Nghiên cứu thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của thân rễ hai loài: củ gấu (Cyperus rotundus L.) và củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.)

Quy định này có mô tả quy trình xác định đặc điểm chất lượng dược liệu và thuốc cổ truyền Việt Nam trong đó có đề cập đến việc nghiên cứu đánh giá thành phần hoá học kết hợp với kỹ thuậ

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN MINH CHÂU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ DẤU VÂN TAY CỦA THÂN RỄ HAI LOÀI:

CỦ GẤU (CYPERUS ROTUNDUS L.) VÀ

CỦ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2016

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN MINH CHÂU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ DẤU VÂN TAY CỦA THÂN RỄ HAI LOÀI:

CỦ GẤU (CYPERUS ROTUNDUS L.)

VÀ CỦ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.)

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tập thể hướng dẫn

TS Trần Thượng Quảng TS.Nguyễn Tiến Đạt

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Minh Châu

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất của mình tới TS Trần Thượng Quảng và TS Nguyễn Tiến Đạt, hai thầy đã chỉ ra hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện công việc của luận

án

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ tại Bộ môn Hóa Hữu cơ

- Viện Kỹ thuật Hóa học - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, các cán bộ phòng Hoạt chất Sinh học - Viện Hóa Sinh Biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, ban lãnh đạo và các cán bộ Công ty Cổ phần Thiết bị Sài Gòn, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành tốt bản luận án này

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả Luận án

Nguyễn Minh Châu

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về chi Cyperus L 3

1.1.1 Chi Cyperus L trên thế giới 3

1.1.2 Chi Cyperus L tại Việt Nam 4

1.2 Thành phần hóa học của chi Cyperus L 7

1.2.1 Các hợp chất terpenoid 10

1.2.2 Các hợp chất flavonoid 13

1.2.3 Các hợp chất quinone 14

1.2.4 Thành phần tinh dầu 15

1.2.5 Các hợp chất khác 16

1.3 Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay 16

1.4 Giới thiệu về hai loài củ gấu và củ gấu biển 21

1.4.1 Vài nét về thực vật 21

1.4.2 Công dụng và hoạt tính sinh học 23

1.4.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học 24

1.4.4 Các nghiên cứu về sắc ký dấu vân tay 34

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Mẫu thực vật 36

2.1.1 Mẫu nghiên cứu thành phần hóa học 36

2.1.2 Mẫu nghiên cứu dấu vân tay sắc ký 36

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 37

2.2.1 Phương pháp ngâm chiết 37

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 37

2.2.3 Sắc ký cột (CC) 38

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 38

2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) 38

2.3.2 Độ quay cực ([α]D) 38

2.3.3 Phổ hồng ngoại (IR) 38

2.3.4 Phổ lưỡng sắc tròn (CD) 38

2.3.5 Phổ khối lượng (MS) 38

2.3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 38

2.4 Phương pháp xây dựng dấu vân tay sắc ký 39

2.4.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 39

Trang 6

2.4.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 39

2.4.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 39

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 40

3.1 Chiết và phân lập các hợp chất từ thân rễ củ gấu 40

3.1.1 Quy trình chiết và phân lập 40

3.1.2 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các chất phân lập từ thân rễ củ gấu 43

3.2 Chiết và phân lập các hợp chất từ thân rễ củ gấu biển 49

3.2.1 Quy trình chiết và phân lập 49

3.2.2 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ thân rễ củ gấu biển 52

3.3 Phân tích định tính sắc ký dấu vân tay bằng HPTLC 55

3.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích HPTLC 55

3.3.2 Điều kiện sắc ký HPTLC 55

3.3.3 Kết quả 55

3.4 Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay bằng HPLC 55

3.4.1 Chuẩn bị mẫu phân tích HPLC 55

3.4.2 Điều kiện phân tích HPLC 55

3.4.3 Kết quả 56

3.5 Nghiên cứu định lượng một số thành phần chính bằng HPLC 56

3.5.1 Chuẩn bị mẫu phân tích định lượng HPLC 56

3.5.2 Phân tích định lượng bằng HPLC 56

3.5.3 Kết quả 56

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 57

4.1 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 57

4.1.1 Hợp chất CR1: ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (Hợp chất mới) 57

4.1.2 Hợp chất CR2: (+)-catechin 60

4.1.3 Hợp chất CR3: eriodictyol 63

4.1.4 Hợp chất CR4: luteolin 67

4.1.5 Hợp chất CR5: 7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavone 70

4.1.6 Hợp chất CR6: hovetrichoside C 71

4.1.7 Hợp chất CR7: piceatannol 75

4.1.8 Hợp chất CR8: resveratrol 78

4.1.9 Hợp chất CR9: trans-scirpusin A 79

4.1.10 Hợp chất CR10: trans-scirpusin B 83

4.1.11 Hợp chất CR11: cassigarol E 84

4.1.12 Hợp chất CR12: 1,4-dihydroxyeudesm-11-ene 88

4.1.13 Hợp chất CR13: 1β,4β-dihydroxyeudesm-11-ene 90

4.1.14 Hợp chất CR14: 5,7-dihydroxychromone 91

4.1.15 Hợp chất CR15: (+)-lyoniresinol 3a-O--D-glucoside 94

4.1.16 Hợp chất CS1: (S)-5,5,7-trihydroxy-2,4-dimethoxy-6-methylflavanone (Hợp chất mới) 97

Trang 7

4.1.17 Hợp chất CS2: 3',4',6-trihydroxy-4-methoxyaurone 102

4.1.18 Hợp chất CS3: -mangostin 105

4.1.19 Các hợp chất khác 109

4.2 Nghiên cứu định tính dấu vân tay sắc ký bằng HPTLC 112

4.3 Nghiên cứu định tính dấu vân tay sắc ký bằng HPLC 114

4.3.1 Đánh giá độ lặp lại phân tích dấu vân tay sắc ký 114

4.3.2 Kết quả phân tích dấu vân tay sắc ký 115

4.4 Nghiên cứu định lượng một số thành phần chính bằng HPLC 124

4.4.1 Chuẩn bị chất chỉ thị và thiết lập đường chuẩn định lượng 124

4.4.2 Đánh giá hàm lượng của các chất trong mẫu 126

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 129

TÀI LIỆU THAM KHẢO 131

DANH MỤC CÁC C NG TR NH Đ C NG Ố CỦA LUẬN ÁN 146

PHỤ LỤC 147

Trang 8

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13

C-NMR Cacbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

CD Circular Dichroism spectroscopy Phổ lưỡng sắc tròn

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarization Transfer

Phổ DEPT

ESI-MS ElectroSpray Ionization Mass

Bond Correlation spectroscopy

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC High Performance Thin Layer

Chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

HR-ESI-MS High Resolution ElectroSpray

Ionization Mass Spectroscopy

Phổ khối ion hóa phun mù điện

tử phân giải cao

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Coherence spectroscopy

Phổ tương tác trực tiếp H-C

Trang 9

Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NOE Nuclear Overhauser Effect Hiệu ứng NOE

NOESY Nuclear Overhauser

Effect Spectroscopy

Phổ hiệu ứng NOE

QTOF Quadrupole Time Of Flight Tứ cực thời gian bay

SPME Solid-phase microextraction Vi chiết pha rắn

TLC, SKLM Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

TOF-MS Time Of Flight Mass Spectroscopy Khối phổ thời gian bay

chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Công nghệ Việt Nam

Trang 10

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách các loài thực vật thuộc chi Cyperus L tại Việt Nam 4

Bảng 1.2 Danh sách các chất đã được phân lập từ các loài trong chi Cyperus L 8

Bảng 1.3 Thành phần tinh dầu có trong các loài của chi Cyperus L 15

Bảng 1.4 Một số công trình trên thế giới nghiên cứu dấu vân tay sắc ký 18

Bảng 1.5 Các loại dược liệu trong công trình [5] 20

Bảng 1.6 Danh sách các chất đã được phân lập từ Cyperus rotundus L 25

Bảng 2.1 Địa điểm thu thập mẫu nghiên cứu 36

Bảng 3.1 Chương trình dung môi sắc ký dấu vân tay HPLC 56

Bảng 3.2 Nồng độ các chất chỉ thị (µg/ml) để xây dựng đường chuẩn 56

Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất CR1 và chất tham khảo 60

Bảng 4.5 Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất CR5 và chất tham khảo 71

Bảng 4.8 Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất CR8 và chất tham khảo 79

Bảng 4.16 Số liệu phổ NMR của hợp chất CS1 và chất tham khảo 101

Bảng 4.19 Tổng hợp cấu trúc các hợp chất phân lập được từ thân rễ của 2 đối tượng nghiên cứu là củ gấu (Cyperus rotundus L.) và củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) trong khuôn khổ luận án 109

Bảng 4.20 Giá trị Rf và cường độ của các vết trên sắc ký đồ HPTLC quan sát dưới ánh sáng UV 366 nm khi chưa phun thuốc thử 112

Bảng 4.21 Danh sách các chất chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu sắc ký dấu vân tay 118

Bảng 4.22 Hệ số tương đồng của các mẫu so với mẫu CGV1, CGB1 122

Bảng 4.23 Hệ số tương đồng của các mẫu so với mẫu CGV, CGB trung bình cộng 123

Bảng 4.24 Các thông số phân tích định lượng của một số chất bằng HPLC 125

Bảng 4.25 Hàm lượng các chất (µg/g) trong mẫu nghiên cứu 126

Trang 11

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài trong chi Cyperus L 3

Hình 1.2 Hình ảnh cây củ gấu 21

Hình 1.3 Hình ảnh cây củ gấu biển 21

Hình 2.1 Mẫu tiêu bản thực vật cây củ gấu (Cyperus rotundus L.) 36

Hình 2.2 Mẫu tiêu bản thực vật cây củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) 36

Hình 3.1 Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu 40

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập cặn chiết n-hexane của thân rễ củ gấu 41

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate của thân rễ củ gấu 42

Hình 3.4 Sơ đồ phân lập cặn nước của củ gấu 43

Hình 3.5 Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu biển 49

Hình 3.6 Sơ đồ phân lập cặn chiết chloroform của thân rễ củ gấu biển 50

Hình 3.7 Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate của thân rễ củ gấu biển 51

Hình 3.8 Sơ đồ phân lập cặn nước của thân rễ củ gấu biển 52

Hình 4.1.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất CR1 57

Hình 4.1.2 Phổ 13C-NMR của hợp chất CR1 58

Hình 4.1.3 Phổ DEPT của hợp chất CR1 58

Hình 4.1.4 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CR1 59

Hình 4.1.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất CR1 và chất so sánh 59

Hình 4.2.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất CR2 63

Hình 4.3.4 Phổ HMBC của hợp chất CR3 66

Hình 4.3.5 Cấu trúc hóa học và tương tác chính của hợp chất CR3 67

Hình 4.6.3 Phổ DEPTcủa hợp chất CR6 73

Hình 4.6.4 Phổ HMBC của hợp chất CR6 74

Trang 12

Hình 4.6.5 Cấu trúc hóa học và tương tác HM C chính của hợp chất CR6 74

Hình 4.16.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất CS1 98

Hình 4.16.2 Phổ 13C-NMR của hợp chất CS1 99

Hình 4.16.3 Phổ DEPT của hợp chất CS1 99

Hình 4.16.4 Phổ HMBC của hợp chất CS1 100

Hình 4.16.5 Phổ khối HR-ESI-MS của hợp chất CS1 100

Hình 4.16.6 Cấu trúc hóa học, tương tác chính của hợp chất CS1 và chất so sánh 101

Hình 4.17.4 Phổ HMBC của hợp chất CS2 104

Hình 4.17.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất CS2 104

Trang 13

Hình 4.18.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất CS3 108

Hình 4.19 Sắc ký lớp mỏng của các mẫu khi quan sát dưới ánh sáng UV 366 nm 112

trước khi phun thuốc thử 112

Hình 4.20 Sắc ký lớp mỏng của các mẫu quan sát dưới ánh sáng UV 366 nm 113

sau khi phun thuốc thử 113

Hình 4.21 Sắc ký đồ mẫu đánh giá độ lặp lại 114

Hình 4.22 Sắc ký đồ các mẫu thân rễ củ gấu ở bước sóng 275 nm 116

Hình 4.23 Sắc ký đồ các mẫu thân rễ củ gấu biển ở bước sóng 275 nm 116

Hình 4.24 Sắc ký đồ các mẫu dược liệu Hương phụ ở bước sóng 275 nm 116

Hình 4.25 Sắc ký đồ của 16 mẫu nghiên cứu ở bước sóng 275 nm 117

Hình 4.29 Diện tích píc tại RT 1,44 phút 119

Hình 4.39 Sắc đồ mẫu củ gấu và củ gấu biển thu thập tại Thái ình 121

Hình 4.40 Sắc đồ mẫu củ gấu và củ gấu biển thu thập tại Ninh ình 121

Trang 14

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hiện nay các bài thuốc trong y học cổ truyền ngày càng thu hút được sự quan tâm của thế giới bởi vì chi phí thấp, ít tác dụng phụ so với sử dụng tân dược Tại nhiều quốc gia trên thế giới, các nghiên cứu về thành phần hóa học của dược liệu cổ truyền đã và đang được thực hiện nhằm mục đích tách chiết, tinh chế các chất có hoạt tính sinh học

để làm dược phẩm chữa bệnh Mặc dù thuốc y học cổ truyền được xem là tương đối

an toàn cho người sử dụng so với các loại thuốc tổng hợp, tuy nhiên vẫn có thể có độc tính hoặc gây ra các phản ứng phụ nghiêm trọng Nguyên nhân có thể do nguồn gốc nguyên liệu không đảm bảo, bảo quản nguyên liệu không tốt, dùng hóa chất độc hại

để bảo quản hoặc sự giống nhau về hình thái học của dược liệu nhưng không có tác dụng tương đương Sự kiểm soát nguyên liệu ban đầu cũng đòi hỏi có sự chuẩn hóa, nhiều khi sự nhầm lẫn xuất phát từ sự giống nhau về hình thái học của cây trong cùng nơi thu mẫu, từ sự nhận dạng cây hoặc từ những sai sót từ các mẫu thực vật nhập khẩu Chính vì lý do đó, năm 1991, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã có các quy định

về việc đảm bảo chất lượng cho dược liệu cổ truyền Nếu không xác định được hoạt chất thì cần phải có dấu vân tay sắc ký để xác định chất hoặc hỗn hợp các chất [151]

Ở trong nước, ngày 12 tháng 3 năm 1996, Bộ trưởng Bộ Y tế cũng đã có quyết định số

371/BYT-QĐ về việc ban hành "Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ

truyền" [1] Quy định này có mô tả quy trình xác định đặc điểm chất lượng dược liệu

và thuốc cổ truyền Việt Nam trong đó có đề cập đến việc nghiên cứu đánh giá thành phần hoá học kết hợp với kỹ thuật phân tích dấu vân tay sắc ký

Việt Nam là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời với việc sử dụng các loại thảo dược trong phòng chữa bệnh và tăng cường sức khỏe Một trong những dược liệu được sử dụng rộng rãi là vị thuốc Hương phụ Trong YHCT có câu

“Nam bất thiểu Trần bì, Nữ bất ly Hương phụ” tức là chữa bệnh cho nam giới không thể thiếu vị thuốc Trần bì, còn chữa bệnh cho nữ giới không thể không có vị thuốc Hương phụ Điều này cho thấy tầm quan trọng của dược liệu này Dược liệu Hương

phụ được chế biến từ thân rễ của loài củ gấu (Cyperus rotundus L.) Việc thu hoạch củ

gấu chỉ dựa vào nguồn mọc hoang thiên nhiên, không ai trồng Người ta thường kết hợp thu hái củ gấu với việc làm cỏ vườn, ruộng hoặc tổ chức thu hái riêng [4] Nhưng hiện nay, để phục vụ cho nhu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu, vị thuốc có tên là

“Hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ loài củ gấu biển [13] (Cyperus

stoloniferus Retz.) Tuy hai loài này đều được sử dụng làm dược liệu Hương phụ

nhưng cho tới nay chưa có nghiên cứu so sánh về thành phần hoá học dịch chiết của hai loài này

Thực tiễn nêu trên đã định hướng tác giả lựa chọn nội dung nghiên cứu của luận án:

“Nghiên cứu thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của thân rễ hai loài: củ

gấu (Cyperus rotundus L.) và củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.)”

Trang 15

2 Mục đích, đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Mục đích của luận án là làm rõ hơn về thành phần hóa học, so sánh sự khác biệt về thành phần hóa học giữa hai loài củ gấu và củ gấu biển Nghiên cứu cũng góp phần xây dựng bộ dữ liệu sắc ký dấu vân tay cho hai loài củ gấu và củ gấu biển, ứng dụng vào đánh giá chất lượng và phân biệt hai loài này

Nhiệm vụ của luận án bao gồm:

- Nghiên cứu thành phần hoá học: phân lập các hợp chất sạch từ thân rễ hai loài củ gấu và củ gấu biển bằng các phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học các chất tách được bằng các phương pháp phổ kết hợp

- Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay: xây dựng dữ liệu vân tay sắc ký của hai loài củ gấu,

củ gấu biển trên cơ sở các chỉ thị hóa học, xác định hàm lượng một số hoạt chất chính trong các mẫu thân rễ hai loài: củ gấu, củ gấu biển và dược liệu Hương phụ thu thập ở những địa điểm khác nhau

3 Ý nghĩa khoa học của luận án

Luận án đóng góp những hiểu biết mới về thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của 2 loài thực vật: củ gấu, củ gấu biển ở Việt Nam Ứng dụng những phương pháp vật lý hiện đại trong nghiên cứu cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ

4 Những đóng góp mới của luận án

Hai loài củ gấu và củ gấu biển ở Việt Nam lần đầu được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và dấu vân tay sắc ký

4.1 Về thành phần hóa học

- Từ củ gấu (Cyperus rotundus L.) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của

15 hợp chất, trong đó có hợp chất ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (CR1) là hợp chất mới

- Từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 12 hợp chất, trong đó có hợp chất (S)-5,5,7-trihydroxy-2,4- dimethoxy-6-methylflavanone (CS1) hợp chất mới

- Trong số 12 chất phân lập từ củ gấu biển có 9 hợp chất trùng với các chất phân lập được từ củ gấu

4.2 Về sắc ký dấu vân tay:

- So sánh thành phần hoá học của 2 loài C rotundus và C stoloniferus dựa theo kết

quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất sạch kết hợp với phân tích trên hệ thống sắc ký HPTLC và HPLC

- Thiết lập được các điều kiện phân tích dấu vân tay sắc ký bằng HPLC Đánh giá độ tương đồng giữa các mẫu nghiên cứu trên kỹ thuật HPLC Xác định vùng trên sắc ký đồ cho việc nhận dạng dấu vân tay sắc ký để có thể phân biệt hai loài

- Xây dựng được điều kiện định lượng 7 thành phần hoạt chất trong đối tượng nghiên cứu trên hệ thống HPLC bằng việc sử dụng các chất sạch đã phân lập được làm chất đối chứng

Trang 16

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chi Cyperus L

1.1.1 Chi Cyperus L trên thế giới

Chi Cyperus L thuộc họ Cói (danh pháp khoa học: Cyperaceae) là một họ thực

vật thuộc lớp thực vật một lá mầm

Họ Cói là họ lớn trong bộ Hòa thảo (Poales) có khoảng 90 chi với 4.000-4.500 loài [5] Họ này phân bố rộng khắp thế giới, với trung tâm đa dạng là miền nhiệt đới châu Á và Nam Mỹ Nhiều loài cói, lác có thể phát triển tốt trong mọi điều kiện, như các nơi đầm lầy, đất ít dinh dưỡng, các vùng đất ướt, vùng đất phù sa bồi lấp gần các cửa sông ven biển Họ này mặc dù đa số là cỏ dại nhưng vẫn hiện diện một số loài có

ích cho đời sống con người: được dùng làm cảnh như cây cói giấy (Cyperus papyrus L.) Các cây cói bông trắng (Cyperus tegetiformis Roxb.) hay lác voi được dùng để

đan chiếu, làm dây, củ năng (Eleocharis dulcis (Burm.f.) Hensch.) ăn được, củ gấu (Cyperus rotundus L.) để làm thuốc…

Chi Cyperus L là một chi lớn, gồm khoảng 300 loài, phân bố rộng rãi khắp thế

giới

Cyperus compactus Retz Cyperus compressus L Cyperus croceus Vahl

Cyperus difformis L Cyperus digitatus Roxb Cyperus exaltatus Retz

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài trong chi Cyperus L

Trang 17

1.1.2 Chi Cyperus L tại Việt Nam

Tại Việt Nam, họ Cói có 28 chi và 361 loài, 2 phân loài và 24 thứ, phân bố khắp đất nước từ vùng núi cao, trung du đến đồng bằng, ven biển và các hải đảo Chi

Cyperus L tại Việt Nam có 61 loài được liệt kê trong bảng sau [5, 14]:

Bảng 1.1 Danh sách các loài thực vật thuộc chi Cyperus L tại Việt Nam

STT Tên khoa học Tên tiếng Việt Phân bố tại Việt Nam

1 C andereanus Maury Cói andre Kon Tum

2 C arenarius Retz Cói sa Nam bộ

3 C articulatus L Cói đốt Nam bộ

4 C aschenbornianus

5 C babakan Steud Cói ba ba kan Long An, Đồng Tháp, Tiền Giang, An

Giang, Kiên Giang

6 C brunnescens Boeck Cói nâu Thừa Thiên – Huế

7 C castaneus Willd Cói hạt dẻ Quảng Ninh, Bắc Giang, Thừa Thiên –

11 C compressus L Cói hoa dẹp

Sơn La, Yên ái, Cao ằng, Quảng Ninh, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thừa Thiên – Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Tp.HCM, Long An, Bến Tre, Đồng Tháp, Kiên Giang

12 C corymbosus Rottb Cói hoa tán Hải Phòng, Thừa Thiên – Huế, Nam Bộ

13 C cuspidatus B.H.K Cói mũi cong

Sơn La, Cao ằng, Quảng Ninh,Thái Nguyên, Phú Thọ, Hà Nội, Ninh Bình, Thừa Thiên – Huế, Kon Tum, Đồng Tháp

14 C difformis L Cói tò ty

Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Cao ằng, Quảng Ninh, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Ngãi, Bình

Trang 18

Định, Khánh Hòa, Tp.HCM, Bến Tre, Đồng Tháp

15 C diffusus Vahl Cói hoa xòe

Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Hà Tây cũ, Hòa Bình, Hải Dương, Ninh ình, Nghệ

An, Thừa Thiên – Huế, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Đồng Nai, Long An, Bến Tre, Kiên Giang

16 C digitatus Roxb Cói bàn tay

Cao Bằng, Phú Thọ, Hà Tây cũ, Hà Nội, Thừa Thiên – Huế, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Đồng Tháp

17 C distans L Cói bông cách

Lai Châu, Sơn La, Hà Giang, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Dương, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hà Tây cũ, Hòa ình, Hải Phòng, Ninh Bình, Thừa Thiên – Huế, Kon Tum, Lâm Đồng, Tp.HCM, Long

An

18 C dives Dillie Cói giàu Việt Nam

19 C elatus L Cói mào

Hà Nam, Ninh ình, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Đồng Nai, Tp.HCM, Đồng Tháp, Cần Thơ, ạc Liêu, Cà Mau

20 C esculentus L Cói gấu tàu Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng

21 C exaltatus Retz Cói u du cao

Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Nguyên,

Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ

An, Quảng Trị, Đắc Lắc, Tp.HCM, Long

An, Đồng Tháp, Cần Thơ, Cà Mau

22 C flabelliformis

Tuyên Quang, Hà Nội, Hà Nam, Lâm Đồng, Tp.HCM

23 C fluvo-albescens

24 C fuscus L Cói sậm Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Trung

Bộ

25 C grandis C.B.Clarke Cói đại Cần Thơ

26 C haematocephalus

27 C halpan L Cói đất chua Khắp Việt Nam

28 C.imbricatus Retz Cói bông lợp Khắp Việt Nam

Trang 19

30 C laevigatus L Cói láng Việt Nam

31 C leucocephalus Retz Cói trắng Tp.HCM, Kiên Giang

32 C malaccensis Lamk Cói nước Vùng ven biển Việt Nam

33 C michelianus Link Cói vảy xoắn Quảng Ninh, Hà Nội

34 C microiria Steud Cói tấm Bắc Bộ và Nam Bộ Việt Nam

35 C multispicatus

Boeck Cói đa gié Trung Bộ và Nam Bộ Việt Nam

36 C niveus Retz Cói tuyết Ninh ình, Đồng Nai, Tp.HCM

37 C nutans Vahl Cói ba cạnh Hà Nội, Hòa ình, Thanh Hóa, Đồng

Tháp, Tp.HCM

38 C odoratus L Cói thơm Trung Bộ và Nam Bộ Việt Nam

39 C ohwii Kuk Cói ohwi Phú Yên, Khánh Hòa, Nam Bộ

40 C phaeorhizus

41 C pilosus Vahl Cói lông Phổ biến ở Việt Nam

42 C platystylis R.Br Cói vòi giẹp Các tỉnh miền Tây Nam Bộ

43 C procerus Rottb Cói quy

Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Quảng Nam, Đồng Nai, Tp.HCM, Long An, Bến Tre, Kiên Giang

44 C pulcherrimus

45 C puncticulatus Vahl Cói có đốm Trung Bộ và Nam Bộ Việt Nam

46 C pygmaeus Rottb Cói lùn

Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Nam, Thanh Hóa, Quảng Nam, Khánh Hòa, Bà Rịa – Vũng Tàu

47 C radians Nees &

Lạng Sơn, Quảng Ninh, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Khánh Hòa, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu

48 C rotundus L

Củ gấu, cỏ gấu,

cỏ cú, Hương phụ, cỏ hương phụ

Phổ biến khắp Việt Nam kể cả ở quần đảo Trường Sa

49 C rupestris Kumth Cói đá Cà Mau

50 C sphacelatus Rottb Cói phù Kiên Giang

51 C squarrosus L Cói mũi Nam Bộ Việt Nam

Trang 20

53 C tegetiformis Roxb Cói bông trắng

Quảng Ninh, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái ình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa, Quảng Trị, Bến Tre, miền Tây Nam Bộ

54 C tenuiculmis Boeck Cói ghinê

Cao Bằng, Vĩnh Phúc, Hà Tây cũ, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Tp.HCM, An Giang

55 C tenuispica Steud Cói gié mịn

Tuyên Quang, Cao Bằng, Quảng Ninh, Bắc Giang, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Ninh Bình, Bắc Bộ, Thừa Thiên – Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Tp.HCM, Long An, Đồng Tháp

56 C thomsonii Boeck Cói thomson Hà Tây cũ, Hà Nội

57 C thorelii E.Camus Cói thorel Đồng bằng Nam Bộ

58 C tonkinensis

C.B.Clarke Cói bắc

Hà Tây cũ, Đắc Lắc, Đồng Nai, Tây Ninh

59 C trialatus J.Kern Cói ba cạnh

Lạng Sơn, Hải Dương, Phú Thọ, Hòa ình, Hà Tây cũ, Ninh ình, Quảng Bình, Quảng Trị, Đà Nẵng, Quảng Nam, Khánh Hòa, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tp.HCM, Kiên Giang

60 C truncatus C.A.Mey Cói ngang Lâm Đồng

61 C zollingeri Steud Cói zollinger Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu

1.2 Thành phần hóa học của chi Cyperus L

Cho đến nay có khoảng 16 loài trong tổng số gần 300 loài của chi Cyperus được công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học, đó là các loài: C

alopecuroides Schrad., C articulatus L., C bulbosus Vahl., C capitatus Michx., C carinatus R.Br., C conglomeratus Rottb., C corymbosus Rottb., C distans L., C esculentus L., C longus L., C nipponicus Franch & Sav., C papyrus L., C rotundus

L., C scariosus R.Br., C stoloniferus Retz., C tuberosus Rottb

Trang 21

Các nghiên cứu phân lập các chất có trong các bộ phận của các loài trong chi

Cyperus L cho thấy các lớp chất trong chi Cyperus L bao gồm terpenoid, flavonoid,

stilbenoid, quinone và một số nhóm chất khác Tên gọi các chất đã được phân lập từ

các loài trong chi Cyperus L được thống kê trong bảng dưới đây dựa theo việc phân

Trang 23

Dưới đây là công thức cấu tạo của 57 hợp chất phân lập được từ các loài trong

chi Cyperus L (trình bày theo bảng phân loại lớp chất ở trên)

1.2.1 Các hợp chất terpenoid

Terpenoid là lớp chất được tìm thấy từ nhiều loài trong chi Cyperus L Trong

đó tập chung chủ yếu là các sesquiterpene Dưới đây là các chất trong lớp terpenoid đã

được phân lập từ các loài trong chi Cyperus L

Các hợp chất monoterpene: có nhiều hợp chất monoterpene được phân lập từ

Trang 24

13 cyperusol C

OH

H O OH

Trang 25

21 rotundene 22 cyprotene 23 2,4-patchouladiene

H

29 caryolane 1,9β-diol

O

OH HOH2C

H

32 clovanediol

OH

OH H

33 tricyclohumuladiol

Trang 26

H OH

38

2,3-diacetoxy-19-hydroxy-urs-12-ene-24-O-β-D-xylopyranoside

1.2.2 Các hợp chất f avonoid

Các hợp chất flavonoid cũng đƣợc tìm thấy trong nhiều loài trong chi Cyperus

L Đã có nhiều hợp chất flavonoid với các loại khung tiêu biểu flavane, flavone, aurone đƣợc phân lập từ các loài C capitatus Michx [120, 121, 122], C

alopecuroides Schrad [102], C conglomeratus Rottb [19]

OH

HO

O Glu

Trang 27

42 quercetin 3,3-dimethyl ether R3=Me, R4=H

43 quercetin 3,4-dimethyl ether R3=H, R4=Me

Các hợp chất quinone cũng đƣợc tìm thấy trong nhiều loài trong chi Cyperus L

Đã có nhiều hợp chất đƣợc phân lập từ các loài C alopecuroides Schrad [102], C

capitatus Michx [25], C nipponicus Franch & Sav., C distans L [100]

Trang 28

O O

O

53 cyperaquinone

O O

OH HO

55 alopecuquinone

O

O R

Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học bằng việc phân lập các chất có

trong các bộ phận của các loài trong chi Cyperus L còn có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu trong các loài của chi Cyperus L Các nghiên cứu về thành phần tinh dầu của các loài trong chi Cyperus L đƣợc thực hiện chủ yếu bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ Trong tinh dầu của các loài thuộc chi Cyperus L có các chất nhƣ

Trang 29

57 remirol

Ngoài ra còn có các nghiên cứu khác cho thấy các thành phần acid béo, sterol

và tocopherol, amino acid trong các loài thuộc chi Cyperus L [30, 90]

1.3 Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay

Hiện nay, có khoảng 75-80% dân số thế giới, chủ yếu ở các nước đang phát triển được hưởng việc chăm sóc sức khỏe bằng nền Y học cổ truyền (YHCT), do dễ chấp nhận về văn hóa, dễ tương thích với cơ thể con người và ít tác dụng phụ Thực

tế, trong vài năm qua đã chứng kiến sự gia tăng đáng kể trong việc sử dụng thuốc YHCT ở các nước phát triển Ở Đức và Pháp, nhiều loại thảo mộc và sản phẩm chiết xuất từ thảo mộc được sử dụng như là thuốc kê đơn và được bán hàng tại các nước thuộc Liên minh châu Âu với doanh số khoảng 6 tỷ USD trong năm 1991 và hơn 20 tỷ USD vào năm 2000 Tại Mỹ, các loại thuốc thảo dược hiện đang được bán tại các cửa hàng thực phẩm chức năng với doanh thu khoảng 4 tỷ USD vào năm 1996 và tăng gấp đôi vào cuối thể kỷ 20 Tại Ấn Độ, thị trường thuốc thảo dược là khoảng 1 tỷ USD và việc xuất khẩu thuốc thô nguồn gốc thực vật khoảng 80 triệu USD Thuốc thảo dược cũng có vị trí trong thị trường thực phẩm chức năng mà thị trường này được ước tính vào khoảng 80-250 tỷ USD tại Mỹ và châu Âu [72]

Theo báo cáo của WHO, từ những năm 90 của thế kỷ trước, thế giới đã quan tâm đến việc đánh giá chất lượng thuốc thảo dược Với tình hình sử dụng dược liệu cổ

Trang 30

truyền ngày càng tăng, tổ chức y tế thế giới đã có các quy định về việc nhận dạng dược liệu cổ truyền từ nguyên liệu là thực vật với việc xây dựng các tiêu chuẩn từ nhận dạng cây, các bộ phận sử dụng đến quá trình chuẩn bị nguyên liệu hay sản phẩm cuối cùng Nếu không xác định được hoạt chất thì cần phải có dấu vân tay sắc ký để xác định chất hoặc hỗn hợp các chất [150, 151]

Định nghĩa về dấu vân tay sắc ký: Dấu vân tay sắc ký của một mẫu dược liệu là bản sắc ký đồ của dịch chiết các thành phần hóa học có hoạt tính dược lý của dược liệu đó Sắc đồ này phải đảm bảo các yêu cầu về sự xuất hiện “rõ ràng” hay “mờ nhạt”, sự “giống nhau” hay “khác nhau” của các yếu tố hóa học có mặt trong dược liệu [3, 70]

Dấu vân tay sắc ký dựa trên cơ sở các phương pháp sắc ký, do đây là phương pháp được sử dụng phổ biến để định tính thành phần các chất trong dược liệu, trong dịch chiết dược liệu hay phát hiện các tạp chất, các chất giả mạo pha trộn trong dược liệu hay các thành phẩm từ dược liệu Khi sử dụng các phương pháp sắc ký, có thể phát hiện các thành phần trong hỗn hợp dựa vào số lượng, màu sắc các vết trên sắc ký lớp mỏng hay thời gian lưu và diện tích píc trên HPLC Nếu sử dụng các chất chuẩn sắc ký trong cùng điều kiện, ta có thể xác nhận sự có mặt của chất đó trong dược liệu Điều này giúp cho việc xác nhận dược liệu, tránh nhầm lẫn vì mỗi dược liệu có thành phần hóa học nhất định và đặc trưng gọi là dấu vân tay của dược liệu Với việc định tính dấu vân tay, thay cho chất chuẩn, người ta sử dụng một dược liệu chuẩn và tiến hành chiết xuất, tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện với dược liệu cần kiểm nghiệm Sự khác biệt giữa sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử cho phép đánh giá chất lượng dược liệu Các thành phần lạ trên mẫu thử không có ở mẫu chuẩn có thể là dấu hiệu cho thấy dược liệu không đúng, bị pha tạp hay kém chất lượng

Về nguyên tắc, hai mẫu dược liệu của cùng một loài phải có sắc ký đồ đồng nhất Từ đó, có thể xác nhận được mẫu kiểm nghiệm có đúng hay không, có bị giả mạo hay pha tạp Trên thực tế, thành phần các chất trong các mẫu có thể có những sai biệt nhất định do các điều kiện di truyền (các chủng, dạng, thứ hay loài phụ, các loài lai, loài trồng trọt ) hay điều kiện phát triển (thổ nhưỡng, khí hậu), điều kiện thu hái (tuổi, mùa thu hái) v.v Tùy thuộc vào từng loài và yêu cầu sử dụng mà chấp nhận những sự khác biệt về thành phần đến một mức độ nào đó Nếu sự khác biệt quá lớn, đặc biệt là trên những thành phần chính, thường là do các biến thể dưới loài hay cây mọc ở các vùng có điều kiện rất cách biệt nhau thì có thể phải coi là những dược liệu riêng biệt [3, 70]

Dựa vào những đặc tính nêu trên, phương pháp dấu vân tay sắc ký được sử dụng trong việc đánh giá và kiểm soát chất lượng dược liệu Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới tập trung vào việc xây dựng dấu vân tay sắc ký Dưới đây là bảng liệt kê

Trang 31

một số công trình trên thế giới liên quan đến dấu vân tay sắc ký của các loài thảo dược

Bảng 1.4 Một số công trình trên thế giới nghiên cứu dấu vân tay sắc ký

1 Chyawanprash

2 Radix Scutellariae (Scutellaria

baicalensis Georgi.) CE, HPLC-DAD [146]

3 Radix Semiaquilegiae (Semiaquilegia

adoxoides (DC.) Makino.) HPLC-DAD [104]

4 Flos Carthami (Carthamus tinctorius

6

Baishouwu (Cynanchum auriculatum

Royle ex Wight, Cynanchum bungei

Decne., and Cynanchum wilfordii

(Maxim.) Hemsl

7 12 loại dầu cây lá kim (Pine Needle

8 Nhựa cây (Dracaena

cochinchinensis (Lour.) S.C Chen.) MEEKC, HPLC-DAD [32]

10 Eucommia Bark (Eucommia ulmoides

13 Erigeron breviscapus (vant.) Hand

15 Tinh dầu nghệ kwangsiensis ở Quảng

17 Macrothelypteris torresiana (Gaud.) HPLC-UV [157]

19 Euonymus alatus (Thuhb.) Siebold HPLC-UV, LC-ESI-MS [167]

20 Rễ cây Glehnia littorali F Schmidt

21 Nước sắc thuốc Gegen Qinlian HPLC-DAD, LC-ESI-MS [37]

Trang 32

STT Đối tƣợng nghiên cứu Kỹ thuật sử dụng TLTK

27 Lá đậu Senna (Cassia acutifolia Del.) HPLC-DAD [43]

29 Aconitum heterophyllum Wall ex

30 Rhizoma Smilacis Glabrae HPLC-DAD, HPLC-MS/MS [165]

32 Achillea collina Becker ex Rchb HS-SPME-GC-MS [53]

33 Licorice (Glycyrrhiza uralensis

36 Rễ Aconiti (Aconitum carmichaeli

37

Zingiber montanum Link ex A.Dietr.,

Zingiber americans Bl., Zingiber

Andrographis paniculata (Burm.f.)

Wall ex Nees., và thuốc chữa cao

42 Senecio vulgaris L và Senecio

scandens Buch.-Ham UPLC-ESI-MS [156]

44 ƣởi (Citrus grandis (L.) Osbeck.) HPLC-ESI-(+)-DAD-MS/MS [161]

45 Phyllanthus urinaria Linn và

Phyllanthus amarus Schum & HPLC-TOF-MS [57]

Trang 33

STT Đối tượng nghiên cứu Kỹ thuật sử dụng TLTK

50 Stemona tuberosa Lour., S japonica

(Bl.) Miq., và S sessilifolia Miq HPLC-DAD, LC-MS

n

[47]

51 Curcuma xanthorrhiza Roxb., và

Curcuma longa L HPLC-DAD [113]

52 Schisandra chinensis (Turcz.) Baill

và Schisandra sphenanthera Rehd Flash Evaporation-GC-MS [64]

53 Rhizoma Chuanxiong (Ligusticum

chuanxiong Hort.) HPLC-DAD [49]

Tại Việt Nam, năm 2006 tác giả Nguyễn Thị Bích Thu [7] ở Viện Dược liệu –

Bộ Y tế đã tiến hành “Nghiên cứu chuẩn hóa dược liệu bằng sắc ký lỏng cao áp với kỹ thuật điểm chỉ vân tay” cho 10 loại dược liệu gồm: Cúc hoa, Hạ khô thảo, Hoàng cầm, Sinh địa, Ngũ gia bì gai, Ngũ gia bì hương, Sài hồ, đầu, Tam thất và Mật gấu Đề tài này đã thực hiện các công việc như sau:

- Thu thập mẫu dược liệu chuẩn;

- Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết tách và phân tích thích hợp cho từng loại dược liệu;

- Xây dựng dấu vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao của dược liệu chuẩn bao gồm xác định thời gian lưu, diện tích píc và phổ UV của từng píc trong sắc đồ;

- Ứng dụng kết quả nghiên cứu để xác định chất lượng một số dược liệu trên thị trường

Trong năm 2006 tác giả Nguyễn Kim Bích [6] ở Viện Dược liệu – Bộ Y tế cũng tiến hành đề tài “Phân tích và xác định các đặc điểm hóa học đặc trưng của dược liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa” cho 20 loại dược liệu gồm:

Bảng 1.5 Các loại dược liệu trong công trình [6]

STT Tên dược liệu STT Tên dược liệu

Trang 34

STT Tên dược liệu STT Tên dược liệu

Đề tài đã đưa ra phương pháp phân tích dựa trên cơ sở xác định các đặc điểm đặc trưng dạng “vân tay” nhóm chất của dược liệu theo 2 bước:

- Phân tích sàng lọc xác định nhóm chất của dược liệu

- Tiến hành khảo sát, xác định các đặc điểm hóa học đặc trưng của nhóm chất đã được phát hiện sơ bộ từ kết quả phân tích sàng lọc của dược liệu bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

- Đề tài cũng khảo sát, xác định đặc điểm hóa học đặc trưng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký khí, sắc ký khí – khối phổ tuy nhiên chỉ cho nhóm lignan của Đỗ trọng, alcaloid bay hơi của Xuyên khung và thành phần bay hơi của dược

1.4 Giới thiệu về hai loài củ gấu và củ gấu biển

1.4.1 V i nét về thực vật

Củ gấu còn gọi là cỏ gấu, cỏ cú, cỏ hương phụ, hương phụ; có tên khoa học là

Cyperus rotundus L., thuộc họ Cói (Cyperaceae)

Củ gấu biển hay còn gọi là cỏ cú biển, cú chồi, hương phụ biển; có tên khoa

học là Cyperus stoloniferus Retz., thuộc họ Cói (Cyperaceae)

Hình 1.2 Hình ảnh cây củ gấu

(Cyperus rotundus L.)

Hình 1.3 Hình ảnh cây củ gấu biển

(Cyperus stoloniferus Retz.)

Trang 35

Củ gấu biển mọc rải rác hay thành đám nhỏ ở vùng ven biển, hải đảo, trên đất cát, vùng triều cao Củ gấu biển phân bố ở Quảng Ninh (các đảo ở vịnh ái Tử Long), Hải Phòng (Tiên Lãng), Thái ình (Tiền Hải), Nam Định (Xuân Thủy, Nghĩa Hưng), Ninh ình (Kim Sơn), Thanh Hóa (Hoằng Hóa), Quảng Nam (Cù lao Chàm), Khánh Hòa (quần đảo Trường Sa), Ninh Thuận (Phan Rang), Tp.HCM (Sài Gòn), Kiên Giang (Hà Tiên) Còn có ở Mianma, Lào, Campuchia, Thái Lan, Xingapo, Inđônêxia, Brunây, Niu Ghinê, Ôxtrâylia, châu Phi [14]

Mô tả thực vật:

Củ gấu: là loài cỏ nhiều năm, có thân rễ mang vảy, có củ với vỏ màu xám đen, thịt bên trong màu trắng Thân 3 cạnh, cao 15-30 (60) cm, rộng 1-2 mm Lá ngắn hơn thân, rộng 2-6 mm Cụm hoa dạng anten, dài tới 15 cm; lá bắc tổng bao 2-4, bằng hay dài hơn cum hoa ông hình trứng rộng ông chét ít trong mỗi bông, hình đường, dẹp, dài 1-4 cm, rộng 1,5-2 mm, gồm 10-40 (đôi khi hàng trăm) hoa; trục uốn khúc,

có cánh rộng; vảy hình trứng, dài 3-3,5 mm, rộng 1,7-2 mm, đỉnh nhọn hay có mũi nhọn, đáy cụt ngang, 5-7 gân giữa nổi rõ, màu đỏ nâu, xếp 2 hàng Nhị 3 Quả hình mũi mác ngược hay thuôn, 3 cạnh, dài 1,4-1,5 mm, rộng 0,5-0,7 mm, màu nâu thẫm; đầu nhụy xẻ 3 [5]

Củ gấu biển: là cỏ nhiều năm, có thân bồ dài và củ hình thoi dài 2-3 cm, rộng 1-2 cm, màu nâu thẫm với lông hình vảy bao phủ Thân 3 cạnh, gốc phồng to, cao 15-

50 cm, rộng 1-2 mm Lá dài gần bằng thân, rộng 1,5-4 mm Cụm hoa dạng anten, dài 7-8 cm; lá bắc tổng bao 2-3, dài gần bằng cụm hoa ông hình trứng rộng, dài và rộng 1,5-2,5 cm Bông chét 3-10 trong mỗi bông, hình mũi mác, dẹp, dài 5-15 mm, rộng 2-2,5 mm, gồm 10-20 hoa, trục có cánh rộng; vảy hình trứng rộng, dài 2,5-3 mm, rộng 2-2,5 mm, đỉnh nhọn, đáy hơi phồng, 5-7 gân giữa nổi rõ, màu nâu, 2 bên và giữa màu xanh, xếp 2 hàng Nhị 3 Quả hình bầu dục, dẹp lưng và lưng có gờ nổi lên, dài 1-1,5

mm, rộng 0,9-1 mm, màu nâu thẫm; đầu nhụy xẻ 3 [5]

Trang 36

1.4.2 Công dụng v hoạt tính sinh học

1.4.2.1 Tại Việt Nam

Theo Đông y, Hương phụ (tên gọi vị thuốc từ củ gấu) có vị cay, hơi đắng, ngọt, vào hai kinh: can và tam tiêu Có tác dụng lý khí, giải uất, điều kinh, chỉ thống (làm hết đau), chữa khí uất, ung thư, ngực bụng chướng đau Hương phụ dùng để chữa kinh nguyệt không đều, thấy kinh đau bụng, viêm tử cung mạn tính, các bệnh phụ nữ trước

và sau khi sinh nở; đau dạ dày do thần kinh, giúp sự tiêu hóa, ǎn không tiêu, chữa nôn mửa, đau bụng, đi lỵ, [4]

Theo tác giả Đỗ Tất Lợi, kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy, Hương phụ vườn có tác dụng ức chế sự co bóp của tử cung, làm dịu sự cǎng thẳng, có tác dụng trực tiếp làm cho cơ tử cung dịu lại [4]

Tác giả Vũ Văn Điền, Mai Tất Tố [17] khi nghiên cứu tác dụng giảm đau của Hương phụ đã cho thấy: nước sắc của cả hai loài Hương phụ ở dạng sống và hai dạng chế đều có tác dụng giảm đau nội tạng Trong nhóm hợp chất thì alcaloid có tác dụng giảm đau mạnh nhất, sau đó là tinh dầu còn saponin và glycosid không thể hiện tác dụng Với phương pháp gây đau bằng nhiệt thì hai loại Hương phụ không có tác dụng Nước sắc của cả hai loài Hương phụ đều không độc qua đường uống, tinh dầu Hương phụ biển có LD50 là 12,1 ml/kg Nếu xét về mặt tác dụng giảm đau nội tạng thì có thể dùng Hương phụ biển thay cho Hương phụ vườn

Tác giả Vũ Văn Điền, Cao Văn Thu [16] đã nghiên cứu một số kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của Hương phụ biển và cho thấy: nước sắc cả hai loài Hương phụ

có tác dụng trên 5 chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus

mirabilis, Sarcina lutea và Staphylococcus aureus Hương phụ biển tác dụng mạnh

hơn Hương phụ vườn ở cả dạng sống và chế Ở Hương phụ biển, dạng sống tác dụng mạnh hơn 2 dạng chế, 2 dạng chế có tác dụng như nhau Các nhóm hợp chất toàn phần thì saponin không có tác dụng kháng khuẩn; alcaloid, glycosid, tinh dầu có tác dụng trên cả 10 chủng vi khuẩn trong đó glycosid tỏ ra tác dụng mạnh hơn cả

Theo tác giả Trần Văn ính [12] chế phẩm Hương phụ có xu hướng làm giảm

co bóp tử cung tại chỗ ở liều dùng 4-6 g/kg đối với thỏ Trên tim ếch, Hương phụ vườn và Hương phụ biển làm giảm biên độ co bóp và hơi giảm nhịp tim của ếch ở liều 1-4%, ở liều 5% tâm trương toàn bộ Về tác dụng giảm đau: Hương phụ vườn và Hương phụ biển có tác dụng như nhau Hỗn dịch nhóm alcaloid toàn phần có tác dụng giảm đau hơn nước sắc toàn phần và tinh dầu, saponin và glycosid không có tác dụng giảm đau Kết quả thử trên huyết áp cho thấy 2 loại Hương phụ có tác dụng hạ huyết

áp nhẹ Hương phụ vườn và Hương phụ biển có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn

Trang 37

1.4.2.2 Trên thế giới

Ở Ấn Ðộ, củ gấu biển được xem như thuốc lợi tiểu, kích thích tim Người ta đã nghiên cứu tác dụng ức chế trực tiếp co bóp của tử cung, đồng thời làm giảm trương lực của tử cung, tác dụng giảm đau (do hợp chất -cyperene), tác dụng làm ra mồ hôi, trị giun, lợi tiểu, và làm se [15] Theo Parekh và Chanda [108, 109], dịch chiết củ gấu bằng ethanol có tác dụng kháng khuẩn mạnh và rõ rệt hơn dịch chiết bằng nước Tuy nhiên tính kháng nấm thì không cao Nhóm nghiên cứu của Wei và cộng sự [148] cho thấy thành phần -cyperone trong dịch chiết bằng ether dầu hỏa của thuốc chống trầm cảm trên mô hình chuột chế biến từ củ gấu Nhóm nghiên cứu của Puratchikody và cộng sự [111] cho thấy dịch chiết ethanol của củ gấu có tác dụng chữa lành vết thương trên mô hình chuột Một nhóm các nhà khoa học tại trường Đại học Kangwon, Hàn Quốc [69] cho thấy dịch chiết ethanol 70% của củ gấu có tác dụng chống dị ứng Theo Kempraj và Bhat [75], tinh dầu cất lôi cuốn hơi nước của củ gấu có khả năng diệt ấu trùng và trứng muỗi Sivapalan [129] và nhiều tác giả khác [68, 93, 29, 81] đã có công trình viết tổng quan về tác dụng của củ gấu như là một loại dược liệu tiềm năng bao gồm các hoạt tính: chống viêm, hạ sốt, giảm đau, an thần, chống co giật, chống nôn,

ức chế hoạt động nhu động dạ dày, bảo vệ dạ dày, chống tiêu chảy, hạ huyết áp, bảo

vệ gan, chống béo phì, chống viêm khớp, làm lành vết thương, chống ôxi hóa, chống tiểu đường, kháng khuẩn, chống sốt rét, chống đột biến gen Nghiên cứu độc tính trên chuột cho thấy cặn chiết củ gấu đưa vào qua đường miệng với hàm lượng tới 2000 mg/kg vẫn đảm bảo an toàn [35]

1.4.3 Các nghiên cứu về th nh phần hóa học

1.4.3.1 Tại Việt Nam

Trong nước có luận văn tốt nghiệp dược sĩ đại học năm 1970 của Đàm Đảm đã xác định trong Hương phụ vườn có các thành phần sau: tinh bột 0,18%, clorid 0,42%, chất béo 1,32%, chất nhựa, flavonoid, glycosid, alcaloid, tinh dầu 1,27% [18]

Luận án phó tiến sĩ khoa học Y dược năm 1994 của DS.Vũ Văn Điền [18] đã xác định được trong Hương phụ có 0,54-0,62% tinh dầu theo phương pháp cất lôi cuốn hơi nước, 0,104-0,128% alcaloid theo phương pháp cân, 0,75-0,77% glycosid bằng phương pháp đo quang, 0,041-0,050% saponin theo phương pháp cân, 0,72- 0,78% flavonoid bằng phương pháp đo quang, 1,67-1,78% tanin bằng phương pháp chuẩn độ và khảo sát thành phần tinh dầu của hai loài Hương phụ bằng sắc ký khí

Trang 38

Theo tác giả Nguyễn Xuân Dũng, Vũ Văn Điền, Vũ Ngọc Lộ [9] thì trong thành phần tinh dầu của Hương phụ vườn có 27 chất còn trong tinh dầu Hương phụ biển có 22 chất

Kết quả nghiên cứu của tác giả Trần Huy Thái, Trần Thị Ngọc Diệp [11] cho

thấy, hàm lượng tinh dầu từ thân rễ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Rezt.) đạt

0,62% theo nguyên liệu khô Tinh dầu là chất lỏng màu vàng sẫm, có mùi thơm và nhẹ hơn nước Bằng phương pháp sắc khí khối phổ (GC-MS), 28 hợp chất trong tinh dầu củ gấu biển được xác định, chiếm 86,27% tổng hàm lượng tinh dầu Thành phần chính của tinh dầu là các hợp chất sesquiterpenoid Thành phần hóa học chính của

tinh dầu là α-cyperon (32,37%), -seline (3,74%), 1,4 4-8-tetramethyl (6,1%), 2-cyclohexen-1-ol-2-methyl-5 (5,95%), caryophyllenoxid (3,68%)

methanoazulen-7-on-octahydro-Tại Việt Nam các nghiên cứu về thành phần hóa học của củ gấu và củ gấu biển chỉ tập trung vào phần tinh dầu chưa có nghiên cứu chi tiết thành phần trong dịch chiết củ gấu Về củ gấu biển có thể thấy gần như chưa có nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các chất trong thành phần

1.4.3.2 Trên thế giới

Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của củ gấu Các nghiên cứu này cho thấy trong củ gấu có các lớp chất terpenoid, flavonoid, stilbenoid, quinone… ên

cạnh một số chất đã được phân lập từ các loài trong chi Cyperus L như: 3 mustakone

[107], 11 α-cyperone [107], 12 β-selinene [58], có rất nhiều chất đã được phân lập từ

loài Cyperus rotundus L Dưới đây là danh sách các chất đã được phân lập từ Cyperus

Trang 39

92 3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid α-D-arabinofuranoside

Định dạng
Số trang	213
Dung lượng	5,27 MB