Nghiên cứu, xác định đồng thời hàm lượng vitamin a, d2, d3 trong một số thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Vì vậy việc phân tíchhàm lượng vitamin A, D trong thực phẩm là cần thiết, vừa để xây dựng mộtquy trình định lượng đồng thờivitamin trong thực phẩm, vừa để góp phần xâydựng bảng thành phầ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI

HÀM LƯỢNG VITAMIN A, D2, D3 TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI

HÀM LƯỢNG VITAMIN A, D2, D3 TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS MAI THỊ THANH HUYỀN

NGHỆ AN - 2015

Luận văn được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề - KhoaHóa, Trung tâm Kiểm định An toàn Thực Phẩm và Môi trường, Trường Đạihọc Vinh.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:

 TS Mai Thị Thanh Huyền - Bộ môn Hóa Phân tích, Trường Đại họcVinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện trong suốt quá trìnhthực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn:

 PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa, PGS.TS Trần Đình Thắng, TS ĐinhThị Trường Giang - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuậnlợi, động viên tôi trong quá trình làm luận văn

 ThS Chu Thị Thanh Lâm - Phòng thí nghiệm Khoa Hóa, Trường Đại họcVinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô, Cán bộ bộmôn Hóa Hữu cơ, Hóa Phân tích - Khoa Hóa, Phòng Đào tạo Sau Đại học,các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đãđộng viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Nghệ An, tháng 10 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Mai Hương

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

danh mỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vitamin D 3

1.1.1 Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi 3

1.1.2 Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể 7

1.2 Vitamin A 10

1.2.1 Giới thiệu 10

1.2.2 Vai trò của vitamin A 12

1.2.3 Nguồn cung cấp vitamin A cho cơ thể 14

1.3 Các phương pháp xác định vitamin A và D 14

1.3.1 Phương pháp thử nghiệm sinh học 14

1.3.2 Phương pháp quang phổ 15

1.3.3 Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch 16

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 18

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 27

2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 27

2.1.1 Hóa chất 27

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 27

2.2 Thu thập và bảo quản mẫu 28

2.3 Xử lý mẫu 28

2.5 Lựa chọn và cài đặt, vận hành thiết bị HPLC 29

2.6 Chuẩn bị máy trước khi tiến hành phân tích 30

2.7 Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của vitamin A, D2, D3 trong dung dịch 30

2.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động 30

2.9 Phương pháp khảo sát đánh giá 30

2.9.1 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn định lượng của phương pháp .30

2.9.2 Giới hạn phát hiện (LOD) 31

2.9.3 Giới hạn định lượng (LOQ) 32

2.9.4 Xác định độ lặp lại (repeatability) 33

2.9.5 Xác định độ thu hồi 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Các thông số khảo sát 35

3.3 Khảo sát các điều kiện phân tích trên HPLC 35

3.3.1 Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của vitamin D2, D3, A trong dung dịch 35

3.3.2 Lựa chọn cột phân tích cho máy HPLC 36

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động 37

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng 41

3.3.5 Kết quả khảo sát phương pháp đo lập phương pháp chạy chuẩn vitamin A, D2, D3 42

3.4 Xây dựng đường chuẩn của vitamin 42

3.5 Khảo sát độ lặp lại của máy 46

3.6 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp .47

3.7 Xác định hiệu suất thu hồi 49

3.8 Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm 50

KẾT LUẬN 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 58

25(OH)D : 25-hydroxyl vitamin D

25(OH)D2 : 25-hydroxyl vitamin D2

25(OH)D3 : 25-hydroxyl vitamin D3

IT : Bẫy ion ( Ion trap)

IS : Chất nội chuẩn(internal standard)

LC : Sắc kí lỏng (Liquid chromatography)

MS : Phổ khối (Mass spectrometry)

MTBE : Methyl-tert-butyl ether

SPE : chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

UPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

RMSE : Độ lệch khởi động (root mean square error)

THF : Tetra hydro furan

ACN : Aceton nitril

LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

Trang

Hình 1.1 Khái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D

4

Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu 29

Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS của vitamin D 2 36

Hình 3.2 Sắc ký đồ của vitamin A, D 2 , D 3 ở tốc độ dòng 0,3 ml/phút cột C 8 36

Hình 3.3 Sắc ký đồ của vitamin A, D 2 , D 3 ở tốc độ dòng 0,5ml/phút cột C 18 37

Hình 3.4 Sắc ký đồ các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:THF 38

Hình 3.5 Sắc ký đồ các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:MTBE 39

Hình 3.6 Sắc ký đồ các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:ACN 40

Hình 3.7 Sắc ký đồ của các vitamin ở các tốc độ dòng khác nhau 41

Hình 3.8 Peak của các nồng độ vitamin D 2 , D 3 , A trong đường chuẩn xếp chồng lên nhau 44

Hình 3.9 Đường chuẩn vitamin A 44

Hình 3.10 .Đường chuẩn vitamin D 2 45

Hình 3.11 .Đường chuẩn vitamin D 3 .45

Hình 3.12 .Sắc đồ mẫu cà rốt .51

Hình 3.13 .Sắc đồ mẫu gan bò 51

Hình 3.14 .Sắc đồ mẫu gan cá Tra .51

Hình 3.15 .Sắc đồ mẫu gan gà .52

Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D mỗi ngày của các lứa tuổi .10

Bảng 3.1 Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:THF 37

Bảng 3.2 Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:MTBE 39

Bảng 3.3 Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:ACN 40

Bảng 3.4 Sắc ký đồ của vitamin D 2 ở dòng 1 ml/phút (a) và 0,5 ml/phút (b) 42

Bảng 3.5 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vitA .43

Bảng 3.6 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D 2 43

Bảng 3.7 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D 3 43

Bảng 3.8 Độ lặp lại của máy HPLC 46

Bảng 3.9 LOD, LOQ của vitamin A 47

Bảng 3.10 LOD, LOQ của vitamin D 2 48

Bảng 3.11 LOD, LOQ của vitamin D 3 48

Bảng 3.12 Kết quả xác định hiệu xuất thu hồi đối với các vitamin 49

Bảng 3.13 Tổng hợp các điều kiện phân tích vitamin A, D 2 , D 3 50

Bảng 3.14 Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm 50

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Vitamin là một chất không sinh năng lượng nhưng nó không thể thiếutrong sự sống của con người Vitamin đóng vai trò là chất xúc tác trong cácphản ứng sinh hóa, từ quá trình trao đổi chất, đến xây dựng hệ thống miễndịch trong cơ thể Mỗi loại vi chất có những công dụng riêng và đều chứatrong nguồn thực phẩm hàng ngày Vitamin giúp chuyển hóa tối đa chất dinhdưỡng thành năng lượng sống cho cơ thể, tăng cường sức đề kháng, bảo vệ cơthể.Cơ thể con người cần 13 loại vitamin: A, C, D, E, K và 8 loại vitaminthuộc nhóm B nhưng cơ thể con người chỉ tổng hợp được vitamin D khi cóánh sáng mặt trời Chính vì vậy cơ thể lấy vitamin từ nguồn bên ngoài là chủyếu, có thể lấy vitamin từ thức ăn, đồ uống chứa nhiều vitamin như các lạirau, củ, trái cây…

Vitamin D và vitamin A là hai vitamin thuộc nhóm vitamin tan trongdầu Vitamin A rất cần thiết cho thị giác, cho sự tăng trưởng, sự phát triển vàduy trì của biểu mô Vitamin A có nhiều trong gan, thận động vật, các chếphẩm từ sữa, trứng và dầu gan cá Thiếu vitamin A gây hiện tượng tăng sừng

da, khô mắt, quáng gà lúc xẩm tối.Vitamin Dcó chức năng sinh học là duy trìnồng độ canxi và phốt pho bình thường trong huyết tương bằng cách tănghiệu quả hấp thụ các chất khoáng từ khẩu phần ăn ở ruột non và tăng huyđộng canxi, phốt pho từ xương và máu Vitamin D có nhiều trong gan cá, bơ,sữa, trứng, nấm… Thiếu vitamin D sẽ gây còi xương ở trẻ em, yếu cơ Vitamin cần thiết cho cơ thể nhưng thừa vitamin cũng có thể gây nên nhữngvấn đề nghiêm trọng Trái với nhóm các vitamin tan trong nước khi thừa đềuthải ra theo đường nước tiểu thì các vitamin tan trong dầu được dự trữ ở ganvới các mức độ khác nhau Với một lượng vitamin A, D quá cao có thể gây

ngộ độc cho cơ thể Nếu thừa vitamin A trong thời gian dài gây đau xươngkhớp, rụng tóc, môi khô nứt nẻ, chán ăn, gan lách to Còn khi dùng với liềucao D2, D3 hàng nghìn lần liều phòng có thể gây ngộ độc Các triệu chứng haygặp là kém ăn, buồn nôn, nóng, tiểu nhiều, ngừng lớn, xanh xao, đôi khi gây

co giật khó thở

Với những đặc điểm trên, kiểm soát và bổ sung hàm lượng vitamin phùhợp là rất quan trọng, nhất là khi trên thị trường ngày càng xuất hiện nhiềuloại thực phẩm chế biến sẵn có bổ sung vitamin A và D Vì vậy việc phân tíchhàm lượng vitamin A, D trong thực phẩm là cần thiết, vừa để xây dựng mộtquy trình định lượng đồng thờivitamin trong thực phẩm, vừa để góp phần xâydựng bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm địa phương.Có nhiều phươngpháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin A, D2, D3 trong thực phẩm, trong

đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép phân tích với độ nhạy và

độ chọn lọc cao Vì vậy chúng tôi đã chọn đề tài “NGHIÊN CỨU, XÁC

THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)”.

2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng được phương pháp xác định đồng thời hàm lượng vitamin A,

D2, D3 trên máy HPLC

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội

tụ, độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp

- Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin A,

D2, D3trong một số thực phẩm

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Hàm lượng vitamin A, D2, D3 trong một số thực phẩm gan, cà rốt và nấm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vitamin D

1.1.1 Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi

Vitamin D là tinh thể không màu không mùi không vị, không tan trongnước mà tan trong chất béo và các dung môi hữu cơ Nó được phát hiện ranăm 1922, được phân lập năm 1932, tìm được cấu trúc năm 1936, và đến năm

1959 được tổng hợp nhân tạo Thuật ngữ vitamin D dùng để chỉ một nhómsterol có cấu trúc tương tự nhau, có khả năng làm tăng hấp thụ canxi vàphotphat trong cơ thể chống bệnh còi xương ở trẻ và loãng xương hay xốpxương ở người già Nhóm chất này gồm từ D2 đến D7 song quan trọng nhất là

D2 (ergocalciferol được tổng hợp từ ergosterol có nhiều trong nấm và menbia), D3(cholecalferol có trong thịt, cá, gan, trứng, sữa được tổng hợp từ 7-dehydrocholeterol ở dưới da nhờ ánh sáng tia từ ngoại) Trong cơ chế sinhhọc, đặc tính và vai trò của chúng khá giống nhau Trong cơ thể vitamin Dchuyển hoá ở gan và thận tạo ra chất chuyển hoá có đặc tính là 1,25 -dihydroxycholecalciferol nhờ enzim deoxylase

Vitamin D có vai trò quan trọng trong quá trình tạo xương và răng nhờ

có tác dụng chuyển hoá và tăng hấp thu canxi và phot pho ở ruột Bên cạnh

đó, canxi cũng cần thiết cho hoạt động của tim, cơ bắp và hệ thần kinh, đồngthời tham gia vào quá trình đông máu Ở trẻ nhỏ vitamin D tham gia vào quátrình canxi hoá sụn nên rất cần thiết cho sự phát triển xương ở trẻ Trẻ em bịthiếu vitamin D dẫn đến còi xương, lùn, xương bị dị dạng, răng không đều bị

dị hình, ở người lớn nêu thiếu vitamin D sẽ dẫn đến loãng xương Cung cấp

đủ lượng vitamin D mỗi ngày làm giảm nguy cơ mắc bệnh cao huyết áp vàmột số bệnh ung thư, vì vitamin D điều hoà lượng canxi trong máu ức chế tếbào ung thư, đặc biệt là ung thư gan và ung thư đại trực tràng Bà mẹ mang

thai nếu thiếu vitamin D dẫn đên con sinh ra còi xương, khuyết tật, nhất là 3tháng đầu thai kì, sẽ là tổn thương não không thể phục hồi.

Hình 1.1 Khái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D

Các biểu hiện cho thấy trẻ bị thiếu vitamin D: thần kinh bị kích thích,ngủ không yên giấc, hay tỉnh giấc, quấy khóc, và rõ ràng nhất là ở trẻ dưới 3tháng tuổi), hay bị mồ hôi trộm cả khi trời lạnh, bị co giật nếu sốt cao, có thểkhó thở Nếu tình trạng thiếu vitamin D trầm trọng sẽ gây biến đổi cơ, biếndạng xương, sẽ ảnh hưởng đến chiều cao tầm vóc của trẻ sau này và khó cóthể phục hồi Vì vậy, các mẹ cần cung cấp đủ lượng vitamin D mỗi ngày chotrẻ để trẻ phát triển bình thường với tầm vóc cao to khoẻ mạnh

Thiếu vitamin D làm giảm hàm lượng serotonin trong não, ảnh hưởngđến tinh thần của con người Serotonin là một loại hoocmon được gọi là

“hoocmon hạnh phúc”, suy giảm lượng hoocmon này khiến tâm trạng conngười bất ổn, dễ buồn chán, cáu bẳn, không kiểm soát được hành động và suynghĩ, nếu thiếu hụt một cách trẩm trọng sẽ dẫn đến trầm cảm Nguyên nhânchính dẫn đến thiếu hụt lượng vitamin D trong cơ thể là ít tiếp xúc với ánhnắng mặt trời, dù cho có chế độ ăn đầy đủ và đều đặn

Vitamin D đã được hoạt hoá duy nhất ảnh hưởng đến 2000 gen, đặcbiệt là tăng cường hệ miễn dịch Vì vậy, thiếu vitamin D trong cơ thể gây racác chứng bệnh nan y như:

1 Bệnh cúm: ở trẻ nếu thiếu hụt vitamin D sẽ làm giảm khả năng miễndịch và dễ nhiễm bệnh ở đường hô hấp

2 Suy nhược cơ bắp: theo nghiên cứu, có những người khoẻ mạnh mà

cơ bắp yếu đó là do thiếu hụt vitamin D

3 Bệnh vảy nến: những người ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời khảnăng mắc bệnh là rất cao

4 Bệnh thận mãn tính: do cơ thể thiếu hụt trầm trọng lượng vitamin Dlàm tăng nguy cơ mắc bệnh thận

5 Đái tháo đường: Theo nghiên cứu, cung cấp đủ lượng vitamin D chotrẻ thì làm giảm 80% nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường typ 1

6 Bệnh hen suyễn: Cung cấp đầy đủ lượng 1200 IU/ngày cho trẻ làmgiảm rõ rệt nguy cơ mắc bệnh hen học đường

7 Bệnh nha chu: những người bị bệnh về nướu mãn tính đau nhức vàchảy máu nướu nên bổ sung thêm lượng vitamin D để cơ thể sản xuất đủdefensins và cathelicidin Đây là các hợp chất chứa các vi sinh vật giúp làmgiảm vi khuẩn gây bệnh trong miệng

8 Bệnh tim mạch: Thiếu hụt vitamin D trong cơ thể gây suy tim sunghuyết, nguyên nhân dẫn đến căn bệnh tim tiềm ẩn

Theo các nghiên cứu đã đưa ra hàm lượng vitamin D thường đượcchuẩn đoán bằng cách đo nồng độ hợp chất 25-hydroxyvitamin D là một tiềnchất của 1,25-dihydroxyvitamin D trong máu Một báo cáo năm 2008 đã chiathành 4 loại :

 Hơi thiếu 50-100nmol/l (20-40ng/ml) (1nmol/l = 0.4 ng/ml)

 Thiếu nhẹ 25-50nmol/l (10-20ng/ml)

 Thiếu trung bình 12.5-25.0 nmol/l (5-10ng/ml)

 Thiếu nghiêm trọng <12.5 nmol/l (<5ng/ml)

Theo nghiên cứu hàm lượng cần thiết 25(OH)D trong máu cần thiết đểtránh bệnh còi xương ở trẻ và loãng xương ở người già là 15ng/ml Lượngcần thiết để tối ưu hoá sự hấp thu canxi ở ruột là 34ng/ml Gần đây đã phát hiện

ra rằng hàm lượng trung bình 29-38 ng/ml có thể làm giảm đáng kể nguy cơ mắcbệnh ung thư về nội tạng và trên 33ng/ml sẽ làm giảm 50% tỷ lệ mắc ung thưtrực tràng và ở mức 52 ng/ml làm giảm 50% nguy cơ ung thư vú

Tuy nhiên, bên cạnh các ưu điểm vượt trội của nó nếu quá lạm dụng

và cung cấp quá nhiều cho cơ thể cũng sẽ dẫn đến hậu quả khá nghiêm trọng

Đó là làm tăng hàm lượng canxi quá mức trong máu, tăng canxi niệu làm đaunhức xương khớp, tăng huyết áp, tạo sỏi thận, đau mỏi, suy nhược, đau đầumệt mỏi, giòn xương

Giải pháp ngăn ngừa thiếu hụt vitamin D

Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể gồm : ánh sáng mặt trời (phơinắng 20 phút/ ngày) và từ thuốc bổ Bên cạnh đó có khoảng 10% hàm lượngvitamin D cấp cho cơ thể mỗi ngày được lấy từ bữa ăn Các thực phẩm giàuvitamin D như : trứng, cá, gan, sữa, nấm, các thực phẩm có bổ sung vitaminD Lượng vitamin D cần thiết bổ sung theo khuyến cáo của Viện Dượcphẩm Mỹ là 200- 600IU/ngày Nhưng thực tế, mỗi cơ thể cần một lượngkhác nhau tuỳ theo thể trạng, độ tuổi của mỗi người Có một số trường hợplên đến 2000-4000IU/ngày

1.1.2 Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể

Có 3 con đường mà cơ thể hấp thụ được vitamin D: qua da, bằng ănuống và bằng thuốc bổ sung

Theo truyền thống, nguồn vitamin D con người bắt đầu từ da, khôngphải bắt nguồn từ miệng Sự tổng hợp vitamin D của da xảy rất nhanhchóng và mạnh mẽ, quá trình tổng hợp diễn ra dễ dàng chỉ sau một vài phútđược tiếp xúc với ánh nắng mặt trời Tiếp xúc với ánh nắng mặt trời chứkhông phải chế độ ăn uống là nguồn cung cấp chính vitamin D cho cơ thểcho dự trữ và tuần hoàn, có thể xem đây là một chức năng của phần bề mặt

da hở Nguồn cung cấp vitamin D qua da giúp cung cấp 80-85% nhu cầuvitamin D của cơ thể Dưới tác dụng của tia cực tím các tiền chất vitamin D

có ở tuyến bã và lớp Malpighi của biểu bì sẽ được chuyển thành vitamin D.Nếu được phơi nắng đầy đủ, sau 3 giờ, 1cm2 da có thể sản xuất ra 18UIvitamin D3

Ví dụ khi người có làn da được tắm nắng vào mùa hè (toàn thân, liềutối thiểu UVB), mỗi cơ thể sản xuất ~ 20.000 IU vitamin D trong <30 phút

Để đạt được điều này tương đương với con người sẽ phải uống 200 ly sữa(100 IU/8 oz thủy tinh) hoặc dùng 50 viên vitamin tổng hợp tiêu chuẩn (400IU/viên) trong một lần

Nguồn cung cấp tự nhiên vitamin D khác là qua thức ăn Vitamin D cótrong nguồn thực phẩm từ động vật (D3) và thực vật (D2), có nhiều trong cácthực phẩm như dầu gan cá thu, dầu dừa, lòng đỏ trứng, sữa động vật

Những thực phẩm chứa nhiều Vitamin D:

Gan nấu chín:

Có lẽ nhiều người không biết rằng, gan là có một nguồn cung cấpvitamin D tuyệt vời cho cơ thể Mặc dù tất các loại thực phẩm như gan bò,gan gà và gan bê đều có chứa một hàm lượng lớn vitamin D, nhưng gan bê cóhàm lượng vitamin D cao nhất trong số đó Gan bê không những hữu ích cho

sự phát triển xương mà còn giúp cho làn da, mái tóc khỏe mạnh và thúc đẩytái tạo tế bào.

Sữa:

Sữa được xem là một trong những nguồn cung cấp vitamin D tốtnhất Một ly sữa có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể.Ngoài ra, sữa không những rất bổ dưỡng cho trẻ em mà còn có tác dụng tốtvới sức khỏe của người lớn Các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng vitamin D cótrong sữa có khả năng chống lão hóa, do đó hãy thêm sữa vào thực đơnhằng ngày của bạn

Lòng đỏ trứng:

Trứng là một thực phẩm giàu vitamin D, đặc biệt là phần lòng đỏ trứng.Lòng đỏ trứng có khả năng điều hòa hệ thần kinh, hệ tim mạch và não Hơnnữa, trứng còn làm giảm nguy cơ bị đục thủy tinh thể cũng như kích thích tócmọc nhanh hơn

Cá hồi:

Cá hồi cũng là những nguồn cung cấp vitamin D rất lớn Thực tế, cáhồi là một trong những nguồn vitamin D tự nhiên và các axít béo thiết yếurất hiếm có Loại cá này giúp cải thiện các chức năng của não bộ và bảo vệ

hệ thần kinh Nó hoạt động như một chất chống trầm cảm và do đó hỗ trợtrong việc giúp não thư giãn, tăng hiệu quả hoạt động của não và cải thiệntrí nhớ

Dầu gan cá:

Dầu gan cá tuyết được biết đến rộng rãi như là một nguồn cung cấp mộtlượng lớn vitamin D Loại dầu cá này có khả năng cải thiện tình trạng của tim

và hệ tim mạch Hơn nữa, nó hỗ trợ trong việc tăng cường các hoạt động của

cơ bắp và độ đàn hồi của mạch máu Các nghiên cứu đã cho thấy dầu gan cágiúp làm giảm lượng cholesterol cao trong máu và làm loãng máu, do đó giảmnguy cơ tắc nghẽn động mạch

Cá mòi đóng hộp

Mặc dù cả cá mòi tươi và đóng hộp đều được ưa chuộng nhưng cá mòiđóng hộp được cho rằng có lợi hơn cho sức khỏe Ngoài các chất dinh dưỡngkhác, cá mòi đóng hộp rất giàu vitamin D, do đó giúp cải thiện sức khỏe củaxương và sức khỏe tim mạch Hơn nữa, loại thực phẩm này còn được biết đếnnhư một phương pháp điều trị viêm nhiễm hiệu quả và kiểm soát mức đườngtrong cơ thể

Pho mát

Pho mát là một trong những sản phẩm làm từ sữa rất giàu vitamin D.Lượng vitamin D này sẽ giúp hấp thụ lượng canxi cao từ phô mai, qua đó tăngcường độ chắc khỏe của xương và ngăn ngừa chứng loãng xương hiệu quả.Hơn nữa, sự có mặt của vitamin D trong pho mát rất hữu ích cho việc tăngcường sức khỏe răng miệng và tránh sâu răng Điều này rất hữu ích trong việcngăn ngừa sự hao mòn men răng

Cá trích

Cá trích là một trong những nguồn giàu chiết xuất vitamin D Với hơn

952 IU vitamin D chỉ trong một chén cá trích, loại cá giàu dinh dưỡng này làmột thực phẩm thiết yếu trong chế độ ăn uống khỏe mạnh Đặc biệt là cá tríchĐại Tây Dương có lợi hơn nhiều so với cá ở Thái Bình Dương Mọi cách chếbiến cá trích đều không làm giảm đi lượng vitamin D cung cấp cho cơ thể

Nấm

Dữ liệu về thành phần thực phẩm hiện nay cho thấy nấm là một nguồncung cấp vitamin D tốt ngoài các nguồn từ động vật như trứng, sữa, thịt,

cá v.v và vitanmin D được bảo toàn tốt trong quá trình nấu ăn [16]

Các báo cáo về nấm của một số nước trên thế giới cho thấy hàm lượngvitamin D trong nấm tự nhiên ở trong khoảng 2 - 40 µg/100g, có thể đáp ứng

đủ nhu cầu vitamin D trong một ngày của cơ thể người và thay thế nguồnvitamin D từ các sản phẩm từ động vật, đặc biệt đối với người ăn chay [20]

Lượng vitamin D cơ thể cần mỗi ngày phụ thuộc vào tuổi của mỗi người.Trung bình lượng khuyến cáo hàng ngày từ tổ chức Food and Nutrition Board chocác lứa tuổi khác nhau được liệt kê dưới đây đơn vị quốc tế (IU) bảng 1.1.

Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D mỗi ngày của các lứa tuổi [12].

Liều lượng(IU) Khuyến cáo- tối đa

Liều lượng (µg) Khuyến cáo- tối đa

Retinyl acetat C22H32O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 7 dimethyl 9 (2 6

-6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,-6,8 - nona tetraen - 1 - yl acetat

Retinyl propionate C23H34O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 7 dimethyl 9 (2 6

-6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,-6,8 - nona tetraen - 1 - yl propionat

Retinyl palmitat (C35H47O2 )(2E, 4E, 6E, 8E) 3 7 dimethyl 9 (2

-6 - -6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,-6,8 - nona tetraen - 1 - ylpropionat

Vitamin A có tính chất hóa học sau:

- Không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi của lipit, ete,ethanol…

- Bền trong điều kiện yếm khí, bền với acid và kiềm ở nhiệt độkhông quá cao

- Dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí, ánh sáng làm tăng quá trình oxyhóa vitamin A

- Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase thì retinol chuyển sangdạng retinal

- Phản ứng với SbCl3 cho phức chất màu xanh

- Phản ứng với H2SO4 cho phức chất màu nâu

1.2.2 Vai trò của vitamin A

Vitamin A có vai trò quan trọng trong sự phát triển của phôi thai, hìnhthành cơ quan trong quá trình phát triển của thai nhi, chức năng miễn dịchbình thường, và phát triển của mắt và thị lực

Vitamin A có các chức năng :

- Bảo vệ cấu trúc của da trong toàn bộ cơ thể

- Yểm trợ thị giác trong quá trình phân biệt vùng sáng và vùng tối

- Xúc tác sự phóng thích tố sinh dục và hưng phấn quá trình thụ thai

- Phát triển sự tăng trưởng của nhau và bào thai

- Hưng phấn quá trình kiến tạo tủy xương

- Ức chế độc chất sinh ung thư và gây xơ cứng tế bào

Vitamin A là một vi chất có vai trò đặc biệt quan trọng với cơ thể, gồm

4 vai trò chính :

- Trên mắt: vitamin A có vai trò tạo sắc tố võng mạc giúp mắt nhìnđược trong điều kiện thiếu ánh sáng, nếu thiếu vitamin A sẽ giảm khả năngnhìn trong bóng tối hay còn gọi là mắc bệnh quáng gà, nếu không điều trị sẽdẫn tới mù lòa.

- Trên da và niêm mạc: vitamin A giúp tăng tiết chất nhày và ức chế sựsừng hóa Nếu thiếu vitamin A sẽ làm giảm bài tiết chất nhày và tăng sự sừnghóa khiến cho mắt bị khô da bị khô, nứt nẻ và sần sùi

- Trên xương : cùng với vitamin D, vitamin A có vai trò giúp cho sựphát triển xương và tham gia vào quá trình phát triển cơ thể, đặc biệt ở trẻ em.Nếu thiếu vitamin A trẻ em sẽ còi xương, chậm lớn

- Trên hệ miễn dịch : vitamin A giúp tăng tổng hợp các protein miễn dịchnâng, cao sức đề kháng của cơ thể do có tác dụng chống oxy hóa Khi thiếuvitamin A cơ thể dễ bị mắc các bệnh nhiễm khuẩn và tổn thương ở đường hô hấp,tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục Dễ nhạy cảm với tác nhân gây ung thư

Mới đây người ta còn phát hiện vitamin A còn có khả năng làmtăng sức đề kháng với các bệnh nhiễm khuẩn, uốn ván, lao sởi, phòngngừa ung thư…

Thiếu vitamin A dẫn đến nguy cơ chậm lớn và ngừng phát triển, sừnghóa các màng nhầy ( ở niệu đạo, phế nang, đường tiêu hóa, ) đặc biệt là sừnghóa ở giác mạc gây mù lòa Nếu thừa vitamin A sẽ gây đau bụng, buồn nôn,

bơ phờ, chậm chạp, phù gai thị, thóp phồng, vài ngày tiếp theo da bong toànthân rồi hồi phục dần khi đã ngừng thuốc Nó có thể gây buồn nôn, vàng da,

dị ứng, biếng ăn, nôn mửa, nhìn mờ, đau đầu, tổn thương cơ và bụng, uể oải

và thay đổi tính tình Ngộ độc mãn có thể xảy ra sau khi uống 40.000 đơn vịhoặc hơn mỗi ngày, dùng thời gian dài gây đau xương khớp, rụng tóc, môikhô nứt nẻ, chán ăn, gan lách to Trong các trường hợp kinh niên, rụng tóc,khô màng nhầy, sốt, mất ngủ, mệt mỏi, giảm cân, gãy xương, thiếu máu và

tiêu chảy có thể là các triệu chứng hàng đầu gắn liền với ngộ độc ít nghiêmtrọng Các triệu chứng ngộ độc nói trên chỉ xảy ra với dạng tạo thành trước(retinoit) của vitamin A (chẳng hạn từ gan), còn các dạng caretonoit (như β-carotene trong cà rốt) không gây các triệu chứng như vậy.

1.2.3 Nguồn cung cấp vitamin A cho cơ thể

Vitamin A trong thực phẩm có nguồn gốc động vật dưới dạng retinol,còn thức ăn có nguồn gốc thực vật ở dưới dạng caroten (tiền vitamin A)

Retinol (các nguồn động vật): cá tuyết và cá bơn, dầu gan, thịt bò, bê, thịt

cừu và thịt gà, gan, bơ, phô mai, trứng, sữa, cá thu, thịt bò, cá mòi đóng hộp

Beta-Carotene (pro-vitamin A, các nguồn thực vật): cải xoăn, cà rốt

thường xuyên, rau mùi tây, rau bina, khoai lang, mơ khô, cải xoong, cải xanh, xoài, cà chua, bắp cải, đậu Hà Lan đông lạnh

1.3 Các phương pháp xác định vitamin A và D

1.3.1 Phương pháp thử nghiệm sinh học

Phương pháp chính thức đầu tiên để xác định vitamin D là phươngpháp thử nghiệm sinh học, trong đó hoạt tính sinh học của vitamin D đượcxác định bằng khả năng của nó ngăn ngừa hoặc cải thiện các triệu chứng thiếuhụt vitamin D trong cơ thể [16]

Bằng cách đo khả năng hoạt động chống còi xương, bằng thử nghiệmtrên loài chuột (kiểm tra điểm vôi hóa hoặc kiểm tra chữa bệnh còi xương) đã

từ lâu được sử dụng để xác định vitamin D trong thực phẩm hoặc các dượcphẩm Chuột còi xương được cho ăn bằng thức ăn có chứa một lượng khácnhau của vitamin D đã được thiết lập theo các định mức tiêu chuẩn Sau bảyngày, xương của những con chuột được xử lý bằng dung dịch nitrat bạc.Lượng canxi mới được chuyển vào xương được biểu hiện thành vết tối trênảnh chụp Thang tiêu chuẩn được thiết lập bằng cách xây dựng mối liên hệgiữa các vùng tối trên xương với lượng vitamin D trong chế độ ăn uống (cho

gà con mới sinh thức ăn bổ sung có chứa hàm lượng khác nhau của vitaminD) Hàm lượng vitamin D trong mẫu sau đó được xác định bằng cách so sánhvới khu vực mờ tối của chất chuẩn, từ đó xác định tỷ lệ tro xương sau ba tuầnvới mỗi chế độ ăn uống.

Các sinh trắc nghiệm này có thể phát hiện vitamin D ở nồng độ rấtthấp Ví dụ, kiểm tra trên dòng chuột có thể phát hiện hàm lượng thấp tới 12

ng vitamin D Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là không phân biệtgiữa các dạng khác nhau của vitamin D, đòi hỏi thời gian chuẩn bị lâu dài, độtin cậy thấp so với các phương pháp khác

Phương pháp thử nghiệm sinh học với vitamin A là đã tiến hành chochuột ăn thực phẩm đã bị rút hết chất béo bằng hỗn hợp ete-rượu (1909) Vớithí nghiệm này, Step đã đưa ra nhận xét rằng: trong thực phẩm có các yếu tốhòa tan trong chất béo cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể gọi là yếu tố

A, sau này gọi là vitamin nhóm A

Từ lâu người ta cho rằng vitamin A chỉ tồn tại chủ yếu trong các sảnphẩm động vật như gan cá, mỡ bò, trứng… Mãi đến năm 1920 Osborn,Mendel và một số tác giả khác phát hiện thấy có các hợp chất tương tự ở thựcvật Sau đó tới Eiler (1929), Mur (1930) đã đưa ra ý kiến cho rằng các hợpchất tương tự đó, các Caroten chính là tiền thân của Vitamin A hay gọi làprovitamin A Năm 1828-1931 nhà bác học Thụy Sỹ Paul Karrer đã dùngphương pháp sắc ký để phân chia và phát hiện ra cấu trúc của Vitamin A vàCaroten Năm 1950 nhiều nhà hóa học trong đó có Karrer đã tổng hợp thànhcông chất β-Caroten là một trong số 3 dạng phân quan trọng của Caroten

1.3.2 Phương pháp quang phổ

Phổ hồng ngoại đã được sử dụng để phân tích định lượng của vitamin

D Trong các pha rắn, vitamin D2 có thể được phân biệt với vitamin D3 dựavào đỉnh phổ vitamin D2 tại 907 cm-1.Phổ FTIR đặc trưng của tinh thể vitamin

D2 và D3 cũng đã được mô tả Vitamin D có thể được định lượng bằng cách đo

sự hấp thụ tia cực tím tối đa ở 264 nm Hạn chế của phương pháp này là cáchợp chất hấp thụ tia cực tím khác trong mẫu đo sẽ can thiệp vào kết quả địnhlượng vitamin D [17]

Phương pháp so màu cũng được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích cácvitamin A trước khi phương pháp HPLC ra đời Phương pháp này dùng đểphân tích chất tổng hợp và thực phẩm dựa trên sự hình thành một phức chấtmàu xanh giữa triclorua antimon hoặc trifluoroacetic acid với retinol trongchloroform, được đo ở 620 nm Phương pháp này được sử dụng trên toàn thếgiới nhưng dần được thay thế bằng phương pháp HPLC Vì phương pháp somàu có nhược điểm: thiếu đặc trưng, màu sắc không ổn định đòi hỏi phảinhanh chóng và thời gian đo lường phải phù hợp, và sử dụng các thuốc thử ănmòn và gây ung thư, các bước khảo nghiệm phải được kiểm soát cẩn thận

1.3.3 Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch

Năm 2013 Wendy L Arneson và cộng sự [24] đã đề cập đến các phươngpháp hiện tại được dùng rộng rãi để đánh giá hàm lượng vitamin D trong lâmsàng bằng cách đo lượng 25(OH)D và các dạng chuyển hóa hydroxyl vitamin Dkhác trong huyết thanh người Trong bài báo này tác giả có đánh giá về cácphương pháp thường dùng phổ biến nhất để định lượng vitamin D đó là phươngpháp miễn dịch phóng xạ (RIA), phương pháp LC-MS/MS và phương phápHPLC Tác giả đã mô tả khá đầy đủ về quy trình thực hiện phương pháp xétnghiệm miễn dịch và nêu ra một số phương pháp xét nghiệm miễn dịch để địnhlượng vitamin D được FDA chấp thuận hiện có gồm phương pháp xét nghiệmmiễn dịch quang hóa học (ECLIA), phương pháp RIA

Phương pháp miễn dịch enzyme cũng được sử dụng để phân tíchvitamin D Vitamin D cho liên kết với protein đồng nhất, từ đó đo lường hàmlượng thực tổng cộng 25(OH)D Các tổ hợp liên kết protein - vitamin D có thể

nhận diện vitamin D2 và D3 và cũng xác nhận hàm lượng tổng cộng hydroxy D một cách chính xác.

25-Lena Jafri và nhóm cộng sự [20] đã so sánh ba phương pháp miễn dịchphóng xạ (RIA) với HPLC và phương pháp miễn dịch quang hóa học(ECLIA) trong việc định lượng 25(OH)D trong huyết thanh người Trongnghiên cứu này, đối với phương pháp RIA: sử dụng một ống phóng xạ gama

đa năng Genesys ghi lại sự phát xạ của các phân tử Giới hạn phát hiện dướicủa thử nghiệm là 1,5 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là 100 ng/mL và CV củathử nghiệm là 11% Đối với phương pháp HPLC sử dụng hệ thống HPLCPerkin Elmer series 200 để phân tích các 25(OH)D huyết thanh, với cột 5 μmC-18 (4,6×150 mm, Supelco) và một đầu dò mảng diode Lấy 0,5ml mẫuhuyết thanh thêm vào 25μl etanol sau khi votex và ủ trong vòng mười phút ởnhiệt độ phòng thì thêm tiếp 500μl metanol và isopropanol (90:10, v/v) vàtiếp tục votex mười lăm giây Dung dịch thu được thêm vào 1,5 mL n-hexane

và tiếp tục votex trong 1 phút và ly tâm trong ba phút Lớp hexane được chobay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ Các mẫu được pha trong 100 ml metanol

và đem phân tích tại tốc độ dòng chảy 1,75 ml/phút với pha động nước (85:15, v/v) bằng đầu dò UV ở 265nm Giới hạn phát hiện là 3 ng/mltrong khi khoảng tuyến tính tiêu chuẩn là 25-100 ng/ml Với phương phápECLIA sử dụng máy phân tích xét nghiệm miễn dịch Roche (Roche ModularE170), bộ kit thương mại dựa trên phương pháp ECLIA từ Roche Giới hạnphát hiện dưới của thử nghiệm là 4,0 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là 100 ng/

Metanol-ml và độ chính xác của thử nghiệm là CV = 9,9% Hàm lượng trung bình25(OH)D với HPLC so với RIA là 50,1 nmol/l ( khoảng tuyến tính là 17,7-199,4 nmol/l) và 51,1 nmol/l (12,5-187,2 nmol/l), trong khi nồng độ 25(OH)Dtrung bình với RIA so với ECLIA là 32,4 nmol/l (9,98-199,7 nmol/l) và 29,9nmol/l (4,9-214,6 nmol/l) Dữ liệu so sánh cho HPLC so với RIA cho thấy

RIA = -1.13 +1.01 (HPLC) (RMSE = 11,2 nmol/l) và cho RIA so với ECLIAthì ECLIA = 3.21 +0.9 (RIA) (RMSE=9.6 nmol/l) Kết quả cho thấy có mốitương quan có thể chấp nhận được giữa HPLC và RIA cũng như RIA vàECLIA trong định lượng 25(OH)D.

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng rộngrãi để xác định các vitamin tan trong chất béo từ giữa những năm 1970 và đãđược thông qua như là phương pháp chính thức nhờ khả năng phát hiện, tínhchọn lọc cao Thiết bị sử dụng để phân tích vitamin D trong thực phẩm là máysắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng hệ thống tách sắc ký ghép nối các đầu dò

UV, đầu dò mảng đi ốt (DAD) và đầu dò khối phổ (MS)

Hiệp hội hóa học phân tích tiêu chuẩn (AOAC) đã xác nhận cácphương pháp hóa học sau để phân tích vitamin D trong thực phẩm

Phương pháp AOAC 980.26: vitamin D trong các chế phẩm vitamintổng hợp

Phương pháp AOAC 981.17: vitamin D trong sữa tăng cường và sữa bột.Phương pháp AOAC 982.29: vitamin D trong thực phẩm, các loại bộthỗn hợp và thức ăn chăn nuôi

Phương pháp AOAC 992.26: vitamin D3 trong sữa công thức pha sẵndành cho trẻ em

Phương pháp AOAC 995.05: vitamin D trong sữa công thức cho trẻ sơsinh và các sản phẩm đường ruột (cho ăn bằng ống)

Phương pháp AOAC 2002.05: Cholecalciferol (vitamin D3 ) trong thựcphẩm được lựa chọn (sữa tăng cường, sữa công thức cho trẻ sơ sinh, cháo, bơthực vật, dầu ăn và dầu cá)

Các phương pháp trên về nguyên tắc đều tương tự nhau, mỗi phươngpháp đều thông qua 4 giai đoạn chính:

+ Xà phòng hóa mẫu.

+ Chiết mẫu để tách các vitamin D ra khỏi các nền mẫu thực phẩm.+ Làm sạch, tách các vitamin D khỏi các thành phần khác trong thực phẩm.+ Định lượng bằng HPLC với đầu dò UV

Các phương pháp trên khác nhau bởi việc lựa chọn chất nội chuẩn,dung môi chiết (heptan, hexane, pentane hoặc ether dầu hỏa ), các phươngpháp làm sạch (các cột nhôm, cyano, cột pha đảo hoặc silica, pha rắn ), sựlựa chọn của cột phân tích (Partisil, pha đảo hoặc silic) và bước sóng UV đểphát hiện (254 hoặc 265 nm.)

Phương pháp HPLC đầu tiên được giới thiệu để xác định vitamin D làphương pháp ngoại chuẩn [22], sau đó được giới thiệu phương pháp nộichuẩn Tuy nhiên những nghiên cứu này chỉ xác định được vitamin D3 vàvitamin D2 mà không bao gồm dạng chuyển hóa 25(OH)D

Tác giả Anders S và cộng sự [11] đã nghiên cứu xác định vitamin

D3trong sữa bột, sữa công thức, dầu ăn, margarine và dầu cá bằng phươngpháp HPLC Phương pháp phân tích dựa trên phương pháp đề xuất củaAOAC 2002.05 Mẫu phân tích được thêm chất nội chuẩn là vitamin D2 sau

đó xà phòng hóa bằng KOH, etanol có bổ sung thêm chất chống oxi hóabutylated hydroxytoluene (BHT) Chiết mẫu thu được bằng cyclohexan và n-heptan (1:1) và làm sạch bằng cột silica Dịch chiết được đem đo mẫu ở máyHPLC đầu dò UV ở bước sóng 265nm,cột cho phân tích định lượng LC-C18,250x 4,6 mm, dp = 5μm (Vydac 201 TP 54, hoặc tương đương) với cột bảo vệC18, 4.0x4,0 mm, dp = 5μm (LiChroCART 4-4, hoặc tương đương) Sử dụng

hệ pha động 1: 0.5% isopropanol và 2% methyl-tert-butyl ether (MTBE)trong cyclohexane:n-heptan; trộn 5 ml isopropanol và 20 mL MTBE với 1Lcyclohexane:n-heptan (1 + 1); pha động 2: isopropanol+n-heptan (20 + 80).Pha loãng 200 ml isopropanol thành 1 lít với n-heptan; Pha động 3:Metanol+axetonitril (20 + 80) Pha loãng 200 ml metanol thành 1 lít với

acetonitrile Hàm lượng vitamin D3 trong các mẫu nghiên cứu từ 0,4 - 12µg/100g.Sự thu hồi từ các mẫu với vitamin D3 được thêm chuẩn thay đổi 93-102% Giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSDr) cho kết quả chấp nhận thay đổi

từ 2,2% (dầu cá) và 7,4% (dầu ăn), 6,8% (bơ thực vật)

Jette Jakobsen và cộng sự [16] đã xác định hàm lượng tổng vitamin Dtrong thịt bao gồm vitamin D3 và 25-hydroxyvitamin D3, được định lượng bằngphương pháp HPLC sau khi thủy phân bằng kiềm, chiết pha rắn và bán chuẩn bịHPLC Một hệ thống bán chuẩn bị HPLC gồm bộ điều khiển 600 và bơm, mộtmáy làm lạnh 717 PLUS mẫu tự động và một detector hấp thụ bước sóng 2487

Detector DAD được sử dụng ở khoảng 220-320nm và việc định lượng được hiện

ở bước sóng 265nm Vitamin D2 được sử dụng giống như chất nội chuẩn đốivớivitamin D3 cũng như là đối với 25(OH) D3 Nghiên cứu này là một phươngpháp phân tích có thể được sử dụng cho việc đánh giá các loại vitamin D khácnhau, đóng góp thông tin mới vào bảng thành phần thực phẩm

Markus Herrmann và cộng sự đã phát triển một phương pháp xétnghiệm sắc ký lỏng khối phổ song song (LC-MS) sử dụng hệ thống khối phổAPI 5000 kết hợp với một nguồn bức xạ ion hóa, tách sắc ký sử dụng cột sắcký pha đảo Supelco C8 (Supelcosil LC-8, 3.3cm x 3mm, kích thước hạt 3μm)được sử dụng cột bảo vệ Phenomenex C8 (4 × 2,0 mm) để định lượng25(OH)D2 và 25(OH) D3 trong huyết thanh [19] Phương pháp mới này đượcđánh giá kết quả cùng với hai phương pháp sử dụng rộng rãi để xét nghiệmmiễn dịch RIAvà ECLIA Kết quả cho thấy phương pháp LC-MS định lượngchính xác 25(OH)D phù hợp với phép phân tích bằng RIA còn đối vớiphương pháp ECLIA thì cho thấy có sự sai lệch

Một phương pháp định lượng đơn giản vitamin D được Lone Hymøller

và cộng sự công bố năm 2011 [18] Mẫu huyết tương hoặc huyết sau khi xàphòng hóa và chiết xuất được tách bằng cột sắc ký lỏng pha đảo C30 (250mm

× 4.6mm ID) với cỡ hạt 5,0μm và cột bảo vệ C30 (10mm × 4.0mm ID) với cỡhạt 5,0μm Nhiệt độ cho cả hai cột là 500C, thể tích tiêm mẫu là 50 μl.Chương trình gradient rửa giải được thực hiện tại tốc độ dòng chảy 1,0ml/phút với MeOH (85%) và EtOH trong 55 phút Trong 12 phút đầu tiên 5%EtOH được bơm qua cột và sau đó là tỉ lệ EtOH được tăng lên đến 40% trong

ba phút Mười bảy phút sau đó số lượng EtOH được tăng lên đến 90% trongthời gian 3 phút và được duy trì liên tục trong 10 phút để làm sạch các cột.Gradient được đưa trở lại thiết lập ban đầu trong 5 phút và 5 phút sau đó cácmẫu tiếp theo có thể được tiêm Các peak thu được nằm trong khoảng 25 phútđầu tiên Giới hạn phát hiện gấp ba lần so với tín hiệunhiễu nền đã được xácđịnh đến 0,14 ng/ml huyết tương và giới hạn định lượng gấp mười lần tín hiệunhiễu nền đến 0,45 ng/ml huyết tương Phương pháp này được sử dụng để xácđịnh thành phần vitamin D và chất chuyển hóa của nó trong huyết tương củasáu loài khác nhau với: bò, lợn, gia cầm, chồn, ngựa, và con người Ở gia súchiệu suất thu hồi đạt 86,6 và 101,0%, sai khác trong ngày từ 0,9 đến 5,9%, vàsai khác giữa các ngày là 0,2 đến 1,7% Tuy nhiên, tùy thuộc vào loại và sốlượng mẫu mà phần tỉ lệ sai số là khác nhau

Wiraj J Jasinghe và cộng sự đã đưa ra kết luận từ việc phơi nắng cho

nấm để tăng hàm lượng vitamin D [25] Nấm tươi (Lentinula edodes), nấm Sò (Pleurotus ostreatus), nấm Mỡ (nấm nút) (Agaricus bisporus), và nấm Bào ngư (Pleurotus cystidus) được chiếu xạ 1 giờ với tia cực tím A (UVA; bước

sóng 315-400 nm), tia cực tím B (UVB; bước sóng 290-315 nm), và tia cựctím-C (UVC; bước sóng 190-290 nm) Mẫu bột nấm khô đông lạnh (0,5g)được cân chính xác vào bình đáy tròn 250 ml và trộn với 4ml dung dịch natriascorbate (17,5 g natri ascorbate trong 100 ml dung dịch NaOH 1 M), 50mletanol (95%), và 10ml dung dịch kali hydroxit 50% Mẫu được xà phòng hóatrong điều kiện đun hồi lưu ở 80 °C trong 1 giờ, sau đó nó đã nhanh chóng

làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển vào phễu tách Hỗn hợp này lần đầutiên được chiết xuất với 15ml nước de-ion, sau đó là 15ml etanol và sau đóchiết ba lần với n-pentan có thể tích lần lượt là 50, 50 và 20ml Toàn bộ phầnhữu cơ được rửa ba lần với 50 ml dung dịch KOH 3% trong etanol 5% và sau

đó rửa lần cuối với nước de-ion cho đến khi trung hòa Các phần dịch chiếthữu cơ được chuyển vào bình đáy tròn, cô quay ở 40°C, và ngay lập tức táihòa tan trong 5ml etanol Sau đó mẫu được đi qua một bộ lọc 0,45μm 20 μlcủa mẫu lọc được tiêm vào hệ thống HPLC đầu dò UV và tách rửa nhờ cộtC18 pha đảo với pha động là ACN:MeOH (5:25) và tốc độ dòng chảy 2,3 ml/phút Quá trình chuyển đổi của ergosterol thành vitamin D2 dưới UVA, UVB

và UVC đã có sự khác biệt đáng kể Hàm lượng vitamin D2 cao nhất (184 ±5.71 μg/g DM) được quan sát thấy trong nấm Sò chiếu tia UVB ở nhiệt độ 35

0C và độ ẩm khoảng 80% Mặt khác, theo cùng điều kiện chiếu xạ, hàm lượngvitamin D2 thấp nhất (22,9 ± 2,68 μg/g DM) đã được quan sát thấy trong nấm

mỡ Ngoài ra cường độ của bức xạ tia cực tím và liều chiếu xạ được áp dụng,cũng góp phần vào sự chuyển đổi của ergosterol trong nấm thành vitamin D2.Ngay cả trong điều kiện bình thường, 5g nấm đông cô tươi được chiếu trong

15 phút với tia UVA, hoặc UVB là thừa đủ để có được các liều cung cấp được

đề nghị của vitamin D cho người lớn (10 μg /ngày)

Năm 2010 Sundar R.K và cộng sự đã công bố một công trình khoa học vềhàm lượng vitamin D2 trong nấm mỡ (Agaricus bisporus) sau khi tiếp xúc với tia

cực tímbằnghệ thống HPLC-MS sử dụng cột Gemini 5μm C18 với pha độngmethanol:acetonitrile (25:75, v/v), tốc độ dòng 0.2 ml/min [21] Hàm lượngvitamin D2 trong nấm tăng tương ứng với số lượng các xung ánh sáng tia cực tím.Không có sự khác biệt thành phần vitamin D2 trong nấm từ các giỏ 200g và 500gtheo các xung ánh sáng Nấm lớp trên cùng có hàm lượng vitamin D2 cao hơn sovới lớp dưới cùng của một giỏ còn nấm thái lát (dày khoảng 5 mm) sau khi chiếu

xạ có hàm lượng vitamin D2 cao hơn nấm thái lát thông thường Như vậy, sử dụng

các xung cực tím cung cấp một phương pháp có hiệu quả cao để tăng nồng độvitamin D2 trong nấm mỡ A Bisporus

Xiuping Xue và các cộng sự [26] đã đưa ra phương pháp xác định đồngthời 5 vitamin tan trong dầu menadione, retinyl acetate, cholecalciferol, α-tocopherol và α-tocopherol acetate trong thức ăn chăn nuôi bằng phương phápsắc ký lỏng hiệu năng cao sau khi chiết pha rắn Mẫu nghiên cứu sau khi chodung dịch NH3 0,2% vào đem siêu âm trong bể ở 400 - 500C trong vòng 20 -

30 phút Sau đó đem chiết bằng ethanol Dung dịch sau khi chiết được làmnguội đến nhiệt độ phòng trong bóng tối Sau khi thêm một lượng thích hợpethanol vào thì đem li tâm 10 phút sau đó đem đi chiết pha rắn sử dụng cộtOasis HLB Đầu tiên, cột Oasis HLB được hoạt hóa bởi 1ml dung dịchmethanol, tiếp theo là 1ml nước đề ion Sau đó 1ml dung dịch cần chiết được

đi qua cột Oasis HLB với tốc độ dòng là 1ml/phút Sau khi rửa giải bằng 1mldung dịch methanol 5% thì mẫu được hòa tan bằng 1ml ethanol và được đem

đi phân tích trên máy HPLC Shimadzu đầu dò UV ở bước sóng 230 và 265nm

sử dụng cột Atlantis dC18 (4,6mm × 150mm; 5µm) (Waters Crop, Dublin,Ireland) Pha động là MeOH:H2O tỉ lệ 98:2 với tốc độ dòng 1ml/phút Phươngpháp có độ nhạy và độ chọn lọc cao Phương pháp này có giới hạn phát hiện(LOD) trong khoảng 0,075 - 1,26µg/ml và có giới hạn định lượng (LOQ)trong khoảng 0,25 - 4,2 µg/ml

C Genestar và các cộng sự [13] đã đưa ra phương pháp để xác địnhVitamin A trong chế dược phẩm mà không cần xà phòng hóa bằng phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo (Nova-Pack C18, 4 µm,60Å) với pha động aceto-nitrile-tetrahydrofuran-nước (55: 37: 8) và tốc độdòng 1,5 ml/phút Xử lý mẫu bao gồm quá trình chiết suất hàm lượng retinolacetate từ dạng viên nang hoặc viên nén với methanol Chiết tách đạt đượcbằng cách khuấy mạnh trong 2 - 2,30h ở nhiệt độ phòng Phương pháp nàyđược đo ở bước sóng từ 240 - 360 nm và ở bước sóng 325nm chiết tách được

vitamin A acetat tối ưu, không làm thay đổi dung môi là cần thiết đưa mẫutrong hệ thống sắc ký Phương pháp này là phù hợp để định lượng thườngxuyên vitamin A.

Sữa bò được coi là một nguồn dinh dưỡng cung cấp vitamin A, E và carotene Tim Plozza và cộng sự [23] đã xác định đồng thời các vitamin trongsữa bò bằng phương pháp sử dụng sắc lý lỏng hiệu năng cao gắn với khối phổ(HPLC-MSn) Các hợp chất này được tách với cột C18-A Polaris và pha độngnước-methanol và mức được xác định bằng cách sử dụng những mảnh vỡ

b-MS2 (vitamin A, m/z 213 và m/z 199, vitamin E m/z 165 và b - carotene m/z413) HPLC-MSn được hoạt động ở chế độ ion dương APCI Phương phápnày đã được chứng minh bằng cách sử dụng các nghiên cứu lặp lại và so sánhvới kiểm chứng trước đó lỏng hiệu suất cao sắc ký UV/vis (HPLC-UV/Vis)

và huỳnh quang (Fl-HPLC) quy trình được sử dụng trong phòng thí nghiệm

Hệ thống đo khuếch đại tương tự như nhau cho HPLC-MSn, HPLC-UV /Vis

và HPLC-Fl, ví dụ: vitamin A 45lg/100 ml, HPLC-MSn ± 8%, HPLC-UV/Vis

± 9%; vitamin E 150 lg/100 ml, HPLC-MSn ± 11%, HPLC-Fl ± 9%; carotene 12 lg/100 ml, HPLC-MSn ± 18%, HPLC-UV/Vis ± 21% Lấy 10mlsữa bò được trộn lẫn với 0,5g axit ascorbic, 40ml ethanol và 10ml kiềm vànước (1:1) được khuấy tan trong 30 phút Sau đó cho thêm 50ml nước, 10mlethanol và 50ml dung dịch hexan (chứa chất chống oxi hóa butylated hydroxytoluen 1,5mg/100ml) Khuấy mạnh trong 2 phút, để lắng và chiết Sau đó chothêm 20ml dung dịch hexan (chứa chất chống oxi hóa BHT 1,5 mg/100ml).Sau khi chiết, rửa giải ba lần với 100ml nước,sau đó cho thêm hexan đến100ml lấy 10ml dung dịch hexan cho vào ống thủy tinh và làm khô dướidòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng Cặn thu được đem hòa tan trong 1mlmethanol và được lọc bằng Teflon, cho mẫu vào ba vial đem đi phân tích trên

b-máy HPLC-MSn, HPLC-UV/Vis và HPLC-Fl HPLC-MSn sử dụng cột C18

-A Polaris, pha động methanol - nước với tốc độ dòng 0,2 ml/phút

Các phân tích được thực hiện với một hệ thống dung môi bậc bốn nước

2695 với một bộ tự động làm mát ở 40C và buồng cột làm nóng ở 300C(Waters, Milford, MA, USA) trong cặp gắn kết của một đầu dò huỳnh quangShimadzu RF-10Axl (a-tocopherol Ex 295 nm Em 330 nm) và một đầu dòmảng photodiode Waters 996 (tất cả trans-retinol 320 nm) Phương pháp đomẫu này sử dụng cột C18 Bondclone (Phenomenex, Syd-ney, Australia) đượctrang bị với một cột bảo vệ C18 Phân tích All trans-retinol and α-tocopherol

có pha động gồm nước: methanol (5:95), tốc độ dòng 1 ml/phút Phân tích Carotene sử dụng pha động có tỉ lệ (75:20:5) của acetonitrile: amoni acetat(50mM pha trong MeOH ) : diclometan (cho thêm 0,05% trietyl amin và0,1% chất chống oxi hóa BHT) với tốc độ dòng 2ml/phút

β-Tháng 9/ 2008 Vitamin A (retinol) được xác định bằng pp sắc ký lỏnghiệu suất cao với UV-phát hiện sau khi xà phòng hóa và chiết tách bởi DennisEriksen [14] Phương pháp này đặc biệt hữu dụng đối với thuốc viên có chứamột lượng lớn các β - carotene và các sản phẩm có chứa một lượng nhỏvitamin A Nồng độ tối thiểu của mẫu: khoảng 0,3mg vitamin A/g Lấykhoảng 0,3g mẫu cho vào bình nón, thêm 10ml natri ascorbate 2%, 30mldung dịch chống oxi hóa BHT 0,1% và 3ml dung dịch KOH (17M) Cho bìnhvào siêu âm 30 phút Sau đó thêm 30ml natri sulphate 3% và 100ml ether đếnlúc chiết tách 100ml ether Tiếp tục quá trình chiết Phương pháp này sử dụngmáy HPLC Shimadzu cột C18, pha động là Heptan : 1-propanol (99:1) với tốc

độ dòng 2ml/phút, đo độ hấp phụ ở các bước sóng 310, 325 và 334nm theonhư SOP QAM - 10101 Thời gian chạy mẫu là 12 phút, phát hiện vitamin A

ở phút thứ 7