nghiên cứu về bệnh PRSV trên bầu bí

Bệnh khảm lá bầu bí đã được xác định do PRSV gây ra.PRSV có bộ gen RNA thuộc chi Potyvirus

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa, đất đai màu mỡ rất thuận lợi để phát triển nông nghiệp Các vùng trồng rau màu đã và đang phát triển theo hướng chuyên canh với quy mô lớn nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng trong nước và xuất khẩu ngày càng tăng Tuy vậy, năng suất nông sản của chúng ta vẫn bấp bênh theo từng vụ, từng năm do ảnh hưởng của thời tiết, thiên tai, dịch hại mà đặc biệt là do các bệnh hại, trong đó bệnh virus gây thiệt hại đáng kể

Bệnh virus gây thiệt hại lớn nhất không phải là làm cho cây trồng bị chết nhanh chóng mà chính là chúng làm cho cây bị thoái hóa, giảm sức sống, dần dần tàn lụi Ở cây lâu năm một số virus gây nên hiện tượng mất triệu chứng làm cho người sản xuất nhầm lẫn, không phát hiện được bệnh, đến lúc cây tàn lụi, khi đó người sản xuất mới biết thì đã quá muộn Ngoài ảnh hưởng đến sức sống của cây, bệnh virus còn ảnh hưởng lớn tới sản phẩm cuối cùng như làm biến dạng quả, giảm năng suất và chất lượng quả

Trong số cây trồng nông nghiệp Việt Nam cũng như trên thế giới, cây rau

ăn quả thuộc họ bầu bí được xem là cây trồng quan trọng và phổ biến vì dễ trồng

và có giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp lương thực thực phẩm cho người và làm thức ăn chăn nuôi…

Trên cây họ bầu bí đang phải đối mặt với nhóm bệnh quan trọng là bệnh virus Bệnh khảm lá rất phổ biến, đặc biệt trên các cây bí ngô, bí xanh dưa chuột, bí ngồi và các loại dưa Gọi là bệnh khảm nhưng triệu chứng khác kèm theo thường là cây sinh trưởng còi cọc, lá và quả bị biến dạng dữ dội Hậu quả là năng suất, chất lượng cũng như giá trị thẩm mỹ của quả bị giảm mạnh

Một số các biện pháp phòng chống virus đã từng được thử nghiệm trên các đối tượng virus bao gồm phòng chống vector dùng bẫy xua đuổi hoặc tạo tính kháng tập nhiễm hệ thống (Systemic Acquired Resystance, SAR) bằng cách

xử lý cây với một số hóa chất như Salicylic Acid (SA) và Methyl (BION) Tính kháng tập nhiễm hệ thống là tính kháng phổ rộng, chống

Acybenzolar-S-được nhiều tác nhân gây bệnh kể cả virus Tuy nhiên các biện pháp này chưa từng được thử nghiệm đối với Papaya ringspot virus.

Bệnh khảm lá Papaya ringspot virus (PRSV) trên bầu bí được phát hiện bởi Webb và Scott (1965) PRSV là một virus có bộ gen RNA, thuộc chi

Potyvirus, họ Potyviridae Virus PRSV có phổ ký chủ hẹp Ngoài tự nhiên,

PRSV không truyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngoài tự nhiên bằng nhiều loài rệp muội họ Aphididae theo kiểu không bền vững

Bệnh do PRSV trên các cây họ bầu bí rất phổ biến, hiện không có biện pháp phòng chống do bệnh lan truyền theo kiểu không bền vững nên không thể phòng chống vector Có thể phòng chống hiệu quả bằng giống kháng nhưng hiện chưa có giống kháng nào được xác định tại Việt Nam

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, được sự phân công của Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của TS Hà Viết Cường, tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu bệnh khảm lá Papaya ringspot virus (PRSV) trên cây bầu bí tại Gia Lâm”

- Điều tra thành phần bệnh hại trên cây bầu bí tại Gia Lâm

- Đánh giá tính kháng của bệnh khảm lá trên tập đoàn giống dưa chuột và

bí ngô tại Khoa Nông học

- Xác định virus thu thập ngoài đồng ruộng bằng ELISA (PRSV, ZYMV, CMV) và begomovirus bằng PCR

- Lây nhiễm nhân tạo bằng tiếp xúc cơ học virus PRSV trên một số giống tiềm năng kháng trông điều kiện nhà lưới

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm chung chi Potyvirus

2.1.1 Phân loại

Họ Potyviridae (tên có nguồn gốc từ Potato vius Y) là họ virus thực vật lớn nhất với trên 200 loài (bảng 2.1) Tất cả thành viên trong họ đều có bộ gen RNA sợi đơn, cực dương, có phân tử dạng sợi mềm đường kính 11-15 nm và dài 650-950 nm đối với các virus có bộ gen đơn ( Hình 2.1) và 200-300 x 500-600

nm và dài 650-950 nm đối với các virus có bộ gen kép

Hiện nay, các potyvirus được phân loại thành 6 chi trên cơ sở tổ chức bộ gen, vector lan truyền, so sánh trình tự Đặc điểm bộ gen, mối quan hệ vector và

số loài của các chi được trình bày ở bảng 2.1 Trong số 6 chi, chi Potyvirus là quan trọng nhất, cả về số lượng loài cũng như các bệnh có ý nghĩa kinh tế mà chúng gây ra

Các virus của 5 chi Potyvirus, Macluravirus, Ipomovirus, Rymovirus và Tritimovirus có bộ gen không phân đoạn tức bộ gen chỉ gồm 1 phân tử RNA duy nhất nên gọi là virus có bộ gen đơn Các virus của chi còn lại, chi Bymovirus, có bộ gen kép gồm 2 phân tử RNA-1, và RNA-2 Đối với các bymovirus, phân tử RNA-1 tương đương với 2/3 kính thước tính từ đầu 3’ còn phân tử RNA-2 tương đương phần còn lại của bộ gen của các virus có bộ gen đơn

Bảng 2.1 Phân loại họ Potyviridae

loài

2.Ipomovirus Sweet Potato mild mottle

Bọ phấn( Không bền vững)

4

3.Macluravirus Maclura mosaic virus

Rệp( không bền vững)

4

4.Rymovirus Ryegrass mosaic virus

Nhện(bền vững hoàn toàn)

3

5.Tritimovirus Wheat streak mosaic virus

Nhện(bền vững hoàn toàn)

4

6.Bymovirus Barley yellow mosaic

2.1.2 Đặc điểm phân tử virus (virion)

Phân tử potyvirus có hình sợi mềm, kích thước 11-15 x 650-950 nm Mỗi phân tử virion được cấu tạo từ 1700-2000 tiểu phần protein sắp xếp theo kiểu xoắn đối xứng xung quanh phân tử RNA genome

http://viralzone.expasy.org/all_by_species/50.html

Hình 2.1 Hình thái virion của potyvirus

Acid nucleic: Tất cả các potyvirus có chứa 1 phân tử RNA genome sợi Tổ chức bộ gen của các potyvirus giống nhau, tính từ trái sang phải là:

• Đầu 5’ chứa 1 vùng không dịch mã (5’UTR)

• Một ORF đơn, lớn gọi là ORF chính (major ORF)

• Đầu 3’ chứa 1 vùng không dịch mã (3’UTR) và 1 chuỗi polyA

http://viralzone.expasy.org/all_by_species/50.html

Hình 2.2 Tổ chức bộ gen của các potyvirus

2.1.3 Lan truyền

Lan truyền ngoài tự nhiên bằng rệp muội theo kiểu không bền vững

Nhiều virus truyền qua vật liệu giống như củ giống (PVY - khoai tây; OYDV, LYSV, SYSV - hành tỏi), hạt (BCMV - đậu đỗ), qua phấn hoa (BCMV - đậu đỗ)

Có thể truyền qua tiếp xúc cơ học

PRSV được chia làm hai dạng PRSV-w và PRSV-p Trong đó, PRSV-p xâm nhiễm và gây hại trên hầu hết các loài đu đủ và cây thuộc họ bầu bí trên thế giới, còn PRSV-w chỉ xâm nhiễm trên những cây thuộc họ bầu bí, không xâm nhiễm trên cây đu đủ Cây con mới trồng dễ bị nhiễm bệnh.

2.2.2 Môi giới truyền bệnh

PRSV là một loài vi sinh vật sống kí sinh Chúng lây truyền từ cây chủ này sang cây chủ khác thông qua một vector Đó là hai loài aphids (rầy mềm hay rệp muội), Aphis gossypii (rệp bông) và Myzus persicae (rệp đào), chúng mang theo virus trên cơ thể và truyền sang cây khi chúng chích hút cây, và truyền theo phương thức không bền vững (non-persistant) Ngoài ra, bệnh còn có thể bị lây truyền từ cây bệnh sang cây lành nếu con người chạm vào cây bệnh rồi sau đó chạm vào cây lành hoặc lây truyền trực tiếp qua các vết thương cơ học Virus không truyền qua hạt của quả bị bệnh Đồng thời virus không có khả năng tồn tại trong môi trường đất và trong các mô cây đã bị chết (Purcifull et al., 1984)

2.2.3 Triệu chứng

Bệnh gây hiện tượng khảm ở lá cây, lá có nhiều màu vàng xanh lẫn lộn, khảm càng nặng lá biến sang màu vàng Lá bị bệnh có kích thước nhỏ lại biến dạng, nhăn Quả nhỏ, biến dạng, chai sượng

2.2.4 Biện pháp phòng chống

Hiện nay chưa có biện pháp phòng trừ hữu hiệu bệnh này Trước mắt có thể

áp dụng một số biện pháp phòng trị sau:

- Tạo nguồn cây sạch bệnh trong vườn ươm cách ly chống rệp

- Không trồng cây họ bầu bí ở những vùng đã nhiễm bệnh

- Phun thuốc hoá học kết hợp biện pháp hoá học để diệt côn trùng truyền bệnh, nhất là rệp bông và rệp đào Một số thuốc hữu hiệu trừ rệp: Bassa, Trebon, Pegasus, Applaud, Sumicidin, Supracid, Zolone

- Thực hiện chọn lọc, vệ sinh vườn bầu bí thường xuyên để loại bỏ cây bệnh, tránh lây lan

2.3 Nguồn gốc xuất xứ và tình hình sản xuất cây họ bầu bí

Dưa chuột (Cucumis sativus) là một cây trồng phổ biến trong họ bầu bí Cucurbitaceae, là loại rau ăn quả thương mại quan trọng, nó được trồng lâu đời trên thế giới và trở thành thực phẩm của nhiều nước Những nước dẫn đầu

về diện tích gieo trồng và năng suất là: Trung Quốc, Nga, Nhật Bản, Mỹ, Hà Lan, Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Ai Cập và Tây Ban Nha

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất dưa chuột của một số nước trên thế giới

qua các năm 2006, 2007

Quốc gia

Diện tích (nghìn ha) Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (nghìn tấn)

Bí ngô (Curcurbita pepo L var pepo) trồng ở hầu hết các hạt của California, sản xuất có xu hướng tập trung gần khu dân cư bởi vì hầu hết các quả

bí ngô được bán tại thị trường địa phương hoặc trực tiếp cho người tiêu dùng Bí ngô có giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng khá cao: Trong 100g thịt bí ngô có 0,9g protein, 5 - 6g gluxit, ngoài ra còn có nhiều vitamin như B1, B2, PP, B6 đặc biệt có 400g vitamin B5 và có cả các axit béo quý như linoleic, linolenic, 28mg beta - caroten Bí ngô còn có nhiều nguyên tố vi lượng và các axit amin như: alanine, valin, leucin, cystin, lysin Hạt bí ngô chứa nhiều dầu béo và có tác dụng trừ giun sán rất tốt Trong 100g màng đỏ bao quanh hạt có tới 250 mg beta - caroten và ngay cả trong 100g lá tươi của bí ngô cũng chứa 1 mg beta - caroten

Dưa hấu (Citrullus lanatus) là cây trồng chính ở miền Nam nước Mỹ Trên thế giới, trên 10 virus được biết gây hại cho sản xuất dưa hấu (Provvidenti, 1986b) Hầu hết những virus gây bệnh cho dưa hấu ở Mỹ do Papaya ringspot virus – type W (PRSV-W), watermelon mosaic virus (WMV) và zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)

2.3.1 Thành phần bệnh virus trên cây họ bầu bí

Bệnh khảm lá Papaya ringspot virus (PRSV) trên bầu bí được phát hiện bởi Webb và Scott (1965) Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) làm cho cây trồng còi cọc, phiến lá nhỏ và không đều, lá khảm chỗ tối chỗ xanh chỗ phồng lên Quả biến dạng, nổi u và mất màu

PRSV-W trước đây có tên là Watermelon mosaic virus (WMV-1) Nó là một potyvirus, với sợi dài 760-800 x 12 nm và có lõi là RNA Phổ ký chủ của PRSV-W là họ bầu bí PRSV-W có vector truyền bệnh là các loài rệp muội Cucumber mosaic virus (CMV) được tìm thấy khắp nơi trên thế giới và gây bệnh trên hơn 800 loài cây (cây trồng và cây dại), bao gồm họ bầu bí

CMV làm cây phát triển còi cọc, lá bị biến dạng, giảm kích thước, quăn và cuộn lại, có vết khảm vàng hoặc vết chấm lốm đốm với các khoảng vàng Lá

non trên đỉnh sinh trưởng có thể biến dạng hình nơ Hoa có thể bị méo mó và có cánh hoa xanh Quả nhỏ, mất mã và mất màu

CMV là một cucumovirus có dạng hình cầu đường kính 29 nm và bao gồm

3 sợi đơn RNAs Virus được truyền bởi các loài rệp muội

Squash leaf curl virus (SLCV) được tìm thấy đầu tiên từ những năm 1970s ở vùng Tây Nam của nước Mỹ Ngay sau đó virus này được tìm thấy trên một các loài bầu bí trồng ở vùng nước Mỹ, Mexico và châu Mỹ

SLCV gây triệu chứng trên lá vết khảm vàng sang xen lẫn hoặc các vết chấm lốm đốm Lá bị quăn, nhỏ Cây còi cọc, kém phát triển Hoa nở muộn hoặc rụng Quả không phát triển, biến dạng, mất màu

SLCV là một geminivirus, có sợi dài 20 x 30 nm và axit nucleic dạng sợi đơn DNA Vector truyền bệnh là bọ phấn và được phát hiện đầu tiên trên họ bầu bí Squash mosaic virus (SqMV) được biết từ rất sớm của những năm 1990s

Ở nhiều nước trên thế giới giảm sút bởi sử dụng hạt bị virus

Squash mosaic virus (SqMV) có triệu chứng thay đổi cực độ Lá khảm đậm nhạt, gân lá xanh thẫm, đốm hình nhẫn và giống với một số virus khác Lá mầm cũng có triệu chứng Cây còi cọc và quả xấu xí, mất màu SqMV thuộc nhóm comovirus, kích thước sợi virus 28-30nm Axit nucleic có 2 sợi đơn RNAs Các chủng khác nhau gây ra các triệu chứng khác nhau trên các loài bầu

bí khác nhau Vector của virus này là bọ cánh cứng có sọc và có đốm (Acalymma trivittatum), (Diabrotica undecimpunctata) Virus này bền vững và

có thể lây truyền trong suốt quá trình sản xuất và thu hoạch Ký chủ của virus này là các loài thuộc họ bầu bí và họ rau muối

WMV thuộc nhóm potyvirus với sợi dài 730–765 nm và axit nucleic dạng RNA WMV gây hại trên cây họ bầu bí, họ đậu và các cây trồng khác; ký chủ của virus khoảng trên 150 loài Vector truyền bệnh là rệp muội

Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) là một virus hại bầu bí quan trọng trên thế giới gây mất mùa màng Bệnh phát hiện đầu tiên tại miền Bắc Italy và miền Nam nước Pháp những năm cuối 1970s tới 1980s và tìm thấy ở UK năm

1987 Lá bị phồng lên và khảm xanh thẫm, lá biến dạng, có khía, răng cưa, chết hoại và các triệu chứng khác Cây phát triển còi cọc, lóng ngắn Quả biến dạng, nổi u, phồng và nứt

ZYMV thuộc nhóm potyvirus với sợi dài 750 x 11 nm và axit nucleic dạng sợi đơn RNA Bao gồm một số chủng khác nhau ZYMV được truyền bởi rệp muội, hạt có vỏ mỏng và qua vết cắt trong quá trình thu hoạch

Bảng 2.3 Thành phần bệnh virus gây hại trên bầu bí đã được xác định

2 Squash mosaic virus SqMV Comoviridae Comovirus Bọ cánh cứng

3 Squash leaf curl virus SLCV Geminiviridae Begomovirus Bọ phấn

2.3.2 Tình hình sản xuất bầu bí ở Việt Nam

Các giống cây rau và bầu bí được trồng phổ biến ở nước ta như: bí ngô, bí ngồi, dưa chuột (dưa leo), dưa hấu… Riêng đối với dưa chuột được xem là một trong những loại rau chủ lực, có diện tích 19.874 ha, năng suất 16,88 tấn/ha, sản lượng 33.537 tấn chỉ đứng sau cà chua

Các vùng trồng dưa chuột lớn của cả nước bao gồm các tỉnh phía Bắc thuộc vùng đồng bằng sông Hồng Phía Nam, các huyện ngoại thành TP

Hồ Chí Minh, đồng bằng sông Cữu Long như Tân Hiệp - Tiền Giang, Châu Thành - Cần Thơ, Vĩnh Châu - Sóc Trăng Miền Trung và Tây Nguyên gồm vùng rau truyền thống như Đà Lạt, Đơn Dương, Đức Trọng (Lâm Đồng), các tỉnh duyên hải miền Trung ( Thừa Thiên Huế )

Bảng 2.4 Diện tích, năng suất và sản lượng một số loại rau chủ lực năm 2004 Loại rau Diện tích (ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (tấn)

Nguồn: Tổng cục thống kê năm 2004

2.3.3 Những nghiên cứu về bệnh virus trên cây họ bầu bí ở Việt Nam

Năm 1991 – 1992 Vũ Triệu Mân và Lecoq (Inra Pháp) và các CTV đã xác định bằng phương pháp ELISA (tại ĐHNN I) các virus PRSV, WMMV 2, CMV, SqMN, ZyMV có mặt trên 24 loài cây họ bầu bí, cà chua, họ đậu…ở miền Bắc Việt Nam

Ở Việt Nam, cây bầu bí bị rất nhiều loại virus tấn công với nhiều triệu chứng khác nhau do vậy khó có thể phân biệt được virus gây bệnh nếu chỉ dựa vào triệu chứng Theo kết quả nghiên cứu của Vũ Triệu Mân (1995) có nhiều loài virus cùng gây hại trên bầu bí, trong đó điển hình là những loài sau (bảng 2.5)

Bảng 2.5: Mức độ phổ biến của những loài virus trên cây trông họ bầu bí

Cây dưa hấu 1,888 1,157 0,037 0,001 0,026

Các virus TMV, CMV, PRSV, PMV,…đã được nghiên cứu và sản xuất thử kháng huyết thanh tại trường ĐHNN I Kỹ thuật ELISA được sử dụng từ

1990, kỹ thuật PCR bắt đầu áp dụng từ năm 1995, để chẩn đoán bệnh

2.4 Tính kháng bệnh virus PRSV trên cây họ bầu bí

Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) trước đây có tên là Watermelon mosaic virus (WMV-1), gây ảnh hưởng tới các loài cây trồng nông nghiệp quan trọng của họ bầu bí và lợi ích kinh tế bởi sức phá hoại của chúng (Provvidenti, 1993) PRSV-W được lan truyền theo kiểu bán bền vững bởi 24 loài rệp trong

15 chi Khả năng chống virus đã được xác định trong dưa chuột, dưa hấu, bí đao,

bí ngô và mướp (Provvidenti, 1993) Nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng dưa hấu có tính kháng rất tốt đối với PRSV-W

Những nghiên cứu được phát triển chắc chắn và phù hợp để kháng

PRSV-W Các chủng của PRSV-W là 1637, 1870, 2030, 2038, 2040, 2052, 2169, 2201,

2207, và W-1A được lây nhiễm vào bí xanh và được sử dụng trong tiêm chủng Cây trồng được xếp theo cấp từ 0 – 9 tùy theo mỗi triệu chứng chết hoại lá, khảm lá, biến dạng lá Họ đã tìm được phương pháp tốt nhất để kháng PRSV-W

là trồng cây con trong chậu vuông cạnh 100mm (hoặc 55mm nếu nảy mầm đồng đều) và lây nhiễm chủng 2052 ở giai đoạn lá thật đầu tiên bằng phương pháp cơ học Lá bí bệnh được nghiền trong cối sứ với tỷ lệ 1 : 5 (1g lá với 5 ml đệm phosphate 0.02M, pH 7.0)

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh virus Papaya ringspot và tính kháng trên cây họ bầu bí

3.1.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2015

3.1.3 Địa điểm điều tra xác định thành phần bệnh

- Điều tra thành phần bệnh hại ở một số vùng trồng bầu bí tại Gia Lâm

- Địa điểm đánh giá các dòng/giống kháng trong điều kiện đồng ruộng: Khu ruộng thí nghiệm dưa chuột khoa nông học

- Địa điểm thực hiện thí nghiệ đánh giá tính kháng trong điều kiện nhà lưới: Nhà lưới Trung tâm bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Địa điểm thí nghiệm trong phòng: Trung tâm bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Các dòng/giống bầu bí

- virus PRSV (nguồn cây bầu bí)

- Mẫu cây bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm điều tra, sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silicagel để kiểm tra virus

3.2.1 Thiết bị nghiên cứu

Máy đọc bản ELISA, máy PCR, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ định ôn

3.2.2 Dụng cụ nghiên cứu

- Pipet tự động 1 đầu côn: 10 - 20 µm, 100 µm, 200 µm, v.v

- Ống đong 10 - 1000 ml

- Ống falcon 15 – 50 ml

- Bình thuỷ tinh loại 50 - 1000 ml

- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Điều tra đồng ruộng

• Phương pháp điều tra thành phần bệnh hại bầu bí ở ruộng sản xuất:

Áp dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo “Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện Bảo vệ thực vật Chọn ngẫu nhiên 1 ruộng đại diện cho giống, đại diện cho giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây Điều tra theo phương pháp 5 điểm trên đường chéo góc (cách

bờ 2 mét) mỗi điểm điều tra từ 50 - 100 cây đối với ruộng có diện tích lớn, điều tra 100% số cây đối với ruộng có diện tích nhỏ

Theo dõi định kỳ 1 tháng một lần, thu thập số liệu và tính tỷ lệ bệnh Quan sát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh

• Phương pháp thu thập mẫu lá bệnh virus:

Mẫu thu đựng riêng trong từng túi có ghi đầy đủ các thông tin sau:

+ Địa điểm ruộng

+ Thời gian lấy mẫu

+ Đặc điểm triệu chứng bệnh

+ Tỷ lệ nhiễm bệnh chung cả ruộng

• Phương pháp bảo quản mẫu bệnh virus:

Có hai phương pháp bảo quản mẫu: bảo quản khô và bảo quản tươi

+ Bảo quản khô: Mẫu thu về được để trong túi chứa hạt Silicagel Thay hạt Silicagel đến khi mẫu khô

+ Bảo quản tươi: Mẫu thu về được để nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -20 C ở Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới

Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, chọn những lá có triệu chứng điển hình đem về bảo quản khô bằng hạt Silicagel

3.3.2 Đánh giá tính kháng trong kiện đồng ruộng

• Ruộng thí nghiệm gồm 46 giống dưa chuột do Bộ môn Rau hoa quả - cảnh quan trồng tại Khoa Nông học

•Điều tra:

+Đánh dấu tất cả các cây trong ruộng thí nghiệm

+Điều tra định kỳ 1 tháng 1 lần từ giai đoạn cây con đến thu hoạch

+Cấp 3: Hầu hết các lá khảm dữ dội, các đốm biến vàng liên kết với nhau

+Cấp 4: Hầu hết các lá khảm dữ dội, mỗi lá ít nhất có 50% diện tích lá biến dạng dữ dội

+Cấp 5: Các lá có triệu chứng khảm dữ dội, các đốm biến vàng liên kết với nhau và biến dạng dữ dội

•Các giống điều tra có tỷ lệ nhiễm bệnh virus hoặc tỷ lệ cấp độ bệnh trung bình thấp được xem là kháng hơn

•Thu mẫu có triệu chứng điển hình và kiểm tra bằng phương pháp ELISA gián tiếp, các giống có phản ứng dương (+) là giống nhiễm PRSV giống có phản ứng (-) là giống kháng với PRSV

3.3.3 Đánh giá tính kháng trong điều kiện nhà lưới

1 Phương pháp lây nhiễm:

a Giá thể gieo cây thí nghiệm

- Đất gieo trồng cây thí nghiệm được ủ trong formol 5 ngày để tiêu diệt các nguồn bệnh có trong đất thí nghiệm, có che phủ nilông, sau đó bỏ nilông ra cho đất thoáng, sau 2 ngày có thể sử dụng Đất sau khi ủ trong formol được bổ sung phân bón vi sinh và vỏ trấu hun trước khi gieo cây thí nghiệm

- Đất được đập vụn trộn với xơ dừa và trấu hun với tỷ lệ 4:1:1 (4 đất: 1 xơ dừa: 1 trấu hun)

- Hỗn hợp giá thể được phơi 1 – 2 nắng nhằm hạn chế 1 số loại nấm đất hại cây con

- Cho giá thể vào các chậu nhựa có đục lỗ

- cây bầu bí giai đoạn lá mầm bắt đầu hình thành lá thật (khoảng 1 tuần sau

- Dùng tăm bông chấm vào dịch hỗn hợp có chứa virus trên rồi sát nhẹ lên

lá cây theo chiều từ cuống lá đến chóp lá Sau thời gian lây nhiễm 30 phút, dùng bình xịt có chứa nước cất rửa dịch chiết và bột carborandum 600 Mesh bám trên

bề mặt lá để thuận lợi cho việc quan sát triệu chứng bệnh sau này được rõ ràng

- Cây thí nghiệm đặt trong nhà lưới chống côn trùng, thực hiện chăm sóc cây và theo dõi triệu chứng biểu hiện bệnh của cây lây nhiễm Ghi chép, quan sát mô tả và đánh giá kết quả các chỉ tiêu theo dõi

2 Cách đánh giá:

- Qua điều tra thu thập, chọn lọc một số giống có khả năng kháng bệnh virus mỗi giống trồng 30 cây

- Thiết kế thí nghiệm theo kiểu RCBD với 3 lần nhắc lại

- Lây nhiễm nhân tạo, đánh giá mức độ bệnh qua 4 tuần sau lây nhiễm theo thang phân cấp 5 cấp

3.3.4 Phương pháp kiểm tra ELISA gián tiếp phát hiện PRSV, ZYMV, CMV

3.3.4.1 Nguồn kháng huyết thanh/kháng thể

3.3.4.1.1 Phương pháp thực hiện

Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp dựa theo tài liệu mô tả của Green (1991) và Vũ Triệu Mân (2003), có các bước sau:

Bước 1: Nghiền mẫu

Tiến hành nghiền mẫu trong dung dịch đệm Carbonate pH 9,6 với tỷ lệ 0,5

g lá/1 ml dung dịch đệm

Nghiền mẫu đối chứng dương

Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100 µl 0l/giếng Sau đó để bản ELISA vào hộp

ẩm và ủ qua một đêm ở tủ lạnh thường

Bước 2: Rửa bản ELISA

Sau khi ủ qua đêm, sáng hôm sau đem bản ELISA đi rửa (trước khi rửa vảy mạnh bản ELISA để loại hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần bằng đệm PBS– T, mỗi lần cách nhau 3 – 4 phút Mỗi lần rửa bản ELISA đều vảy mạnh để loại hết đệm PBS – T ra khỏi các giếng, sau đó mới tiến hành nhỏ đệm PBS – T mới vào

để rửa tiếp

Ủ bản ELISA ở 370C trong 45 phút

Bước 3: Cố định kháng thể thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA

Nghiền lá cây khỏe trong dung dịch đệm PBST – PO với tỷ lệ 1 g lá/30 ml dung dịch đệm PBST – PO

Lọc lấy dịch cây khỏe, hòa kháng huyết thanh của virus PRSV với tỷ lệ 1/500

Nhỏ dịch cây khỏe + kháng huyết thanh của PRSV vào bản ELISA, mỗi giếng nhỏ 100 µl

Để bản ELISA trong hộp ẩm rồi đem ủ ở 370C trong 2 giờ

Bước 4: Hòa kháng thể đơn dòng IgG (thỏ) của hãng Sigma với tỷ

Bước 6: Đánh giá kết quả

Để bản ELISA trong hộp ẩm, rồi để trong tối 2 giờ Sau đó đánh giá kết quả bằng mắt thường và đo trị số ELISA (OD) ở bước sóng 405 nm Các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng (+) Giếng không có màu là cây không

bị nhiễm bệnh Đọc kết quả tiếp bằng cách đưa vào máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm

3.3.5 Phương pháp kiểm tra PCR

Bước 2: Hòa loãng dịch nghiền 50 lần với đệm Tris 0,1M, pH 8 (5 μl dịch nghiền hòa loãng với 245 μl đệm Tris)

Bước 3: Lưu trữ mẫu trong tủ lạnh -20oC

100 ml dung dịch gel cho 4µl, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng

- Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 40 C thì đổ vào khuôn có đặt lược tạo lỗ khuôn Để khuôn ở nhiệt độ phòng

- Lấy các tube 0,5mL đã hấp khử trùng, đánh số thứ tự Cho vào mỗi tube 4

µl Loading Dye X6, đảo đều và Spin trong 5 giây

- Cắm nguồn điện cho máy điện di, đặt ở hiệu điện thế 100V trong 25 – 30 phút, tắt máy điện di, đặt bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại, quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh

3.3.6 Phương pháp tính và xử lý số liệu

- Tỷ lệ bệnh : TLB (%) = ×

b a

100

- Trong đó: a: Số cây có triệu chứng nhiễm bệnh virus.

b: Tổng số cây điều tra

ti = thời gian tồn tại lần đo thứ i

- Số liệu thu thập được xử lý trong Microsoft Office Excel

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Điều tra thành phần bệnh hại trên cây bầu bí tại huyện Gia Lâm vụ

Bảng 4.1 Tình hình bệnh hại bầu bí một số xã tại huyện Gia Lâm

vụ xuân hè 2015

ĐOẠN CÂY SỐ Virus TỈ LỆ BỆNH HẠI (%)

(khảm, nhăn)

Virus (khảm, biến vàng)

Phấn trắng

Sương mai

bệnh sương mai Trong các bệnh virus gây hại trên các cây họ bầu bí được điều tra có 2 triệu chứng điển hình nhất là khảm nhăn và khảm biến vàng.

Trên các địa điểm điều tra, nhìn chung các bệnh do virus gây ra trên cây họ bầu bí vụ xuân hè 2015 khá phổ biến, trong 9 ruộng ở 3 xã điều tra đều thấy xuất hiện virus gây bệnh khảm nhăn lá (hình 4.1) với tỷ lệ bệnh cao nhất là 38.3% tại ruộng dưa chuột thứ 2 của xã Cổ Bi, thấp nhất ở ruộng bí ngô thứ 3 tại xã Đa Tốn là 10.7%

Do điều kiện thời tiết không thích hợp nên bệnh phấn trắng hay sương mai tuy có phát triển trên các ruộng điều tra nhưng tỷ lệ bệnh và mức độ gây hại cũng không đáng kể

Virus khảm biến vàng trên bí ngô Phấn trắng trên dưa chuột

Khảm nhăn trên dưa chuột Sương mai trên dưa chuột Hình 4.1 Một số bệnh gây hại trên cây họ bầu bí tại Gia Lâm

4.2 Đánh giá tính kháng đồng ruộng đối với virus PRSV của tập đoàn

giống dưa chuột trồng tại khoa Nông học vụ đông năm 2014

4.2.1 Xác định bệnh virus chính trên tập đoàn giống dưa chuột vụ đông 2014 bằng phương pháp ELISA

Tập đoàn giống dưa chuột có 46 giống được bộ môn Rau- hoa quả thu thập

từ các tỉnh miền núi và đồng bằng Bắc Bộ gieo trồng tại khu ruộng thí nghiệm của khoa Nông học để đánh giá năng suất và một số đặc điểm nông sinh học của các giống thuộc tập đoàn này Trong vụ đông năm 2014 các bệnh hại làm ảnh hưởng đến sức sống và năng suất của các giống, trong đó bệnh virus gây hại khá nghiêm trọng do các bệnh virus gây ra vẫn chưa có biện pháp nào phòng chống hiệu quả ở Việt Nam

Tại Việt Nam, có ít nhất 4 virus là PRSV (Papaya ringspot virus), ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus) và SqLCCNV (Squash leaf curl China virus) đã được biết gây bệnh trên cây bầu bí Trong số chúng, PRSV và ZYMV là các potyviruses, gây triệu chứng khảm lá và biến dạng trên nhiều cây họ bầu bí và lan truyền trên đồng ruộng nhờ rệp muội Các nghiên cứu trước đây cho thấy PRSV phổ biến hơn ZYMV SLCCNV là một begomovirus, gây bệnh đốm biến vàng, biến vàng và cây còi cọc trên cây bầu bí, đặc biệt là bí ngô Sự có mặt của CMV trên cây bầu bí vẫn chưa được báo cáo bởi các bằng chứng khoa học tin cậy

Phần lớn các cây trên ruộng thí nghiệm biểu hiện triệu chứng khảm (Hình 4.2) Tuy nhiên triệu chứng khảm do PRSV và ZYMV là giống nhau và tương

tự với CMV nên cần phải kiểm tra ELISA

Hình 4.2 Triệu chứng bệnh virus điển hình trên ruộng dưa chuột thí

nghiệm vụ đông 2014

Kiểm tra 30 mẫu dưa chuột thu thập trên ruộng thí nghiệm với các triệu chứng khác nhau (Hình 4.2) cho thấy 21/30 (70 %) mẫu phản ứng dương với PRSV Tất cả các mẫu đều âm tính với CMV và chỉ 1 mẫu dương tính với ZYMV (Bảng 4.2)

Kết quả ELISA cho thấy phổ biến nhất trên ruộng thí nghiệm là PRSV

Bảng 4.2 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV đối với các mẫu

dưa chuột thu tại ruộng thí nghiệm trông vụ đông 2014

* Ngưỡng = 2 x trung bình giá trị OD của cây đối chứng khỏe Giá trị OD (450 nm) đo sau 1 giờ

Hình 4.3 Các mẫu dưa chuột thu trên ruộng thí nghiệm vụ đông 2014

được kiểm tra ELISA

Hình 4.4 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu

dưa chuột thu tại ruộng thí nghiệm vụ đông 2014

4.2.2 Đánh giá tính kháng PRSV trên tập đoàn giống dưa chuột thí nghiệm

vụ đông 2014

Điều tra định kỳ trên ruộng dưa chuột thí nghiệm (Bảng 4.3) cho thấy 4 giống, HB1, LCH3b, SL27b và SL29g, biểu hiện một số mức độ kháng PRSV

Tất cả các cây giống LCH3b đều không biểu hiện chứng ở tất cả các lần điều

tra Ở lần điều tra cuối cùng, tỷ lệ bệnh ở các giống HB1, SL27b và SL29g lần lượt là 6.3, 7.7 và 13.3 %, thấp hơn nhiều so với các giống còn lại Cấp bệnh trung bình của giống HB1 bằng 2, thấp hơn nhiều so với các giống khác Tuy nhiên cấp bệnh trung bình của 2 giống SL27b và SL29g, bằng 4, cao hơn so với nhiều giống khác

Bảng 4.3 Đánh giá tính kháng PRSV của các dòng dưa chuột trồng vụ

đông 2014 (Chỉ trình bày số liệu 2 lần điều tra cuối)

Số Giống Điều tra ngày 3/11/2014 Điều tra gày 8/12/2014

n (tổn

g số)

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bệnh (%)

Cấp bệnh trung bình

Cấp bệnh cao nhất

Cấp bệnh thấp nhất

n (tổng số)

n (cây bệnh)

Tỷ lệ bệnh (%)

Cấp bệnh trung bình

Cấp bệnh cao nhất

Cấp bệnh thấp nhất

của tập đoàn giống dưa chuột đối với bệnh khảm lá PRSV dựa trên số liệu 6 lần điều tra từ ngày 3 tháng 11 đến ngày 8 tháng 12.