KHẢO SÁT PHÂN BỐ THỰC NGHIỆM LIỀU – HIỆU ỨNG SAI HÌNH NHIỄM SẮC THỂ Ở TẾ BÀO LYMPHO NGƯỜI CHIẾU BỨC XẠ GAMMA SUẤT LIỀU THẤP

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮTKý hiệu C Tần số sai hình nhiễm sắc thể ngẫu nhiên trong phương chuẩn liều - hiệu ứng Ci Đơn vị đo hoạt độ nguồn phóng xạ Curie D Đại lượng chỉ liều hấp th

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÙI THỊ KIM LUYẾN

KHẢO SÁT PHÂN BỐ THỰC NGHIỆM

LIỀU – HIỆU ỨNG SAI HÌNH NHIỄM SẮC THỂ

Ở TẾ BÀO LYMPHO NGƯỜI CHIẾU BỨC XẠ

GAMMA SUẤT LIỀU THẤP

Chuyên ngành: Di Truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRẦN QUẾ

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS Trần Quế, Trưởng phòng Công nghệ Sinh học thuộc Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án

Xin chân thành cảm ơn các Cô Chú và các Anh Chị nhân viên phòng CNSH

đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Xin cảm ơn Ban Giám hiệu và các Thầy Cô trong khoa Đào tạo sau Đại học trường ĐH KHTN TP HCM đã giúp đỡ và giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian học

Người thực hiện

Bùi Thị Kim Luyến

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Mục lục i

Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt iii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các hình vẽ, đồ thị vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một số khái niệm cơ bản về bức xạ ion hóa và hiệu ứng sinh học 3

1.1.1 Bản chất của bức xạ ion hóa 3

1.1.2 Nguồn phóng xạ 5

1.1.3 Quá trình gây hiệu ứng sinh học của bức xạ ion hóa 6

1.1.4 Hiệu ứng sinh học gây bởi bức xạ ion hóa 8

1.1.5 An toàn phóng xạ 9

1.2 Phân tử ADN, bộ nhiễm sắc thể người 12

1.2.1 Cấu trúc của phân tử DNA (Deoxyribonucleic acid) 12

1.2.2 Bộ nhiễm sắc thể người và các tiêu chí phân loại 13

1.3 Sai hình nhiễm sắc thể (chromosomal aberration) 15

1.3.1 Khái niệm về sai hình nhiễm sắc thể 15

1.3.2 Cơ chế tạo nên sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho dưới tác động của bức xạ ion hóa 16

1.4 Kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể trong định liều sinh học 18

1.4.1 Vai trò quyết định của tế bào lympho máu ngoại vi người 18

1.4.2 Kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể 19

1.4.3 Các mối quan hệ định lượng của sai hình nhiễm sắc thể hai tâm ở tế bào lympho dưới tác động của bức xạ ion hóa 20

1.5 Nội dung cơ bản của phương pháp định liều sinh học sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể 22

1.6 Ứng dụng kỹ thuật phân tích sai hình NST trong đo liều sinh học trên Thế giới và tại Việt Nam 22

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.1 Tế bào lympho máu ngoại vi người 25

2.1.2 Nguồn phóng xạ sử dụng trong nghiên cứu 25

2.1.3 Các thiết bị nuôi cấy tế bào và phân tích số liệu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp chiếu mẫu, đo liều 25

2.2.2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào lympho và làm tiêu bản hiển vi 25

2.2.3 Phương pháp phân tích sai hình nhiễm sắc thể 27

2.2.4 Phương pháp toán học 28

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của bức xạ gamma suất liều thấp đến chỉ số phân bào nguyên nhiễm 30

3.2 Nghiên cứu khả năng phát sinh hiệu ứng sai hình nhiễm sắc thể 40

3.2.1 Các kiểu sai hình bắt gặp 40

3.2.2 Kết quả phân tích tần số các kiểu sai hình 44

3.3 Xây dựng đường phân bố thực nghiệm liều - hiệu ứng 55

3.3.1 Kết quả phân bố liều - hiệu ứng thực nghiệm của tập hợp A 57

3.3.2 Kết quả phân bố liều - hiệu ứng thực nghiệm của tập hợp B 59

3.3.3 Kết quả phân bố liều - hiệu ứng thực nghiệm của tập hợp C 61

3.3.4 Kết quả phân bố liều - hiệu ứng thực nghiệm của tập hợp D 62

3.3.5 Kết quả phân bố liều - hiệu ứng thực nghiệm với tập hợp E 64

3.3.6 Kết quả xác định phương trình phân bố liều - hiệu ứng thu được từ mẫu chiếu bức xạ gamma từ nguồn Co60, suất liều 125mGy/h, giới hạn liều 1Gy đến 0,5Gy 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

C Tần số sai hình nhiễm sắc thể ngẫu nhiên trong phương chuẩn liều -

hiệu ứng

Ci Đơn vị đo hoạt độ nguồn phóng xạ (Curie)

D Đại lượng chỉ liều hấp thụ của bức xạ trong phương chuẩn liều - hiệu

ứng

Go Ký hiệu pha nghỉ trong chu trình phân bào

Gy Đơn vị đo liều hấp thụ của bức xạ ion hóa (Gray)

H Đại lượng chỉ liều tương đương của bức xạ ion hóa (Equivalent dose)

Sv Đơn vị đo liều tương đương của bức xạ ion hóa (Sievert)

WR Trọng số bức xạ (khả năng gây tổn thương sinh học của từng nguồn

phóng xạ)

y Tần số sai hình nhiễm sắc thể trong phương trình chuẩn liều - hiệu ứng

α Hệ số tuyến tính của phương trình chuẩn liều - hiệu ứng

β Hệ số bình phương của phương trình chuẩn liều - hiệu ứng

Chữ viết tắt

BD Tổn thương bazơ nitơ (Base Damage)

DNA Deoxyribonucleic acid

DSB Đứt gãy đôi phân tử DNA (Double Strand Break)

IAEA Cơ quan Năng lượng Nguyên tử Quốc tế (International Atomic Energy

Agency)

LET Hệ số truyền năng lượng tuyến tính của bức xạ ion hóa (Linear Energy

Transfer)

MI Chỉ số phân bào nguyên nhiễm (Mitotic Index)

NHEJ Cơ chế sửa chữa đứt gẫy của nhiễm sắc thể mà không cần trình tự

tương đồng (Nonhomologous End Joining)

1 1.1 Giá trị của LET trong môi trường nước 6

2 1.2 Giá trị trọng số bức xạ của các loại bức xạ ion hóa khác nhau 10

3 1.3 Trọng số mô của các mô khác nhau trong cơ thể 11

4 3.1a Kết quả phân tích MI đối với tập hợp mẫu A 30

5 3.1b Kết quả phân tích MI đối với tập hợp mẫu B 32

6 3.1c Kết quả phân tích MI đối với tập hợp mẫu C 33

7 3.1d Kết quả phân tích MI đối với tập hợp mẫu D 35

8 3.1e Kết quả phân tích MI đối với tập hợp mẫu E 37

9 3.1f Chỉ số phân bào nguyên nhiễm trung bình của 5 tập hợp A,

10 3.2a Kết quả phân tích tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tập hợp A 44

11 3.2b Giá trị hiệu suất sinh học tương đối (RBE) trong giới hạn

liều 0,1Gy – 0,5Gy thuộc tập hợp A 45

12 3.3a Kết quả phân tích tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tập hợp B 45

13 3.3b Giá trị hiệu suất sinh học tương đối (RBE) trong giới hạn

liều 0,1Gy – 0,5Gy thuộc tập hợp B 46

14 3.4a Kết quả phân tích tần số sai hình nhiễm sắc thể tập hợp C 47

15 3.4b Giá trị hiệu suất sinh học tương đối (RBE) trong giới hạn

liều 0,1Gy – 0,5Gy thuộc tập hợp C 47

16 3.5a Kết quả phân tích tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tập hợp D 48

17 3.5b Giá trị hiệu suất sinh học tương đối (RBE) trong giới hạn

liều 0,1Gy – 0,5Gy thuộc tập hợp D 49

18 3.6a Kết quả phân tích tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tập hợp E 49

19 3.6b Giá trị hiệu suất sinh học tương đối (RBE) trong giới hạn

liều 0,1Gy – 0,5Gy thuộc tập hợp E 50

22 3.8a Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong

xác định hệ số tương quan tuyến tính đối với tập hợp A 58

23 3.8b

Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong xác định hệ số tương quan hàm mũ bình phương đối với tập hợp A

58

24 3.9a Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong

xác định hệ số tương quan tuyến tính đối với tập hợp B 60

25 3.9b

Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong xác định hệ số tương quan hàm mũ bình phương đối với tập hợp B

60

26 3.10a Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong

xác định hệ số tương quan tuyến tính đối với tập hợp C 61

27 3.10b

Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong xác định hệ số tương quan hàm mũ bình phương đối với tập hợp C

62

28 3.11a Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong

xác định hệ số tương quan tuyến tính đối với tập hợp D 63

29 3.11b

Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong xác định hệ số tương quan hàm mũ bình phương đối với tập hợp D

63

30 3.12a Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong

xác định hệ số tương quan tuyến tính đối với tập hợp E 64

31 3.12b

Mối quan hệ giữa liều bức xạ và tần số sai hình hai tâm trong xác định hệ số tương quan hàm mũ bình phương đối với tập hợp E

65

33 3.14 Các hệ số hồi quy thực nghiệm và phương trình phân bố thực

nghiệm liều – hiệu ứng của 5 tập hợp A, B, C, D, E 67

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT Số hiệu

2 1.2 Cấu trúc siêu hiển vi của bộ nhiễm sắc thể người 13

4 1.4 Hình thái và trật tự sắp xếp các cặp nhiễm sắc thể người 15

5 1.5 Sai hình vòng có tâm được hình thành từ 2 đứt gẫy đôi trên 1

6 1.6 Sai hình 2 tâm được hình thành từ 2 đứt gẫy đôi trên 2 NST 17

7 1.7 Cơ chế tạo mảnh không tâm được hình thành từ 1 DSB trên

8 1.8 Cơ chế tạo sai hình 3 tâm được tạo thành từ các DSB trên 3

9 2.1 Hình ảnh mô tả một số kiểu sai hình NST 27

10 3.1 Biểu đồ so sánh MI trung bình của 5 tập hợp A; B; C; D; E

12 3.3 Giải thích cơ chế tạo sai hình mảnh không tâm theo luận cứ

14 3.5 Giải thích cơ chế tạo thành sai hình hai tâm theo luận cứ

67

vì vậy kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể tận dụng được ưu thế lấy toàn

bộ cơ thể là một liều kế Phân bố toán học của phép chuẩn liều dĩ nhiên bị chi phối bởi các thông số về liều lượng, bản chất và năng lượng bức xạ, bởi vậy công tác định liều sinh học đòi hỏi phải có đường chuẩn thích ứng Hội nghị đo liều sinh học năm 1990 tại Madrid, Tây Ban Nha khẳng định yêu cầu phải có chuẩn liều riêng đối với mọi phòng thí nghiệm đo liều sinh học

Cùng với tình hình sử dụng ngày càng rộng rãi các loại nguồn phóng xạ trong công nghiệp và trong y tế, các giải pháp an toàn nguồn phóng xạ trở thành nhiệm vụ quan trọng nhằm đảm bảo sức khỏe cộng đồng Đo liều sinh học là giải pháp hiệu quả nhất trong việc đánh giá sức khỏe cộng đồng trong mọi tình huống rủi ro nguồn xạ Thực hiện các nghiên cứu phân bố chuẩn liều - hiệu ứng đối với các nguồn phóng xạ suất liều thấp là công cụ của công tác quản lý y tế các rủi ro nguồn xạ, đảm bảo an toàn phóng xạ trong bối cảnh bức

xạ suất liều thấp ở vùng liều thấp được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực của đời sống Kết quả của đề tài tạo thêm cơ sở dữ liệu làm công cụ giải quyết các nhiệm vụ định liều sinh học trong thực tế

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

- Đánh giá ảnh hưởng của bức xạ gamma phát ra từ đồng vị Co60, suất liều

125 mGy/h, giới hạn liều từ 0,1Gy đến 0,5Gy đến chỉ số phân bào nguyên nhiễm

- Đánh giá khả năng gây sai hình NST của bức xạ gamma thuộc nguồn nghiên cứu trong giới hạn liều 0,1 – 0,5Gy

- Xây dựng đường phân bố thực nghiệm liều – hiệu ứng sai hình nhiễm sắc

thể ở tế bào lympho máu ngoại vi người chiếu bức xạ gamma từ đồng vị Co60, suất liều 125 mGy/h, giới hạn liều từ 0,1Gy đến 0,5 Gy

CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC

- Xác định mức độ ảnh hưởng của bức xạ gamma phát ra từ đồng vị Co60, suất liều 125 mGy/h, giới hạn liều từ 0,1Gy đến 0,5Gy đến chỉ số phân bào nguyên nhiễm

- Xác định tần số các kiểu sai hình nhiễm sắc thể gây bởi bức xạ gamma suất liều thấp và hiệu suất sinh học tương đối của bức xạ gamma trong giới hạn liều từ 0,1Gy đến 0,5Gy

- Xây dựng đường phân bố thực nghiệm liều – hiệu ứng sai hình NST hai tâm ở tế bào lympho máu ngoại vi người với nguồn phát gamma từ đồng vị

Co60, suất liều 125 mGy/h, giới hạn liều từ 0,1Gy đến 0,5Gy

ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đánh giá khả năng gây sai hình NST và xây dựng đường phân bố thực nghiệm liều – hiệu ứng sai hình NST hai tâm ở tế bào lympho máu ngoại vi người với nguồn phát gamma từ đồng vị Co60

suất liều thấp (125 mGy/h), ở

giới hạn liều thấp (từ 0,1Gy đến 0,5Gy)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số khái niệm cơ bản về bức xạ ion hóa và hiệu ứng sinh học

1.1.1 Bản chất của bức xạ ion hóa

- Khái niệm chung

Bức xạ là những dạng năng lượng phát ra trong quá trình vận động và biến đổi của vật chất Nguồn phát ra bức xạ có thể có nguồn gốc tự nhiên như: tia

vũ trụ, tia tử ngoại, tia hồng ngoại, bức xạ mặt trời, các chất phóng xạ tự nhiên

có trong đất, đá, nước và không khí…, hoặc cũng có thể do con người tạo ra như: sóng viba, sóng vô tuyến, phóng xạ trong các hoạt động nghiên cứu phóng

xạ của con người (y học, khai thác mỏ, năng lượng nguyên tử, vũ khí hạt nhân…)

Bức xạ ion hóa là những loại bức xạ mang năng lượng cao, truyền cho các electron của vật chất một năng lượng đủ lớn để bứt chúng ra khỏi nguyên tử, gây ra sự ion hóa trong vật chất mà nó đi qua [6], [8], [19]

- Phân loại bức xạ ion hóa

Có hai dạng bức xạ ion hoá:

(1) Các tia bức xạ có bản chất hạt: hạt anpha (α), hạt bêta (β), neutron

(2) Các tia bức xạ có bản chất sóng điện từ: tia Roentgen (tia X ) và tia gamma (γ)

+ Hạt anpha (α)

Hạt α là thành phần của hạt nhân nguyên tử Heli thoát ra từ một nhân nguyên tử nặng trong quá trình biến đổi hạt nhân Thí dụ Radi biến thành Radon và phát ra các hạt α:

88Ra® 86Rn+ 2He

Hạt α mang điện dương, năng lượng của hạt mất đi nhanh chóng khi đi qua vật chất do va chạm vào các điện tử của những nguyên tử vật chất Những va chạm liên tiếp đó làm cho hạt đi chậm lại, cuối cùng các hạt này nhường lại toàn bộ năng lượng đủ để lấy các điện tử ra khỏi quỹ đạo, tạo ra các ion Tia α

có tác dụng ion hoá rất mạnh (30.000 cặp ion trong 1cm không khí mà tia đi qua), nhưng khả năng đâm xuyên kém dễ dàng bị chặn lại bởi tờ giấy hoặc da

người Nếu hấp thụ vào cơ thể qua đường hô hấp hay đường tiêu hoá, những chất phát ra tia α sẽ gây tác hại cho cơ thể [1], [8]

+ Hạt beta (β)

Hạt β phát ra từ hạt nhân không ổn định, số lượng proton và neutron có sự chênh lệch lớn Khi có nhiều neutron, sự biến đổi neutron thành proton phát sinh điện tử mang điện tích âm, đó chính là các hạt electron nhanh, hay còn gọi

là hạt β-, ví dụ: khi P32 biến thành S32 Khi có nhiều proton, sự biến đổi ngược lại và phát sinh điện tử mang điện tích dương là các hạt positron hay còn gọi

là hạt β+, ví dụ: khi Na22 biến thành Ne22 Năng lượng của các hạt β kém các hạt α, khả năng ion hoá cũng thấp hơn nhiều (150 cặp ion qua 1cm không khí) Tia β có sức xuyên thấu kém, chỉ đi trong không khí được vài mét Một lá nhôm vài milimet là có thể ngăn chặn các hạt electron Sẽ nguy hiểm nếu hấp thụ vào cơ thể những chất phát ra tia β [1], [6]

+ Hạt neutron

Neutron là hạt không mang điện tích nên có sức xuyên thấu rất lớn Tuy không gây ion hóa trực tiếp nhưng khi tương tác với nguyên tử, chúng có thể sinh ra tia alpha, beta, các tia gamma, tia X Các nguyên tố có hạt nhân bị va chạm bởi hạt neutron trở thành có tính phóng xạ Trong trường hợp hạt neutron

va chạm trực tiếp với hạt nhân nguyên tử Hidro, toàn bộ năng lượng của neutron được truyền cho hạt nhân nguyên tử, proton bắn ra từ hạt nhân có khả năng ion hóa rất mạnh Do đó, neutron là bức xạ gây ion hóa gián tiếp nhưng rất nguy hiểm Có thể chặn hạt neutron bằng lớp nước dày, paraphin hay bê tông dày

[1], [6], [8]

+ Tia gamma (γ)

Một số hạt nhân sau khi phóng tia α, β+ hay β-, sẽ có quá nhiều năng lượng

và ở trạng thái kích thích Sự trở lại trạng thái ổn định sẽ phát ra photon γ Như vậy, tia γ là chùm hạt photon phóng ra từ hạt nhân nguyên tử, không có trọng lượng và không mang điện tích Do đó, không bị lệch hướng bởi từ trường, bản thân là các sóng điện từ có năng lượng lớn và bước sóng ngắn, khi bay qua trường điện từ của hạt nhân, không trực tiếp lấy đi các hạt electron của nguyên

tử, mà truyền cho chúng một năng lượng, chuyển các hạt electron lên trạng thái kích thích Sau đó tự các hạt electron sẽ bứt ra khỏi nguyên tử, biến chúng thành các ion Khả năng ion hoá của tia γ kém hơn so các tia α và β: Chỉ sinh vài cặp ion khi đi qua 1cm không khí Trái lại, khả năng đâm xuyên lại rất

mạnh so với các tia α và β Một lớp bê tông hay chì dầy có thể ngăn chặn được chúng [1], [19]

+ Tia Roentgen (tia X)

Giống như tia γ, tia X cũng có bản chất là bức xạ điện từ nhưng có bước sóng dài hơn Khi có sự di chuyển của electron ở lớp ngoài vào các lớp trong (điện tử di chuyển từ mức năng lượng cao xuống mức năng lượng thấp hơn) sẽ phát ra tia X đặc trưng Tia X cũng được sinh ra do sự phát bức xạ hãm Các tính chất của tia X cũng tương tự như tia γ

Sóng điện từ có năng lượng thấp, sóng ánh sáng có bước sóng thấp như tia cực tím (UV) là các dạng bức xạ không được xếp trong nhóm bức xạ ion hóa [1], [8], [37]

1.1.2 Nguồn phóng xạ

Nguồn phóng xạ là một đơn vị cấu trúc phát ra bức xạ, nguồn phóng xạ có thể là nguồn tự nhiên hay nguồn nhân tạo Nguồn tự nhiên là các mỏ có hoạt độ phóng xạ cao trong tự nhiên Nguồn nhân tạo là các thiết bị phát bức xạ như: lò phản ứng hạt nhân, các nguồn gamma, tia X sử dụng trong y tế, công nghiệp, nông nghiệp, khai mỏ, nghiên cứu khoa học … Nguồn phóng xạ tồn tại ở 2 dạng: nguồn kín và nguồn hở Nguồn kín là nguồn có thiết bị bao bọc tác nhân phát xạ ví dụ: lò phản ứng hạt nhân, nguồn Co60, nguồn X rays Nguồn hở là các nguồn không được bao bọc ví dụ như các loại đồng vị phóng xạ dùng trong

y tế, nông nghiệp, thăm dò địa chất…

Nguồn phóng xạ có các đặc trưng chủ yếu như sau:

- Bản chất của nguồn

Mức độ gây hiệu ứng của bức xạ ion hóa khi tương tác với vật chất phụ thuộc vào năng lượng, mật độ và độ xuyên thấu Các dạng bức xạ khác nhau với năng lượng khác nhau, sẽ có tốc độ mất năng lượng khác nhau khi tương tác với vật chất Nếu xét về mật độ của những nguyên tử bị ion hóa dọc theo đường đi của một tia bức xạ thì những bức xạ có hệ số truyền năng lượng tuyến tính (LET) thấp sẽ để lại các nguyên tử bị ion hóa với mật độ thấp hơn nhiều so với bức xạ LET cao Khả năng gây thương tổn thương tế bào của bức xạ LET cao lớn hơn gấp nhiều lần so với bức xạ LET thấp [1], [19]

- Hệ số truyền năng lượng tuyến tính (LET)

Hệ số truyền năng lượng tuyến tính (LET - Linear Energy Transfer) được tính bằng số năng lượng trung bình mà hạt truyền cho vật chất (qua quá trình

ion hóa và kích thích) trên một đơn vị chiều dài quãng đường đi của hạt Đơn

vị của LET là keV/µm [8], [36], [38]

LET có giá trị khác nhau với mỗi loại bức xạ, giá trị này rất quan trọng trong đánh giá tác dụng sinh học của bức xạ đối với tế bào sống Dựa vào giá trị LET, các bức xạ ion hóa được chia thành hai nhóm:

+ Nhóm bức xạ có LET thấp: tia X, tia γ, hạt electron

+ Nhóm bức xạ có LET cao: các hạt α, proton, các hạt nặng mang điện (các ion của các nguyên tố như: Cacbon, Argon, Neon…)

Bảng 1.1 Giá trị của LET trong môi trường nước (nguồn: ICRU 1995) [21]

- Suất liều

Suất liều là liều lượng tính trong một đơn vị thời gian, suất liều hấp thụ có đơn vị tính là Gy/s Đối với các hiệu ứng sinh học, suất liều liên quan đến hiệu suất sinh học tương đối (RBE – Relative Biological Efficiency) [19]

1.1.3 Quá trình gây hiệu ứng sinh học của bức xạ ion hóa

- Quá trình vật lý

Giai đoạn này diễn ra trong một biên độ thời gian cực nhỏ (10-16

– 10-12giây), đó là thời gian để bức xạ tác động đến cấu trúc chịu tương tác Đối với

hệ thống sinh học, cấu trúc chịu sự tương tác trực tiếp là các phân tử: DNA, RNA, Protein, Enzyme, và màng tế bào

Tác động của bức xạ ion hoá lên hệ thống thông tin di truyền tế bào: DNA, RNA, enzyme có ý nghĩa quan trọng Các phân tử DNA có thể bị ion hóa trực tiếp hoặc gián tiếp Đối với cơ chế gián tiếp, bức xạ ion hóa các phân tử nước

Loại bức xạ ion hóa LET (KeV/µm)

trong vùng lân cận phân tử DNA, các phân tử nước sẽ bị phân ly hình thành các gốc tự do, trực tiếp tác động gây tổn thương phân tử DNA [6], [17], [19]

Tế bào chứa khoảng 80% nước và dưới 1% DNA nên cơ chế gián tiếp có ý nghĩa nhất định đối với việc gây tổn thương phân tử DNA Đối với bức xạ LET thấp như tia gamma, tia X, electron thì tác dụng trực tiếp gây nên khoảng 1/3 tổng số các thương tổn, phần còn lại là do hiệu ứng gián tiếp Khả năng ion hóa các nguyên tử, phân tử của bức xạ ion hoá chính là điều khác biệt với các tác nhân không ion hóa, sự khác biệt này giải thích tại sao một lượng nhỏ năng lượng được hấp thụ bởi bức xạ ion hóa lại có thể gây nên một tác hại lớn hơn nhiều so với các tác nhân khác [19], [21]

- Quá trình hóa học

Giai đoạn này diễn ra trong vòng từ 10–13 đến 10–2 giây, được bắt đầu bằng

sự hình thành các gốc tự do từ sự thủy phân do bức xạ Quá trình này xảy ra sau khi phân tử nước hấp thụ năng lượng từ bức xạ, theo các giai đoạn sau:

H2O + γ " HOHÆ + e–

H2O + e– " HOH–

Các ion HOH– và HOH+ không bền vững và có thể bị tách thành các phần

tử nhỏ hơn: HOHÆ " HÆ + OH— và HOH– " OH– + H—

OH— và H— được gọi là các gốc tự do (free radicals), là những phân tử trung hòa có một electron không ghép cặp ở vỏ ngoài cùng Do đó, chúng có hoạt tính hóa học rất mạnh Đặc biệt gốc hydroxyl OH— với thời gian tồn tại 10-

5giây, là một tác nhân oxy hóa mạnh, có khả năng gây tổn thương phân tử DNA trong phạm vi 3nm [31]

Các gốc tự do cũng có thể tạo ra hydrogen peroxide H2O2, rất độc đối với

tế bào H2O2 có thể được hình thành do kết hợp hai gốc tự do OH— (OH— + OH—

→ H2O2), hay H— + O2 → HO—2 và 2HO—2 → H2O2 + O2 hoặc HO—2 + H— →

strand breaks), đứt gẫy sợi đôi (DSB - Double strand breaks), tổn thương base (BD - Base damages) ở các mức độ khác nhau, đứt gẫy liên kết giữa DNA và protein… Trong đó, loại tổn thương đặc trưng cho bức xạ ion hóa và đóng vai trò quan trọng nhất đối với tác dụng của bức xạ ion hóa trên phân tử DNA là những đứt gẫy đôi phức tạp [6], [19], [35], [39]

- Quá trình sinh học

Giai đoạn này diễn ra từ 10–2 giây đến vài giờ Đây là giai đoạn diễn ra quá trình sửa chữa những tổn thương sơ cấp xuất hiện trên phân tử DNA Những base bị tổn thương được sửa sai bằng cơ chế cắt bỏ những base riêng lẻ (Base– Excision Repair) hoặc một đoạn oligonucleotide (Nucleotide– Excision Repair) Tổn thương chuỗi đơn SSB được sửa sai dựa vào trình tự của mạch bổ sung Sửa chữa đứt gẫy đôi DSB liên quan đến một số cơ chế: Hai đầu đứt gẫy

có thể được nối lại mà không cần trình tự tương đồng theo cơ chế NHEJ (Nonhomologous End Joining), hay dựa vào trình tự tương đồng theo cơ chế

HR (Homologous Recombination) Những tổn thương sơ cấp, đặc biệt là những tổn thương đứt gẫy đôi cũng khởi phát một quá trình chuyển tín hiệu bằng cách sử dụng hoạt tính kinase của hệ thống enzyme tham gia vào quá trình đáp ứng của tế bào với tổn thương xảy ra trên phân tử DNA theo các con đường khác nhau, dẫn đến ngăn chặn sự phân bào ở các giai đoạn khác nhau của chu trình tế bào [39], [48], [79], [83]

1.1.4 Hiệu ứng sinh học gây bởi bức xạ ion hóa

- Hiệu ứng ở cấp độ phân tử

Giai đoạn này có thể kéo dài từ vài giờ đến nhiều năm sau khi chiếu xạ Bức xạ ion hóa gây tổn thương cho hàng loạt các phân tử khác nhau trong tế bào: phân tử protein, lipid, acid nucleic, hydrat cacbon…làm tổn thương những cấu trúc trong tế bào, trong đó quan trọng nhất là những tổn thương xảy ra với vật chất di truyền ở cấp độ phân tử là DNA, những tổn thương không được phục hồi, hoặc phục hồi nhầm trên phân tử DNA dưới tác động của bức xạ ion hóa, dẫn đến những tổn thương về chức năng của gene Cuối cùng được biểu hiện thành những triệu chứng lâm sàng [16], [48]

- Hiệu ứng ở cấp độ tế bào

Ở cấp độ tế bào, bức xạ ion hóa có thể tác dụng ở các mức độ khác nhau

tùy vào liều lượng, bản chất bức xạ và loại tế bào chịu tác dụng Trường hợp bị tổn thương nặng, tế bào sẽ bị chết: có thể chết giữa phase (interphase death) -

tế bào ngừng tất cả mọi hoạt động sống, có thể mất khả năng phân chia (reproductive death) Những tế bào mang đột biến gene liên quan đến sự kiểm

soát chu trình tế bào có thể nhân lên vô hạn định (gây nên bệnh ung thư) Đột biến có thể được truyền cho thế hệ tiếp theo nếu xảy ra ở tế bào sinh dục [48], [49], [75]

- Hiệu ứng ở cấp độ cơ thể

+ Các hiệu ứng cấp do bức xạ gây ra

Khi toàn thân nhận một liều cao trong một thời gian ngắn sẽ làm ảnh hưởng đến hệ mạch máu, hệ tiêu hóa, hệ thần kinh trung ương Các ảnh hưởng trên đều có chung một số triệu chứng như: buồn nôn, ói mửa, mệt mỏi, sốt, thay đổi

về máu và những thay đổi khác Đối với da, liều cao của tia X gây ra ban đỏ, rụng tóc, bỏng, hoại tử, loét, đối với tuyến sinh dục gây vô sinh tạm thời, đối với mắt gây hư hại giác mạc, kết mạc Hiệu ứng cấp thuộc loại tác dụng tất nhiên của bức xạ ion hóa với cơ thể là các tác dụng chỉ xảy ra và chắc chắn xảy

ra khi liều vượt quá một mức ngưỡng nào đó và mức độ trầm trọng càng tăng khi liều càng lớn [16], [48], [77]

+ Các hiệu ứng muộn do bức xạ gây ra

Hiệu ứng muộn hay còn được gọi là tác dụng mãn tính (chronic) là những tác dụng chỉ có thể quan sát sau nhiều năm Một người khi bị chiếu xạ có thể bị những tác dụng cấp tính hay không (tùy theo liều), nhưng luôn luôn có nguy cơ

bị các tác dụng muộn Tất cả các tác động của bức xạ ion hóa ảnh hưởng đến vật chất di truyền của cơ thể thuộc về tác dụng ngẫu nhiên, có xác suất xảy ra tăng theo liều hấp thụ, và dù liều hấp thụ thấp bao nhiêu đi nữa, tác dụng vẫn

có thể xảy ra với một xác suất nhất định (không có ngưỡng) Mức độ trầm trọng của tác dụng loại này trên mỗi cá thể là không phụ thuộc liều, và khi nó xảy ra, các hậu quả là như nhau Ung thư, bệnh máu trắng, ung thư xương, ung thư phổi, đục thủy tinh thể, giảm thọ, rối loạn di truyền là các hiệu ứng muộn có thể xảy ra khi cơ thể bị nhiễm xạ [1], [48], [77], [83]

1.1.5 An toàn phóng xạ

- Các đại lượng và đơn vị đo liều

+ Liều chiếu (exposure dose - chỉ dùng riêng cho tia gamma và tia X)

Liều chiếu: Là liều bức xạ phát ra từ nguồn phát xạ, có đơn vị là Culomb/kg (C/kg) hay Roentgen (R) R là liều chiếu của tia gamma hay tia X, khi tác động vào 1kg không khí ở điều kiện chuẩn thì làm xuất hiện 1 điện tích là 2,58.10-4C/kg

+ Suất liều chiếu (exposure dose rate): Là liều chiếu tính trong một đơn vị thời gian [1], [19]

+ Liều hấp thụ (absorbed dose)

Liều hấp thụ: Là đại lượng liều lượng bức xạ đặc trưng cho mức độ hấp thụ của vật chất khi bị chiếu, đó chính là năng lượng bức xạ bị hấp thụ bởi 1 đơn

vị khối lượng môi trường, D = dE/dm (dE là năng lượng trung bình của bức xạ truyền cho vật chất có khối lượng là dm trong thể tích nguyên tố) Liều hấp thụ

có đơn vị là J/kg (trong an toàn bức xạ gọi là Gray – viết tắt Gy), 1Gy = 1 J/kg Trước đây, thường dùng đơn vị là rad, 1Gy = 100 rad [35], [39]

Suất liều hấp thụ (absorbed dose rate): Liều hấp thụ trong một đơn vị thời gian được gọi là suất liều hấp thụ, đơn vị thường dùng là (Gy/s hoặc rad/s)

+ Liều tương đương (equivalent dose)

Cùng một liều hấp thụ nhưng tác dụng sinh học của bức xạ còn tuỳ thuộc vào loại bức xạ, với cùng một liều hấp thụ như nhau, trong cùng một loại mô, tổn thương sinh học mà tia α gây ra lớn hơn gấp nhiều lần so với tia X hoặc tia

γ Đặc trưng cho sự phụ thuộc vào loại bức xạ, người ta dùng đại lượng có tên gọi là trọng số bức xạ wR Như vậy, liều tương đương sinh học của mô (cơ quan) T nào đó của cơ thể trong một trường bức xạ được tính theo hệ thức:

Đơn vị tính liều tương đương là Sievert (viết tắt là Sv) Trước đây, thường dùng đơn vị là rem: 1Sv = 100rem Đơn vị Sievert được sử dụng phổ biến để tính toán ảnh hưởng của tia phóng xạ đối với cơ thể con người trên cơ sở tính đến sự khác nhau về tác dụng sinh học của các tia phóng xạ khác nhau Do vậy, nếu đánh giá lượng tia phóng xạ mà cơ thể con người nhận bằng đơn vị Sievert thì dù nó là tia phóng xạ tự nhiên hay nhân tạo, ảnh hưởng đối với cơ thể con người tương đương nhau nếu số đơn vị này bằng nhau [39], [55]

+ Liều hiệu dụng (Effective dose)

Liều hiệu dụng E được tính theo hệ thức:

T

E = å w H Trong đó wT là trọng số mô, HT là liều tương đương Tổng được lấy theo tất cả các mô chịu tác dụng của bức xạ Đối với toàn bộ cơ thể: T 1

STT Mô hoặc cơ quan Trọng số mô wT

1 Tuyến sinh dục (buồng trứng, tinh hoàn) 0.20

Thí dụ: Liều hiệu dụng đối với phổi gây bởi bức xạ α là:

E(Sv) = 20 0,12 D (Gy) = 2,4 D (Gy)

+ Hoạt độ (radioactivity)

Hoạt độ nguồn phóng xạ là số hạt nhân phân rã từ nguồn / đơn vị thời gian Trong hệ SI, đơn vị đo hoạt độ là Becquerel (Bq) 1Bq = 1 phân rã /giây Hiện nay người ta vẫn dùng đơn vị Curie (Ci) 1Ci = 3,7.1010 Bq

Mối liên hệ: 1Ci = 37 GBq (3,7.109 Bq); 1 Bq = 2,7.10-11Ci

- Các phương pháp đo liều phóng xạ

+ Phương pháp đo liều vật lý và hóa học

Nguyên tắc hoạt động của các thiết bị này dựa vào các hiệu ứng vật lý và hóa học khi bức xạ tương tác với vật chất: sự ion hóa của chất khí; sự ion hóa

và kích thích chất rắn; tác dụng hóa học; tác dụng của neutron với vật chất và hiệu ứng phân cực môi trường Các loại liều kế sau đây được sử dụng dựa trên các nguyên tắc vật lý và hóa học: buồng ion hóa; bút đo liều; ống đếm tỷ lệ; ống đếm Geiger-Muller; buồng Wilson; buồng khuyếch tán; buồng bọt; đầu dò (detector) dẫn điện; detector bán dẫn; detector nhấp nháy; detector nhiệt phát quang; nhũ tương ảnh; ống đếm Bo; ống đếm proton giật lùi; ống đếm phản ứng phân hạch; ống đếm kích hoạt…

Để đảm bảo an toàn, các cơ sở phóng xạ được thường xuyên kiểm tra bằng các máy kiểm xạ (detector), nhân viên bức xạ luôn phải đeo liều kế cá nhân Liều kế cá nhân được thiết kế để đeo trên ngực, chân tay của người làm việc [1], [19], [39], [77]

+ Phương pháp đo liều sinh học

Đo liều sinh học dựa trên nguyên tắc các loại hiệu ứng sinh học có ngưỡng (xuất hiện ở một khoảng liều nhất định) Thành tựu y sinh học phóng xạ đã chỉ

ra một số triệu chứng lâm sàng có ngưỡng như sau:

Liều nhỏ hơn 150 mSv: không có dấu hiệu lâm sàng, có sự thay đổi vật chất

di truyền, xuất hiện sai hình NST; Liều lớn hơn 150 mSv: không có dấu hiệu lâm sàng, giảm tinh dịch; Liều lớn hơn 500 mSv: không có dấu hiệu lâm sàng, giảm nhẹ số lượng tế bào lympho; Liều lớn hơn 1000 mSv: buồn nôn, nôn, thay đổi công thức máu (tỷ lệ bạch cầu / hồng cầu / tiểu cầu); Liều lớn hơn

2000 mSv: nhức đầu, sốt; Lớn hơn 6-8 Sv: Xuất hiện hội chứng đường ruột;

20-50 Sv: Loạn ý thức Trên cơ sở phân tích những đặc điểm ổn định của tế bào lympho máu ngoại vi người, năm 1982 IAEA khuyến cáo sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể để đo liều phóng xạ [21], [24], [28], [39]

1.2 Phân tử ADN, bộ nhiễm sắc thể người

1.2.1 Cấu trúc của phân tử DNA (Deoxyribonucleic acid)

Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: một nhóm phosphate, một gốc đường pentose và một trong bốn loại base nitơ: adenine (A), thymine (T), guanine (G) và cytosine (C) Hai mạch đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai mạch; A

bổ sung cho T và C bổ sung cho G, quan hệ này giải thích được cấu trúc chặt chẽ của phân tử DNA và tính bảo tồn trong sao chép

Watson - Crick đã đưa ra mô hình cấu trúc DNA dạng B có các đặc điểm về kích thước: chiều xoắn của chuỗi xoắn kép: từ trái sang phải; khoảng cách 1 vòng xoắn: 34A0 tương ứng với 10 cặp base; đường kính: 20 A0 [2], [5], [78]

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc DNA dạng B

1.2.2 Bộ nhiễm sắc thể người và các tiêu chí phân loại

- Cấu trúc nhiễm sắc thể của người

Nhiễm sắc thể có 2 cấp độ cấu trúc, thể đơn trước pha S (Synthesic phase)

và thể đôi sau pha S Trước pha S, mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử ADN dạng xoắn kép kết hợp với các phân tử protein histon và phi histon ở các cấp

độ cấu trúc khác nhau, nhiễm sắc thể thể một luôn ở trạng thái dãn xoắn Sau pha S mỗi phân tử DNA được nhân đôi theo nguyên tắc bổ sung, nhiễm sắc thể

ở dạng thể đôi với 2 nhiễm sắc tử

10

Hình 1.2 Cấu trúc siêu hiển vi của bộ nhiễm sắc thể người

Tại kỳ giữa của pha phân chia (metaphase) NST ở trạng thái cô đặc nhất có hình dạng và kích thước điển hình với đường kính 1400nm, gồm hai chromatid chị em liên kết với nhau tại tâm động Vị trí tâm động là đặc điểm đặc trưng phân loại các cặp nhiễm sắc thể, tâm động chia NST thành hai vai với chiều dài khác nhau: vai dài (q), vai ngắn (p) cách nhau bởi eo sơ cấp Đầu mút nhiễm sắc thể hay còn gọi là telomere, mang trình tự nucleotide TTAGGG lặp lại nhiều lần có chức năng giới hạn nhiễm sắc thể, tổn thương chuỗi đôi phân tử DNA làm mất chức năng giới hạn và các đầu mút này trở thành “đầu dính” Nhiễm sắc thể còn có thể kèm cách vai bởi eo sơ cấp Mỗi đầu nhiễm sắc thể

có thể có hơn một thể kèm, tạo nên eo thứ cấp Căn cứ vào vị trí tâm động, NST được phân loại thành ba nhóm: tâm giữa (metacentric), tâm lệch (submetacentric) và tâm mút (acrocentric) [5], [64], [78], [36], [38]

Hình 1.3 Các loại vị trí tâm động NST Mỗi cặp nhiễm sắc thể trong genome (karyotype) đều có đặc trưng về kích thước tương đối và chỉ số tâm động Hội nghị Denve, Mỹ (1960); Hội nghị Paris, Pháp (1971); Hội nghị Basel, Thụy Sỹ (1985) thống nhất lấy kích thước tương đối (giá trị phần trăm tỷ lệ giữa kích thước của một nhiễm sắc thể cụ thể

và kích thước của toàn bộ đơn bội - theo quy ước là 22 NST thường và 1 NST

X ) và chỉ số tâm động (giá trị phần trăm tỷ số đo vai ngắn (p) và số đo toàn nhiễm sắc thể đang xét) làm dấu chuẩn phân loại nhiễm sắc thể Ngoài ra, số lượng và độ lớn của các vạch bắt trong kỹ thuật nhuộm band cũng được sử

dụng để phân loại bộ NST Các Hội nghị Quốc tế trên đã sắp xếp bộ nhiễm sắc thể người vào 7 nhóm theo ký tự A, B, C, D, E, F, G [38], [68]

- Bộ nhiễm sắc thể người

Con người thuộc loài Homo sapiens có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội gồm 22 cặp nhiễm sắc thể thường (còn gọi là nhiễm sắc thể sinh dưỡng - autosoma) và một cặp nhiễm sắc thể giới tính (sex chromosome) có đặc trưng đồng nhất ở

nữ, ở nam gồm một NST X và một NST Y Bộ NST người chứa trên 3 tỷ cặp nucleotide

Hình 1.4 Hình thái và trật tự sắp xếp các cặp nhiễm sắc thể người (nam)

1.3 Sai hình nhiễm sắc thể (chromosomal aberration)

1.3.1 Khái niệm về sai hình nhiễm sắc thể

Sai hình nhiễm sắc thể là thuật ngữ di truyền học, chỉ sự thay đổi khác thường về số lượng và hình ảnh cấu trúc của NST Sai hình NST được phát hiện từ rất sớm trên cơ sở nghiên cứu tác động của các tác nhân đột biến lên thực vật, nấm Các nghiên cứu thực vật chiếu xạ của Mather (1934); Rley (1936); Sax (1938, 1940) đã phát hiện sai hình kiểu NST và sai hình kiểu nhiễm sắc tử ở ngay metaphase của chu trình phân bào đầu tiên sau chiếu xạ Ở người, việc phát hiện sai hình nhiễm sắc thể liên quan đến nghiên cứu các bệnh

di truyền [13], [36], [38], [74]

- Sai hình ở cấp độ nhiễm sắc thể (Chromosome aberrant type)

Các sai hình được biểu hiện ở cấp độ nhiễm sắc thể, tức liên quan đến cả hai nhiễm sắc tử của nhiễm sắc thể Các kiểu sai hình này thường xuất phát từ các tổn thương chuỗi đôi phân tử DNA trước phase S Sự đứt gẫy và trao đổi các đoạn NST xảy ra trước khi NST nhân đôi, thuộc loại sai hình nhiễm sắc thể gồm có: sai hình mảnh không tâm (fragment), sai hình đa tâm (polycentromere), sai hình vòng (ring), sai hình chuyển đoạn (translocation), sai hình đảo đoạn (inversion) [13], [36], [38], [74]

- Sai hình ở cấp độ nhiễm sắc tử (Chromatid aberrant type)

Các sai hình được biểu hiện ở cấp độ nhiễm sắc tử, tức chỉ xảy ra trên một nhiễm sắc tử của nhiễm sắc thể Các kiểu sai hình này thường xuất phát từ các tổn thương chuỗi đơn phân tử DNA trước pha S hoặc tổn thương chuỗi đôi sau pha S Thuộc loại sai hình nhiễm sắc tử gồm có: sai hình đứt gẫy nhiễm sắc tử (chromatid break), liên kết dạng cánh (radical) Sai hình kiểu nhiễm sắc tử rất phức tạp về mặt hình thái [13], [36], [38], [59], [74]

1.3.2 Cơ chế tạo nên sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho dưới tác động của bức xạ ion hóa

Những nghiên cứu về sai hình NST dưới tác động của bức xạ ion hóa cho thấy bức xạ ion hóa gây ra sai hình nhiễm sắc thể ở cấp độ nhiễm sắc thể hay nhiễm sắc tử là tùy thuộc vào thời điểm chiếu xạ rơi vào giai đoạn nào của chu trình tế bào: Nếu tế bào được chiếu xạ trước pha S (Go, G1) thì sai hình chỉ biểu hiện ở cấp độ nhiễm sắc thể, liên quan đến cả hai nhiễm sắc tử với những tương đồng về sai lệch, trường hợp tế bào được chiếu xạ ở pha S hoặc G2 (nhiễm sắc thể gồm hai chromatid chị em) thì sai hình biểu hiện ở cấp độ nhiễm sắc tử, chỉ xảy ra trên một nhiễm sắc tử Những quan sát này chứng tỏ rằng: Tổn thương DSB là loại tổn thương quan trọng nhất mà bức xạ ion hóa gây ra trên phân tử DNA và DSB là điều kiện thiết yếu để tạo nên những sai hình nhiễm sắc thể dưới tác động của bức xạ ion hóa [23], [25], [36], [38], [76] Vì quần thể tế bào lympho trong máu ngoại vi tồn tại ở phase Go nên sai hình ở tế bào lympho được quan sát ở metaphase của lần phân bào đầu tiên sau khi chiếu xạ là sai hình kiểu nhiễm sắc thể Các kiểu sai hình được quan sát ở

cả in vitro và in vivo bao gồm: mảnh không tâm, sai hình đa tâm, vòng có tâm

và không tâm, đảo đoạn và chuyển đoạn

Những công trình nghiên cứu về cơ chế gây sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho dưới tác động của bức xạ ion hóa trong vài thập niên qua đã củng cố thêm những nhận định của Savage về cơ chế gây sai hình nhiễm sắc thể đó là:

Số phận của những tổn thương sơ cấp được hình thành dưới tác động của bức

xạ ion hóa rơi vào ba trường hợp sau: (1): những tổn thương sơ cấp có thể được phục hồi một cách chính xác, không làm thay đổi cấu trúc và hình thái của nhiễm sắc thể; (2): Những đứt gẫy được tạo ra trên phân tử DNA vẫn không được sửa chữa, hậu quả là tạo nên những mảnh nhiễm sắc thể không tâm (mất đoạn) được quan sát ở metaphase của lần phân bào đầu tiên sau khi đứt gẫy được tạo ra; (3): Những đầu đứt gẫy khác nhau có thể được nối lại một cách không chính xác, kết quả là tạo nên những sai hình nhiễm sắc thể liên quan đến một hay nhiều nhiễm sắc thể [23], [25], [36] Những công trình nghiên cứu của Scott (1980), Bender (1987), Cornforth và Bedford (1993), Natarajan và Obe (1996) đều khẳng định sai hình nhiễm sắc thể lympho dưới tác động của bức xạ ion hóa liên quan đến những đứt gẫy đôi được tạo ra trực tiếp hoặc gián tiếp và sự tương tác sau đó giữa các đầu đứt gẫy với sự tham gia của cơ chế nối những đầu đứt gẫy mà không cần trình tự tương đồng NHEJ (Nonhomologous End Joining) Phần lớn những sai hình được hình thành ngay sau khi chiếu xạ, phần còn lại được hình thành vài giờ sau khi chiếu xạ [21], [36], [38]

Trường hợp hai đứt gẫy đôi xảy ra trên cùng một nhiễm sắc thể có thể tạo

ra sai hình đảo đoạn (a), hoặc một sai hình vòng có tâm Ở trường hợp tạo ra sai hình vòng nếu hai đầu đứt gẫy còn lại nối với nhau thì tạo ra 1 mảnh (b), nếu hai đầu đứt gẫy còn lại không nối với nhau thì tạo ra 2 mảnh (c)

Hình 1.5 Sai hình vòng có tâm được hình thành từ 2 đứt gẫy đôi trên 1

NST Trường hợp 2 đứt gẫy đôi xảy ra trên 2 nhiễm sắc thể khác nhau tạo ra 4 đầu đứt gẫy Các đầu đứt gẫy có thể tương tác theo hai cách hoàn toàn khác nhau Kết quả có thể tạo nên sai hình chuyển đoạn (a), trong trường hợp trao đổi không đối xứng tạo ra sai hình hai tâm kèm theo một mảnh (b) hoặc hai mảnh (c)

A B C D

E

C D

E

F G

E

A

B

E +

A

B

A

B C D

D

D C

F G (a)

(b) (c)

Hình 1.6 Sai hình 2 tâm được hình thành từ 2 đứt gẫy đôi trên 2 NST Mảnh không tâm cũng có thể được hình thành từ những đứt gẫy đôi không được sửa chữa

Hình 1.7 Cơ chế tạo mảnh không tâm được hình thành từ 1 DSB trên 1 NST

Sai hình 3 tâm liên quan đến 3 nhiễm sắc thể

Hình 1.8 Cơ chế tạo sai hình 3 tâm được tạo thành từ các DSB trên 3 NST Như vậy, sự hình thành nên các kiểu sai hình trong những tế bào chứa đầu đứt gẫy của đứt gẫy đôi không những phụ thuộc vào số lượng đứt gẫy đôi mà còn phụ thuộc vào cơ hội tương tác và kiểu tương tác giữa các đầu đứt gẫy

[57], [59], [74]

1.4 Kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể trong định liều sinh học

1.4.1 Vai trò quyết định của tế bào lympho máu ngoại vi người

Năm 1982, kỹ thuật phân tích sai hình NST ở tế bào lympho máu ngoại vi người được Cơ quan Năng lượng Nguyên tử quốc tế (IAEA) khuyến cáo sử dụng trong đo liều phóng xạ [21] Sở dĩ như vậy là vì sai hình NST ở tế bào lympho máu ngoại vi người có những đặc điểm làm cho nó có khả năng phản

ánh được một cách khách quan và chính xác tác động của môi trường lên con người

Thứ nhất: Do luôn tồn tại ở pha Go trong máu ngoại vi, với số lượng lớn (1ml máu ngoại vi chứa xấp xỉ 1triệu tế bào lympho) phân bố đều khắp cơ thể, cùng với đặc điểm có thời gian sống dài Buckton, Dolphin, Lloyd, Norman, Ramalho đã chứng minh được rằng thời gian bán sống của tế bào lympho trung bình là 4 năm, một số tồn tại vài chục năm [21], [36], [38], [67], [70] Đây chính là cơ sở để tế bào lympho máu ngoại vi đóng vai trò như tấm bia lưu trữ được hầu hết các sai hình NST phát sinh do tác động của môi trường trong suốt đời sống của nó Thêm vào đó, đặc tính tái tuần hoàn của tế bào lympho – tế bào lympho tuần hoàn trong máu ngoại vi có thể quay trở lại các cơ quan lympho (lá lách, các hạch bạch huyết và các mô khác) Điều này có nghĩa các

tế bào lympho mang sai hình nhiễm sắc thể được tạo nên ở bất kỳ phần nào của

cơ thể cuối cùng cũng có mặt trong máu ngoại vi

Thứ hai: Do đặc tính tế bào tồn tại ở pha Go, dưới tác động của tác nhân kích thích phân bào thích hợp sẽ chuyển sang trạng thái phân chia trong in vitro Việc ứng dụng những kỹ thuật trong nuôi cấy tế bào cho phép kiểm soát được thời gian phân chia của tế bào lympho Đây chính là yếu tố quyết định sự thành công của việc sử dụng tế bào lympho trong nghiên cứu sai hình nhiễm sắc thể dưới tác động của bức xạ ion hóa và sử dụng toàn bộ tế bào lympho trong máu ngoại vi như một liều kế sinh học trong trong đo liều bức xạ

Các cơ chế đứt gẫy và phục hồi tổn thương của phân tử DNA xảy ra trước phase S dưới tác động của phóng xạ có sự giống nhau giữa in vivo và in vitro Các kết quả nghiên cứu của Bazerska, Bender, Breman, Clemenger, Dolphin, Evans, Natarajan và Preston đã chứng minh tần số sai hình NST giống nhau giữa tế bào lympho bị chiếu xạ in vitro và từ mẫu bệnh nhân xạ trị cùng liều Đặc điểm phản ánh khách quan và chính xác tác động của các tác nhân đột biến lên sự hình thành sai hình NST ở tế bào lympho trong in vitro cũng như trong in vivo chỉ đúng khi quan sát ở chu kỳ đầu tiên Với tiêu bản nhuộm Hoechst 33258 Fabry, Kodama, Natarajan, Sasaki chỉ ra thời gian nuôi cấy thích hợp để số lượng tế bào đạt metaphase thứ nhất chiếm tối ưu trong quần thể là 48 giờ [21], [39], [45], [46], [58], [76] Như vậy, việc xây dựng những mối liên hệ, những tham số định lượng về mặt toán học giữa liều lượng, bản chất của một loại bức xạ ion hóa với những sai hình phát sinh ở in vitro có ý nghĩa trong việc đánh giá liều lượng, bản chất của bức xạ trong những trường hợp rủi ro liên quan đến bức xạ trong thực tế

1.4.2 Kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể

Liên quan đến các tổn thương phân tử DNA do phóng xạ có các kiểu sai hình đa tâm, mảnh không tâm, minute, vòng có tâm, vòng không tâm, chuyển đoạn, đảo đoạn Kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể phụ thuộc vào kỹ thuật tế bào học, kỹ thuật tiêu bản hiển vi Kỹ thuật FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) có khả năng phân biệt các cặp nhiễm sắc thể bằng màu sắc được

sử dụng thích hợp cho phân tích sai hình chuyển đoạn, tần số sai hình hai tâm được qui đổi theo công thức Lucas Kỹ thuật FISH hiện được sử dụng trong hệ thống phân tích tự động với phần mềm Msearch Một trong những kiểu sai hình nhiễm sắc thể có giá trị định lượng ổn định nhất là sai hình hai tâm (dicentric aberration) [22], [50], [71] Kỹ thuật phân tích sai hình hai tâm được thực hiện với tiêu bản nhuộm giemsa cổ điển (conventioning stain)

Phân tích sai hình hai tâm hiện nay được xem là “chưa thể thay thế” trong

đo liều sinh học Sở dĩ phân tích sai hình hai tâm được áp dụng rộng rãi trên khắp thế giới và được sử dụng để định liều trong tất cả các tai nạn phóng xạ trong vài thập niên qua là do sai hình hai tâm là loại sai hình nhiễm sắc thể rất đặc trưng cho bức xạ ion hóa Trong các tác nhân lý, hóa gây sai hình nhiễm sắc thể còn lại thì chỉ có một số rất ít chất hóa học có thể gây nên loại sai hình này (các hóa chất gây sai hình hai tâm được gọi là nhóm hóa chất bắt chước phóng xạ, ví dụ như bleomycin, tần số sai NST hai tâm trong quần thể tự nhiên rất thấp (1dicentric/1000 tế bào) Sai hình hai tâm rất nhạy với bức xạ ion hóa, chỉ một liều rất thấp của LET thấp cũng có khả năng gây nên sai hình hai tâm (ngưỡng liều 0,05Gy) Tần số sai hình hai tâm có mối quan hệ chặt chẽ với liều lượng, suất liều và bản chất của bức xạ [21], [37], [44], [53], [60], [65]

1.4.3 Các mối quan hệ định lượng của sai hình nhiễm sắc thể hai tâm ở tế bào lympho dưới tác động của bức xạ ion hóa

Trong trường liều đều thì sự tác động của bức xạ ion hóa lên các tế bào tuân theo quy luật ngẫu nhiên Khả năng xảy ra những tổn thương trên phân tử DNA là đồng đều như nhau giữa các tế bào Buckton, Que đã chứng minh phân

bố của các đứt gẫy đôi trên các NST ở tế bào lympho dưới tác động của bức xạ gamma tuân theo qui luật phân bố đều Bauchinger, Bender, Edwards, Fabry, Natarajan, Sasaki, Que xác nhận phân bố của sai hình NST 2 tâm giữa các tế bào chiếu bức xạ gamma, trường liều đều tuân theo qui luật Poisson [11], [14], [23], [26], [54], [68] Qui luật ngẫu nhiên là qui luật cần thiết để đảm bảo sai hình NST phản ánh được tính khách quan tác động của bức xạ ion hoá

Mối quan hệ định lượng của sai hình nhiễm sắc thể hai tâm ở tế bào lympho dưới tác động của bức xạ ion hóa được biểu thị bởi phương trình liều - hiệu ứng sai hình hai tâm và hiệu quả sinh học tương đối Cả hai mối quan hệ này

thể hiện mối liên quan chặt chẽ giữa tần số sai hình hai tâm với liều lượng, suất liều và bản chất của bức xạ Khả năng gây ra tác dụng sinh học của bức xạ ion hóa phụ thuộc vào LET Tổn thương do bức xạ có LET cao gây ra cho phân tử DNA lớn hơn nhiều lần so với bức xạ có LET thấp LET được xem là đại lượng đặc trưng cho chất lượng của bức xạ Các kết quả nghiên cứu trên Thế giới đã chỉ ra các phương trình tổng quát của mối liên quan này có dạng tuyến tính đối với bức xạ LET cao (y = kD + C) và dạng bậc 2 (y = aD + bD2 + C) đối với bức xạ LET thấp Các nghiên cứu của Bauchinger, Bender, Fabry, Natarajan phát hiện ra rằng dạng phương trình liều - hiệu ứng tổng quát luôn được quyết định bởi LET, chúng có dạng tuyến tính với bức xạ LET cao và hàm mũ bậc 2 với bức xạ LET thấp Trên cơ sở sử dụng Enzym Cyto Arabinoza (AraC) tác động vào mẫu máu ngay sau chiếu bức xạ LET cao (neutron nhanh) và bức xạ LET thấp (gamma, tia X) mà Preston đã phát hiện ra

hệ số a phụ thuộc vào số lượng sai hình 2 tâm do các đứt gãy đôi trực tiếp, còn

hệ số b phụ thuộc số lượng sai hình 2 tâm do các đứt gãy đôi gián tiếp (khuyết phục hồi các tổn thương BD) [14], [41], [52], [54], [68], [73], [76]

Trong khi phương trình tổng quát phụ thuộc vào LET của bức xạ thì các hệ

số hồi qui của phương trình thực nghiệm a và b cho biết mối quan hệ chính xác giữa tần số sai hình NST với liều lượng, suất liều, bản chất và LET của riêng từng nguồn bức xạ Các hệ số a, b cũng như tỷ lệ a/b còn phản ánh thực chất mức độ gây đứt gãy đôi trực tiếp hay gián tiếp của bức xạ đang nghiên cứu Nghiên cứu trên các nguồn bức xạ gamma, tia X của Baushinger, Fabry, Leonard, Lloyd, Prosser, Takahashi, Schmid, Vulpis, Wagner, Wambersie đã xác định được mối liên quan liều - hiệu ứng là các phương trình hàm mũ bậc 2 với các giá trị hệ số hồi qui thực nghiệm số a, b và tỷ lệ a/b khác nhau phụ thuộc vào suất liều của các nguồn bức xạ [21], [30], [38], [46], [54] Trên các nguồn bức xạ neutron nhanh, Heartlein và Preston (1985) đã chứng minh hiệu suất tạo đứt gãy đôi trực tiếp của bức xạ LET cao có giá trị cao hơn bức xạ LET thấp rất nhiều và phương trình liều - hiệu ứng phù hợp với dạng tổng quát

y = kD + C với giá trị hệ số k khác nhau ở các nguồn bức xạ khác nhau Nghiên cứu của Barjaktarovic, Bauchinger, Biola, Fabry, Leonard, Lloyd, Prosser, Wambersie sử dụng nguồn bức xạ đơn năng khác nhau và nguồn bức xạ gamma suất liều khác nhau đã chứng minh được giá trị các hệ số a và b phụ thuộc vào bản chất, LET và suất liều [21], [30], [39], [66], [73]

Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho cũng phản ánh bản chất an toàn của nguồn xạ Thông qua chỉ số hiệu suất sinh học tương đối (RBE) và hiệu suất sinh học tương đối cực đai (RBEo) có thể đánh giá được hiệu suất sinh học do các mức liều khác nhau của cùng nguồn hoặc giữa các nguồn khác nhau Công

thức xác định RBE = fi/fg (fi: tần số sai hình NST do nguồn bức xạ i; fg: tần số sai hình NST do bức xạ gamma cùng liều hấp thụ) Trong cùng một nguồn bức

xạ thì hiệu suất tạo ra sai hình NST không giống nhau ở các liều hấp thụ khác nhau Khác với RBE (bao gồm cả trực tiếp và gián tiếp), RBEo là hiệu suất tạo

ra sai hình NST từ các đứt gãy đôi trực tiếp của nguồn bức xạ Công thức xác định RBE0 = ai/ag (ai: hệ số hồi qui tuyến tính của phương trình chuẩn liều - hiệu ứng thực nghiệm đối với nguồn bức xạ i; ag: hệ số hồi qui tuyến tính tính của phương trình chuẩn liều - hiệu ứng thực nghiệm đối với nguồn bức xạ gamma) Nghiên cứu trên các nguồn bức xạ neutron đơn năng khác nhau Bender, Lloyd, Natarajan, Preston, Sasaki đã chứng minh hiệu quả sinh học tương đối cực đại phụ thuộc vào bản chất, LET và suất liều [ 30], [56], [58], [59], [74] Sasaki, Normal, Langlands và nhiều tác giả khác đã khẳng định sự thống nhất giữa tần suất sai hình hai tâm trong các mẫu tế bào Lympho nhận được từ các bệnh nhân ung thư trải qua chiếu xạ in vivo toàn cơ thể với tần suất

dự đoán dựa vào các đường chuẩn in vitro [57], [58]

1.5 Nội dung cơ bản của phương pháp định liều sinh học sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể

Phép xây dựng đường phân bố chuẩn liều - hiệu ứng được thực hiện bằng cách chiếu mẫu trực tiếp, phân tích sai hình NST, kiểm định mối quan hệ liều - hiệu ứng và xây dựng đường hồi quy thực nghiệm

Kết quả phân tích sai hình NST không chỉ đóng vai trò chỉ thị, trên cơ sở các nghiên cứu của Bender (1962, 1963, 1966), Evans (1972), Dolphin (1973), Lloyd (1973), Purott (1973), Hội nghị Đo liều Sinh học được Cơ quan Năng lượng Nguyên tử (IAEA) tổ chức tại Amsterdam, Hà lan năm 1982 thống nhất đưa kỹ thuật phân tích sai hình NST ở tế bào lympho vào thường qui định liều phóng xạ Hội nghị Madrid, Tây Ban Nha năm 1990 đã đề ra một số nguyên tắc

cơ bản: Thứ nhất: Phải sử dụng các phương trình chuẩn liều - hiệu ứng thích hợp với nguồn bức xạ gây nên sự cố; Thứ hai: Phải kiểm tra phân bố sai hình 2 tâm giữa các tế bào lympho để xác định nạn nhân bị chiếu toàn thân hay bị chiếu bộ phận để đưa ra giải pháp định liều thích hợp Phân bố này tuân theo qui luật Poisson tức nạn nhân bị chiếu toàn thân, không theo qui luật Poisson tức nạn nhân bị chiếu bộ phận Công thức định liều cho trường hợp bị chiếu toàn thân là D = {-a + [a2 + 4b (y - C)] 1/2}/2b, trong đó: a và b là các hệ số hồi qui của phương trình thực nghiệm, y là tần số sai hình 2 tâm phát hiện được

ở mẫu phân tích Công thức định liều cho trường hợp bị chiếu bộ phận là: Qdr

= X/Nu = y1 / 1- exp (-y1 - y2), trong đó: X là số sai hình 2 tâm phát hiện được;

Nu là tổng số tế bào có chứa sai hình; y1 là hàm số của sai hình hai tâm; y2 là

hàm số của sai hình mảnh không tâm; Công thức tính liều tương đương: H = D Wr (D: liều hấp thụ; Wr: trọng số bức xạ) [21], [36], [39], [40], [46], [73], đơn

vị là Sv Với đường chuẩn xây dựng trên nguồn gamma Cs137 và phương pháp Qdr, việc phân tích sai hình NST cho định liều đã được tiến hành sau sự cố nguồn Cs137 tại Goiânia, Brazil (1987), liều cá nhân xác định được phụ thuộc vào mức độ tiếp xúc của nạn nhân với nguồn, có giá trị phân bố từ 0,1Gy đến 5,3Gy [29], [36], [39], [65], [80]

1.6 Ứng dụng kỹ thuật phân tích sai hình NST trong đo liều sinh học

trên Thế giới và tại Việt Nam

Sau khi kỹ thuật nuôi cấy tế bào lympho in vitro được Nowel phát hiện vào năm 1960 thì sai hình NST lập tức được sử dụng trong việc đánh giá ảnh hưởng của phóng xạ tại Hiroshima, Nagasaki (Nhật Bản) [39] Sau đó đã được sử dụng để đánh giá mức độ ảnh hưởng trong hầu hết các trường hợp xảy ra sự cố phóng xạ trên thế giới: mây bụi Chernobyl (Ukraine), mất nguồn ở Goiania (Brasil), sự cố Tokai (Nhật bản) Đông Uran (Nga), Elbmarch (Đức) Kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người cũng được sử dụng để đánh giá mức độ ảnh hưởng tích lũy của phóng xạ môi trường, nghề nghiệp: hiệu ứng trường diễn ở Hiroshima, Nagazaki, suối nước nóng ở Áo, thiết bị hạt nhân ở Đức, vùng phóng xạ tự nhiên ở Quảng Đông (Trung Quốc) Tổng kết 42 công trình nghiên cứu trên thế giới của Lloyd (1980) chính là bằng chứng hiện hữu nói lên vai trò của tham số sai hình NST trong việc đánh giá đúng thực chất ảnh hưởng của môi trường phóng xạ lên cơ thể con người [16], [18], [21], [65]

Hội đồng Cố vấn Đo liều Sinh học của IAEA khẳng định: “Mối liên quan liều - hiệu ứng sai hình NST ở tế bào lympho có giá trị định lượng tương đương trong trường hợp in vitro cũng như trong trường hợp in vivo” Hội nghị Quốc tế về đo liều sinh học tại Madrit, Tây Ban Nha (1990) khẳng định vai trò của kỹ thuật phân tích sai hình NST tế bào lympho người trong định liều sinh học Hội nghị cũng bổ sung khuyến cáo năm 1992 với nội dung “mọi phòng thí nghiệm đo liều sinh học phải sử dụng các đường cong liều – hiệu ứng riêng” Tính chất nhạy cảm của hiệu ứng sai hình NST ở tế bào lympho đối với liều lượng, suất liều và bản chất năng lượng của bức xạ là yếu tố dẫn đến khuyến cáo bổ sung trên [21], [36], [39], [80] Hội nghị hiệu ứng phóng xạ liều thấp ở Sevill (Tây Ban Nha), Versail (Pháp), Dublin (Ireland), Toronto (Canada) đặt vấn đề xác định liều giới hạn là một nhiệm vụ của công tác an toàn phóng xạ và

kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người được coi là một giải pháp để giải quyết nhiệm vụ đó Chuẩn liều - hiệu ứng ở vùng liều

thấp đang được IAEA và các phòng thí nghiệm thành viên triển khai, vùng liều thấp trở thành mối quan tâm đặc biệt vì càng ngày mức độ sử dụng các nguồn phóng xạ suất liều thấp càng phổ biến, mối quan tâm về phóng xạ môi trường cũng ngày càng cao [37], [52], [43], [60], [65]

Tại Việt Nam, các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình NST trong đo liều sinh học trong an toàn phóng xạ tại các cơ sở hạt nhân và nguồn phát xạ khác đã được tiến hành nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt Các công trình nghiên cứu của Trần Quế trên các nguồn bức xạ khác nhau

đã xây dựng được các đường chuẩn thực nghiệm liều - hiệu ứng ở vùng giới hạn liều cao với các nguồn bức xạ có tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân: Nguồn gamma Co60 suất liều 0,0125 Gy/s: y = 1,82D + 4,10D2 + C; Nguồn neutron nhiệt tại cột nhiệt lò phản ứng hạt nhân (PƯHN) với thông lượng nhiệt (Φth) = 1,40.109 n/cm2/s, thông lượng neutron cộng hưởng (Φepi) = 1,43.106n/cm2/s,

và bức xạ gamma suất liều 0,0083Gy/s Thành phần liều gồm 33,44% neutron nhiệt, 1,71% neutron cộng hưởng, 64,89 % liều gamma: y = 4,43D + 3,93D2 + C; Nguồn neutron nhiệt tại kênh số 3 lò PƯHN với (Φth) = 52,19.10-6n/cm2/s, (Φepi) = 1,43.10-6n/cm2/s, và bức xạ gamma suất liều 0,00002Gy/s Thành phần liều gồm 87,50 % neutron nhiệt, 2,40 % neutron cộng hưởng, 10,1 % liều gamma: y = 6,24 D + 0,98 D2 + C; Nguồn bức xạ kênh số 4 lò PƯHN với thành phần liều gồm neutron nhiệt 9,21%, neutron cộng hưởng 15,08 %, neutron nhanh chiếm 65,38 % và gamma: y = 34,15 D – 19,03 và y = 14,33 D + 2,12 D2 + C; Nguồn bức xạ gamma suất liều thấp (150 mGy/h) tại cột nhiệt khi lò dừng: y = 0,61 D + 5,25 D2 + C [9], [10], [14], [68], [69], [70] Việc xây dựng được các đường chuẩn liều – hiệu ứng sai hình NST tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt có giá trị trong công tác an toàn phóng xạ đã được đặt ra trong bối cảnh hiện nay tại Việt Nam Các kết quả bước đầu đã được vận dụng vào vào chương trình đo liều sinh học nhằm giải quyết các tình huống đánh giá an toàn phóng xạ, trong đó đã trực tiếp thực hiện phân tích định liều trong một số trường hợp sự cố nguồn công nghiệp, kĩ thuật viên vận hành nguồn chẩn đoán hình ảnh của bệnh viện

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tế bào lympho máu ngoại vi người

Bộ NST người ở metaphase thuộc lần phân chia nguyên nhiễm đầu tiên của

tế bào lympho máu ngoại vi người nuôi cấy in vitro được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu Năm mẫu máu toàn phần lấy từ 5 người khỏe mạnh chưa có tiền sử bệnh lý phải điều trị bằng liệu pháp chiếu phóng xạ, được xác nhận qua test kiểm tra sai hình nhiễm sắc thể với mức 1000 metaphase/mẫu Các mẫu máu được xử lý chống đông trong heparin và bảo quản 40

C/24 giờ trước khi chiếu xạ

2.1.2 Nguồn phóng xạ sử dụng trong nghiên cứu

Nguồn phát gamma đơn năng do đồng vị Co60, hoạt độ 592 Ci, năng lượng photon Eg = 1,25 MeV, LET = 2.0 KeV/µm, suất liều 125 mGy/h Được quản

lý bởi Phòng An toàn phóng xạ, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt

2.1.3 Các thiết bị nuôi cấy tế bào và phân tích số liệu

Các thiết bị nuôi cấy tế bào động vật và làm tiêu bản cố định nhiễm sắc thể Kính hiển vi huỳnh quang ELAB80i (NIKON) độ phóng đại 1500x, chụp ảnh

kỹ thuật số, phân tích được trên máy tính

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiếu mẫu, đo liều

Mỗi mẫu máu được sử dụng cho 1 tập hợp mẫu Máu toàn phần vô trùng chống đông bằng lithium heparin được chia ra 6 lọ dung tích 1 ml, dung tích máu 0,5 ml/lọ, số 1 là lọ dùng để đối chứng (0Gy), 5 lọ còn lại được đánh số phân bố trong dải liều từ 0,1 - 0,5Gy Mỗi lọ được gắn 1 liều kế nhiệt phát quang (TLD - thermal light dosimeter), chiếu mẫu được thực hiện trong hốc chiếu thiết kế đảm bảo trường liều đều, thời gian chiếu phụ thuộc vào liều được tính toán theo thiết kế thí nghiệm Liều hấp thụ của từng lọ chiếu được xác định bằng phương pháp đo nhiệt phát quang (TLD)

2.2.2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào lympho và làm tiêu bản hiển vi

Nuôi cấy tế bào sau chiếu xạ được thực hiện theo thường qui của nhóm cố vấn đo liều sinh học thuộc Cơ quan Năng lượng Nguyên tử Quốc tế (IAEA)

- Hóa chất

+ Môi trường nuôi cấy tế bào: Bột F10 (Diffco)

+ Lithium heparin 1000 000 E/ml (Giffco)

+ Phytohaemagglutinin (PHA) (Sigma)

+ Kháng sinh kanamicine

+ Huyết thanh thai bò (Diffco)

+ L-Glutamin (Giffco)

+ Colchicine (Giffco)

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Chuẩn bị môi trường gốc: 9,9gr bột F10/ 1000ml nước cất 2 lần, chỉnh PH bằng NaHCO3 đến PH 7.3, lọc vô trùng, bảo quản ở 400C

Chuẩn bị môi trường toàn phần: 100ml dung dịch F10 + 20ml huyết thanh + 5ml PHA + 1,25ml L-Glutamin + 1,25ml Heparin + 1ml kháng sinh Kanamicine

- Nuôi cấy tế bào

Mẫu máu toàn phần (0,5 ml) ở mỗi lọ sau khi chiếu xạ được nuôi cấy ở

370C trong 5ml môi trường toàn phần Thời gian nuôi cấy là 48h, 2giờ trước khi thu hoạch thêm vào 1ml dung dịch colchicin 10-5M để bắt giữ các tế bào đang phân chia ở metaphase của lần phân bào thứ nhất và ngăn chặn sự bắt đầu chu trình thứ hai

- Làm tiêu bản hiển vi

Huyền dịch sau cố định được nhỏ từng giọt lên lam kính tráng carnoy, đặt lên máy làm tiêu bản 370C /100 giây Sau khi ghi ký hiệu, tiêu bản được nhúng qua ethylic 70% /10 phút, sau đó đặt vào cốc nhuộm và đổ thuốc nhuộm vào (5% Giemsa stock trong đệm PBS) Thời gian nhuộm là 20 phút Rửa tiêu bản trong nước cất để loại thuốc nhuộm thừa, để khô tự nhiên Trong trường hợp cần bảo quản lâu dài, tiêu bản được gắn lamen

2.2.3 Phương pháp phân tích sai hình nhiễm sắc thể

Phân tích sai hình NST được tiến hành trên kính hiển vi quang học và ảnh

kỹ thuật số truyền qua máy tính Chỉ tiêu phân tích là các giá trị sinh học của hiệu ứng sai hình NST được hình thành, các giá trị định lượng hiệu ứng: Tần số phân bố sai hình NST qua từng mẫu chiếu, từng điểm chiếu

Việc ghi nhận sai hình NST trong phân tích được thực hiện bằng cách nhận dạng các kiểu sai hình nhiễm sắc thể kết hợp với việc kiểm tra các qui luật di truyền hình thành sai hình NST Bộ NST chứa NST bất thường được chụp ảnh trực tiếp nhờ máy ảnh kỹ thuật số gắn trên kính hiển vi huỳnh quang, hình ảnh được truyền qua máy tính, dữ liệu phân tích được lưu lại dưới dạng ảnh, tạo điều kiện cho việc nhận dạng các kiểu sai hình NST và so sánh hình ảnh sai hình NST thu nhận được ở các liều từ 0,1Gy đến 0,5Gy của nguồn bức xạ Gamma suất liều thấp

2 tâm 3 tâm Mảnh Dogleg Minute

Vòng Chuyển đoạn Đảo đoạn Đứt NStử Radical

Hình 2.1 Hình ảnh mô tả một số kiểu sai hình NST

Cơ chế phân loại của Savage được sử dụng để xác định kiểu sai hình nhiễm sắc thể: Mỗi kiểu sai hình nhiễm sắc thể thể hiện được các bằng chứng di truyền học về sự hình thành từ các tổn thương phân tử DNA Số lượng tâm động là bất biến trong Karyotype – bằng 46 Sự hình thành một sai hình hai tâm

luôn kèm theo mảnh không tâm: Trong trường hợp trao đổi hoàn toàn giữa 2 NST, tức là có sự “nối lại”của hai đoạn không mang tâm động của 2 NST thì một mảnh không tâm sẽ đi kèm với một sai hình hai tâm Số đơn vị đếm được trong metaphase là 46 Ngược lại, trong trường hợp trao đổi không hoàn toàn thì sẽ có 2 mảnh không tâm đi kèm với một sai hình hai tâm, lúc này sẽ có 47 đơn vị có mặt trong một metaphase Một sai hình kiểu ring cũng sẽ kèm theo một mảnh không tâm (số đơn vị là 47), hoặc 2 mảnh không tâm (số đơn vị là 48) Một sai hình 3 tâm kèm theo ít nhất hai mảnh không tâm Trong trường hợp mảnh không tâm xuất hiện trong một metaphase không kèm theo sai hình

đa tâm hoặc ring thì số lượng mảnh không tâm sẽ bằng số đơn vị vượt quá 46

2.2.4 Phương pháp toán học

- Số liệu được thu thập theo phương pháp thống kê Sử dụng chương trình Excel, phần mềm SPSS (phiên bản 16.0) để xử lý số liệu theo các bước:

(1): Phân tích, thống kê tần số sai hình hai tâm ở các liều khác nhau của

nguồn bức xạ nghiên cứu

(2): Lập bảng quan hệ liều - tần số sai hình hai tâm

(3): Xác định phương trình phân bố tổng quát

Phương trình tổng quát được xác định qua việc chọn hệ số tương quan tuyến tính hay hệ số tương quan bình phương, giá trị hệ số tương quan nào gần tới 1 hơn thì phương trình tổng là phương trình phù hợp với tương quan đó + Hệ số tương quan tuyến tính:

r(y,d) = [åinDiYi - (åin Di åin Yi)/n] / {[åin Di2 – (åin Di)2]1/2[åin Yi2 – (åin Yi)2]1/2}

Trong đó Yi là tần số sai hình hai tâm phân tích được ở mẫu chiếu liều Di;

ni là số lần chiếu mẫu tại liều Di; n là tổng số lần chiếu mẫu của một tập hợp Phương trình tổng quát y = kD + b

+ Hệ số tương quan bình phương:

Tương quan bình phương là dạng có thể tuyến tính hóa bởi vậy nếu đặt D2

=

Z sẽ được dạng tuyến tính hóa Y = kZ + C

Lúc này hệ số tương quan r(y,z) được tính:

r(y,z) = [åinZiYi - (åin Zi åin Yi)/n] /{[åin Zi2 – (åin Zi)2]1/2[åin Yi2 – (åin

Yi)2]1/2} Phương trình tổng quát: y = aD + bD2

+ C

(4): Xác định phương trình phân bố hồi qui

Xác định phương trình phân bố hồi qui tức là xác định các hệ số hồi qui thực nghiệm của phương trình phân bố tổng quát đã chọn

+ Hệ số hồi quy cho phương trình bậc nhất: y = kD + b

.Gy-1, đơn vị của hệ số β là 10-2

.Gy-2

Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2009 đến 11/2009 tại Phòng Công nghệ Sinh học, Viện nghiên cứu Hạt nhân, Đà Lạt, Việt nam

% số mitose (∑M) /số tế bào (∑TB), kết quả phân tích chỉ số phân bào nguyên nhiễm cho các tập hợp được thể hiện ở các bảng 3.1.

Bảng 3.1a Kết quả phân tích MI đối với tập hợp mẫu A

MI giảm ở liều 0,4 và 0,5Gy Sử dụng phân tích phương sai theo một yếu tố tác động để khảo sát sự ảnh hưởng của bức xạ gamma từ nguồn Co60, suất liều 125mGy/h, giới hạn liều 0,1Gy đến 0,5Gy đến sự phân bào Phân tích này dựa trên việc so sánh trung bình MI của các quan sát ở từng mức liều, nếu các trung bình này khác nhau ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê thì có nghĩa là ở giới hạn liều 0,1Gy đến 0,5Gy bức xạ gamma của nguồn nghiên cứu có ảnh hưởng đến chỉ số phân bào Kiểm định giả thiết H0: Trung bình MI của mỗi điểm liều thuộc tập hợp A bằng nhau; đối thiết H1: Trung bình MI của mỗi điểm liều thuộc tập hợp A không bằng nhau

QA: Tổng bình phương độ lệch giữa các nhóm với nhau