Nghiên cứu về bệnh khảm lá bầu bí Papaya Ringspot Vius tại Gia lâm hà nội

Triệu chứng bệnh virus điển hình trên ruộng dưa chuột thí nghiệm vụ đông 2014 3.2 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu dưa chuột thu tại ruộng thí nghiệm vụ đông 2014

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN TS HÀ VIẾT CƯỜNG

I ĐẶT VẤN ĐỀ

• Trên cây họ bầu bí đang phải đối mặt với nhóm bệnh quan trọng là bệnh virus.

• Bệnh ảnh hưởng đến sức sống của cây và ảnh hưởng lớn tới sản phẩm cuối cùng như làm biến dạng quả, giảm năng suất và chất lượng quả.

• Bệnh khảm lá trên cây họ bầu bí đã được xác định là do Papaya ringspot virus (PRSV) gây ra

• PRSV là một virus có bộ gen RNA, thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae

• Bệnh rất phổ biến và hiện nay chưa có biện pháp phòng chống hiệu quả.

Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

“ Nghiên cứu bệnh khảm lá Papaya ringspot virus (PRSV) trên cây bầu bí

tại Gia Lâm”

1.2 YÊU CẦU

• Điều tra thành phần bệnh hại trên cây bầu bí tại Gia Lâm.

• Đánh giá tính kháng của bệnh khảm lá trên tập đoàn giống dưa chuột

và bí ngô tại Khoa Nông học.

• Lây nhiễm nhân tạo bằng tiếp xúc cơ học virus PRSV trên một số giống tiềm năng kháng trong điều kiện nhà lưới.

• Xác định virus thu thập ngoài đồng ruộng bằng ELISA (PRSV, ZYMV, CMV) và begomovirus bằng PCR.

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Các dòng/giống bầu bí

• Virus PRSV (nguồn cây bầu bí)

• Mẫu cây bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa

điểm điều tra, sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silicagel để kiểm tra virus

2.1 VẬT LIỆU

2.2 PHƯƠNG PHÁP

1 Điều tra đồng ruộng

Áp dụng “Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện Bảo vệ thực vật (5 điểm chéo góc).

2 Đánh giá tính kháng trong kiện đồng ruộng

Ruộng thí nghiệm gồm 46 giống dưa chuột do

Bộ môn Rau hoa quả - cảnh quan trồng tại Khoa Nông học

3 Thu và xử lý mẫu

- Tên mẫu

- Địa điểm ruộng

- Thời gian lấy mẫu

- Đặc điểm triệu chứng bệnh

- Tỷ lệ nhiễm bệnh chung cả ruộng

- Bảo quản khô: Mẫu thu về được để trong túi chứa hạt Silicagel Thay hạt Silicagel đến khi mẫu khô.

- Bảo quản tươi: Mẫu thu về được

để nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -20 C ở Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới

2.2 PHƯƠNG PHÁP

4 Đánh giá tính kháng trong điều kiện nhà lưới

5 Phương pháp kiểm tra ELISA gián tiếp phát hiện PRSV, ZYMV, CMV

6 Phương pháp kiểm tra PCR

7 Phương pháp tính và xử lý số liệu

2.2 PHƯƠNG PHÁP

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Xã RUỘNG GIỐNG GIAI ĐOẠN SỐ CÂY (n)

TỈ LỆ BỆNH HẠI (%)

Virus (khảm, nhăn) Virus (khảm, biến vàng) Phấn trắng Sương mai

Cổ Bi

TT Trâu Quỳ

Đa Tốn

Bảng 3.1 Tình hình bệnh hại bầu bí một số xã tại huyện Gia Lâm vụ

xuân hè 2015

3.1 Điều tra thành phần bệnh hại trên cây bầu bí tại Gia Lâm

4 3

2

Hình 3.1 Một số bệnh gây hại trên cây họ bầu bí tại Gia Lâm.

Virus khảm biến vàng trên bí ngô (1), Phấn trắng trên dưa chuột (2), Khảm

nhăn trên dưa chuột (3), Sương mai trên dưa chuột (4).

Hình 3.2 Triệu chứng bệnh virus điển hình trên ruộng dưa chuột thí nghiệm vụ

đông 2014

3.2 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu dưa chuột thu tại ruộng thí

nghiệm vụ đông 2014

Hình 3.3 Các mẫu dưa chuột thu trên ruộng thí nghiệm vụ

đông 2014 được kiểm tra ELISA

Hình 3.4 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu dưa chuột thu tại ruộng thí

nghiệm vụ đông 2014

Số Giống

Điều tra ngày 3/11/2014 Điều tra gày 8/12/2014

n (tổn

g số)

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bện

h (%)

Cấp bện

h trun

g bình

Cấp bện

h cao nhất

Cấp bện

h thấp nhất

n (tổn

g số)

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bện

h (%)

Cấp bện

h trun

g bình

Cấp bện

h cao nhất

Cấp bện

h thấp nhất

g số)

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bệnh (%)

Cấp bệnh trun

g bình

Cấp bệnh cao nhất

Cấp bệnh thấp nhất

n (tổn

g số)

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bệnh (%)

Cấp bệnh trun

g bình

Cấp bệnh cao nhất

Cấp bệnh thấp nhất

Bảng 3.3 Đánh giá tính kháng PRSV của các dòng dưa chuột trồng vụ đông 2014 (số liệu ở 2 lần điều tra cuối)

STT Giống

Tỷ lệ bệnh (%)

AUDPC (%.ngày)

3/11 10/11 17/11 24/11 1/12 8/12

Bảng 3.4 Chỉ số tích lũy bệnh khảm lá PRSV theo thời gian (AUDPC) của tâp đoàn giống dưa chuột trồng tại ruộng thí nghiệm khoa Nông học

vụ đông 2014

Hình 3.5 Biều đồ trình bày Chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian AUDPC đối với bệnh PRSV của 39

giống dưa chuột Mũi tên đỏ chỉ các giống có tiềm năng kháng

(Area Under the Disease Progress Curve - AUDPC) là chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian hay còn gọi là diện tích dưới đường diễn biến bệnh Chúng tôi cũng tiến hành tính toán AUDPC của tập đoàn giống dưa chuột đối với bệnh khảm lá PRSV dựa trên số liệu 6 lần điều tra từ ngày 3 tháng 11 đến ngày 8 tháng 12.

Số liệu AUDPC của 39 giống (bảng 3.4, hình 3.5) cho thấy có 4 giống có AUDPC rất thấp Các giống này là HB1, LCH3b, SL27b và SL29g với AUDPC lần lượt là 43.8 , 0.0, 161.5 và 233.3 (%.Ngày).

Hình 4.6 Triệu chứng bệnh virus điển hình trên ruộng dưa chuột thí nghiệm vụ

xuân hè 2015

3.3 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu dưa chuột thu tại ruộng thí

nghiệm vụ xuân hè 2015

Bảng 3.5 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV đối với các mẫu dưa chuột thu

tại ruộng thí nghiệm trông vụ xuân hè 2015

Hình 3.7 Các mẫu dưa chuột thu trên ruộng thí nghiệm

vụ xuân hè 2015 được kiểm tra ELISA.

Hình 3.8 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu dưa chuột thu tại ruộng thí

nghiệm vụ xuân hè 2015.

Số Giống

Điều tra ngày 11/5/2015 Điều tra gày 25/5/2015

n (tổng

số)

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bệnh (%)

Cấp bệnh trung bình

Cấp bệnh cao nhất

Cấp bệnh thấp nhất

n (tổng số)

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bệnh (%)

Cấp bệnh trung bình

Cấp bệnh cao nhất

Cấp bệnh thấp nhất

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bệnh (%)

Cấp bệnh trung bình

Cấp bệnh cao nhất

Cấp bệnh thấp nhất

n (tổng số)

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bệnh (%)

Cấp bệnh trung bình

Cấp bệnh cao nhất

Cấp bệnh thấp nhất

Bảng 3.6 Đánh giá tính kháng PRSV của các dòng dưa chuột trồng vụ xuân hè 2015

(số liệu ở 2 lần điều tra cuối)

1 2

Hình 3.9 Tập đoàn giống bí ngô 1 tháng sau gieo tại khu ruộng thí nghiệm khoa Nông học

vụ xuân hè 2015 (1) Triệu chứng bệnh virus điển hình trên ruộng bí ngô thí nghiệm vụ xuân

hè 2015 (2)

3.4 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu bí ngô thu tại ruộng thí

nghiệm vụ xuân hè 2015

Hình 3.11 Các mẫu bí ngô thu trên ruộng thí nghiệm vụ

xuân hè 2015 được kiểm tra ELISA (lần 1)

- Kết quả kiểm tra ELISA trên tổng

sô 30 mẫu bí ngô bị bệnh với các triệu chứng khác nhau đã phát hiện 2 mẫu (tỷ lệ 6.6%) nhiễm virus PRSV và không thấy mẫu nào phản ứng dương với cả 2 loại virus CMV và ZYMV ở lần thu thập đầu tiên.

- Kết quả này là bất thường vì nhiều mẫu thu thập được biểu hiện triệu chứng khảm giống như

bị nhiễm potyvirus.

Bảng 3.8 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV đối với các mẫu bí ngô thu tại ruộng thí

nghiệm trông vụ xuân hè 2015 (lần 2- 17/6)

• Kiểm tra các virus PRSV, CMV và ZYMV trên 52 mẫu lá bí ngô có triệu chứng điển hình ở khu ruộng thí nghiệm

- Kết quả cho thấy 36/52 (69.2%) mẫu có phản ứng với virus PRSV

- Tất cả đều âm tính với virus ZYMV

- 1 mẫu đồng thời nhiễm cả virus CMV và PRSV.

• Qua 2 lần kiểm tra phát hiện sự có mặt của PRSV, CMV và ZYMV cho thấy đa số các triệu chứng khảm lá trên các giống bí ngô là do virus PRSV gây ra.

ZYMV PRSV CMV

Hình 3.12 Các mẫu bí ngô

thu trên ruộng thí nghiệm vụ

xuân hè 2015 được kiểm tra

ELISA (lần 2)

Hình 3.13 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu bí ngô thu tại ruộng

thí nghiệm vụ xuân hè 2015

Từ kết quả đánh giá tính kháng đồng ruộng đối với virus PRSV của tập đoàn

giống dưa chuột trồng tại khoa Nông học vụ đông năm 2014 theo số liệu của

bảng 3.3 và chỉ số AUDPC chọn 4 giống có tỷ lệ bệnh (%) nhỏ nhất là HB1,

LCH3b, SL27b, SL29g Bên cạnh đó chúng tôi cũng chọn ra 1 giống đối chứng

kháng mẫn cảm nhất với virus PRSV là HY1 và 1 giống đối chứng kháng Nhật

T1-126, tiến hành gieo 15 hạt mỗi giống và lây nhiễm virus PRSV bằng phương

pháp tiếp xúc cơ học

3.5 Đánh giá tính kháng PRSV của một số giống dưa chuột tiềm năng kháng trong điều

kiện nhà lưới

1 Kiểm tra virus PRSV các mẫu nguồn trước lây nhiễm bằng phương pháp ELISA

Phần trăm mẫu dương (%) 0 60 0

Bảng 3.9 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV đối với các mẫu bí ngô trước lây nhiễm

2 Lây nhiễm bằng tiếp xúc cơ học và bố trí thí nghiệm

3 Kết quả lây nhiễm nhân tạo PRSV trên các giống dưa chuột tiềm năng kháng

Cấp bệnh TB

TLB (%)

Cấp bệnh TB

TLB (%)

Cấp bệnh TB

Bảng 3.10 Đánh giá tính kháng PRSV trên tập đoàn

giống dưa chuột tiềm năng kháng

Ở tuần đánh giá cuối cho thấy:

- Giống T1- 126 có tỷ lệ nhiễm PRSV là 6.7% thấp hơn nhiều so với các giống còn lại

- Các giống SL27b, HY1 và SL29g có tỷ lệ lần lượt là 92.9, 81.8 và 77.8 rất mẫn cảm với virus khảm lá PRSV.

4 Kiểm tra ELISA tất các cây sau 4 tuần lây nhiễm

64 Đối chứng cây khỏe 1 0.287

65 Đối chứng cây khỏe 2 0.334

Ngưỡng* 0.621

Số mẫu dương 51

Phần trăm mẫu dương 81.0

Qua kết quả (bảng 3.10) và kết quả kiểm tra ELISA (bảng 3.11) cho thấy:

- Các giống SL27b và SL29g với tỷ lệ bệnh 92.9 và 77.8% rất mẫn cảm với virus PRSV.

- Giống LCH3b với tỷ lệ nhiễm bệnh là 42.9 và cấp bệnh trung bình 2.5 có khả năng kháng khá tốt với

PRSV.

- Giống đối chứng kháng Nhật T1- 126 với tỷ lệ bệnh 6.7% khá thấp và cấp bệnh trung bình là 3.0 có

khả năng kháng với virus PRSV hơn các giống được trồng thí nghiệm

- Kiểm tra ELISA trên các mẫu vụ Đông

năm 2014 và vụ Xuân hè năm 2015

mới chỉ phát hiện được các potyvirrus

gây bệnh trên cây bầu bí, chưa phát

hiện được các bogomovirrus gây bệnh

trên cây bầu bí.

- Tại miền Bắc Việt Nam, đã có ít nhất 1

begomovirus được phát hiện thấy trên

cây bầu bí là Squash leaf curl China

virus (SqLCCNV) (Revill et al., 2003)

Mục tiêu của nghiên cứu này là phát hiện begomovirus bằng PCR dùng mồi đặc hiệu cho begomovirus (cặp mồi BegoAFor1/BegoARev1) trên các mẫu cây bầu bí thu thập được có biểu hiện triệu chứng bệnh virus.

3.6 PCR phát hiện bogomovirus trên cây bầu bí thu thập được năm 2014 và 2015

STT Mẫu Giống Triệu chứng Năm

PCR

BegoAFor1/

BegoARev1 Krusty & Homer

1 M1 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 -

-2 M2 Dưa chuột biến dạng +biến khảm nhăn +

vàng

2014 -

-3 M3 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 -

-4 M4 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 -

-5 M5 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 -

-6 M6 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 -

-7 M7 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 -

11 M11 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - +

12 M12 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - +

13 M13 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - +

14 M14 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - +

15 M15 Bí ngô Khảm biến vàng 2015 - +

16 M16 Bí ngô đốm biến vàng Khảm nhăn + 2015 - +

17 M17 Bí ngô đốm biến vàngKhảm nhăn + 2015 - +

-22 M22 Dưa chuột Khảm nhăn + biến dạng 2015 - +

23 M23 Dưa chuột khảm biến dạng 2015 - +

24 M24 Dưa chuột Khảm nhăn 2015 -

-25 M25 Dưa chuột Khảm 2015 -

-26 M26 Dưa chuột Khảm biến dạng 2015 - +

27 M27 Dưa chuột Khảm 2015 - +

28 M28 Dưa chuột Khảm 2015 -

-29 M29 Dưa chuột Khảm nhăn + biến dạng 2015 -

-30 M30 Dưa chuột Khảm biến dạng 2015 -

-STT Mẫu Giống Triệu chứng Năm

PCR

BegoAFor1/

BegoARev1 Krusty & Homer

Bảng 3.12 Kiểm tra PCR các mẫu thu thập từ khu ruộng thí nghiệm khoa Nông học năm 2014 và 2015

- Kết quả PCR 30 mẫu dưa chuột và bí ngô phản ứng PCR âm tính với cặp mồi đặc hiệu begomovirus (cặp mồi BegoAFor1/BegoARev1)

- Tiến hành kiểm tra PCR bằng cặp mồi đặc hiệu phát hiện các begomovirus (DNA – A)

là Krusty & Homer kích thước khoảng 600 bp Kết quả cho thấy 17/30 mẫu có phản ứng dương tính với mồi đặc hiệu Krusty & Homer.

Hình 3.14 Kết quả PCR phát hiện begomovirus (cặp mồi Krusty & Homer) trên 30 mẫu bầu bí thu tại Gia Lâm năm 2014 và 2015 (thứ tự mẫu trình bày ở bảng 3.12)

Ghi chú:

- M là thang DNA (Genruler 1 Kb, hãng Fermentas) với băng tham khảo 1 kb

- Ca là mẫu cà chua thu tại nhà lưới Trung tâm bệnh cây nhiệt đới- HVNNVN.

- N là mẫu nước cất làm đối chứng.

IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 Điều tra đồng ruộng trên các ruộng bầu bí tại khu vực Gia Lâm Vụ Đông 2014 đã phát hiện

4 bệnh chính gồm bệnh biến vàng (do virus), bệnh khảm nhăn (do virus), bệnh phấn trắng (nấm ) và bệnh sương mai (nấm).

2 Điều tra định kì bệnh virus trên tập đoàn 46 giống dưa chuột của bộ môn Rau Hoa Qủa trồng tại khoa Nông học , vụ Đông 2014 đã xác định được 4 giống có tiềm năng kháng bệnh khảm lá Papaya ringspot virus là là HB1, LCH3b, SL29g và SL27b.

3 Điều tra định kì bệnh virus trên tập đoàn 47 giống dưa chuột của bộ môn Rau Hoa Qủa trồng tại khoa Nông học , vụ Xuân hè 2015 đã xác định được 3 giống có tiềm năng kháng bệnh khảm lá PRSV là NEP1, THI và LCH3b.

4.1 KẾT LUẬN

4 So sánh các giống tiềm năng kháng qua 2 vụ Đông 2014 và vụ Xuân hè 2015 cho thấy

giống LCH3b có tiềm năng kháng với virus PRSV.

5 Kiểm tra ELISA đã xác định được thành phần virus trên cây bầu bí tại Gia Lâm năm

2014-2015 gồm 3 virus là PRSV, CMV, ZYMV, trong đó virus PRSV là nguyên nhân chính gây nên các triệu chứng bệnh virus.

6 Kiểm tra PCR đã xác định được trên các tập đoàn giống bí ngô và dưa chuột ngoài các

potyvirus còn có các begomovirus gây bệnh khảm lá.

4.1 KẾT LUẬN

7 Đánh giá tính kháng bệnh khảm lá PRSV trên 4 giống có tiềm năng kháng (SL29g, SL27b,

LCH3b và HB1) bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo cây con trong nhà lưới chống côn trùng đã xác định được giống LCH3b có tính kháng với PRSV Ngoài ra qua kết quả đánh giá tính kháng trong nhà lưới thấy giống đối chứng kháng Nhật T1-126 có biểu hiện tính kháng PRSV khá tốt.

4.2 KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu về tính kháng bệnh khảm lá Papaya ringspot virus trên bầu bí.

4.1 KẾT LUẬN

Em xin cảm ơn quý

thầy cô và các bạn dã lắng nghe