt hiệu quả thử nghiệm rất cao trên cả phương pháp nuôicấy và thực nghiệm ở động vật đổng thời mang lại nhiều hy vọng trong điều trị bệnh nan y.Một trong các hướng đó là người ta đã sử dụng các tiền dược như một cơ chất của ANAE,sau khi thuốc đi vào máu nhờ ANAE xúc tác thuỷ phân tạo ra hoạt chất chính tác dụng lêncác mô đích cần điều trị Điều này sẽ có nhiều lợi ích trước hết là giảm được liều thuốc đưavào bởi vì các tiền dược thường là các chất ít bị phân huỷ bởi các enzym do nó là một este.Thứ hai là thuốc sẽ được giải phóng một cách từ từ nên luôn duy trì được một hàm lượngthuốc nhất định trong cơ thể Ngoài ra còn có thể chọn lựa được mô đích mà thuốc cần tácdụng như gan, thận là các mô có chứa nhiều ANAE Đặc biệt khi kết hợp với liệu pháp ghépgen sinh tổng hợp ANAE thì hiệu quả điều trị của các tiền dược là rất cao nhất là đối vớiung thư của các mô đặc, nó cho phép thuốc tác động chính xác vào vị trí ung thư và giảmtính độc dược toàn thân, về mặt động học thì tác dụng của ANAE phụ thuộc nhiều vào sựphân cực và cấu trúc lập thể của các nhóm thế axyl của tiền dược Tốc độ xúc tác củaANAE tăng tuyến tính với khả năng phân cực của tiền dược tức là khả năng tan của tiềndược trong dung dịch Mặt khác ANAE là một enzym xúc tác thuỷ phân đặc hiệu về mặt lậpthể thường là thuỷ phân liên kết este nằm ớ vị trí equatorial vì thế trong tổng hợp tiền dượccần chú ý tính tan và cấu hình lập thể của tiền dược [53, 149,182] Sau đây là ba ví dụ về sửdụng tiền dược -

ANAK và liệu pháp gen:

- Trans điều tri U H Í > thư: CPT-11 hay còn gọi là irinotecan, PC thuộc họ tiền

dược paclitaxel là các tiền chất chống ung thư theo cơ chế này CPT-11 và PC sau khi đượcđưa vào cơ thể sẽ bị thuỷ phân bởi ANAE tạo thành camptothecin và pađitaxel tương ứng làhoạt chất chống ung thư mạnh đặc biệt là ung thư biểu mô phổi và ung thư hắc tố [133,147] Trong đó isoenzym của ANAE là hCE-2 có ái lực cao với CPT-11 [42, 70, 116] Vớiliều điều trị 2,5 mg/kg/ngày X 5 ngày/tuần X 2 tuần và nhắc lại sau 21 ngày với 3 chu kì

điều trị (MK Danks và c.s - 1999) 7/7 con chuột được gây ung thư tế bào cơ vân đều khỏi và không thấy tái phát [180] A Kojima và c.s (1998) đã dùng AdCMV mang đoạn mã di

truyền ANAE-ADN ghép vào ADN của tế bào ung thư biểu mô tuyến A549

(adenocarcinoma) kháng CPT-11 Kết quả giảm 35% kích cỡ khối LI vào ngày thứ 27 và

41% ở ngày thứ 34 sau điều trị bằns CPT-11 so với khối u không được ghép gen đồng thời

hoạt tính của ANAE lang 42% so với tế bào A549 không kháng thuốc nhờ đó có thể giảm

được liều điều trị tức là giảm độc tính của thuốc đối với cơ thể [82, 83] Điều này đã mở ra

hy vọng về điều trị ung thư đặc biệt là các ung thư đặc kháng thuốc

- T i o i m điều tri các rối loan chuyển hoá ỉipid: Lovastatin (LVS) là một tiền dược

đang được sử dụng điều trị rộng rãi bệnh tăng Cholesterol loại LDL LDL tăng thường gâygiảm sức bền thành mạch và dễ dẫn tới xuất huyết ở người bị bệnh cao huyết áp LVS tồntại dưới dạng este khi đưa vào cơ thể, nhờ tác dụng của ANAE thuỷ phân tạo thành

lovastatin hydroxy axit ( L H A ) tác dụng lên LDL để loại nó ra khỏi cơ thể Trong huyết

tương LHA được tạo thành với tốc độ 15,8 pmol.min'1, trong tế bào gan ở microsome là2,13 pmol.mg'1 protein.min'1 và trong cytosol là 0,92 pmol.mg'1 protein.min'1 BK Tang và

c.s (1995) đã tính toán trung bình huyết tương thưý phân LVS khoảng 18%, lysosom 15%

và cytosol chiếm khoảng 67% ị 162] Hiệu quả điều trị phụ thuộc vào khả năng tổng hợpANAE trong tế bào gan Qua khảo sát 17 mẫu sinh thiết tế bào gan tác giả thấy rằng có 1/17mẫu cả cytosol và microsome đều không có ANAE, 2/17 mẫu thiếu hụt ANAE Điều nàydẫn tới giảm hiệu quả của liều điều trị LVS và kỹ thuật ghép gen ANAE của bạch cầu bệnh

1R

Nói về tủm hoat đông: ANAE gồm một số isoenzym thuộc loại serin esteraza và có tâm hoạt động là Ser-His-Asp [101] Một

số isoenzym của ANAE thì Asp được thay thế bằng Glu MA Myers và c.s (1993) khi tiến hành thay thế His 187 năm trong

tâm hoạt động của isoenzym ANAE-6 bằng Glu thấy rằng ANAE bị biến đổi I'õ rệt về đặc điểm xúc tác Nó làm pH hoạt độngtối ưu tăng từ 7 lên 9, giảm ái lực đối với cơ chất là este của (3-naphtyl và p-nitrophenylaxetate, mất hoạt tính đối vớiaxetylthiocholine và làm tăng năng lượng hoạt hoá tự do Gibb's Điều này đã chứng tỏ gốc thứ 187 nằm trong trung tâm hoạtđộng của ANAE-6 đã tương tác trực tiếp với nhóm ankyl kị nước và sự tương tác này nằm trong giai đoạn chuyển tiếp Sựthay thế Glu làm giảm khả năng tham gia vào quá trình xúc tác các phản ứng thuỷ phân [115] Mô hình RD Newcomb và c.s

(1997) đưa ra đã chứng minh rằng Aspl37 có thể đóng vai trò như một bazơ định hướng phân tử H20 vào vị trí phù hợp tạivùng tâm hoạt động thuận lợi cho quá trình thuỷ phân cơ chất của ANAE [118] Theo Webb thì tâm hoạt động của ANAEđược chia làm 4 vùng ái lực với các nhóm: gốc của ancol (Vị), liên kết este (V2), gốc của axyl có hai vùng (V3, V4) (Hình

1.1) Tác giả cho rằng ái lực và phản ứng thuỷ phân este tăng lên nếu nhóm axyl có chiều dài từ 4-6 nguyên tử c Nếu chiềudài của gốc axyl tăng lên trên 4 nguyên tử c thì nó sẽ được hấp phụ tĩnh điện lên vùng v4 Khi đó phân tử sẽ bị quay đi mộtgóc làm thay đổi không gian lập thể của phân tử cơ chất vì thế tốc độ phản ứng bị giảm đi[36]' acyl c o

alkyl

[-]

G

[-)

S ơ đ ồ ỉ ì : C ơ c h ế A N A E xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết este Như vậy

quá trình xúc tác thuỷ phân diễn ra tại trung tâm hoạt động trên hai axit amin là His và Sercòn Asp là một axit amin có vai trò định hướng phân tử H20 vào vị trí thích hợp cho quá

Hình 1.1- Mô hình tâm hoạt động của ANAE theo Webb Trong dó :

V Ị ' Vùng ái lực với liên kết ankyl; V2: Tâm hoạt động có ái lực với liên kết este;

Còn Jones đưa ra mô hình tâm hoạt động được biểu diễn theo không gian

hình vuông như sau:

Hình ỉ 2- Mô hình tâm hoạt động theo Jones Trong đó: Hị! Vùng ái

lực kị nước lớn; Hs: Vùng ái lực kị nước nhỏ pf: Vùng án ngữ không gian cực trước;

PB: Vùng án ngữ không gian cực sau Ser: axit amin serin nằm trong trung tâm hoạt

động

Vùng Hị là vùng dành cho tương tác điện giữa enzym và nhóm ankyl Còn vùng Hs

là vùng tương tác điện giữa enzym và gốc axyl Chính vì có cấu trúc tâm hoạt động như vậynên phân tử cơ chất có khả năng liên kết thuận lợi khi các gốc ankyl có cấu trúc lớn còn gốc

axyl thì nhỏ ỉ.2.1.2- Điều kiện tối ưu:

vể cơ chất: ANAE có thể thuỷ phân được khoảng 19 cơ chất khác nhau:

p-nitrophenylaxetat, a và P-naphtylaxetat Ái lực của ANAE đối với các cơ chất này là rấtkhác nhau và phụ thuộc vào các isoenzym ANAE-A trong microsom của tế bào gan có áilực thấp đối với p-nitrophenylaxetat Km vào khoảng 25 nmol Còn cũng với cơ chất này thìANAE-B có ái lực khá cao Km tới 400 I^mol [168, 185] Tuy vậy trong sô các cơ chấtnhuộm ANAE theo phương pháp tạo phẩm màu azo thì a-naphtol axetate phù hợp để pháthiện nhiều isoenzym của ANAE nhất Sở dĩ như vậy là vì gốc ancol tạo ra sau khi thuỷ phân

có tính tan thấp và có tính đặc hiệu cao với nhóm enzym ANAE Trong các nhóm thế axylcủa a-naphol thì ANAE-1 có ái lực đối với propionate cao hơn so với axetat, butyrat vàhexonat [171]

Về pH: ANAE hoạt động tốt trong vùng pH = 6,5 - 8.5 [171] Tuy nhiên tuỳ vào

từng phản ứng cụ thể mà lựa chọn pH thích hợp sao cho phản ứng diễn ra thuận lơi nhất

về nhiêj đô: dải nhiệt độ của ANAE hoạt động khá cao từ 35-60° thậm chí G Manco

và c.s đã phát hiện một ANAE trong vi khuẩn Bacillus có khả năng hoạt động tối ưu ở nhiệt

dịch của ANAE [187, 190] D Patel và c.s (1991) đã tìm ra 17 chất ức chế khác nhau đối với

ANAE của bạch cầu mà chủ yếu là hợp chất photpho hữu cơ và hợp chất của flo Cơ chế của

sự ức chế này phụ thuộc chủ yếu vào sự tương tác cạnh tranh giữa cơ chất và chất ức chế tạitâm hoạt động [125] Các chất ức chế ANAE có thể phân loại ra một số loại chính sau đây:

1.2.2.1- Các hợp chất flo:

Có rất nhiều công trình công bố về các dẫn chất có flo gây ức chế ANAE [25, 36,75] Trong các isoenzym của ANAE thì loại A bị ức chế bởi phenylmethylsunfonyl floride

( P M S F ) - sản phẩm thuỷ phân của parathion và cresylbenzodioxaphotphorin oxit còn gọi

là paraoxon - với nồng độ rất thấp IC50 vào khoảng 100 nmol/ml Còn loại B thì chỉ bị ứcchế ở nồng độ PMSF khá cao IC50 vào khoảng 100 |ig/ml [168] Theo Pophof thì cơ chế của

sự ức chế này là do cơ chế tương tác tĩnh điện đẩy nhau giữa cơ chất và hợp chất của flohoặc giữa yếu tố tiếp nhận của phân tử với vùng tâm hoạt động [132]

1.2.2.2- Các dẫn chất của photpho hữu cơ:

Về mặt hoá học thì đó là một nhóm chất mà trong phân tử của nó có chứa ionphotpho hoá trị 5 liên kết trực tiếp với các gốc hữu cơ hoặc thông qua nguyên tử oxy Đây làmột phản ứng ức chế cạnh tranh giữa cơ chất và hợp chất có chứa photpho hữu cơ [36] Quátrình ức chế của các hợp chất photpho hữu cơ là do sự kết hợp không thuận nghịch với

ANAE từ đó làm mất hoạt tính của enzym (sơ đồ 1.2) Quá trình ức chế này gọi là ức chế

cạnh tranh không thuận nghịch Ngược lại quá

trình ANAE xúc tác cho phản ứng thuỷ phân cơ chất là quá trình thuận nghịch, enzym saukhi tham gia vào phản ứng thuỷ phân tiếp tục quay trở lại xúc tác cho phân tử cơ chất tiếptheo Đời sống của ANAE càng kéo dài thì khả năng xúc tác của enzym càng lớn sản phẩmphản ứng, các chất hoá học và các yếu tố vật lý không thuận lợi thường là các yếu tố gây ứcchế làm giảm đời sống của enzym.

ANAE

Sơ đồ 1.2: Cơ chế của sự ức chếANAE xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết este Trong đó:

Rj, R2: là các gốc ankyl; Y: -O, -C ; X: -CN, -F, -0C6H4N02 Trong những năm gần đây córất nhiều cổng trình công bố về các hợp chất photpho hữu cơ gây ức chế ANAE in vitro và

in vivo [66, 100, 151, 163, 180, 190] Các hợp chất được tập trung nghiên cứu nhiều nhất là:parathion, tri - o - tolyl photphat, dietyl 4-nitrophenyl este của axit photphoric, o,o-dialkyl-s- bromethiophotphat, p,p-diphenyletylphotphonic

AP Brestkin và c.s cho rằng quá trình ức chế ANAE phụ thuộc vào cấu trúc của gốcankyl và trọng lượng phân tử của hợp chất photpho hữu cơ [25] Hầu hết các hợp chất này là

các chất độc Bằng thực nghiệm trên chuột Nagy và c.s (2000) đã chứng minh diisopropyl

florophotphat gây ức chế hoạt động của ANAE, làm giảm khả năng thải độc đối với chất độc2-pyrrolino-doxorubixin [116] Ngoài ra parathion sau khi vào cơ thể gây ức chế ANAE làmngăn cản sự dẫn truyền của hệ thần kinh trung ương Chính vì thế parathion thường được

dùng trong các thuốc bảo vệ thực vật RD Newcomb và c.s (ỉ 997) đã cho rằng sự kháng

thuốc trừ sâu có chứa photpho hữu cơ luôn đi kèm với sự giảm hoạt tính của ANAE trongcác loài này

Nguyên nhân của sự giảm này là do đột biến trong mã di truyền tại vùng tâm hoạtđộng và Gly]37 đã thay thế cho Asp]37 Đặc biệt có rất nhiều công trình báo cáo cho rằngANAE có vai trò quan trọng gây ra hiện tượng kháng thuốc diệt muỗi của các loại muỗitruyền bệnh sốt rét [29, 118, 148, 187, 188] Ngược lại với các loại sâu thì nồng độ củaANAE trong muỗi lại tăng cao, sự tăng này do hiệu ứng cảm ứng sự kích thích tổng hợp

ANAE nhằm bảo vệ cơ thể muỗi [28] AJ Ketterman và c.s ( 1 9 9 2 ) căn cứ vào hệ số động

học của tốc độ thuỷ phân liên kết este ANAE ở muỗi đối với 4 loại thuốc diệt muỗi làtemephos, clorpyriíbs, ĩenitrothion và propoxur, tác giả cho rằng ái lực của liên kết giữaANAE với các chất này đóng vai trò quyết định trong việc đào thải các thuốc diệt muỗi vàtính kháng thuốc [81, 131]

1.2.2.3- Các hợp chất khác:

EDTA cũng là một chất ức chế mạnh đối với một isoenzym của ANAE là hCE-Aphụ thuộc canxi vì vậy máu thu thập có chất chống đông là EDTA sẽ làm giảm hoạt tính của

ANAE [163] T Purshottam và c.s (1992) khi sử dụng soman với liều LD50 (0,22mglỉkg)

thấy rằng sau 30 phút ANAE trong huyết thanh bị ức chế hoàn toàn, trái lại ANAE trong tế

bào gan lại hầu như không bị ảnh hưởng [135] Ngoài ra các kim loại nặng cũng là nhữngchất ức chế đối với ANAE Đặc biệt các ion kim loại này thường đi kèm với muối điazo đểlàm tăng tính bền của muối vì vậy khi chọn muối điazo cần hết sức chú ý đến các ion kimloại tạo phức với các muối này

1.2- CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ANAE

Có hai phương pháp chính xác định ANAE: phương pháp phá vỡ màng tế bào vàphương pháp không phá vỡ màng tế bào Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểmriêng Mỗi phương pháp đòi hỏi những trang thiết bị thích hợp Vì vậy tuỳ vào mục đíchnghiên cứu, ứng dụng mà người ta sử dụng phương pháp nào cho thích hợp Trong thực tếnghiên cứu enzym người ta thường sử dụng cả hai phương pháp, chúng bổ sung cho nhau từ

đó có thể thu được kết quả tổng quan và toàn diện hơn về enzym

Sơ đồ 1.3 dưới đây sẽ trình bày một cách tổng quát nhất về vai trò, ứng dụng cua haiphương pháp phân tích này:

Sơ đồ 1.3: Các phương pháp xác định ANAE

1.3.1- Phương pháp phá vỡ tẽ bào

Là phương pháp xác định ANAE bằng cách phá vỡ tế bào từ đó thu được các dịchbào tương hay các mảnh bào quan như: màng tế bào, lưới nội nguyên sinh chất, bộ máygolgi, lysosom Trước hết người ta tách tế bào định nghiên cứu bằng các phương pháp lytâm tỷ trọng hay tách bằng các phương pháp tách đặc hiệu cho từng

dòng tế bào nhằm thu được tế bào nghiên cứu thuần nhất Để tách bạch cầu thì người tathường dùng bông thuỷ tinh, còn tách bạch cầu monocytes thì tốt nhất là dùng ống plasticbẹt và ly tâm trong dung dịch Percoll và NaCl 1,5 mol.r' với tỷ trọng 1,033 tới 1,050 [74,104] Sau đó phá vỡ màng tế bào bằng nước cất hoặc nhiệt độ đông lạnh tức là đưa tế bàovào nhiệt độ âm sau đó đưa nhanh lên nhiệt độ cao mà ở đó enzym còn giữ nguyên được cấutrúc Tiến hành ly tâm tỷ trọng hoặc kết tủa các microsome bằng aceton sẽ thu được dịchbào tương, các bào quan, hoặc các mảnh tế bào [165, 166] Dịch bào tương có thể tiến hànhphân tích định lượng ANAE ngay hoặc được tiếp tục tinh chế để thu ANAE tinh khiết Đốivới các mảnh bào quan tiến hành phá vỡ màng bào quan ta thu được dịch chứa các enzymhay các mARN Tinh khiết các enzym hoặc mARN này bằng các phương pháp sắc ký lỏngcao áp hoặc sắc ký phân bố [63] Một kỹ thuật tinh khiết enzym thường hay được sử dụng làphương pháp sắc ký tương tác kỵ nước hay sắc ký ái lực với xanh Cibacron [146] Thang độ

tinh khiết thường được đo bằng kỹ thuật quét gel đo tỷ trọng (demitometric gel scanning

assay) [169] Sau khi thu được enzym thì tiến hành xác định enzym bằng các kỹ thuật phân

tích enzym Có nhiều phương pháp phân tích enzym và mỗi phương pháp thu được các khíacạnh khác nhau về enzym

Phương pháp phân tích quang phổ:

Đây là phương pháp phổ biến dùng để nghiên cứu định lượng, động học, ức chế vàhoạt hoá enzym Các phương pháp quang phổ như: Phổ khối, phổ huỳnh quang, phổ hấp thụ,phát xạ được sử dụng rộng rãi vào việc phân tích ANAE Có rất nhiều loại cơ chất dùng để

xác định ANAE bằng phương pháp phân tích quang phổ M Hosokawa và c.s (1995) đã tìm

được 10 loại cơ chất khác nhau dùng để xác định các ANAE trong microsome của tế bàogan [68] Người ta thường dùng các cơ chất phổ biến như: naphtol axetat, các dẫn xuất của

phenyl benzoates, isocacboxazid, palmitoyl coenzym A [19] L Sreerama và c.s (1994) đã

phát triển một kỹ thuật phân tích các isoenzym ANAE bằng phương pháp dùng các chất ứcchế dựa trên nguyên lý quan sát điểm gẫy tại vị trí IC50 của đường cong động học Với kỹthuật này đã cho phép tác giả phân biệt được hầu hết các isoenzym của ANAE [156]

- Kỹ thuật đo phổ hấp thụ: được dùng phổ biến nhất trong phòng thí nghiệm.

Cơ chất để xác định ANAE thường được dùng là a-naphtylaxetat.

- Kỹ thuật phân tích phổ phát xạ: là một phương pháp có độ nhạy cao Cơ chất

thường được sử dụng để xác định ANAE là beclomethasone-17,21- dipropionate Sau khi bịthuỷ phân tạo sản phẩm cuối cùng là beclomethason-17- monopropionate [96J

- Kỹ thuật đo phổ huỳnh quang: phương pháp này đặc biệt hay được sử dụng trong y

tế nhằm phân tích và theo dõi các enzym thuỷ phân thuốc nói chung và ANAE nói riêng Cácenzym này khi thuỷ phân thuốc thường làm thay đổi pH của môi trường phản ứng Các thuốcthử huỳnh quang nhạy cảm với pH như 2',7'- bis(cacboxyetyl)-5(6)-cacboxyfloresceinthường được lựa chọn làm chất chỉ thị pH vì nó phù hợp pKa đối với các nghiên cứu trongđiều kiện sinh lý của cơ thể con người và không ảnh hưởng tới hoạt động thuỷ phân củaenzym Quá trình đo phổ được tiến hành ở bước sóng nhỏ hơn 442 nm [144]

-Phươns pháp điên di:

Chủ yếu được sử dụng để định lượng và phân tích các isoenzym và xác định trọnglượng phân tử [76, 148, 172] Có nhiều phương pháp điện di khác nhau như: điện di trên

giấy, điện di trên hồ tinh bột, polyacrylamit (7%) Các hệ đệm điện di thường được sử dụng

là hệ đệm tris-boric, tris-glycin Đây là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao

SM Gignac và c.s ị1991) đã tách dải isoenzym ANAE đặc hiệu của tế bào monocytes và dải

này có độ nhạy với tỷ lệ monocytes trong tế bào máu tới 1% [58] Nhưng đều theo nguyên lýchung là ANAE mang điện tích âm trong môi trường điện chúng di chuyển về cực dương và

bị tách thành nhiều vạch do điểm đẳng điện khác nhau Như phần trên đã đề cập vùng đẳngđiện của ANAE trong bạch cầu nằm từ 5,5-6,1 Việc xác định điểm đẳng điện thường dựavào các chất chuẩn Sau khi điện di xác định enzym bằng các cơ chất đặc hiệu và phản ứnglên màu 5-bromoindoxyl axetat, naphtyl AS axetate kết hợp với muối điazo là những cơ chấtthích hợp với phương pháp này [140] Tuỳ theo cường độ màu mà có thể xác định được hàmlượng của enzym

Ngày nay có rất nhiều kỹ thuật xác định các vạch enzym sau điện di với độ nhạv và

độ đặc hiệu cao như: kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, kỹ thuật phóng xạ

Đặc biệt kỹ thuật quét đo tỷ trọng (scanning densitometry) đạt được độ nhạy và độ chính

xác cao đồng thời dễ dàng xác định được isoenzym thông qua các vạch và động học enzym

nhờ xác định tốc độ phân huỷ cơ chất [171] QW Yin và c.s ( 1 9 9 1 ) thông báo đã tách được

hơn 50 isoenzym ANAE liên kết với màng tế bào trong các mô khác nhau bằng phươngpháp này [191]

Phương pháp sắc ký:

Thường dùng để định lượng và xác định trọng lượng phân tử của ANAE [79] Các

kỹ thuật sắc ký thường được sử dụng là sắc ký trao đổi nhồi gen sephadex G- 100, cellulose, phenyl-Sepharose tinh khiết [140, 165] Phương pháp sử dụng nguyên lý táchisoenzym theo khối lượng và kích thước phân tử trong quá trình chuyển động đi qua cộtnhồi gel cùng với pha động Phía cuối của cột nhồi có gắn một thiết bị xác định enzym vớicác cơ chất gắn kháng thể đơn dòng đặc hiệu

DEAE-1.3.2- Phương pháp không phá vỡ tê bào hay hoá học tê bào

Là phương pháp phát hiện gián tiếp enzym thông qua phát hiện sản phẩm thuỷ phân

cơ chất đặc hiệu của ANAE Có thể phân nhuộm hoá học ANAE trong tế bào thành một sốloại như sau:

Nhỉiôm hoá hoc tế hào đơn thuần :

Đó là các kỹ thuật dựa vào phản ứng lên màu hoá học của sản phẩm thuỷ phân cơchất với các chất tạo màu Có một số phương pháp chính sử dụng trên nguyên lý của kỹthuật này như sau:

- Phương pháp kết tủa muối kim loại: Được sử dụng lần đầu bởi Gomori ( 1 9 4 1 )

nhằm phát hiện ATPaza, esteraza, lipaza nhờ sự kết tủa sản phẩm thuỷ phân cơ chất vớimuối Ca++, sau đó muối này được chuyển thành muối CoS có màu đen Do quá trình cơ chất

đi qua nhiều giai đoạn nên ion Ca++ thường bị mất đi vì vậy phản ứng có độ nhạy kém [36]

Cơ chất thường được sử dụng là: glycerol photphat hoặc glycine, 8-hidroxyquinolineglucoronat Đến nay hầu hết các phòng th nghiệm không còn sử dụng kỹ thuật này

- Phương pháp sử dụng phẩm màu indigo: Phương pháp do Bernet, Seligman và

Holt áp dụng và phát triển nhằm phát hiện esteraza trong tế bào Indigo và dẫn xuất của nó

bị thuỷ phân tạo ancol sau đó tiến hành oxi hoá đóng vòng tạo phẩm

màu indigo có màu chàm Đây là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu khá cao Cácchất 5-bromo-indoxyl, 5-bromo-4-cloro-indoxyl là những cơ chất phù hợp nhất cho phảnứng nhuộm Đường kính của vùng enzym có thể phát hiện lên đến 5 |am [36] Đây là mộtphương pháp có rất nhiều triển vọng do số các hợp chất có chứa indoxyl tăng lên nhanhchóng nhờ công nghệ hoá dầu.

- Phương pháp sử dụng phẩm màu azo: Phương pháp do Menten, Junge và Green

nghiên cứu và phát triển dựa trên phản ứng kết tủa ancol do esteraza xúc tác phản ứng thuỷphân liên kết este tạo ra với muối điazo hình thành phẩm màu azo Màu tại vùng có enzymphụ thuộc vào cấu trúc của muối điazo sử dụng Đây là một phương pháp tốt nhất trong cácphương pháp nhuộm hoá học tế bào đơn thuần do nó có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao Cơchất sử dụng phổ biến trong kỹ thuật này là a hoặc ß-naphthol axetate hay butyrate Trong

đó dạng a tốt hơn do nó ít tan trong dung dịch nước nên khả năng kết tủa tại vùng enzymcao hơn [176] a-naphtol được giải phóng ra lập tức kết hợp với muối điazo có trong dungdịch tạo phẩm màu azo có màu đỏ hoặc đen phụ thuộc vào cấu trúc của muối điazo Nhờxuất hiện màu trên vùng enzym mà ta có thể xác định được có hay không có ANAE

Phươns pháp hoá hoc tế bào kết hơp với phân tích dòm chảy:

Nguyên lý là tiến hành nhuộm ANAE trong tế bào máu sau đó cho các tế bào này điqua một khe có chiếu một chùm tia laser hẹp, do tính chất bắt màu khác nhau của tế bào màchùm laser bị lệch đi một góc nhất định Nhờ các sensor cảm nhận mà máy có thể nhận dạngđược các tế bào thuộc các dòng monocytes Kỹ thuật này cho phép tự động hoá phân tích tếbào monocytes [93]

Hoá hoc tế bào kết lĩơp với hoá miễn dich và hoá phát auans:

Đây là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Kỹ thuật dùng kháng thểđơn dòng kẹp giữa cơ chất và chất đánh dấu theo kiểu bánh Sanwich [55, 192] Chất đánhdấu là các chất màu theo kiểu nguyên lý ELIS A hay chất phát quang theo nguyên lý FPIA.Đây là những kỹ thuật có độ nhạy rất cao, nhất là khi kết hợp với kính hiển vi điện tử.Ngoài ra để phát hiện vùng có enzym bằng kính hiển vi điện tử người ta còn sử dụng kỹ

thuật phát hiện enzym theo cơ chế trung gian tiếp nhận (receptor - mediated mechanism) tại

bề mặt của các tiểu bào quan Tức là

người ta sử dụng các kháng thể đơn dòng của chuột hoặc thỏ có gắn chất đánh dấu như chấtmàu huỳnh quang hoặc các đổng vị phóng xạ chống lại một nhóm cấu trúc đặc hiệu

(receptor) của ANAE tạo một phản ứng kháng nguyên - kháng thể Qua kính hiển vi điện tử

có gắn các thiết bị phát hiện các chất đánh dấu nhờ đó mà phát hiện vùng có ANAE Bằng

kỹ thuật này mà s Meda và c.s (1992) đã phát hiện ra ANAE trong ống lumen của lưới nội

nguyên sinh chất của tế bào [103]

1.3.3- Những ưu và nhược điểm của hai phương pháp phân tích

Như sơ đồ 1.3 chúng ta thấy phương pháp phá vỡ màng tế bào thường được sử dụng

để phân tích định lượng, cấu trúc và các isoenzym Đây là những phương pháp phân tích hếtsức tinh tế và có độ nhạy, độ đặc hiệu cao Cùng với sự phát triển của các ngành khoa họchoá học, vật lý và sinh học phân tử các kỹ thuật này đang trở thành những công cụ khôngthể thiếu trong các phòng thí nghiệm Các máy PCR, máy điện di có gắn các thiết bị phân

tích quét đo tỷ trọng (scanning densitometry) cho phép phân tích nhanh chóng, chính xác

các isoenzym cũng như giải mã cấu trúc phân tử của các phân tử enzym phức tạp Tuy nhiênphương pháp phân tích này có nhược điểm là không xác định được vị trí của enzym trongcác tế bào Ngoài ra phương pháp đòi hỏi phải có các trang thiết bị, chất chuẩn, kiểm chuẩnđổng bộ phù hợp với phương pháp phân tích và người sử dụng phải có trình độ hiểu biếtcao Vì thế kỹ thuật này thường được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm nghiêncứu hoặc ứng dụng vào các ngành cần nhu cầu công nghệ cao

Kỹ thuật không phá vỡ màng tế bào có ưu điểm là xác định được chính xác vị trí củaenzym trong tế bào như khi còn đang sống nhờ vào kỹ thuật cố định Kỹ thuật có độ nhạy và

độ đặc hiệu cũng khá cao đủ để đáp ứng cho công việc xác định enzym Đặc biệt kỹ thuậtthường đơn giản và tuỳ theo nhu cầu về mức độ phân tích mà cần trang thiết bị phù hợp vìthế nhuộm hoá học tế bào có thể áp dụng rất tốt từ những phòng thí nghiệm đơn sơ đến hiệnđại Nhược điểm lớn nhất của kỹ thuật nhuộm enzym là khó tiến hành định lượng Quá trìnhphân tích chỉ mang tính chất bán định lượng theo phương pháp phân độ và tính điểm Tuyvậy các nghiên cứu gần đây sử dụng các kỹ thuật ghép nối thu nhận ảnh với máy vi tínhhoặc gắn với các sensor quang học có thể tăng khả năng chính xác trong kỹ thuật định lượngenzym

Kỹ thuật phân tích hình ảnh kết hợp với nhuộm hoá học tế bào bằng máy đo ảnh quét tế bàogắn với máy tính là một thí dụ, đã khắc phục một phần nhược điểm của kỹ thuật nhuộm hoáhọc tế bào [34] Trước hết nó tránh được sự che phủ của các chromogene nhờ đó có thểquan sát được toàn bộ các vùng có chứa các chất màu đặc hiệu đối với enzym Thứ hai cóthể xử lý ảnh thu được theo kỹ thuật số bằng một số phần mềm cho phép cắt tế bào thànhtừng lớp siêu mỏng để tiến hành phân tích cường độ màu tại vùng nghiên cứu Do cường độmàu tỷ lệ tuyến tính với hàm lượng và hoạt tính của enzym nên bằng phương pháp thay đổinồng độ cơ chất, nhiệt độ, thời gian, chất ức chế, hoạt hoá cùng với mẫu chuẩn cho phépphân tích định lượng tương đối chính xác hoạt tính của ANAE p Champelovier và c.s

(1994) đã dùng phương pháp này so sánh với các phương pháp miễn dịch marker, di truyền

và phân tích gen ADN để xếp loại dòng tế bào ung thư máu theo FAB thì thu được các kếtquả hoàn toàn phù hợp [34] Ngoài ra kỹ thuật đo màu trực tiếp trên kính hiển vi

(Microdensitometry) cũng là một hướng nghiên cứu có rất nhiều triển vọng.

1.3.4- ứng dụng toán học và tin học trong nghiên cứu enzym

Trong nghiên cứu enzym, để tìm được các điều kiện hoạt động tối ưu nhằm thu đượchiệu suất cao đòi hỏi cần phải nắm vững cơ chế hoá học cũng như cơ chế động học của phảnứng Muốn vậy phải sử dụng những công cụ nghiên cứu lí thuyết và thực nghiệm một cáchphù hợp với đối tượng nghiên cứu Tin học và toán học là hai công cụ quan trọng giúp cácnhà khoa học nhanh chóng đạt được mục đích nghiên cứu

1.3.3.1- ứng dụng tin học trong hoá học lượng tử để giải thích cơ chế phản

ứng

Ngày nay, muốn hiểu được những vấn đề về bản chất của hoá học hiện đại chúng takhông thể không biết dến cấu tạo nguyên tử và phân tử mà nền móng của nó là hoá họclượng tử Những năm gần đây, các phương pháp tính lượng tử đã chứng tỏ nó là mộtphương pháp hữu hiệu không thể thiếu được trong nhiều lĩnh vực hoá học Về nguyên tắccác phương pháp tính đều dựa vào việc giải phương trình Schrödinger:

Những năm gần đây, nhất là những năm đầu thập kỷ cuối cùng của thế kỷ 20, sựphát triển mạnh mẽ của kỹ thuật máy tính cùng với sự ra đời các chương trình tính lượng tửkhác nhau như: Quanta, Sybyl, Alchemy, Hyperchem, Gaussian [2]; đã cho phép người tatiến hành các nghiên cứu lý thuyết về cấu trúc phân tử, khả năng và cơ chế xảy ra phản ứng

để dự đoán các quá trình hoá học Kết quả các chương trình tính toán này có ưu điểm là đưa

ra một bức tranh tổng thể về hợp chất nghiên cứu mang tính định lượng như: mật độ điện tử,

độ dài liên kết, nhiệt hình thành phân tử, momen lưỡng cực và cấu trúc lập thể của phântử Từ các dữ liệu này có thể dự đoán được hướng và khả năng tương tác của các tiểu phântrong môi trường phản ứng đổng thời xác định được các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quátrình phản ứng Như vậy, kết quả của các chương trình tính gần đúng lượng tử sẽ là cơ sởđịnh hướng cho các mô hình kế hoạch hoá thực nghiệm, từ đó có thể giảm được số thínghiệm

4.1.2- ứng dụng toán học trong hoá học thực nghiệm

Toán học từ lâu đã là công cụ không thể thiếu được đối với các nhà khoa học thựcnghiệm Đặc biệt gần đây xuất hiện rất nhiều phương pháp toán học để giải các bài toán vềqui hoạch hoá thực nghiệm và xử lý số liệu như: Phương pháp đơn hình, phương pháp quihoạch hoá thực nghiệm theo ma trận bậc, theo đường dốc nhất, Ở đây chúng tôi xin đề cậpđến một phương pháp hay được sử dụng trong thực nghiệm đó là phương pháp đơn hình

Phương pháp đơn hình là một phương pháp tìm vị trí tối ưu theo ba qui tắc:

Quỵ tắc ỉ

Phải loại bỏ thực nghiệm nào mà cho giá trị hàm mục tiêu nhỏ nhất và thay thế thínghiệm đó bằng một thí nghiệm khác, đối xứng qua trọng tâm của k đỉnh còn lại Khi đóđơn hình mới được xác định bằng k đỉnh cũ và đỉnh thực nghiệm mới Ọuá trình như vậyđược lặp đi lặp lại cho đến khi không tìm được giá trị hàm mục tiêu mong muốn nào tốt hơn

(hình 1.3).

Quy tắc 2: Trong trường hợp khi áp dụng hai lần liên tiếp quy tắc một thì lại được

đỉnh trước đây đã bỏ đi, khi đó ta áp dụng qui tắc một cho đỉnh có giá trị hàm mục tiêu nhỏthứ hai của đơn hình trước đây

mò nên sau đó khó rút ra được các ảnh hưởng của từng nhân tố lên kết quả thực nghiệm.Nguyên nhân là do điều kiện tiến hành phản ứng thay đổi

liên tục và điều kiện phản ứng của lần thí nghiệm sau phụ thuộc hoàn toàn vào kết quà vàđiều kiện phản ứng của lần thí nghiệm trước trừ đơn hình gốc Ngoài ra số thí nghiệm vàđiểm tối ưu bị phụ thuộc nhiều vào đơn hình ban đầu cùng với bước nhảy cúa các điều kiệnthực nghiệm; Nếu bước nhảy nhỏ thì sẽ phải làm quá nhiều thực nghiệm và nếu bước nhảylớn thì dễ bỏ qua điểm tối ưu Vì thế để khắc phục tình trạng này Nelder và Mead đã cải tiếntheo phương pháp thu hẹp ngoài và thu hẹp trong và được gọi là đơn hình mềm dẻo [5].

Tóm lai: ANAE đã và đang là đề tài thu hút nhiều nhà khoa học trên thế giới quan

tâm Lĩnh vực ứng dụng ANAE trong y học ngày càng rộng rãi không chỉ ở mức độ chẩnđoán, điều trị, dự phòng mà còn là cơ sở trong việc nghiên cứu các bệnh lý phân tử Ngàynay nhuộm phát hiện ANAE đã được công nhận là một tiêu chuẩn tham chiếu chính thứctrong các phòng thí nghiệm và là một kỹ thuật đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu gần nhưtương đương với các kỹ thuật miễn dịch và di truyền Phương pháp nghiên cứu enzym nóichung và ANAE nói riêng cần phải tìm hiểu được bản chất, cơ chế phản ứng và sử dụng cáccông cụ nghiên cứu thích hợp

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

Hai bệnh nhân không mắc các bệnh máu và công thức tuỷ nằm trong giới hạn bìnhthường Bệnh phẩm sử dụng để nhuộm là dịch tuỷ Một bệnh nhân dùng để nghiên cứutối ưu hoá Một bệnh nhân dùng để nghiên cứu các chất ảnh hưởng đến hoạt động củaenzym

Một bệnh nhân bị ung thư bạch cầu thể M4 để kiểm tra mức độ dương tính của phản ứngnhuộm ANAE sau khi đã tối ưu hoá

- Toàn bộ phần thực nghiệm được tiến hành tại khoa xét nghiệm Huyết học - Truyền máu

Bệnh viện 19-8

2.1.1- Phương pháp nghiên cứu

2.1.1.1- Phương pháp tôi ưu hoá hình học về mặt lý thuyết lượng tủ bằng phương pháp tính PM3 gần đúng thuộc phần mềm HYPERCHEM 4.5:

Nhằm góp phần cung cấp một số thông tin về các số liệu lượng tử như: Các tham sốnăng lượng, mật độ điện tích, cấu trúc lập thể để từ đó giải thích cơ chế đồng thời dự đoáncác yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng nhuộm ANAE

Cơ chê hóa học của phản ứng được nhiều tác giả công nhận là [35, 40, 101]:

- T h u ỷ phân cơ chất dưới tác dụng của ANAE tạo thành dẫn xuất củaa- naphtol.

- Phản ứng ghép đôi với muối điazo tạo chất màu azo.

thể đi qua một số giai đoạn tạo các hợp chất trung gian như sau:

phenyl-3-hidroxy-2-Nó có thể tồn tại dưới ba dạng cân bằng hỗ biến tuỳ thuộc vào pH môi tnrờng Trongmôi trường trung tính nó tồn tại ở dạng naphtol, trong môi trường kiềm thì nó chuyển dần

Bước 2 : Phản ứng ghép đôi để tạo chất màu aio

Phản ứng ghép đôi giữa tác nhân là muối điazo của dimetoxyanilin và họp phần azo do quá trình thuỷ phân cơ chất ở trên tạo ra và là phản ứngthế electrophin (SE ) Giai đoạn này có thể tạo thành phức ơ trung gian chuyển tiếp khi màhợp chất điazo tạo liên kết với nguyên tử cacbon của hợp phần azo và hidro thì chưa tách ra.Sau đó proton bị tách ra khỏi phức ơ, tạo ra sản phẩm thế là chất màu azo: 2-hidroxy-3-N-phenylcacbonamit-l-naphtyl-2',5'-dimetoxy-4'- N-phenylcacbonamitphenyl-azo

4-benzoylamino-2,5-Điazo của 4-benzoylamino Cơ chất đã thuỷ phân

-2,5-dimethoxyaniline

2.2.22- Tối ưu hoá thực nghiệm bằng phương pháp đơn hình:

a-Tính toán đơn hình sốc (S„ì

Chọn đơn hình S0 nằm trong hệ toạ độ như sau: Đặt trọng tâm của đơn hình trùng vớigốc toạ độ Công thức tính toạ độ đỉnh thực nghiệm được suy ra từ đơn hình này theo mộtphương như sau:

Ma trận tương ứng với đơn hình gốc bốn nhân tố ảnh hưởng đến kết quả thực nghiệm

chưa thay số: (xem bảng 2.2)

Bảng 2.2- Ma trận mã hoá đơn hình S 0

Bảng 2.3- Ma trận mỡ hoá đơn hình S() sau khi thay số