Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp của virus dengue các type sử dụng trong chẩn đoán sốt dengue sốt xuất huyết dengue

Danh sách cán bộ thực hiện đề tài kc.04-18* “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp của virus Dengue các type sử dụng trong chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất

Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖn c«ng nghÖ sinh häc

B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc vµ kü thuËt §Ò tµi:

§Ò tµi KC.04-18

Nghiªn cøu øng dông c«ng nghÖ gen s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp cña virus Dengue c¸c type sö dông trong chÈn ®o¸n

sèt Dengue/sèt xuÊt huyÕt Dengue

Lời cảm ơn Tập thể cán khoa học thuộc đề tài KC.04.18 xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành

và sâu sắc tới Bộ Khoa học Công nghệ, Ban Chủ nhiệm Chương trình KC.04, Bộ Tài chính, Ban Lãnh Đạo Viện Công nghệ Sinh học và Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương đã chỉ đạo sát sao và tạo mọi điều kiện thuận lợi

để đề tài hoàn thành nhiệm vụ

Thay mặt tập thể Cán bộ Khoa học

thực hiện Đè tài KC.04-18

PGS.TS Đinh Duy Kháng

A thông tin về đề tài

B Báo cáo chính

b.2 Cáo cáo toàn văn

1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus Dengue 12

1.3.3 Xác định typ huyết thanh của virus dengue 20

1.4.1 Phát triển vắc xin phòng sốt dengue/sốt xuất huyết dengue 21

2.2.1 Đối tượng 23

2.2.4 Dung dịch và môi trường 28

2.3.1 Phương pháp sản xuất kháng nguyên virus Dengue trên tế

bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/ 36

2.3.4 Phương pháp khuếch đại gen mã hoá tiền kháng nguyên

màng (pre-M) và kháng nguyên vỏ (E) của cả 4 typ virus dngue

bằng phản ứng RT-PCR

44

2.3.5 Phương pháp tạo dòng các đoạn gen đã khuếch đại 48

2.3.6 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E coli khả biến

bằng sốc nhiệt

48

2.3.7 Biến nạp vào tế bào P pastoris bằng xung điện 49

2.3.8 Phương pháp tách chiết plasmid từ E coli 51 2.3.9 Phương pháp tách chiết DNA genome từ tế bào P pastoris 51 2.3.10 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn 52 2.3.11 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 53

2.3.12 Phương pháp xác định trình tự axit nucleic 54

2.3.14 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 56 2.3.15 Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli

2.3.18 Sản xuất thioredoxin tái tổ hợp và kháng thể kháng

thioredoxin tái tổ hợp gắn peroxidase (HRP)

3.1 Nhân virus Dengue typ I (DEN-1), virus Dengue typ II (DEN-2), virus Dengue typ III (DEN-3) và virus

Dengue typ IV (DEN-4) trong tế bào muỗi Aedes

67

3.1.1 Tuyển chọn các type virus Dengue phân lập từ năm 2001

đến năm 2005 tại miến Bắc, miền Trung và Tây Nguyên

67

3.2 Tách dòng và xác định trình tự đoạn gene

Prem-m và e của 4 type virus dengue

74

3.2.1.1 Kiểm tra RNA tách chiết bằng phương pháp quang phổ

kế

74

3.3 biểu hiện trong e coli, tinh sạch, kiểm tra tính

đặc hiệu kháng nguyên domain 3 thuộc protein vỏ

của virus dengue các type

91

3.3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET – TRX – FuS – E3 91

3.3.1.1 Khuếch đại đoạn gen E3 bằng cặp mồi biểu hiện 92

3.3.1.2 Thiết kế plasmid tái tổ hợp pET-TRX-FuS-DxE3 93

3.3.3 Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp

3.3.4 Kiểm tra phản ứng của kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể

kháng kháng nguyên tự nhiên của virus Dengue bằng Western Blot

3.4 biểu hiện kháng nguyên màng và vỏ của virut

Dengue type 1, 2, 3, 4 trong hệ nấm men Pichia

pastoris

99

3.4.1 Thiết kế vector biểu hiện vùng gen preM – E 99

3.4.1.1 Ghép nối hai nửa Dx3’ và Dx5’ thành đoạn Dx hoàn

chỉnh

103

3.4.1.2 Khuếch đại đoạn Dx bằng cặp mồi biểu hiện 107

3.4.1.3 Gắn đoạn Dx vào vector pPICvà chọn dòng pPICDx 109

3.4.2 Biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên preM-E (gen preM-env)

trong Pichia pastoris

112

3.4.3 Kiểm tra phản ứng của kháng nguyên DxME tái tổ hợp với

kháng thể kháng virus Dengue tự nhiên bằng Western Blot

3.8 tóm l−ợc kết quả của đề tài theo hợp đồng và

thuyết minh đề tài

129

Danh sách cán bộ thực hiện đề tài kc.04-18*

“Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp

của virus Dengue các type sử dụng trong chẩn đoán

sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue”

1 PGS TS Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ Sinh học

2 PGS TS Trương Nam Hải Viện Công nghệ Sinh học

3 TS Phạm Thúy Hồng Viện Công nghệ Sinh học

4 TS Lê Quang Huấn Viện Công nghệ Sinh học

5 CN Nguyễn Tiến Minh Viện Công nghệ Sinh học

6 CN Bạch Thị Như Quỳnh Viện Công nghệ Sinh học

7 CN Nguyễn Thị Ngọc Diệp Viện Công nghệ Sinh học

8 CN Trịnh Quý Bôn Viện Công nghệ Sinh học

9 CN Dương Hồng Quân Viện Công nghệ Sinh học

10 CN Phạm Minh Tuấn Viện Công nghệ Sinh học

11 CN Dương Văn Cường Viện Công nghệ Sinh học

12 CN Nguyễn Thị Sinh Viện Công nghệ Sinh học

13 ThS Bùi Hoàng Anh Viện Công nghệ Sinh học

14 ThS Phùng Thu Nguyệt Viện Công nghệ Sinh học

15 CN Lê Thị Thu Hồng Viện Công nghệ Sinh học

16 CN Trần Thị Hường Viện Công nghệ Sinh học

17 CN Nguyễn Hồng Thanh Viện Công nghệ Sinh học

18 CN Bùi Thanh Xuân Viện Công nghệ Sinh học

19 CN Trần Thị Thanh Huyền Viện Công nghệ Sinh học

20 GS TS Trương Uyên Ninh Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ương

21 TS Lê Thị Quỳnh Mai Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ương

22 TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ương

23 TS Đỗ Thị Thoa Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ương

24 ThS Trương Thừa Thắng Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ương

25 CN Nguyễn Thị Thu Thủy Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ương

26 TS Nguyễn Xuân Quang Bệnh Viện Bạch Mai

27 TS Vũ Thị Tường Vân Bệnh Viện Bạch Mai

28 BS Nguyễn Thị Hạnh Bệnh Viện Bạch Mai

* Chú thích: Một số tác giả đăng ký tham gia đề tài trong thuyết minh ban đầu nhưng vì điều kiện cụ thể và vì lý do cá nhân nên đã không tham gia được Ngược lại, do yêu cầu của đề tài, một số cán bộ không có tên trong thuyết minh nhưng đã được mời tham gia đề tài

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất

kháng nguyên tái tổ hợp của virut Dengue các typ sử

dụng trong chẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết

6 Thuộc Chương trình: KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn 2001-2005

"Nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ sinh học", Mã số KC.04

7 Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên: Đinh Duy Kháng

Học hàm/học vị: TS

Chức vụ: Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học

Điện thoại: CQ: 04 7563386 NR: 04 9870812 Fax: 04 8363144

Mobile: 0913087536

E-mail: vsmt@hn.vnn.vn, dinhduykhang@hotmail.com

Địa chỉ cơ quan: 18, Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Số 106, Tổ 9, Phường Thanh lương, Quận Hai Bà Trưng, Hà Nội

8 Cơ quan chủ trì đề tài

Tên tổ chức KH&CN: Viện Công nghệ Sinh học, Trung Tâm KHTN&CN Quốc gia

Điện thoại: 04 8362599 Fax: 04 8363144

E-mail: binh@ibt.ac.vn

Địa chỉ: 18, Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Nội dung KH&CN của đề tài

9 Mục tiêu của đề tài

1 Mục tiêu chung

Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất kháng nguyên virut Dengue tái tổ hợp các typ I, II, III, IV

Đánh giá độ nhậy, độ đặc hiệu và tính ổn định về chất lượng của các kháng nguyên đã tạo ra

2 Mục tiêu cụ thể

2.1 Tạo được chủng E coli và nấm men P pastoris tái tổ hợp dùng

trong sản xuất kháng nguyên virut Dengue các typ I, II, III, IV

2.2 Sử dụng chủng tái tổ hợp để sản xuất được kháng nguyên virut Dengue các typ I, II, III, IV đảm bảo tính đặc hiệu và ổn định về chất lượng sử dụng trong chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue 2.3 Thử khả năng tạo đáp ứng miễn dịch phòng vệ của các kháng nguyên tái tổ hợp để làm đề cho việc tạo ra vắc xin Dengue thử nghiệm

2.4 Đào tạo đội ngũ cán bộ chuyên sâu trong lĩnh vực công nghệ gen

vi sinh để có thể chủ động về khâu giống trong trong công nghệ sản xuất các chế phẩm tái tổ hợp từ vi sinh vật

12 Nội dung nghiên cứu (liệt kê và mô tả những nội dung cần nghiên cứu, nêu bật được những nội dung mới và phù hợp để giải quyết vấn đề đặt ra, kể cả những dự kiến hoạt động phối hợp để chuyển giao kết quả nghiên cứu đến người sử dụng)

Nghiên cứu qui trình công nghệ để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp dùng trong chẩn

đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue bao gồm các khâu sau:

1.1 Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên vỏ (kháng nguyên E) của cả 4 type virut Dengue

1.2 Thiết kế vector biểu hiện các gen đã tách dòng

1.3 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli và P pastoris

1.4 Chọn lọc các dòng E coli và P pastoris tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên

vỏ của virut dengue

1.5 Nghiên cứu biểu hiện, thu nhận protein tái tổ hợp

1.6 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện biểu hiện của các chủng tái tổ hợp để thu nhận lượng kháng nguyên tối đa

1.7 Thiết lập một qui trình tách chiết, tinh chế thích hợp, có hiệu suất cao để thu nhận protein tái tổ hợp đủ độ sạch ứng dụng trong việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue

nguyên tái tổ hợp đã được tạo ra

1.9 Xây dựng được qui trình công nghệ cho sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp của virut

Dengue các typ có đủ độ đặc hiệu, độ nhạy để chẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết

Dengue

Qui trình tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp, ứng dụng trong sản xuất kháng nguyên tái

tổ hợp chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue là hoàn toàn mới ở Việt Nam Việc

nghiên cứu áp dụng qui trình công nghệ hiện đại thuộc lĩnh vực Công nghệ gen sẽ nâng

cao trình độ cán bộ, đào tạo đại học và sau đại học với kiến thức của công nghệ cao góp

phần nâng cao tiềm lực Khoa học Công nghệ thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học, thực hiện

chủ trương của Đảng và Nhà nước là công nghiệp hóa, hiện đại hóa phải dựa vào nội lực là

Thời gian (BĐ-KT)

Người, cơ quan thực hiện

1

- Thiết kế các cặp mồi và xây

dựng kế hoạch tách dòng gen

mã hóa kháng nguyên vỏ của

virut Dengue các typ I, II, III,

IV

Các cặp mồi và qui trình tách dòng gen mã hóa kháng nguyên vỏ của virut Dengue

09/2002

Viện CNSH

Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải

2 - Nuôi cấy virut Dengue trên tế

bào muỗi C6/36 và nhân virut

Dengue trong não chuột ổ

Các chủng virut Dengue thuộc typ

I, II, III, IV nhân lên trong tế bào muỗi và não chuột

ở

09/2002- 10/2002

Viện VSDT, Nguyễn Hồng Hạnh, Trương Uyên Ninh, Lê Thị Quỳnh Mai,

Đỗ Thị Thoa

2 - Tách dòng và xác định trình

tự gen mã hóa kháng nguyên vỏ

(kháng nguyên E) của virut

Dengue các typ I, II, III, IV

Gen mã hóa kháng nguyên E của cả 4 type Dengue giải trình tự và đăng kỹ trong Ngân Hàng Dữ liệu gen Quốc tế

03/2003

10/2002-Viện CNSH, Viện VSDT,

Lê Thị Quỳnh Mai, Đinh Duy Kháng, Lê Quang Huấn

3

- Thiết kế vector biểu hiện

mang gen mã hóa kháng

nguyên E của virut Dengue các

typ I, II, III, IV để biểu hiện

trong E coli và nấm men P

pastoris

Các vector tái tổ hợp hoàn chỉnh mang gen mã hóa kháng nguyên E của cả 4 typ virut Dengue để biểu

hiện trong E coli

và nấm men P

pastoris

06/2004

04/2003-Viện CNSH, Trương Nam Hải, Phan Văn Chi, Lê Quang Huấn, Lê Thanh Hòa

4 - Biến nạp vector đã thiết kế

vào tế bào E coli và nấm men

- Chủng E coli và

P pastoristái tổ

08/2004

01/2004-Viện Công nghệ Sinh học

P pastoris Sàng lọc các chủng

tái tổ hợp có khả năng tổng hợp

kháng nguyên E của virut

Dengue các typ I, II, III, IV

hợp tạo ra kháng nguyên E của virut Dengue các typ

Đinh Duy Kháng, Trương Nam Hải, Phan Văn Chi, Lê Quang Huấn

5 - Nghiên cứu qui trình công

nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh

chế kháng nguyên Dengue tái tổ

hợp các typ (mỗi loại 1000 ml)

- Kháng nguyên tái

tổ hợp của virut Dengue các typ I,

II, III, IV có độ nhạy, độ tinh khiết

và độ đặc hiệu cao

10/2004

03/2004-Viện Công nghệ Sinh học, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Lê Thanh Hòa, Lê Quang Huấn

6 - Đánh giá kháng nguyên tái tổ

hợp và kháng thể chống kháng

nguyên tái tổ hợp bằng các kỹ

thuật miễn dịch

- Kết luận về độ sạch và độ đặc hiệu của kháng nguyên

11/2004

06/2004-Viện VSDT, Nguyễn Hồng Hạnh,

Trương Uyên Ninh, Đỗ thị Thoa, Lê Thị Quỳnh Mai

6 - ứng dụng các protein tái tổ

03/2005

09/2004-Viện VSDT, Bệnh Viện Bạch Mai

Nguyễn Hồng Hạnh,

Trương Uyên Ninh, Đỗ thị Thoa, Lê Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Xuân Quang

III Kết quả của đề tài

15 Dạng kết quả dự kiến của đề tài

I II III

♦ Mẫu (model, maket) ♦ Quy trình công nghệ ♦ Sơ đồ

♦ Sản phẩm ♦ Phương pháp ♦ Bảng số liệu

♦ Vật liệu ♦ Tiêu chuẩn ♦ Báo cáo phân tích

♦ Thiết bị, máy móc ♦ Quy phạm ♦ Tài liệu dự báo

♦ Dây chuyền công nghệ ♦ Đề án, qui hoạch triển

khai

♦ Giống cây trồng ♦ Luận chứng kinh tế-kỹ

thuật, nghiên cứu khả

thi

2 Các bài báo Trong nước: 9

4 Qui trình tạo chủng E coli dùng

trong sản xuất kháng nguyên tái tổ

5 Qui trình tạo chủng nấm men P

pastoris dùng trong sản xuất kháng

nguyên tái tổ hợp chẩn đoán

SD/SXHD đạt tiêu chuẩn như đã

công bố (Sugrue RJ và cs, 1997)

Qui trình tạo chủng P pastoris

đạt 20 mg/lit huyền dịch

6 Qui trình tách chiết và tinh chế

kháng nguyên Dengue tái tổ hợp từ

chủng E coli cho cả 4 typ Dengue

Qui trình tách chiết và tinh chế kháng nguyên đủ độ sạch và độ

đặc hiệu cao

7 Qui trình tách chiết và tinh chế

kháng nguyên Dengue tái tổ hợp từ

nấm men P pastoris cho cả 4 typ

Dengue

Qui trình tách chiết và tinh chế kháng nguyên đủ độ sạch và độ

đặc hiệu cao

8 Báo cáo tổng kết đề tài chung Được HĐKH các cấp chấp nhận

17 Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lượng đối với sản phẩm tạo ra (dạng kết quả I, II)

Mức chất lượng

Dự kiến

Số lượng sản phẩm

Thế giới

Kháng nguyên tái tổ hợp của cả 4 typ

virut Dengue dùng trong chẩn đoán

SD/SXHD với hàm l−ợng protein tái tổ

hợp khoảng 100 àg/ml kháng nguyên

Độ tinh khiết,

độ đặc hiệu

Chất l−ợng nh−

của CDC

Ch−a

có

Đã có 1000 ml

cho mỗi typ virut Dengue

đủ để tạo ra

100 bộ Kit thử nghiệm

V Kinh phí thực hiện đề tài và nguồn kinh phí

(giải trình chi tiết xin xem phụ lục kèm theo)

Đơn vị tính: Triệu đồng

23 Kinh phí thực hiện đề tài phân theo các khoản chi

Thuê khoán chuyên môn

Nguyên,vậ

t liệu, năng l−ợng

Thiết bị, máy móc

Xây dựng, sửa chữa nhỏ

Nh÷ng tõ viÕt t¾t

Amp Ampicillin

D1, D2, D3, D4 Virus Dengue c¸c type 1, 2, 3, 4

Dengue dNTP deoxynucleotide

EDTA Acid

Immunosorbent Assay

Immunosorbent Assay

(ph¶n øng trung hßa gi¶m m¶ng ho¹t tö)

Sds Sodium dodecyl sulphat

Reaction Sds-page Sodium dodecyl sulphat-Polyacrylamid

gel electrophoresis

galactopyranosite

Việt Nam nằm trong vùng lưu hành mạnh mẽ của virus Dengue Những

vụ dịch nghiêm trọng đầu tiên xảy ra ở cả hai miền Nam - Bắc vào những năm

1958 - 1960 và gần đây vẫn tiếp tục xuất hiện

Kết quả giám sát dịch tễ học trong 10 năm qua cho thấy sốt xuất huyết Dengue là một trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc và tử vong cao ở Việt Nam Theo thống kê của Tổ chức Y Tế Thế Giới từ năm 1963 đến 1988 số người mắc bệnh sốt xuất huyết Dengue và chết ở Việt Nam là lớn nhất so với các nước trong khu vực Đông Nam á và Tây Thái Bình Dương

Virus dengue thuộc họ Flaviridae, giống Flavivirus bao gồm 4 type huyết

thanh là dengue type 1, type 2, type 3 và type 4 Các virus thuộc nhóm này gây bệnh ở động vật, người và truyền bệnh thông qua côn trùng chân khớp nên còn

gọi là Arbovirus Hai loài muỗi A aegypti và A albopictus là vectơ truyền bệnh

SD/ SXHD chủ yếu [6, 11] Genome virus là một sợi RNA đơn dương, chứa một khung đọc mở duy nhất mã hoá cho 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc [60]

Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue thường có những biểu hiện lâm sàng giống các bệnh gây sốt và sốt xuất huyết thông thường nên dễ dẫn đến những chẩn đoán và điều trị sai lệch Vì vậy việc nghiên cứu tìm ra phương pháp phát hiện nhanh, chính xác virus Dengue là hết sức cần thiết để giúp bác sĩ có phác đồ

điều trị thích hợp đối với bệnh nhân và đồng thời giúp các nhà dịch tễ học có biện pháp khoanh vùng, hạn chế sự lây lan của dịch bệnh

Việc xây dựng bộ KIT chẩn đoán nhanh virus Dengue và sản xuất vaccine phòng bệnh là hết sức cần thiết Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành những nghiên cứu cơ bản với những nội dung chính sau đây:

- Tách dòng và xác định trình tự các đoạn gene mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng nhất là kháng nguyên màng (PreM) và kháng nguyên vỏ (E) của bốn type dengue

- Thiết kế các vector biểu hiện vùng kháng nguyên màng và vỏ của bốn type dengue

- Biểu hiện và tinh sạch các protein tái tổ hợp

- Đánh giá khả năng phản ứng đặc hiệu của các kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng virus dengue tự nhiên bằng các kỹ thuật ELISA, Western blot và Dot blot

- Sử dụng các kháng nguyên tái tổ hợp để tạo ra các Kit chẩn đoán sốt dengue/sốt xuất huyết dengue

Chương I

tổng quan tài liệu

1.1 Bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue

1.1.1 Biểu hiện lâm sàng

Sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) được chia thành nhiều cấp độ

khác nhau tuỳ theo mức độ nặng của bệnh mà bệnh nhân có những biểu hiện như: sốt từ 38 đến 400C, kéo dài 2-7 ngày kèm theo các triệu chứng đau đầu, đau

cơ, buồn nôn, phát ban, có thể kèm theo rét tuy không thành cơn, choáng váng, chóng mặt, xuất huyết dưới da, xuất huyết niêm mạc, xuất huyết phủ tạng ở thể

nặng bệnh nhân có thể bị sốc hay còn gọi là hội chứng sốc Dengue (HCSD,

DSS) HCSD xảy ra với trẻ em nhiều hơn ở người lớn, phổ biến nhất vào ngày sốt

thứ 4 đến thứ 6, ở bệnh nhân nặng có dấu hiệu suy tuần hoàn, đau bụng, bồn chồn, vật vã, nếu không được can thiệp sớm bệnh nhân có thể bị tử vong sau từ

12 đến 24 giờ [10, 11]

Các triệu chứng của bệnh thường rất đa dạng nhưng lại không có tính chất

đặc trưng Do đó, không thể phân biệt được sự khác biệt về lâm sàng giữa các

bệnh nhân nhiễm các type virus dengue khác nhau Mặt khác, các triệu chứng

này cũng tương tự như các triệu chứng gặp phải khi bị nhiễm các loại virus gây bệnh khác như cúm, sởi, viêm não v.v [11]

Căn cứ theo biểu hiện lâm sàng của bệnh SD/SXHD có thể chia thành 3 cấp

độ sau đây :

+ Sốt dengue (SD): còn gọi là sốt dengue cổ điển, thường có các triệu

chứng như các bệnh nhiễm virus khác là: sốt từ 38- 400 C, đau mỏi cơ và các khớp xương, đau đầu vùng trán và thái dương, rất ít gặp mảng xuất huyết dưới

da, tỉ lệ tử vong thấp (khoảng 0.018%) [11]

+ Sốt xuất huyết dengue (SXHD): Sốt cấp tính cao, kéo dài 2-7 ngày kèm

theo nhức đầu, đau khớp cơ, xuất hiện mảng hoặc chấm xuất huyết dưới da, niêm

mạc, xuất huyết nội tạng, hạ sốt do xuất huyết nhiều, có các biểu hiện như chảy máu mũi, chảy máu chân răng nhiều và kéo dài [6, 11]

+ Hội chứng sốc dengue (HCSD, DSS): Có các biểu hiện tượng tự như

SXHD nhưng còn kèm theo hiện tượng mạch đập nhanh, huyết áp tụt, da lạnh và

ướt Khi sốc sâu, kéo dài có thể dẫn tới suy thận cấp, rối loạn tiêu hoá, ngừng tim, xuất huyết nội tạng và tử vong sau 12-24 giờ [6, 11]

ở người mắc sốt dengue thường thấy các đặc điểm như: Hạch lympho sưng,

đau toàn thân, lượng tiểu cầu ít giảm, giãn mạch ngoại vi, bạch cầu giảm, hematocrit tăng nhẹ Đối với trường hợp mắc SXHD thì có thêm các đặc điểm khác nữa như: gan to, tiểu cầu giảm, hematocrit tăng hơn 20% so với bình thường, có biểu hiện vàng da, xuất huyết phủ tạng hệ tiêu hoá và ngoài tiêu hoá như não, màng não v.v thể nặng có thể chuyển sang các giai đoạn khác nghiêm trọng hơn như SXHD thể não (hội chứng não cấp), SXHD thể suy gan cấp v.v [11]

1.1.2 Tác nhân truyền bệnh

Bệnh SD/SXHD lây qua đường máu Các nghiên cứu về trung gian truyền

bệnh đã xác định muỗi vằn Aedes aegypti (A aegypti) là vector chủ yếu, ngoài ra các loại muỗi khác như Aedes albopictus, Aedes polynesiens cũng có thể truyền bệnh SD/SXHD Muỗi A aegypti là loại muỗi sống ở trong nhà hoặc xung quanh

nhà Chỉ có muỗi cái đốt người và đốt vào ban ngày, chủ yếu vào sáng sớm và chiều tối [43] Muỗi cái có thể truyền bệnh sau thời kỳ ủ bệnh 3 đến 10 ngày hoặc có thể truyền bệnh ngay nếu đang hút máu bệnh nhân dở dang rồi đốt sang người khác Nơi đậu của muỗi là những chỗ tối tăm trong nhà như: hốc tủ, gầm giường, gầm bàn, chỗ treo quần áo, chăn màn và những vật dụng khác Một điểm

đáng lưu ý là muỗi A aegypti có khả năng truyền virus dengue qua lăng quăng (bọ gậy), nghĩa là virus dengue có chu kỳ xuyên qua trứng Đây cũng là một yếu

tố quan trọng trong công tác phòng chống bệnh, diệt muỗi trưởng thành phải đi

phương pháp quản lý muỗi dựa và cộng đồng Vòng đời của muỗi A aegypti

được thể hiện ở hình 1.1

Sau khi bị nhiễm virus, muỗi sẽ bị nhiễm suốt đời Muỗi cái có thể truyền

virus dengue cho trứng và trứng lại có khả năng tồn tại rất lâu trong điều kiện

khô hạn (có thể trên 1 năm), đây là một yếu tố khó khăn cho việc diệt muỗi [1] Muỗi sinh sản vào mùa mưa, ở những nơi chứa nước nhân tạo (vũng nước đọng, chum, vại v.v…)

Thời gian virus nhân lên trong hạch nước bọt muỗi là từ 3 – 10 ngày tuỳ

theo nhiệt độ môi trường Muỗi cái có thể truyền dọc virus dengue sang thế hệ

sau tuy nhiên đường truyền dọc này không có vai trò lớn trong cơ chế lây truyền

dengue sang người, người vẫn là vật chủ chính nhân virus dengue

1.1.3 Tình hình dịch bệnh trên thế giới

So sánh hai bản đồ phân bố trên thế giới có thể nhận thấy rằng dịch SD/SXHD có xu hướng lan rộng không những trong mỗi nước mà còn ra nhiều nước khác (hình 1.2), hàng năm có sự gia tăng số nước thông báo có dịch và số trường hợp mắc bệnh Đông Nam á, Tây Thái Bình Dương và Trung Mỹ đang là

vùng hoạt động mạnh của virus dengue và SD/SXHD Theo thống kê của WHO

từ năm 1995 đến nay, mỗi năm có khoảng 50 triệu người bị nhiễm virus dengue

Hình 1.1: Vòng đời của Muỗi

với khoảng 500.000 trường hợp phải nhập viện do mắc SXHD, trong đó có khoảng 12.000 trường hợp tử vong, số trường hợp tử vong có thể còn cao hơn nếu như bệnh nhân không được chẩn đoán và điều trị kịp thời Đặc biệt vào những tháng đầu năm 2004, tại Inđônêxia dịch SD/SXHD đã bùng phát mạnh với tổng số trường hợp bị nhiễm hơn 80.000, con số tử vong là hơn 1000 trường hợp [30]

Hình 1.2 Bản đồ phân bố SD/SXHD thập niên 90, năm 2001 và năm 2005.

Vùng biểu thị bằng màu hồng nhạt là nơi có SD/SXHD; Màu hồng là nơi có

SD/SXHD cộng với HCSD Màu vàng là vùng có lưu hành của muỗi A.

aegypti; Màu đỏ là vùng có lưu hành của muỗi A aegypti cùng với dịch

SD/SXHD

Virus Dengue lần đầu tiên được Sabin A.B phân lập được từ những binh

Hawaii và 1 chủng ở New Guinea có kháng nguyên giống nhau được gọi là

DEN-1 Ba chủng virus còn lại ở New Guinea có kháng nguyên khác với chủng trên,

được gọi là DEN-2 Sau đó 2 typ huyết thanh khác có chứa các quyết định kháng nguyên khác DEN-1 và DEN-2 được xác định là DEN-3 và DEN-4 được Hammon

W McD tìm ra từ bệnh nhân mắc sốt xuất huyết ở Manila vào năm 1956 [1, 4, 45] Cho tới nay, đã có rất nhiều mẫu virus Dengue thuộc cả 4 typ huyết thanh

được phân lập ở nhiều nơi trên thế giới (Hình 1.3.)

1.1.4 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam

ở Việt Nam, vụ SD/SXHD đầu tiên xảy ra ở miền Bắc vào năm 1958 Sau đó xảy

ra một số vụ dịch lớn như vụ dịch năm 1978 với 393.725 người, gây tử vong 1449 người Trong 5 năm gần đây, số trường hợp mắc bệnh trung bình mỗi năm được thông báo là 100 ngàn và có khoảng 200 người bị tử vong [11] ở

nước ta, bệnh SD/SXHD lưu hành rộng rãi ở vùng Châu thổ Sông Hồng, Sông Cửu Long và vùng duyên hải miền Trung

đến tháng 11, sau đó bị gián đoạn do mùa đông lạnh Còn ở các tỉnh phía Nam, dịch có thể xảy ra quanh năm, đặc biệt khu vực đồng bằng sông Cửu Long

Pasteur TP Hồ Chí Minh, số trường hợp SD/ SXHD trong năm 2002 là 21.908, cho đến giữa tháng 6 năm 2003 dịch SD/ SXHD đã có mặt tại 61/61 tỉnh thành với gần 9.300 người mắc bệnh trong đó đã có 22 tử vong Từ đầu năm đến giữa tháng 6/2004, cả nước đã có trên 16.600 trường hợp mắc bệnh (tăng 79,6% so với cùng kỳ năm trước), riêng ở 20 tỉnh thành phía nam đã có 20 trường hợp bị tử vong Theo thống kê của WHO, trong vòng 30 năm (1960 - 1989) Việt Nam đã

có hơn một triệu ca mắc DHF trong tổng số hai triệu ca của 8 nước Đông Nam á [1, 4]

1.2 ViruS Dengue

1.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc

Virus dengue thuộc họ Flaviridae, giống Flavivirus bao gồm 4 type huyết thanh là Dengue1, Dengue2, Dengue3, Dengue4 Virus dengue hình khối cầu có

đường kính khoảng 40-50 nm, chứa một sợi RNA đơn-dương (khoảng 10200

nucleotide) Cũng như các Flavivirus khác virus dengue có một lớp vỏ

(envelope) bản chất là glycoprotein-lipit bao quanh màng protein, lớp vỏ này bắt nguồn từ màng tế bào vật chủ (hình 1.3) Ngoài ra nucleocapsid có cấu trúc đối xứng 20 mặt Hạt virus có hệ số lắng khoảng 175S đến 215S Tỷ trọng xác định bằng ly tâm gradien sacaroza khoảng 1,19 g/cm3 Tỷ lệ này có thể thay đổi đôi chút do các kỹ thuật tinh chế [1, 6]

1.2.2 Hệ gen (Genome) của virus dengue

Virus Dengue có hệ gen của Flavivirus điển hình Genome là một sợi

RNA đơn, dương có chiều dài xấp xỉ 10200 ribonucleotit Hệ gen chứa một khung đọc mở mã hoá cho một chuỗi polyprotein duy nhất Chuỗi này sau đó sẽ

được phân cắt bởi các enzyme của tế bào vật chủ và các enzyme của virus thành

10 phân tử protein chức năng, bao gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu

trúc Genome của virus Dengue có cấu trúc phân bố của các gen theo thứ tự như

sau: 5’-C-preM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’ (hình 1.5)

Hình 1.4 Cấu trúc của hạt virus Dengue Các protein quan trọng của virus

bao gồm: Protein vỏ (E.Protein), Protein màng (M Protein), Protein lõi (C.Protein) Bên trong hạt virus là sợi ARN đơn dương (Positive strand RNA)chứa các gen của virus theo trình tự được mô hình hóa phía dưới

- Đầu 5’ không mã hoá dài khoảng 100 nucleotit, được metyl hoá đảm bảo sự bền vững cho vật liệu di truyền Đầu 3’ (không được polyadenin hoá) không mã hoá dài khoảng 400 nucleotit

- Khoảng một phần tư chiều dài của genome tính từ đầu 5’ mã cho các protein cấu trúc: protein lõi (C), protein màng (M), protein vỏ (E) Đoạn này chứa nhiều vùng đặc hiệu nhóm và đặc hiệu type Người ta dựa vào các vùng đặc biệt này để phân biệt cấu trúc gen của các virus trong nhóm và các type virus trong loài

Hình 1.5 Cấu trúc genome của virus Dengue Genome của virus Dengue là

một sợi ARN đơn dương (Positive single strand RNA) bao gồm 2 vùng là cấutrúc (STRUCTURAL) và phi cấu trúc (NONSTRUCTURAL) Vùng cấu trúcchứa các gen của virus theo trình tự được mô hình hóa phía dưới bao gồm:Gen mã hóa protein lõi (C), gen mã hóa tiền protein màng (prM) và gen mãhóa protein vỏ (E) Vùng phi cấu trúc chứa các gen: Gen mã hóa protein phicấu trúc (1), gen mã hóa protein phi cấu trúc (2A), gen mã hóa protein phicấu trúc (2B), gen mã hóa protein phi cấu trúc (3), gen mã hóa protein phi cấutrúc (4A), gen mã hóa protein phi cấu trúc (4B) và gen mã hóa protein phi cấutrúc (5)

- Phần còn lại của genome mã hoá cho 7 protein phi cấu trúc thực hiện các chức năng sinh học xác định vòng đời của virus Chức năng của các protein này

đến nay vẫn chưa được biết đầy đủ

Khoảng 1/4 chiều dài của genome tính từ đầu 5’ (khoảng hơn 2000 nucleotid) mã hoá cho các protein cấu trúc Đoạn gen này chứa nhiều vùng quyết

định kháng nguyên quan trọng góp phần đánh giá đặc hiệu type Tính chất đặc trưng của vùng này cho phép phân biệt cấu trúc gen của các virus trong nhóm và trong cùng type huyết thanh Hiện nay đã phân biệt được 4 type huyết thanh của

virus dengue gây bệnh là: DEN – 1, DEN – 2, DEN – 3 và DEN – 4 Về phương

diện kháng nguyên, cả 4 type huyết thanh này đều có liên quan chặt chẽ với nhau và có phản ứng chéo nhau [6] Khi cơ thể nhiễm một trong bốn type virus

dengue, cơ thể sẽ sinh miễn dịch đối với type virus đó trong một thời gian dài

nhưng không có tác dụng miễn dịch đối với các type còn lại Điều này giải thích tại sao một người có thể nhiễm cả bốn type virus trong suốt cuộc đời [11, 30]

• Protein cấu trúc

Bao gồm protein lõi (C), protein vỏ (E), protein màng (M)

+ Protein lõi (C) là protein có kích thước nhỏ và là thành phần cơ bản tạo nên lõi nucleocapsit của virus

+ Protein vỏ (E) có nguồn gốc từ màng tế bào chủ, được glycosyl hoá ở

pH thấp, mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu và tương tác với các thụ thể gây ra các triệu chứng của SD/SXHD

+ Protein màng (M) Có hai dạng phụ thuộc vào thời điểm sinh trưởng của virus bao gồm M có khối lượng phân tử 8 kDa và pre-M có khối lượng phân tử

19 – 23 kDa

• Protein phi cấu trúc

Chức năng của nhóm protein này chưa được biết một cách đầy đủ Các chức năng sinh học này xác định vòng đời của virus Cấu trúc đoạn gen này khá

giống nhau ở các type virus dengue khác nhau, đây chính là nguyên nhân gây lên

các phản ứng chéo nhau trong chẩn đoán huyết thanh học

+ NS5 thành phần là các enzyme polymerase phụ thuộc RNA có chức năng phiên mã DNA và enzyme methyltransferase metyl hoá đầu 5’

+ Ngoài ra còn có các vị trí của NS2A, NS2B, NS4A, NS4B Các protein này cùng phối hợp thực hiện các chức năng sinh học trong vòng đời của virus

1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus Dengue

Sau khi bám vào tế bào chủ, nhờ liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào chủ thích hợp là Fc và C3, virus dengue xâm nhập ngay vào tế bào

theo cơ chế thực bào Tại vùng có pH thấp, hình dạng của virus bị biến đổi, xảy

ra quá trình dung giải vỏ protein E, RNA virus được giải phóng vào trong bào tương RNA virus hoạt động như một mRNA nhờ enzyme polymerase của tế bào

chủ trực tiếp dịch mã thành polyprotein Hoạt động này diễn ra trong tế bào chất vùng gần nhân và được sự hỗ trợ của mạng lưới nội chất Để sao chép genome của mình, virus phải tạo một sợi RNA âm bổ sung với sợi đơn dương của mình Quá trình này được xúc tác bởi một protein là replicase và enzyme RNA polymerase của tế bào chủ, sau đó RNA sợi đơn âm này sẽ được sử dụng như một sợi khuôn để tổng hợp ra một bản sao mới của sợi dương Khi các protein capsit được tổng hợp đủ, chúng tập hợp lại thành một cấu trúc rỗng gọi là procapsit, sợi RNA dương đi vào cấu trúc này và kết hợp thành nucleocapsit Các nucleocapsit này di chuyển đến màng tế bào chất nhờ bộ máy Golgi, sau đó chúng di chuyển đến mặt trong của màng và được bao bọc bởi màng Các hạt virus trong một tế bào được hình thành và giải phóng ra ngoài do tế bào chủ bị huỷ hoại Các nucleocapsit có màng bao chính là màng sinh chất của tế bào chủ

cũ và các virion mới có thể sử dụng các bao màng này để hoà nhập với màng của

1.2.4 Đặc điểm kháng nguyên

Virus dengue mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây

ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên kết hợp bổ thể trên protein màng (E) [3, 47]

Virus dengue có nhiều kháng nguyên, trong đó có kháng nguyên đặc hiệu type,

kháng nguyên chung của phân nhóm và của nhóm Dựa vào sự khác biệt giữa

các đặc điểm quyết định kháng nguyên người ta phân chia virus dengue thành 4 type khác nhau từ D1 đến D4 Cả 4 type huyết thanh của virus dengue rất gần

nhau về phương diện kháng nguyên vì vậy chúng có một phần miễn dịch chéo

Virus dengue còn có chung một số đặc điểm kháng nguyên với một số

Flavivirus khác Kháng nguyên của virus dengue khu trú ở đại thực bào phổi,

lách, gan, tuyến ức, các tổ chức da và bạch cầu đơn nhân Khi xâm nhập vào cơ thể các kháng nguyên của virus là kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và kháng nguyên kết hợp bổ thể sẽ kích thích cơ thể hình thành các kháng thể đặc hiệu tương ứng [6, 7]

Các kháng nguyên quan trọng về mặt dịch tễ học của virus Dengue chủ yếu nằm ở vùng vỏ Ngoài ra, một số protein phi cấu trúc của virus Dengue cũng

có tính kháng nguyên [77, 83] Trong ba protein cấu trúc C, M (cả prM) và E của virus Dengue thì protein vỏ E (hình 1.7) là một protein đa chức năng và là kháng nguyên quan trọng trên bề mặt của virus

Hình 1.7: Cấu trúc dimer của protein E Hai chuỗi peptid là 2 dải băng đối xứng nhau, 2 vị trí

được glycosyl hóa gắn gốc đường N-acetyl glucosamine vào Asn-67 và -153 Phân tử β-octyl

glucoside (bOG) nằm giữa Domain I và II

Protein E có khả năng liên kết với các thụ thể và cảm ứng dung hợp màng virus với màng tế bào vật chủ, giúp virus xâm nhập vào trong tế bào vật chủ [83, 86] Protein E còn chứa các quyết định kháng nguyên không trung hòa gây hiện

(2006), domain 3 thuộc kháng nguyên E còn là vùng chứa các quyết định kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao Với lý do này, Mota J và các cs của mình đã thiết kế một loại vắc xin ADN tứ liên phòng chống Dengue với hiệu quả đạt tới 87% trên chuột bằng ghép nối các domain 3 của cả 4 typ virus Dengue Protein prM liên kết với protein E giúp tạo đúng nếp gấp và tăng tính bền vững cho protein E trong quá trình hình thành cấu trúc không gian của virus Sau khi xâm nhập vào muỗi, protein vỏ E của virus được glycosyl hóa thành một glycoprotein, nhờ đó mới có khả năng bám vào thụ thể trong quá trình xâm nhập vào cơ thể người [88]

1.2.5 Các kháng nguyên dùng trong chẩn đoán

Muốn thực hiện kỹ thuật chẩn đoán miễn dịch thì điều kiện tiên quyết vẫn

là phải có kháng nguyên Các kháng nguyên cổ điển dùng trong chẩn đoán virut Dengue có thể được sản xuất từ não chuột bạch m ới nở đã nhiễm virut (Fujita N

và cs, 1978), nuôi cấy tế bào (Samuel R và cs, 1973) hoặc có thể sản xuất từ muỗi nhiễm virut Dengue (Kuberski T.T và Rosen L., 1977) Tuy nhiên gần

đây, với sự phát triển của sinh học phân tử, các kháng nguyên virut Dengue đã

được sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp Từ năm 1987 người ta đã bắt đầu nghiên cứu để tạo tạo ra các kháng nguyên virut Dengue tái tổ hợp Zhao B.T.,

1987, đã tạo ra được chủng virut đậu bò tái tổ hợp sản xuất 2 protein quan trọng của virut dengue là PreM và E (kháng nguyên vỏ và tiền kháng nguyên màng)

Năm 1990, Cohen S và cs đã thành công trong việc tạo ra chủng Salmonella tái

tổ hợp từ chủng Salmonella vắc xin sống giảm độc lực mang gen mã hóa protein

E của virut dengue có khả năng bảo vệ chuột BALB/c chống lại virut dengue

Delenda C và cs (1994) đã tạo ra được chủng Baculovirus tái tổ hợp mang gen

mã hóa protein E của virut dengue-2 có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch sinh

kháng thể trung hòa virut dengue-2 Năm 1995, người ta cũng đã thành công

trong việc tạo ra chủng E coli tái tổ hợp sản xuất ra một loại protein liên kết

giữa 2 loại protein của virut dengue type 2 là protein NS1 và protein E có khả năng tạo đáp ứng kháng thể trung hòa virut (Srivastava AK và cs 1995) Một chiến lược tạo ra các protein virut tái tổ hợp có cấu trúc kháng nguyên gần giống với kháng nguyên tự nhiên (ví dụ tạo ra kháng nguyên vỏ giống với hạt virut)

được xúc tiến mạnh mẽ từ năm 1996 (Ellis RW., 1996) Chủng nấm men Pichia

pastoris rất có lợi thế trong việc thực hiện mục tiêu này Năm 1997, Sugrue RJ

và cs đã thành công trong việc tạo ra chủng Pichia pastoris tái tổ hợp mang gen

mã hóa protein E và tạo ra protein tái tổ hợp có hình dạng giống hạt virut

dengue Người ta cũng đã tạo ra được chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sản xuất

vỏ của virut dengue type 4 và sản xuất kháng thể dơn dòng kháng protein tái tổ hợp này (Pupo-Antunez M, 2001) Ngoài ra, người ta còn có thể tạo ra chủng

Pichia pastoris tái tổ hợp sản xuất ra một protein lai giữa kháng nguyên bề mặt

của virut viêm gan B và kháng nguyên vỏ của virut dengue (Bisht H, 2001) Năm

2002, người ta đã tạo ra được chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sản xuất ra protein

vỏ của virut dengue type 4 và tinh chế bằng cột sắc ký hấp phụ kim loại để thu

được protein sạch tạo ra đáp ứng kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu và kháng thể trung hòa (Hermida L và cs, 2002) Tuy nhiên, các kháng nguyên vỏ tái tổ

hợp của virus dengue biểu hiện trong E coli gần đây lại được đặc biệt quan tâm

vì các kháng nguyên này cũng có thể tạo ra được kháng thể trung hòa kháng

virus dengue (Chiu MW và Yang YL, 2003) Biểu hiện trong E coli để tạo ra

các kháng nguyên tái tổ hợp dùng trong chẩn đoán SD/SXHD còn có một lợi thế khác là kháng nguyên tái tổ hợp giá thành hạ, biểu hiện ra được một lượng lớn trong một thời gian ngắn, và chỉ cần tinh chế một bước là có thể thu được kháng nguyên sạch Ngoài ra, các kháng nguyên này cũng phản ứng rất đặc hiệu với kháng thể kháng virus dengue tự nhiên (Jaiswal S và cs, 2004)

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm bao gồm các khâu: phân lập virus, phát hiện các kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền của virus (RNA) trong huyết thanh hay trong các mô nhiễm virus, hoặc phát hiện các kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh bệnh nhân [38, 46, 106]

1.3.1 Chẩn đoán huyết thanh học

Các phương pháp chủ yếu chẩn đoán huyết thanh học của virut Dengue bao gồm: Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI), phản ứng kết hợp bổ thể (CF), phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT), phép thử miễn dịch hấp phụ gắn enzym tóm bắt kháng thể IgM (MAC-ELISA) và phép thử miễn dịch hấp phụ gắn enzym phát hiện kháng thể IgG (GAC-ELISA)

- Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất,

được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán huyết thanh học không phải chỉ riêng đối với virut Dengue mà còn cho nhiều loại virut có khả năng ngưng kết hồng cầu nói chung Kháng nguyên dùng trong phản ứng HI để chẩn đoán huyết thanh học của sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue là kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) thường được sản xuất trên não chuột bạch mới nở và trên nuôi tế bào Kháng thể HI tồn tại rất lâu trong huyết thanh bệnh nhân vì vậy phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu cũng là kỹ thuật thường được dùng trong việc điều tra dịch

tễ huyết thanh học của virut Dengue (Clark, D H và Casals, 1958) Tuy nhiên

kỹ thuật HI chỉ xác định được sự nhiễm virut Dengue nói chung chứ khó có thể kết luận được bệnh nhân nhiễm virut thuộc typ nào Ngoài ra, trong chẩn đoán huyết thanh học bằng phản ứng HI cần phải có máu kép để đánh giá động lực kháng thể giữa hai lần lấy máu, máu 1 được lấy trong giai đoạn cấp tính và máu

2 được lấy sau 2-3 tuần kẻ từ khi lấy máu 1, điều này rất khó thực hiện và cho kết quả chậm Đây cũng là nhược điểm của phản ứng HI (Gubler, D.J và Clark, G.G., 1995)

- Phản ứng kết hợp bổ thể (CF): Phản ứng kết hợp bổ thể dùng trong chẩn

đoán huyết thanh học SD/SXHD là phản ứng dùng để xác định động lực kháng thể chống kháng nguyên CF của virut Dengue Kháng thể chống kháng nguyên

CF thường tồn tại trong một thời gian ngắn với nồng độ thấp (Samuel R và cs, 1973) vì vậy chỉ có ý nghĩa trong việc chẩn đoán huyết thanh học đối với các vụ dịch đang lưu hành mà không thể áp dụng trong điều tra huyết thanh học của virut Dengue trên cơ sở kháng thể tồn lưu

- Phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT): Là phản ứng phát hiện

kháng thể trung hòa virut Dengue trong huyết thanh Đây là phản ứng rất nhạy

và đặc hiệu, rất có ý nghĩa trong việc đánh giá khả năng bảo vệ của cơ thể chống lại virut Dengue sau nhiễm trùng tự nhiên hoặc gây miễn dịch thực nghiệm (Russell, P.K và Nisalak, A., 1987) Kháng thể trung hòa tồn tại rất lâu vì vậy sau khi nhiễm trùng hoặc gây miễn dịch chủ động, cơ thể sẽ có miễn dịch lâu dài

đối với virut Dengue cùng typ Điều này cũng có ý nghĩa rất lớn đối với việc điều tra hồi cứu huyết thanh học của virut Dengue trên cơ sở kháng thể tồn lưu Tuy nhiên, PRNT là phản ứng rất đắt tiền, phức tạp và phải sử dụng virut Dengue sống vì vậy việc sử dụng phương pháp này trong các phòng thí nghiệm vẫn còn rất hạn chế (Hayes, E.B và Gubler, D.J., 1992)

- Phép thử miễn dịch hấp phụ gắn enzym tóm bắt kháng thể IgM

(MAC-ELISA): Phép thử này được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây

trong việc chẩn đoán sớm virut Dengue Kháng thể thuộc lớp IgM hình thành sớm hơn kháng thể thuộc lớp IgG và tồn tại trong huyết thanh một thời gian ngắn (trong vòng 1-2 tháng) và chỉ có hiệu giá cao ở các trường hợp nhiễm trùng tiên phát (Kuno, G., và cs, 1991) Chính vì vậy MAC-ELISA rất có ý nghĩa trong việc

đánh giá nhiễm trùng hiện tại của virut Dengue và đặc biệt tiện lợi so với các phương pháp chẩn đoán huyết thanh khác vì chỉ cần lấy 1 mẫu máu (Kuno, G.,

và cs, 1998)

- Phép thử miễn dịch hấp phụ gắn enzym phát hiện kháng thể

IgG (GAC-ELISA): Về nguyên tắc, đây là một kỹ thuật ELISA thông thường

dùng để phát hiện kháng thể chống virut Dengue thuộc lớp IgG Phương pháp này có nguyên lý đơn giản là gắn bản bằng kháng nguyên nào thì phát hiện kháng thể chống kháng nguyên đó, thường thì người ta gắn bản với kháng

hiệu nên cũng chỉ có thể đánh giá nhiễm virut Dengue chứ không thể nhận biết

được nhiễm typ nào (Chungue, E và cs, 1989)

Não chuột bạch mới nở: Mặc dù cả 4 typ virus dengue đều được phân lập

từ huyết thanh người trên não chuột bạch mới nở, nhưng đây là phương pháp cần nhiều thời gian, giá thành cao [52, 56, 93] Hơn nữa, đây là hệ thống kém nhạy nên nhiều mẫu virus dengue hoang dại không được phân lập thành công trên hệ thống này Như vậy phải đòi hỏi hàng loạt những bước cấy truyền để thích nghi virus do đó phương pháp kém hiệu quả và không kinh tế Tuy nhiên, hệ thống này lại có lợi thế là có thể phân lập được các virus khác thuộc nhóm Arbo từ huyết thanh bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng giống với sốt dengue

Nuôi tế bào động vật: Nuôi tế bào động vật cũng có nhiều bất lợi giống

như não chuột bạch mới nở là cần nhiều thời gian, giá thành cao và kém nhạy, do cũng phải cấy truyền nhiều để virus có thể thích nghi [38, 46, 106, 114]

Phân lập trên muỗi: Phân lập trên muỗi là phương pháp nhạy nhất đối

với virus dengue [38, 87] Bốn loài muỗi thường được sử dụng trong phân lập

virus dengue là A aegypti, A albopictus, Toxorhynchities amboinensis, và

T splendens Virus dengue có thể nhân lên ở hầu hết các mô của muỗi kể cả tổ

chức não bộ Sau khi nhân lên, virus dengue trong mô muỗi có thể được phát hiện bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp thường sử dụng mô não hay mô tuyến nước bọt [38, 67]

Phân lập trên tế bào muỗi: Phân lập virus dengue trên tế bào muỗi là

phương pháp được sử dụng nhiều nhất hiện nay [38, 57, 69, 101] Dòng tế bào

được thiết lập đầu tiên từ tế bào muỗi A albopictus là dòng C6/36 và ngày nay

cũng vẫn còn được sử dụng nhiều nhất trong việc phân lập virus dengue vì đây là phương pháp nhanh nhạy và hiệu quả [57]

1.3.3 Xác định typ huyết thanh của virus dengue

Phương pháp được chọn để định typ huyết thanh của virus dengue là phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp với các kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng mỗi typ virus dengue gắn fluorescein isothiocyanate (FITC) [38, 46, 54] Thử nghiệm có thể dễ dàng được thực hiện với các tế bào, não chuột ổ hoặc mô của muỗi nhiễm virus dengue Đây là một phương pháp rất tiện lợi vì dễ thực hiện, nhanh và có thể đồng thời xác định được sự đồng nhiễm các typ huyết thanh khác nhau của virus dengue trên cùng một bệnh nhân [35, 74]

1.3.4 Các phương pháp chẩn đoán hiện đại

Trong những năm gần đây, một số phương pháp mới đã được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh nói chung và chẩn đoán virus dengue nói riêng Phương pháp sinh học phân tử được sử dụng nhiều nhất đối với các virus RNA là phương pháp PCR phiên mã ngược (RT-PCR) Đây là một phương pháp nhạy, nhanh,

đơn giản, có thể sử dụng các mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân, sinh thiết tử thi hay các mẫu muỗi [29, 46, 75, 106] Tuy nhiên, cũng cần phải nhấn mạnh rằng phương pháp RT-PCR không thể thay thế cho phương pháp phân lập virus được Các mẫu virus phân lập là cực kỳ quan trọng cho việc nghiên cứu sâu về sự khác biệt của chủng virus đang lưu hành, cơ chế bệnh sinh, giám sát dịch tễ học từ đó

có được htông tin quan trọng cho việc dự phòng và điều trị và nghiên cứu phát triển vắc xin hiệu quả

1.4 Dự phòng và kiểm soát bệnh

Dự phòng và kiểm soát bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue là nhiệm

vụ cấp bách, bởi vì bệnh càng ngày càng lan rộng trên phạm vi toàn cầu, đặc biệt

từ cuối thế kỷ 20 [36, 40, 41, 49, 80] Tuy nhiên, việc ngăn chặn và dự phòng

các biện pháp kiểm soát vectơ truyền bệnh vẫn còn rất hạn chế Vì vậy, chương trình phòng chống bệnh hiệu quả nhất phải là một chương trình tổng hợp bao gồm nhiều biện pháp kết hợp như: giám sát tác nhân gây bệnh bằng các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm, phản ứng nhanh khi có dịch, giáo dục cộng đồng những hiểu biết về bệnh SD/SXHD và kiểm soát muỗi truyền bệnh, gấp rút nghiên cứu sản xuất vắc xin và sử dụng vắc xin phòng bệnh khi vắc xin có hiệu lực ra đời [39]

1.4.1 Phát triển vắc xin phòng sốt dengue/sốt xuất huyết dengue

Các vắc xin dự tuyển đầu tiên được phát triển bởi các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ ngay sau khi virus dengue được phân lập không lâu [63, 92] Tuy nhiên, qua nhiều năm nghiên cứu, cho đến nay cũng vẫn chưa có được một vắc xin có hiệu lực thật sự trong phòng chống sốt dengue/sốt xuất huyết dengue [14,

48, 50,89, 110] Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo nên nghiên cứu phát triển loại vắc xin tứ liên để phòng sốt dengue/sốt xuất huyết dengue và tìm ra phương thức triển khai hiệu quả và kinh tế nhất [18, 19] Với sự tài trợ của WHO, trong vài năm gần đây, người ta đã đạt được những bước tiến đáng kể trong nghiên cứu phát triển vắc xin phòng SD/SXHD [17, 16, 15, 105, 113] Vắc xin sống giảm độc lực dự tuyển có hứa hẹn đã được thử lâm sàng giai đoạn I, II ở Thái Lan [17] Một hiệp định thương mại đã được ký kết và vắc xin này cũng

đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn một ở dạng tứ liên tại Mỹ

Các kế hoạch phát triển các vắc xin phòng sốt dengue/sốt xuất huyết dengue bằng công nghệ phân tử cũng đã được đặc biệt quan tâm trong những năm gần đây Các vắc xin này bao gồm: các vắc xin dưới đơn vị [28, 78, 99], các vắc xin tạo ra bởi các vector biểu hiện trong các loại tế bào khác nhau [21, 79], virus nhân tạo được tạo ra bằng kỹ thuật tái tổ hợp [20, 22, 60, 62, 64, 84], vắc xin ADN [65] Virus nhân tạo được tạo ra trên nền của virus DEN-2 là chủng dự tuyển vắc xin PDK-53 Chủng virus tái tổ hợp này được tạo ra bằng phương pháp

đưa thêm các gen mã hoá kháng nguyên capsid, tiền kháng nguyên màng M) và kháng nguyên vỏ (Envelope) của các typ DEN-1, DEN-3, DEN-4 vào

DEN-2 [64] Nhờ thao tác di truyền như thế này, người ta có thể tạo ra được chủng dự tuyển vắc xin an toàn hơn, có hiệu lực hơn và nhân lên tốt hơn so với chủng dự tuyển giảm độc lực đã được tạo ra bằng cấy truyền trước đây

- Virus Dengue type I (DEN-1) gây dịch tại Tây Nguyên

- Virus Dengue type II (DEN-2) gây dịch tại Nghệ An

- Virus Dengue type III (DEN-3) gây dịch tại Đà Nẵng

- Virus Dengue type IV (DEN-4) gây dịch tại Hà Tĩnh

Sử dụng 4 mẫu này cho việc tách dòng, nghiên cứu, biểu hiện gen và tạo Kit chẩn đoán

2.2.2 Các sinh phẩm

KIT tách dòng TA cloning (Invitrogen)

KIT làm phản ứng RT-PCR SuperScriptTM One-Step RT-PCR with Platinum Tag (Invitrogen)

KIT làm phản ứng xác định trình tự BigDyeđ Terminator v3.1

KIT tinh sạch plasmid - S.N.A.P.TM (Invitrogen)

Kit tách chiết DNA từ gel agarose - S.N.A.P free UV (Invitrogen)

Cột protein A Sepharose để tinh chế kháng thể (Invitrogen)

Cột Con-A (Concanavalin A) Sepharose để tinh chế kháng thể sau khi gắn cộng hợp (Invitrogen)

Cộng hợp kháng IgG người gắn HRP (Bio Rad)

Cộng hợp kháng IgG thỏ gắn HRP (Bio Rad)

Cộng hợp kháng IgG chuột gắn HRP (Bio Rad)

Vector biểu hiện pET-TRX-FuS

Tế bào vi khuẩn E coli làm vật chủ tách dòng các chủng DH5α [end A1

Tế bào vi khuẩn E coli làm vật chủ biểu hiện chủng BL21 (DE3) star [F

omp hsd SB(rBmB)gal dcm (DE3) plysS(Caml)]

Hệ vector biểu hiện trong nấm men P pastoris pPIC9

Chủng nấm men P pastoris làm vật chủ biểu hiện chủng GS115 [His-]

2.2.2.1 Hệ tách dòng pCR2.1

Chúng tôi sử dụng plasmid pCRđ 2.1 của hãng Invitrogen làm vector cho công việc tạo dòng gen và xác định trình tự kháng nguyên vỏ virus dengue

Plasmid pCRđ 2.1 có kích thước 3.9 kb Thành phần cấu tạo nên plasmid

và vị trí của từng thành phần trong plasmid được thể hiện ở bảng 2.1 và hình 2.1

Bảng 2.1: Các thành phần của vectơ pCR2.1

Gen LacZ Sp6 promoter

Vị trí tạo dòng T7 promoter F1 ori

Gen kháng kanamycin Gen kháng ampicillin ColE1 ori