nguyên lý ứng dụng kỹ thuật dpcd vào công nghệ thuc phẩm

Nhiệm vụ của đồ án “Tổng quan tài liệu về kỹ thuật Dense Phase CO2 – Nguyên lý ứng dụng trong công nghệ thực phẩm” là tìm hiểu về kỹ thuật thanh trùng, tiệt trùng dùng CO2 siêu tới hạn,

LỜI NÓI ĐẦU

Xã hội ngày một phát triển, nhu cầu của con người ngày một nâng cao đòi hỏi kỹ thuật cũng phải có những bước phát triển phù hợp Công nghệ thực phẩm cũng không ngoại lệ Việc tìm ra những phương pháp xử lý mới, những sản phẩm mới cũng như những nguồn nguyên liệu mới đã trở thành những vấn đề mang tính chiến lược hiện nay

CO2 siêu tới hạn là một trong những đề tài được tìm hiểu nhiều trong suốt thời gian gần đây và nhờ những ưu điểm của mình mà CO2 siêu tới hạn đã được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu và thực tế như trích ly, tinh sạch, làm môi trường phản ứng Đặc biệt, việc sử dụng CO2 siêu tới hạn để thanh trùng, tiệt trùng thực phẩm đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và đưa ra những kết luận về ưu điểm của kỹ thuật mới này so với các kỹ thuật truyền thống

Nhiệm vụ của đồ án “Tổng quan tài liệu về kỹ thuật Dense Phase CO2 – Nguyên lý ứng dụng trong công nghệ thực phẩm” là tìm hiểu về kỹ thuật thanh trùng, tiệt trùng dùng CO2 siêu tới hạn, gọi là kỹ thuật Dense Phase Carbon Dioxide (DPCD), phân tích các ảnh hưởng của kỹ thuật này lên chất lượng thực phẩm cũng như nguyên lý ứng dụng kỹ thuật DPCD vào công nghệ thực phẩm

Chương 1 GIỚI THIỆU

Trong những kỹ thuật không dùng nhiệt nói trên thì kỹ thuật Dense phase CO2

được xem là kỹ thuật có nhiều ưu điểm nhất Dense phase CO2 (DPCD) là một kỹ thuật sử dụng CO2 ở trạng thái dense phase (trạng thái siêu tới hạn) để vô hoạt vi sinh vật và enzyme có trong nguyên liệu ở nhiệt độ thấp do đó mà giảm được những ảnh hưởng bất lợi của nhiệt đến chất lượng thực phẩm Kỹ thuật này đã được nghiên cứu trong hơn 50 năm qua, đặc biệt là trong 2 thập kỷ vừa qua, và ảnh hưởng của nó lên các tế bào sinh dưỡng, các bào tử vi sinh vật, bao gồm cả các mầm bệnh, vi sinh vật gây thối, nấm men, nấm mốc, và nhiều loại enzyme khác nhau đã được chứng minh Nhiều thực phẩm lỏng đạt được giá trị cảm quan tốt, giữ được hương vị tự nhiên, giá trị dinh dưỡng cũng như các tính chất hoá lý sau khi được xử lý bằng DPCP Mặt khác, CO2 là loại nguyên liệu không độc, không gây cháy nổ, giá thành thấp, bên cạnh đó nó cũng là thành phần trong nhiều loại thực phẩm chẳng hạn như các loại thức uống có gas

Nghiên cứu đầu tiên được cho là mở đầu cho khả năng ứng dụng kỹ thuật DPCD là nghiên cứu của Fraser (1951) Nghiên cứu đã kết luận rằng sự giải phóng đột ngột khí CO2 ở áp suất cao khoảng 34 atm về áp suất thường có thể phá vỡ tế bào vi khuẩn Quá trình tiến hành trong nghiên cứu trên có một bước nén CO2 ở áp suất cao để tăng khả năng thẩm thấu qua màng tế bào rồi giải phóng áp suất khiến CO2giãn nở và phá vỡ tế bào Giả thuyết ấy ngày nay đã được chứng minh và công trình của Fraser và cộng sự được xem là bằng chứng đầu tiên về ứng dụng của kỹ thuật DPCD như một phương pháp thanh trung, tiệt trùng không dùng nhiệt

Năm 1969, nhà sản xuất Swift & Co nhận được bằng sáng chế của Hoa Kỳ cho phát minh hệ thống tiệt trùng thực phẩm sử dụng CO2 Họ đã kết luận rằng thực phẩm tiệt trùng có thể giữ được mùi vị tự nhiên khi tiệt trùng bằng CO2 ở áp suất cao

Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm hiểu cơ chế, động học và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý thực phẩm dùng kỹ thuật DPCD để tối

ưu hoá quá trình xử lý Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng tìm hiểu những ảnh hưởng của kỹ thuật này lên thực phẩm và tiến hành so sánh nó với các kỹ thuật thanh trùng, tiệt trùng khác

Ngày nay, kỹ thuật DPCD đã cho thấy những ưu điểm và tầm ứng dụng rộng rãi trong các công nghệ cần xử lý vi sinh vật và enzymes Nhiều nghiên cứu vẫn còn được tiến hành với quy mô lớn nhỏ khác nhau để tìm hiểu sâu hơn về kỹ thuật ưu việt này

Carbon dioxide là một trong những loại khí đầu tiên được xác định là tồn tại tự

do trong không khí Vào thế kỷ 17, Jan Baptist Helmont, một nhà hoá học người Bỉ, là người đầu tiên phát hiện ra sự tồn tại của một loại khí không màu sau một thí nghiệm đốt than củi và gọi nó là một loại “gas”

Trong thập niên 50 của thế kỷ 17, Joseph Black, nhà vật lý học người Scotland, cũng đã tìm hiểu về tính chất của CO2 và kết luận rằng loại khí này nặng hơn không khí, không duy trì sự cháy và sự sống của sinh vật, có thể được tạo ra bằng cách nung nóng hay cho đá vôi tác dụng với acid Ông cũng nhận thấy là dung dịch nước vôi trong sau khi được sục khí CO2 thì sẽ hoá đục do tạo thành calcium carbonate, và đã dùng hiện tượng này giải thích cho việc tạo thành CO2 từ hoạt động trao đổi chất của con người, động vật và từ quá trình lên men của vi sinh vật Sau đó, nhà hoá học người Pháp, ông Antoine Lavoisier đã chứng minh được chất khí tạo thành từ phản ứng đốt cháy than củi của Jan Baptist Helmont có tính chất như Black mô tả là một oxide của carbon

Năm 1775, Joseph Priestley đã sử dụng CO2 tạo thành từ phản ứng giữa acid sulfuric và đá vôi để sản xuất soda, một loại thức uống có CO2 đầu tiên

Năm 1823, Humphrey Davy và Micheal Faraday lần đầu tiên hoá lỏng được

CO2. Năm 1834, Charles Thilorier trong một tai nạn tình cờ đã phát hiện ra cách tạo carbon dioxide dạng rắn (thường gọi là băng khô) sau khi mở một bình cao áp chứa CO

Ngày nay, CO2 đã được tìm hiểu kỹ lưỡng và được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau

2.1.2 Tính chất vật lý và hoá học của CO2

Carbon dioxide là một hợp chất hoá học không phân cực, hình thành từ một nguyên tử carbon nối đôi với hai nguyên tử oxy, có công thức hoá học là CO2

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của CO2

CO2 tồn tại ở trạng thái khí trong điều kiện thường, không màu, không mùi, không duy trì sự cháy, tồn tại trong không khí với nồng độ xấp xỉ 0,03%, ít độc với con người và động vật

Bảng 2.1: Một số thông số hoá lý của CO2

Độ tan trong nước (to phòng) 1,45 kg/m3

Khả năng hoà tan trong nước của CO2 là một tính chất quan trọng Tại điều kiện thường (14,7 psi, 15oC), một thể tích CO2 có thể hoà tan hoàn toàn trong một thể tích nước Tuy nhiên, để duy trì sự hoà tan này ta cần phải duy trì áp suất, nếu không CO2 sẽ giải phóng khỏi nước dưới dạng các bọt nhỏ Khả năng hoà tan của

CO2 phụ thuộc vào áp suất, nhiệt độ và pH dung dịch, cụ thể là hàm lượng CO2 hoà

tan trong nước sẽ tăng khi tăng áp suất, giảm nhiệt độ và tăng pH Trong đó, áp suất ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hoà tan của CO2: áp suất càng cao thì lượng CO2hoà tan càng nhiều

Aùp suất (psi)

Hình 2.2: Đồ thị biểu diễn khả năng hoà tan của CO2 trong nước ở những nhiệt độ

khác nhau theo áp suất Quá trình hoà tan CO2 vào nước được mô tả như sau:

Ban đầu, CO2 trạng thái khí sẽ hoà tan vào nước

Sau đó, CO2 sẽ tương tác với nước để tạo thành acid carbonic Chỉ khoảng 1% CO2 hoà tan tồn tại dưới dạng H2CO3

Acid carbonic là một acid yếu, phân ly qua hai giai đoạn

H2CO3 ↔ H+ + HCO3- pKa = 6,57 HCO3- ↔ H+ + CO32- pKa = 10,62

Acid carbonic có thể bị phân huỷ tạo thành CO2 và nước

Ngoài ra, CO2 là một hợp chất không phân cực, do đó mà nó dễ dàng tan vào các dung môi không phân cực như chất béo Đây là một trong những đặc tính quan trọng của CO2 khi ứng dụng trạng thái dense phase của nó để thanh trùng hay tiệt trùng thực phẩm vì CO2 sẽ hoà tan vào phần kỵ nước ở giữa màng lipid kép của tế bào vi sinh vật và gây biến tính màng

2.1.3 Giản đồ pha của CO2

Hình 2.3: Giản đồ pha của CO2

CO2 có thể tồn tại ở nhiều trạng thái khác nhau: rắn, lỏng, khí tuỳ thuộc vào điều kiện áp suất và nhiệt độ

Tại điểm tới hạn (critical point), khi tăng áp suất và nhiệt độ, CO2 sẽ tiến vào vùng trạng thái siêu tới hạn (supercritical), khi đó nó sẽ có tính chất nằm giữa trạng thái lỏng và khí Tại một nhiệt độ cố định trên nhiệt độ tới hạn Tc, khi ta tăng áp suất, CO2 không ngưng tụ chuyển về trạng thái lỏng được, khối khí CO2 bị nén lại,

do đó mà mật độ chúng tăng lên, tạo nên một trạng thái dày đặc mà ta gọi là trạng thái dense phase Vì vậy, trạng thái dense phase cũng được xem là trạng thái siêu tới hạn

2.2 Tổng quan về dense phase CO2

(Coustantina Tzia và George Liadakis, 2003)

2.2.1 Định nghĩa về dense phase hay trạng thái siêu tới hạn

Trạng thái siêu tới hạn là trạng thái của một chất, hợp chất hay hỗn hợp mà nhiệt độ và áp suất tồn tại của nó trên nhiệt độ tới hạn (Tc), áp suất tới hạn (Pc) và dưới áp suất chuyển sang thể rắn của chất đó

2.2.2 Nguyên lý tạo thành CO2 siêu tới hạn

Trạng thái của một chất biến đổi khi thay đổi các thông số trạng thái của chất đó Nguyên tắc tạo trạng thái siêu tới hạn của một chất là hiệu chỉnh nhiệt độ và áp suất của chất đó phải lớn hơn nhiệt độ tới hạn và áp suất tới hạn của chính nó Bảng 2.2: Nhiệt độ tới hạn và áp suất tới hạn của một số chất thông dụng

Như vậy, đối với CO2, ta duy trì áp suất trên 7,37 Mpa và nhiệt độ trên 31,1oC thì có thể tạo ra CO2 ở trạng thái siêu tới hạn

2.2.3 Tính chất của lưu chất siêu tới hạn

2.2.3.1 Hằng số tới hạn

Điểm tới hạn của một chất được xác định bởi nhiệt độ và áp suất, tại đó trạng thái pha lỏng và pha khí không thể phân biệt

Khi một chất bị nén và gia nhiệt đến một áp suất và nhiệt độ cao hơn điểm tới hạn thì chất đó chuyển sang một trạng khác được gọi là trạng thái siêu tới hạn Nhiệt độ, áp suất và thể tích mol của một chất ở điểm tới hạn được gọi là nhiệt độ tới hạn (Tc), áp suất tới hạn (Pc) và thể tích mol tới hạn (Vc) tương ứng Các tham số trên được gọi là hằng số tới hạn Mỗi chất có một hằng số tới hạn nhất định (bảng 2.2)

2.2.3.2 Tỷ trọng

Tỷ trọng của lưu chất siêu tới hạn sẽ thay đổi khi nhiệt độ và áp suất tương ứng của môi trường thay đổi Trong mọi trường hợp, sự gia tăng nhiệt độ dẫn đến sự giảm tỷ trọng Tỷ trọng của lưu chất biến đổi nhanh ở vùng nhiệt độ và áp suất gần điểm tới hạn Tỷ trọng rút gọn (ρr = ρ/ρc) của hợp chất tinh khiết ở áp suất rút gọn (Pr = P/Pc) là 1,0 có thể thay đổi từ giá trị khoảng 0,1 (tỷ trọng giống chất khí) đến khoảng 2,0 (tỷ trọng giống chất lỏng) khi ta tiến hành hiệu chỉnh nhiệt độ rút gọn (Tr = T/Tc) trong dãy từ 0,9 – 1,2 (hình 2.4, bảng 2.3)

Hình 2.4: Sự biến thiên tỷ trọng rút gọn của một chất trong vùng lân cận tới hạn

Bảng 2.3: So sánh đặc tính vật lý của chất lỏng, chất khí và chất lỏng siêu tới hạn

Khi tỷ trọng của lưu chất siêu tới hạn có giá trị tương đương với tỷ trọng của chất đó ở trạng thái lỏng thì chất lỏng siêu tới hạn hoạt động như dung môi lỏng Tuy nhiên, khi nhiệt độ rút gọn tăng đến giá trị khoảng 1,6, chất lỏng siêu tới hạn trở nên giống chất khí do sự giãn nở tăng cùng với sự tăng nhiệt độ

2.2.3.3 Hằng số điện môi

Tại áp suất cao, chất khí không còn tồn tại ở trạng thái khí lý tưởng do sự tăng cường liên kết vật lý giữa các ion, các lưỡng cực, các lưỡng cực tạm thời và nhiều cực ảnh hưởng tới các tương tác phân tử trong hệ Năng lượng tương tác (Eq) giữa các điện tích q1, q2 được xác định bởi một hàm của hằng số điện môi (ε) và khoảng cách giữa các điện tích (r)

r

q q

E q

4

2

1

επ

= Hằng số điện môi tĩnh là một thông số hiệu quả để đánh giá đặc tính dung môi của chất lỏng có cực như ethanol, methanol và nước Hằng số điện môi cũng là thông số phụ thuộc vào tỷ trọng và có thể thay đổi bằng cách hiệu chỉnh nhiệt độ và áp suất của hệ Hằng số điện môi của chất lỏng siêu tới hạn là một thông số quan trọng để ước lượng sự tăng cường liên kết nội phân tử thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực Ví dụ: ở nhiệt độ 40oC, giá trị hằng số điện môi của CO2 tăng khi áp suất tăng từ 70 – 200.105Pa và đạt trạng thái giống chất lỏng khi áp suất của hệ dao động quanh giá trị 200.105Pa Như vậy, áp suất càng cao thì liên kết nội phân tử càng được củng cố, tính chất không phân cực của CO2 càng được tăng cường Điều

này giải thích nguyên nhân ở áp suất càng cao thì khả năng tan của các chất không phân cực và các hợp chất khó bay hơi trong dung môi CO2 càng tăng

Hình 2.5: Tỷ trọng và hằng số điện môi của CO2 theo áp suất ở 50oC

2.2.3.3 Đặc tính chuyển động

Độ nhớt

Độ nhớt là một thông số quan trọng dùng để đánh giá sự chuyển động của chất lỏng trong hệ thống Độ nhớt của chất khí tăng khi nhiệt độ tăng trong một khoảng áp suất nhất định Tuy nhiên, độ nhớt của chất lỏng siêu tới hạn lại giảm khi tăng nhiệt độ trong 1 khoảng áp suất nhất định

Đối với lưu chất ở trạng thái siêu tới hạn, khi áp suất của hệ càng tăng thì tỷ trọng của nó cũng tăng và đạt giá trị bằng với tỷ trọng của chất đó ở trạng thái lỏng Trong khi đó, độ nhớt của lưu chất siêu tới hạn lại tăng chậm hơn và vẫn chưa đạt đến độ nhớt của chất đó ở trạng thái lỏng

Hình 2.6: Độ nhớt của CO2 ở các nhiệt độ khác nhau trong vùng siêu tới hạn

Khả năng khuếch tán

Khả năng khuếch tán cũng là một thông số quan trọng đánh giá hiệu quả trích ly của lưu chất siêu tới hạn Khả năng khuếch tán của một chất ở trạng thái siêu tới hạn cao hơn so với chất đó ở trạng thái lỏng, vì vậy mà khả năng truyền khối của lưu chất siêu tới hạn cũng cao hơn

Khả năng khuếch tán của lưu chất siêu tới hạn tăng khi nhiệt độ tăng và giảm khi áp suất tăng

2.2.3.4 Nhiệt dung riêng và sự dẫn nhiệt

Các thông số về nhiệt dung riêng và sự dẫn nhiệt được dùng để mô tả cách truyền nhiệt trong hệ Trong vùng tới hạn, nhiệt dung đẳng áp rất lớn và đạt đến giá trị cực đại rồi giảm dần về giá trị ổn định (hình 1.5) Tuy nhiên, nhiệt dung đẳng tích chỉ thay đổi rất ít trong vùng tới hạn

Hình 2.7:Nhiệt dung riêng của CO2 ở 320oK

Sự dẫn nhiệt của chất lỏng siêu tới hạn được xem là một tính chất truyền nhiệt quan trọng Hệ số dẫn nhiệt (λ) là hệ số tỷ lệ giữa dòng nhiệt Q và gradient nhiệt độ của chất lỏng

Q = λ.∇T Hầu hết hệ số dẫn nhiệt của chất lỏng siêu tới hạn tăng với sự tăng nhiệt độ và tỷ trọng của hệ Bảng 1.3 thể hiện số liệu về hệ số dẫn nhiệt của nước và CO2 như một hàm của nhiệt độ ở vài áp suất

Bảng 2.4: Hệ số dẫn nhiệt của nước và CO2

 Tóm lại, trạng thái dense phase hay trạng thái siêu tới hạn được mô tả là một trạng thái trung gian giữa trạng thái khí là lỏng, có khả năng khuếch tán cao

gần với chất khí và khả năng hoà tan các chất tan gần như một dung môi lỏng

Một chất tồn tại ở trạng thái dense phase sẽ có những tính chất giống trạng thái khí do động năng của các phân tử lớn hơn lực hút giữa các phân tử với nhau, vì vậy mà nó có khả năng khuếch tán giống chất khí Mặt khác, chất này cũng sẽ có những tính chất giống trạng thái lỏng do mật độ phân tử lớn, có các tính chất về độ nhớt, tính chất dòng chảy gần giống chất lỏng (N.L Rozzi and R.K Singh , 2002; Yoshaki Fukushima, 1999)

Nhờ tính chất khuếch tán và hoà tan các chất khác mà CO2 ở trạng thái dense phase có thể tiêu diệt vi sinh vật và được áp dụng vào kỹ thuật thanh trùng, tiệt trùng mới không dùng nhiệt độ cao

2.3 Ứng dụng của CO2 siêu tới hạn

CO2 siêu tới hạn được ứng dụng nhiều làm dung môi trích ly các hợp chất ưa béo bên trong các nguyên liệu như hạt, các loại quả, tảo… Bên cạnh đó nó còn được sử dụng để tinh sạch các sản phẩm dầu mỏ, các hợp chất như lecithine…

CO2 siêu tới hạn còn được dùng làm môi trường phản ứng trong một số thiết bị phản ứng

Một trong những ứng dụng của CO2 siêu tới hạn được nghiên cứu nhiều nhất hiện nay là sử dụng CO2 siêu tới hạn để thanh trùng, tiệt trùng các loại nguyên liệu khác nhau trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm… Tương lai đây sẽ là một kỹ thuật nhiều triển vọng thay thế các kỹ thuật thanh trùng, tiệt trùng truyền thống như dùng nhiệt độ cao và hóa chất

2.4 Định nghĩa về kỹ thuật DPCD

Kỹ thuật DPCD được định nghĩa là kỹ thuật sử dụng CO2 ở trạng thái dense phase để xử lý thực phẩm nhằm ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật có hại, vô hoạt các enzyme và kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm

Tuy nhiên, hiện nay, định nghĩa kỹ thuật DPCD không chỉ dừng lại ở phạm vi sử dụng CO2 ở trạng thái dense phase mà còn mở rộng ra các kỹ thuật dùng CO2 ở áp suất cao để xử lý thực phẩm Vì vậy, tên gọi DPCD sử dụng trong đồ án này bao gồm cả kỹ thuật DPCD chính xác theo định nghĩa và các kỹ thuật dùng CO2 áp suất cao

2.5 Ưu nhược điểm của kỹ thuật DPCD

2.5.1 Ưu điểm

Hầu hết các nghiên cứu về kỹ thuật DPCD đều thống nhất với nhau về các ưu điểm nổi bật của kỹ thuật này trong việc thanh trùng, tiệt trùng thực phẩm Một số

ưu điểm có thể kể đến như sau:

Điểm đầu tiên đáng chú ý đến của kỹ thuật DPCD là hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật rất lớn So với các kỹ thuật thanh trùng, tiệt trùng khác thì sản phẩm sau khi xử lý bằng kỹ thuật DPCD cho thấy lượng vi sinh vật tổng số trên mẫu nguyên liệu thấp hơn nhiều Nguyên nhân của ảnh hưởng trên là do tác dụng của nhiều yếu tố cùng một lúc, đặc biệt là khả năng biến tính màng tế bào và trích ly tế bào chất của CO2 ở trạng thái dense phase Nếu chỉ sử dụng áp suất cao thì hiệu quả ức chế vi sinh vật không tốt bằng do tế bào chỉ chịu tác động duy nhất bởi áp suất (có thể kể thêm nhiệt độ) và cũng cần một áp suất rất cao để đạt được hiệu quả mong muốn Mặt khác, trong các loại khí ở trạng thái dense phase thì CO2 là loại khí cho hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật cao hơn hẳn các khí khác chúng khó di chuyển qua màng tế bào vi sinh vật cũng như không có tác dụng giảm pH môi trường và pH nội bào như CO2 Việc làm giảm pH bằng các loại axit như axit phosphoric, axit HCl cũng như việc bổ sung các loại phụ gia chống vi sinh vật như SO2, acid benzoic, acid sorbic và muối của chúng không thể có tác dụng vô hoạt cao như CO2 do những chất kể trên không thể thấm qua màng tế bào dễ dàng như CO2 (Damar và Balaban, 2006)

Hiệu quả ức chế enzyme của kỹ thuật DPCD cũng cao hơn các kỹ thuật truyền thống khác Nghiên cứu vô hoạt enzyme polyphenol oxidase ở tôm hùm của Chen và cộng sự (1992) cho thấy hoạt tính enzyme trong mẫu chỉnh pH còn 35% sau 30 phút, trong khi đó hoạt tính trong mẫu xử lý bằng DPCD mất gần như hoàn toàn chỉ sau 1 phút Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy, nếu chỉ dùng nhiệt độ hoặc áp suất cao thì hiệu quả ức chế enzyme không tốt như xử lý bằng kỹ thuật DPCD

Chất lượng cảm quan của sản phẩm về màu sắc, mùi vị, cấu trúc sau khi xử lý bằng DPCD tốt hơn so với các kỹ thuật truyền thống khác Do nhiệt độ tiến hành kỹ thuật DPCD không cao nên hạn chế được những biến đổi bất lợi do nhiệt gây ra như sự biến màu, tạo mùi vị không mong muốn Mặt khác, áp suất của kỹ thuật DPCD cũng không cao nếu như so sánh với kỹ thuật áp suất thuỷ tĩnh cao (High Hydrostatic Pressure – HHP), do đó mà cấu trúc của sản phẩm cũng không bị biến đổi đáng kể

Thành phần dinh dưỡng của sản phẩm ít bị biến đổi, ít thất thoát các cấu tử mẫn cảm với nhiệt độ, các chỉ tiêu hoá lý khác như hàm lượng chất khô, pH, hàm lượng acid tổng hầu như không thay đổi

Chất lượng về cảm quan và dinh dưỡng tốt sau khi xử lý là ưu điểm nổi bật khi áp dụng kỹ thuật DPCD

Khí CO2 sử dụng trong kỹ thuật DPCD không gây độc, gây cháy nổ, rẻ tiền và có thể tái sử dụng lại trong quá trình xử lý bằng DPCD Ngoài ra,

CO2 ở trạng thái dense phase còn có những tính chất hoá lý phù hợp tạo được hiệu quả thanh trùng, tiệt trùng cao hơn so với các loại khí khác cùng trạng thái

Khả năng cớ giới hoá, tự động hoá cao

Nhờ các ưu điểm trên mà kỹ thuật DPCD được coi là có triển vọng trong tương lai, thay thế các kỹ thuật truyền thống khác

2.5.2 Nhược điểm

Ngoài các ưu điểm kể trên, kỹ thuật DPCD cũng tồn tại một số nhược điểm:

Chi phí đầu tư trang thiết bị cao

Do tác dụng của áp suất cao nên tuổi thọ thiết bị chịu ảnh hưởng nhiều, yêu cầu độ bền của thiết bị cũng tăng lên đáng kể

Phạm vi ứng dụng chưa rộng rãi do quá trình xử lý các mẫu dạng rắn gặp khó khăn

Việc vận hành hệ thống tương đối phức tạp

Trong số các nhược điểm kể trên thì vấn đề chi phí thiết bị cao đang là nhược điểm lớn của kỹ thuật DPCD Việc ứng dụng kỹ thuật này trong sản xuất đòi hỏi phải có sự tính toán cân đối giữa chi phí cần thiết để cải thiện các chỉ tiêu quan

trọng về cảm quan như màu sắc, mùi vị và kéo dài thời gian bảo quản nhờ kỹ thuật DPCD và giá cả sản phẩm trên thị trường

Chương 3 CÁC BIẾN ĐỔI CỦA THỰC PHẨM KHI XỬ LÝ

BẰNG KỸ THUẬT DPCD

3.1 Biến đổi sinh học

Kỹ thuật DPCD đã được chứng minh là có khả năng tiêu diệt vi sinh vật có mặt trong nguyên liệu dạng lỏng và dạng rắn DPCD có thể vô hoạt vi sinh vật ở dạng tế bào sinh dưỡng, dạng bào tử, các loại vi khuẩn chịu nhiệt và các loại nấm men, nấm mốc Kỹ thuật này có thể sẽ dần dần thay thế kỹ thuật dùng nhiệt độ cao trong một số sản phẩm cần giữ được các tính chất hoá lý về cấu trúc cũng như các tính chất cảm quan như màu sắc, mùi vị…

Có nhiều cơ chế liên quan đến khả năng vô hoạt vi sinh vật của kỹ thuật DPCD, tuy nhiên đến này vẫn chưa rõ cơ chế nào là chủ yếu Một số cơ chế đã được chứng minh như sau:

3.1.1 Cơ chế vô hoạt tế bào sinh dưỡng

3.1.1.1 Tác dụng giảm pH

CO2 có thể làm giảm pH khi hoà tan vào nước có trong thực phẩm và hình thành acid carbonic Khi phân ly, acid này tạo ra các ion bicarbonate, carbonate và H+ làm giảm pH môi trường

CO2 + H2O ↔ H2CO3

H2CO3 ↔ H+ + HCO3- pKa = 6,57 HCO3- ↔ H+ + CO32- pKa = 10,62

pH đo

pH dự đoán

pH quá trình

Hình 3.1: pH của nước xử lý với CO2 áp suất cao

pH nội bào của vi sinh vật có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng Khi môi trường ngoài dư H2CO3 thì chúng sẽ thấm qua màng tế bào dưới dạng không phân ly Vào bên trong tế bào, H2CO3 sẽ phân ly tạo ra H+ làm giảm pH nội bào Tế bào sẽ tự chỉnh pH nội bào về với giá trị phù hợp bằng cách bơm ion H+ ra ngoài môi trường Đây là cơ chế vận chuyển chủ động để đẩy H+ ra khỏi tế bào nhờ xúc tác của enzyme vận chuyển H+-ATPase và năng lượng do ATP cung cấp Khi có quá nhiều H2CO3 tràn vào, cơ chế bơm H+ sẽ không còn hiệu quả

do phải tiêu hao nhiều năng lượng để đạt pH cân bằng Kết quả là pH nội bào sẽ giảm mà không thể phục hồi được nữa (Damar và Balaban, 2006; Hong và Pyun, 1999)

Tác dụng giảm pH nội bào có thể làm vô hoạt tế bào thông qua việc làm rối loạn hệ thống trao đổi chất của tế bào do ức chế hoạt động của một số enzyme Các enzyme của hệ thống trao đổi chất sẽ bị ảnh hưởng với mức độ khác nhau tùy vào loại enzyme và giống vi sinh vật Đối với vi khuẩn Escherichia coli, các enzyme có điểm đẳng điện trong vùng acid như alkaline phosphatase và β-galactosidase bị vô hoạt hoàn toàn, trong khi đó các enzyme có điểm đẳng điện trong vùng base như acid phosphatase chỉ bị ảnh hưởng rất ít (Ballestra và cộng sự, 1996) Nghiên cứu của Hong và Pyun (2001) đã chứng minh khoảng 13 enzyme khác nhau của vi

khuẩn Lactobacillus plantarum dưới điều kiện xử lý bằng DPCD tại nhiệt độ 30oC và áp suất 7 MPa, trong đó có cystein arylamidase, α-galactosidase, α- và β-glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase mất hoạt tính đáng kể còn các enzyme lipase, leucine arylamidase, acid và alkaline phosphatase và Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase ít bị ảnh hưởng Khả năng sống sót của L plantarum giảm hơn 90%

Bảng 3.1: Sự thay đổi hoạt tính một số enzyme của vi khuẩn Lactobacillus

plantarum sau khi xử lý bằng kỹ thuật DPCD

Tuy nhiên, cho đến này, hầu như chưa có nghiên cứu nào đưa đến kết luận sự vô hoạt của enzyme nào sẽ ảnh hưởng chủ yếu đến sự sống của vi sinh vật Vì vậy những nghiên cứu tìm hiểu vai trò của các enzyme đối với sự sống của tế bào vẫn tiếp tục được thực hiện Việc phát hiện enzyme nào đóng vai trò quyết định đối với sự sống của tế bào là rất quan trọng vì từ đó ta có thể tiêu diệt vi sinh vật thông qua việc tập trung tiêu diệt các enzyme này (Damar và Balaban, 2006; Spilimbergo và Bertucco, 2003; Hong và Pyun,2001)

Tác dụng làm giảm pH của CO2 ban đầu được cho là cơ chế vô hoạt vi sinh vật chính Hiện nay, những cơ chế khác đã được chứng minh là có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả vô hoạt vi sinh vật hơn là ảnh hưởng của pH Tuy nhiên có một điều mà hầu hết các nhà khoa học đều đồng ý là tác dụng giảm pH chỉ có được chỉ khi CO2hoà tan vào nước để hình thành axit carbonic với một nồng độ đáng kể (Spilimbergo

3.1.1.2 Tác dụng của phân tử CO2 và ion bicarbonate

Một số enzyme thiết yếu trong bộ máy trao đổi chất của vi sinh vật có thể bị vô hoạt bởi tác dụng của phân tử CO2 Tại pH thấp, các nhóm amino của các enzyme này tác dụng với CO2 tạo thành các muối bicarbonate và các hợp chất carbamate và làm mất hoạt tính của enzyme Một ví dụ điển hình là enzyme decarboxylase bị vô hoạt do tác dụng này và vì thế mà chuỗi phản ứng trong hệ thống trao đổi chất bị gián đoạn, không thể thực hiện được (Spilimbergo và Bertucco, 2003)

Nghiên cứu của Ishikawa và cộng sự (1995) cho thấy hoạt tính của các enzyme như glucoamylase và acid protease chỉ còn lại rất thấp khi được xử lý bằng kỹ thuật DPCD Các nhà khoa học này kết luận rằng sự vô hoạt những enzyme trên xảy ra là

do sự hấp thu CO2 vào bên trong phân tử enzyme

Ngoài ra, sự kết tủa của các muối carbonate của Ca và Mg bên trong tế bào cũng có thể làm vô hoạt vi sinh vật Các protein chứa những cầu nối Ca là một trong những loại protein quan trọng nhất đối với tế bào Do tác dụng của CO2, các protein chứa cầu nối Ca, Mg sẽ bị kết tủa Điều này phụ thuộc vào đặc điểm của liên kết ion và cấu trúc protein Khi sự kết tủa xảy ra, hoạt động sống của tế bào bị rối loạn (Damar và Balaban, 2006)

3.1.1.3 Tác dụng phá vỡ tế bào

Cơ chế vô hoạt vi sinh vật được kết luận đầu tiên bởi kỹ thuật DPCD là sự phá vỡ cấu trúc tế bào Nguyên nhân tế bào bị vỡ là do sự giải phóng áp suất một cách đột ngột và sự giãn nở của CO2 bên trong tế bào (Fraser, 1951) Nakamura và cộng sự (1994) đã dùng kỹ thuật DPCD xử lý nấm men ở 40oC dưới áp suất 4 MPa trong thời gian 5 giờ và kết luận rằng sau khi xử lý, một số tế bào bị vỡ hoàn toàn, trong khi đó một số khác chỉ bị những vết sướt nhỏ hoặc xuất hiện những lỗ hổng trên bề mặt tế bào Nghiên cứu của Ballestra (1996) và cộng sự về tác động của kỹ thuật DPCD lên vi khuẩn E.coli trong điều kiện áp suất 5 MPa và nhiệt độ 35oC cho kết quả là hơn 25% tế bào không bị tác động của DPCD làm thương tổn nhưng khả năng sống chỉ còn khoảng 1% Tuy nhiên, nghiên cứu của Hong và các cộng sự (2001) lại đưa ra kết luận là không thể tăng hiệu quả vô hoạt vi sinh vật bằng cách gia tăng cường độ giải phóng CO2 hay giải phóng nhanh áp suất Hong và Puyn (1999) cho thấy rằng vi khuẩn L plantarum xử lý bằng CO2 (6,8 MPa, 30oC trong

vòng 60 phút) bị vô hoạt hoàn toàn nhưng kính hiển vi điện tử quét lại không cho thấy bất kỳ sự tổn thương nào về cấu trúc

Người ta có thể đánh giá mức độ vô hoạt gây ra bởi các thương tổn trên bề mặt tế bào do kỹ thuật DPCD bằng cách đếm trực tiếp các tế bào vỡ trên kính hiển vi Cách này chỉ cho kết quả tổng số tế bào vỡ mà không cho biết số tế bào thực sự bị ảnh hưởng cũng như tỷ lệ sống sót Lin và cộng sự (1991) đã dùng hàm lượng protein tổng giải thoát khỏi tế bào xử lý bằng DPCD để đánh giá mức độ thương tổn Sự giải phóng protein nội bào vào môi trường phụ thuộc vào kích thước lỗ hổng trên màng tế bào

Để quan sát hình thái các tế bào sau khi xử lý nhờ kỹ thuật DPCD, người ta sử dụng kính hiển vi quét eletron (SEM)

Mẫu không xử lý bằng DPCD Mẫu xử lý bằng DPCD

Hình 3.2: Aûnh chụp các tế bào Saccharomyces cerevisiae trong các mẫu không xử lý và có xử lý DPCD (27,5 MPa, 21oC, 5 phút với tỷ lệ CO2/ bia là 0,1) nhờ kỹ thuật

chụp ảnh quét electron (SEM micrograph) Hình 3.2 cho thấy, sau khi xử lý bằng DPCD, một số tế bào vị vỡ và xuất hiện các lỗ hổng trên bề mặt Một số tế bào bị những lỗ hổng khá lớn, trong khi số khác chỉ xuất hiện những lỗ hổng nhỏ Thông qua các lỗ hổng này mà các chất nội bào thoát ra ngoài và lượng chất nội bào thoát ra môi trường cũng khác nhau tùy vào kích thước lỗ hổng trên màng tế bào

Tuy nhiên cơ chế trên cho thấy những thiếu sót trong việc giải thích nguyên nhân tế bào bị ức chế dưới tác dụng của kỹ thuật DPCD: một lượng lớn tế bào

không có bất kỳ dấu hiệu tổn thương cấu trúc nào như bị vỡ, thủng bề mặt nhưng vẫn bị vô hoạt

Hiện nay, giả thuyết hầu hết tế bào vi sinh vật bị vô hoạt trong giai đoạn giải phóng áp suất vẫn còn tồn tại nhiều tranh cãi Một số nghiên cứu cho thấy có sự phá vỡ cấu trúc tế bào ở mức độ cao làm vô hoạt vi sinh vật, trong khi đó, một số nghiên cứu khác lại kết luận điều ngược lại: sự giải phóng áp suất độ ngột không đóng vai trò chính trong sự vô hoạt vi sinh vật mà phải có một cơ chế khác

3.1.1.4 Tác dụng biến tính màng tế bào và trích ly tế bào chất

CO2 khi tồn tại ở trạng thái dense phase sẽ có tính chất như một dung môi, vì vậy mà chúng có khả năng trích ly các tế bào chất và làm biến tính màng tế bào (Damar và Balaban, 2006; Spilimbergo và Bertucco, 2003; Hong và Pyun,2001) Như chúng ta đã biết, màng tế bào là một màng kép, phần ưa béo của các phospholipid hướng vào nhau và phần ưa nước hướng ra ngoài Như vậy, phần ngoài màng và trong màng là phần ưa nước Các phân tử CO2 trong trạng thái dense phase có khả năng khuếch tán, tính linh động cao nên có thể dễ dàng thấm qua màng tế bào và tương tác với thành phần ưa béo nằm giữa màng, làm biến tính màng tế bào và giảm tính nhạy cảm của màng (các nhà khoa học gọi hiện tượng này là “hiệu ứng gây tê”) Do hiệu ứng này mà màng tế bào trở nên lỏng lẻo, tính thấm tăng, cơ chế vận chuyển proton chủ động của tế bào bị phá vỡ và lượng CO2 tích lũy bên trong tế bào sẽ tăng lên Một khi CO2 đã thấm qua màng tế bào, nó có thể trích ly các thành phần nội bào và vận chuyển chúng ra ngoài, đặc biệt là trong giai đoạn giải phóng áp suất thì lượng chất trích ly ra môi trường tăng lên đáng kể Sự trích ly các thành phần sống và các lipid nội bào và màng làm vô hoạt tế bào vi sinh vật Thêm vào đó, do tác dụng làm cho màng trở nên lỏng lẻo và dễ thấm nên hiệu quả trích ly sẽ càng tăng

Kết quả nghiên cứu của Hong và Pyun (1999) tiến hành trên vi khuẩn L plantarum kết luận rằng cơ chế vô hoạt vi sinh vật không liên quan đến sự phá hủy cấu trúc tế bào trong quá trình giải phóng áp suất chính là cơ chế biến tính màng tế bào và trích ly tế bào chất Ảnh SEM cho thấy tế bào không có sự thay đổi nào lớn sau khi xử lý bằng DPCD và hình dáng bên ngoài của tế bào không có dấu hiệu biến tính Tuy nhiên, phim chụp bằng kỹ thuật chụp ảnh chuyển electron (TEM) lại

cho thấy có sự biến tính màng tế bào cùng với sự thất thoát của tế bào chất, cụ thể là khoảng không bao bọc giữa thành tế bào và màng tế bào chất trở nên lớn hơn và có những chỗ trống bên trong tế bào chất (hình 3.3) Kết quả là tế bào sau khi xử lý DPCD sẽ chịu những ảnh hưởng bất lợi không thể phục hồi như mất khả năng chịu muối, thất thoát các hợp chất hấp thụ tia UV, thất thoát các ion nội bào, suy yếu khả năng thấm proton

Hình 3.3: Ảnh chụp tế bào Lactobacillus plantarum trước và sau khi xử lý bằng kỹ

thuật DPCD nhờ kỹ thuật chụp ảnh chuyển electron (TEM)

a) Mẫu không xử lý bằng DPCD b) và c) Tế bào Lactobacillus plantarum xử lý bằng DPCD (7 MPa, 30oC, 1 giờ) Nghiên cứu sau này của hai nhà khoa học trên cũng với đối tượng vi khuẩn L plantarum xử lý bằng DPCD (7 Mpa, 30oC) vào năm 2001 cũng đã củng cố giả thuyết về tác dụng biến tính màng tế bào, trích ly các chất nội bào ra môi trường của kỹ thuật DPCD, do đó mà có thể tìm thấy sự có mặt của amino acid, peptide, các lipid trên màng và các ion trong môi trường ngoại bào Trong nghiên cứu này, Hong và Pyun đã tiến hành phân tích các hợp chất có khả năng hấp thụ tia UV và các ion như K+ và Mg2+ trong môi trường ngoại bào trong suốt quá trình xử lý Kết quả được thể hiện trên 2 đồ thị sau:

Thời gian xử lý (phút)

Độ hấp

thu (OD

260,

280)

Hình 3.4: Hàm lượng các chất hấp thu tia UV trích ly ra môi trường trong quá trình

xử lý L plantarum bằng DPCD

Thời gian xử lý (phút)

Kết quả cho thấy, nồng độ các chất hấp thu tia UV cũng như nồng độ các ion K+

và Mg2+ trong môi trường ngoại bào tăng dần theo thời gian và gần như ổn định sau

20 phút Như vậy, kết quả phân tích cho thấy có sự giải phóng các chất nội bào ra môi trường Tuy nhiên, sự giải phóng này không phải do cấu trúc tế bào bị phá vỡ mà là do tác dụng biến tính màng tế bào và trích ly tế bào chất của DPCD

Nhiều nghiên cứu khác cũng đã được tiến hành và đưa ra một số giả thuyết và kết luận về cơ chế vô hoạt vi sinh vật của kỹ thuật DPCD mà nội dung của chúng cũng tập trung vào các cơ chế nói trên Nghiên cứu của Dagan và Balaban dùng kỹ thuật DPCD để thanh trùng bia (2006) dưới điều kiện áp suất 27,6 MPa tại nhiệt độ

21oC trong vòng 5 phút đưa ra kết luận là hầu hết các tế bào nấm men đều có hiện tượng co ngót Nguyên nhân của hiện tượng này được hai nhà khoa học lý giải là do

CO2 trong điều kiện dense phase đã trích ly một phần tế bào chất của nấm men ra môi trường ngoài Bên cạnh đó, nghiên cứu này cũng cho thấy có sự tổn thương về mặt cấu trúc của tế bào nấm men: một số tế bào bị vỡ, số khác thì có các vết thương trên màng

Shimoda và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của DPCD lên khả năng sống của tế bào vi sinh vật (1998) cũng đưa ra các kết luận về tác dụng làm giảm pH nội bào, biến tính màng tế bào và trích ly tế bào chất của kỹ thuật này Ngoài ra, nghiên cứu còn khẳng định các tế bào nấm men S cerevisiae sau khi xử lý bằng DPCD (6 MPa,

35oC) bị vỡ do sự giãn nở của CO2 bên trong tế bào trong quá trình giải phóng áp suất Kết quả là các chất nội bào thoát ra môi trường ngoài và làm cho hàm lượng các chất có khả năng hấp thu tia UV của môi trường xử lý tăng lên đáng kể

Ngoài mẫu thực phẩm lỏng, kỹ thuật DPCD còn được dùng để xử lý mẫu dạng rắn Nghiên cứu của Hong và cộng sự dùng DPCD để ức chế vi khuẩn Lactobacillus

sp trên sản phẩm kimchi (1997) dưới các điều kiện xử lý khác nhau cũng đưa ra những giải thích tương tự về nguyên nhân gây vô hoạt vi sinh vật Theo kết luận của nghiên cứu này thì cũng có nhiều cơ chế ức chế và tiêu diệt vi sinh vật nhờ kỹ thuật DPCD, trong đó bao gồm việc giảm pH nội bào do acid carbonic vận chuyển qua màng vào tế bào rồi phân ly sinh ra H+, cơ chế biến tính màng lipid kép của tế bào dẫn đến “hiệu ứng gây tê” và trích ly các chất nội bào của vi sinh vật ra môi trường ngoài Nghiên cứu cũng đi đến kết luận là kỹ thuật DPCD có thể được sử dụng như là một kỹ thuật thanh trùng không dùng nhiệt để bảo quản kimchi

Mặc dù đưa ra những cơ chế vô hoạt vi sinh vật như trên, tuy vậy vẫn chưa thể kết luận cơ chế nào là cơ chế chủ yếu Các nhà khoa học đều cho rằng tác dụng vô hoạt vi sinh vật chủ yếu là do tác dụng của CO2 Việc làm giảm pH bằng các loại axit như axit phosphoric, axit HCl không thể có tác dụng vô hoạt cao như CO2

(Damar và Balaban, 2006) Những axit này không thể thấm qua màng tế bào dễ dàng như CO2 Khả năng thấm qua màng tế bào được cho là tác dụng chính trong việc giảm pH nội bào CO2 làm vô hoạt hầu như hoàn toàn các vi sinh vật, trong khi đó HCl thì không thể Tính thấm cũng như khả năng tác dụng như một dung môi hòa tan của CO2 trong điều kiện dense phase làm biến tính màng tế bào dẫn đến “hiệu ứng gây tê” được cho là đóng vai trò chính trong việc vô hoạt vi sinh vật

Bảng 3.2: Một số kết quả nghiên cứu khả năng vô hoạt các chủng vi sinh vật khác

nhau bằng kỹ thuật DPCD

Bảng 3.2 (tt)

3.1.2 Cơ chế vô hoạt bào tử

Một số vi khuẩn có khả năng sản sinh một thể nghỉ được gọi là bào tử dưới tác dụng của điều kiện bất lợi Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất và kháng áp suất thẩm thấu cao hơn so với các tế bào sinh dưỡng Chẳng hạn như bào tử của vi khuẩn Clostridium botulinum phải xử lý ở 121oC trong vòng 10 phút mới chết, tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn Clostridium thermosaccharolytium ở

50oC chết rất nhanh nhưng bào tử của nó thì ngay cả ở nhiệt độ 130oC cũng chỉ diệt được 90%

Bào tử có tính bền vững như vậy là do màng của chúng là một cấu trúc phức tạp và vững chắc bao gồm màng ngoài, lớp áo bào tử và lớp vỏ bào tử Trong khi màng tế bào sinh dưỡng có tính linh động thì màng bào tử khá trơ, tính linh động kém, tính đề kháng cao với lizozyme và các enzyme thủy phân như proteinase, trơ với các chất hóa học như chất hoạt động bề mặt, và có tính thẩm thấu kém đối với các cation

Muốn tiêu diệt bào tử, một điều cần thiết phải làm là phải hoạt hóa chúng, tức là tạo điều kiện thuận lợi cho chúng nảy mầm trở thành dạng tế bào sinh dưỡng thì sau đó mới tiêu diệt được

Kỹ thuật DPCD đã được nghiên cứu và kết luận là có khả năng tiêu diệt bào tử trong một phạm vi nào đó Quá trình vô hoạt bào tử trải qua hai giai đoạn:

Giai đoạn hoạt hóa, nảy mầm: sử dụng các tác nhân như nhiệt độ cao (ví dụ như xử lý ở 80oC trong vòng 10 phút), áp suất cao để kích thích bào tử nảy mầm Dưới tác dụng của các tác nhân trên, lớp màng cứng của bào tử

bị phá vỡ, nước thấm vào lõi bào tử và hoạt hóa các enzyme, tổng hợp các cơ quan nội bào, ADN, ARN và protein mới Nhiều nghiên cứu cho rằng trong giai đoạn này nhờ sự hỗ trợ của nhiệt độ và áp suất cao mà các phân tử CO2 sẽ dễ dàng thấm qua màng bào tử, góp phần phá vỡ lớp màng dẫn đến đẩy nhanh tốc độ hoạt hóa và nảy mầm của bào tử

Giai đoạn tiêu diệt: bào tử sau khi được hoạt hóa và nảy mầm sẽ trở nên mẫn cảm dưới tác dụng của DPCD và sẽ dễ dàng bị tiêu diệt

Bảng 3.3: Một số kết quả nghiên cứu về khả năng vô hoạt bào tử của các chủng vi

sinh vật khác nhau bằng kỹ thuật DPCD

Cơ chế vô hoạt bào tử hiện vẫn chưa rõ ràng Giả thuyết cho rằng nhiệt độ sẽ làm tăng khả năng thẩm thấu của CO2 vào bên trong bào tử, bên cạnh đó điều kiện xử lý bằng DPCD cũng kích thích quá trình nảy mầm của bào tử cùng với nhiệt độ và cả hai yếu tố này cùng làm tăng tính mẫn cảm của bào tử, hỗ trợ nhau trong việc tiêu diệt bào tử Nếu chỉ dùng nhiệt độ thì hiệu quả tiêu diệt bào tử không cao bằng

so với khi sử dụng kỹ thuật DPCD CO2 trong điều kiện dense phase vừa có tác dụng gia tăng tốc độ hoạt hóa, nảy mầm của bào tử, vừa đẩy nhanh tốc độ vô hoạt chúng (Damar và Balaban, 2006; Spilimbergo và Bertucco, 2003; Ballestra và Cuq; 1998)

Do các bào tử có khả năng đề kháng cao với những tác động bất lợi từ môi trường nên rất khó tiêu diệt chúng hoàn toàn Càng muốn nâng cao hiệu quả vô hoạt bào tử thì điều kiện xử lý phải càng khắc nghiệt, hậu quả là chất lượng thực phẩm sẽ bị ảnh hưởng một cách nghiêm trọng hơn Vì vậy, hiệu quả của kỹ thuật DPCD trong việc vô hoạt bào tử chỉ đạt được trong một phạm vi giới hạn

3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng vô hoạt vi sinh vật bằng kỹ thuật DPCD

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả vô hoạt vi sinh vật của kỹ thuật DPCD, bao gồm các yếu tố về kỹ thuật như áp suất, nhiệt độ, độ ẩm cũng như các yếu tố về thiết bị và các yếu tố về vi sinh vật

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm khảo sát mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố đến hiệu quả vô hoạt chung nhằm tối ưu hóa quá trình và giảm đến mức thấp nhất các ảnh hưởng không có lợi đến chất lượng thực phẩm

3.1.3.1 Aûnh hưởng của áp suất

Áp suất là một trong những yếu tố công nghệ quan trọng nhất trong kỹ thuật DPCD Áp suất quyết định đến tính chất hóa lý, khả năng khuếch tán cũng như tính hòa tan của CO2 Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả khác nhau khi khảo sát về ảnh hưởng của áp suất đến hiệu quả vô hoạt vi sinh vật cho thấy khả năng vô hoạt

vi sinh vật tăng tỷ lệ thuận với sự tăng áp suất trong một giới hạn nhất định (Damar và Balaban, 2006; Werner and Hotchkiss, 2006; Gunes và cộng sự, 2005; Spilimbergo và Bertucco, 2003; Shimoda và cộng sự, 1998, 2001; Hong và cộng sự,

1997, 1999; Hong và Pyun, 1999; Louka và cộng sự, 1999) Nguyên nhân làm tăng hiệu quả vô hoạt vi sinh vật dưới ảnh hưởng của áp suất là do:

Áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan của CO2, dẫn đến tăng khả năng thẩm thấu của CO2 vào tế bào Do lượng CO2 thẩm thấu tăng làm biến tính màng tế bào và giảm pH nội bào nhanh hơn với mức độ cao hơn Hầu hết mọi nghiên cứu đều thống nhất về kết luận này

Áp suất cao tại nhiệt độ tới hạn còn làm tăng khả năng trích ly của CO2, khiến cho các chất nội bào dễ dàng được trích ra khỏi tế bào và tế bào sẽ dễ bị vô hoạt hơn (Gunes và cộng sự, 2005; Hong và cộng sự, 1997, 1999)

Áp suất cao sẽ làm bào tử hoạt hóa và nảy mầm nhanh hơn, từ đó dễ dàng vô hoạt chúng hơn (Damar và Balaban, 2006; Spilimbergo và Bertucco, 2003; Shimoda và cộng sự, 2002; Ballestra và Cuq, 1997)

Quá trình giải phóng áp suất cũng ảnh hưởng đến hiệu quả vô hoạt vi sinh vật: áp suất cao được giải phóng một cách đột ngột về áp suất thường, thậm chí về vùng chân không sẽ làm vỡ cấu trúc và tiêu diệt tế bào

Bên cạnh đó, áp suất càng cao thì thời gian xử lý có thể ngắn lại nhưng hiệu quả vô hoạt đạt được vẫn cao Nhiều nghiên cứu cũng chứng minh rằng khi áp suất CO2nằm trong vùng dense phase (>7 MPa) thì hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật sẽ cao hơn nhiều so với áp suất ở vùng gần tới hạn (subcritical condition) (Damar và Balaban, 2006; Werner và Hotchkiss, 2006; Gunes và cộng sự, 2005; Louka và cộng sự, 1999)

Theo Damar và Balaban (2006) thì áp suất thường sử dụng trong kỹ thuật DPCD nằm trong khoảng dưới 50 MPa Áp suất quá cao thì hiệu quả vô hoạt vi sinh vật tăng không đáng kể

Áp suất là một trong những thông số kỹ thuật quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả vô hoạt vi sinh vật của kỹ thuật DPCD Tuy nhiên, cũng có nghiên cứu kết luận rằng ảnh hưởng của áp suất chỉ trong một phạm vi giới hạn Áp suất ảnh hưởng đến khả năng hòa tan và khuếch tán của CO2, nhưng khi môi trường đã bão hòa CO2 thì việc tăng áp suất trở nên vô nghĩa vì khi đó, hiệu quả vô hoạt vi sinh vật của kỹ thuật DPCD tăng rất ít, không đáng kể (Damar và Balaban, 2006) Nghiên cứu của Werner và Hotchkiss trên đối tượng sữa nguyên liệu năm 2006 đã ứng dụng kỹ thuật DPCD như một kỹ thuật thanh trùng mới cho sữa thô nguyên liệu Bằng việc sử dụng phương pháp dòng chảy liên tục (continuous flow method), nghiên cứu đã kết luận rằng CO2 tại áp suất và nhiệt độ ở vùng dense phase sẽ cho hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật tốt hơn so với vùng gần tới hạn (subcritical)

Bảng 3.4: Tổng số khuẩn lạc (đơn vị log10, lấy giá trị trung bình và độ lệch chuẩn)

trên sữa nguyên liệu tại các nhiệt độ, áp suất và tỷ lệ CO2 sử dụng

– : không khảo sát

Shimoda và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật DPCD lên nấm men S cerevisiae (2001) cũng khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả vô hoạt vi

sinh vật và đưa ra kết luận là hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật tăng cùng với việc tăng áp suất xử lý

Hình 3.6: Aûnh hưởng của áp suất đến hiệu quả vô hoạt Saccharomyces cerevisiae

bằng DPCD Karaman và Erkmen nghiên cứu động học quá trình vô hoạt vi khuẩn E coli trên nước luộc thịt dùng kỹ thuật DPCD (2001) kết luận rằng tốc độ vô hoạt E coli khi áp suất xử lý càng tăng và cho rằng tại áp suất thấp thì thời gian cần thiết để đạt được hiệu quả vô hoạt đáng kể càng kéo dài

Hình 3.7: Aûnh hưởng của áp suất lên tốc độ vô hoạt vi khuẩn E coli bằng kỹ thuật

DPCD

Nghiên cứu của Hong và Pyun về động học quá trình vô hoạt L plantarum bằng kỹ thuật DPCD năm 1999 cũng đề cập đến các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả vô hoạt vi sinh vật và đã đưa ra những kết luận là tốc độ vô hoạt vi khuẩn L plantarum tăng khi áp suất tăng trong điều kiện nhiệt độ 30oC

Thời gian xử lý (phút)

Năm 1997, Hong và các cộng sự khi nghiên cứu về vô hoạt khuẩn Lactobacillus

sp trên sản phẩm kimchi đã chứng minh giả thuyết khi áp suất tăng thì thời gian xử lý có thể rút ngắn lại nhưng vẫn đảm bảo hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật Tại nhiệt độ

30oC, để giảm số lượng tế bào tổng cộng đi 3 log thì với áp suất CO2 là 30 kg/m2

phải mất tới 240 phút, trong khi đó với áp suất 70 kg/m2 thì chỉ cần không đến 140 phút

Tỷ lệ tế

phẩm kimchi bằng kỹ thuật DPCD

Kết quả trên hình 3.9 cũng cho thấy, ban đầu tốc độ vô hoạt diễn ra khá chậm, sau đó tăng nhanh đáng kể Điều này có thể được giải thích như sau: ban đầu, cần phải có một khoảng thời gian để CO2 khuếch tán vào bên trong tế bào Khi hàm lượng CO2 bên trong tế bào đã tăng đến mức tới hạn (critical level) thì tốc độ vô hoạt sẽ tăng nhanh do nồng độ CO2 đủ để biến tính mạnh mẽ màng tế bào, gây rối loạn bộ máy trao đổi chất thông qua việc vô hoạt các enzyme và trích ly các thành phần trong tế bào chất

3.1.3.2 Aûnh hưởng của nhiệt độ

Cùng với áp suất thì nhiệt độ cũng là một thông số vô cùng quan trọng trong kỹ thuật DPCD Nhiệt độ có những ảnh hưởng phức tạp đến hiệu quả của kỹ thuật DPCD

Như chúng ta đã biết, độ tan của khí CO2 sẽ tăng khi nhiệt độ giảm Nhiệt độ tăng thì khả năng hòa tan của CO2 giảm Tuy nhiên, điều này lại không hề làm suy giảm khả năng vô hoạt vi sinh vật của kỹ thuật DPCD vì nhiệt độ tăng sẽ làm tăng khả năng khuếch tán và thẩm thấu của CO qua màng tế bào, do đó mà hàm lượng

CO2 hòa tan tuy có giảm nhưng lượng CO2 đi qua màng tế bào lại tăng lên Bên cạnh đó, nhiệt độ cao cũng làm màng tế bào trở nên linh động, dễ thấm khiến CO2càng dễ dàng di chuyển qua màng hơn, chính vì vậy lại làm tăng khả năng tiêu diệt

vi sinh vật (Damar và Balaban, 2006; Spilimbergo và cộng sự, 2005; Hong và Pyun, 1999)

Thêm vào đó, nhiệt độ tăng cũng làm thay đổi trạng thái của CO2 Tại áp suất cao trên 7 MPa và nhiệt độ trên 31oC thì CO2 sẽ chuyển sang trạng thái dense phase, nếu nhiệt độ và áp suất tiếp tục tăng cao thì CO2 sẽ đi vào vùng siêu tới hạn, khi đó thì tính thấm của CO2 sẽ rất cao và dễ dàng phát huy tác dụng tiêu diệt vi sinh vật Tuy nhiên, trong vùng siêu tới hạn thì tính thấm và khả năng hòa tan cũng như khả năng khuếch tán của CO2 chỉ tăng trong khu vực giới hạn gần điểm tới hạn, nếu nhiệt độ và áp suất quá cao so với điểm tới hạn thì khả năng hòa tan của CO2giảm đi đáng kể (Damar và Balaban, 2006; Hong và Pyun, 1999)

Hầu hết các nghiên cứu đều kết luận là khi nhiệt độ tăng trong một phạm vi giới hạn thì hiệu quả vô hoạt vi sinh vật của kỹ thuật DPCD cũng tăng với nguyên nhân đã trình bày như trên Nhiệt độ tăng thì tốc độ vô hoạt vi sinh vật tăng lên, thời gian xử lý có thể rút ngắn (Damar và Balaban, 2006; Werner và Hotchkiss, 2006; Spilimbergo và Bertucco, 2003; Shimoda và cộng sự, 2001; Hong và Pyun, 1999; Hong và cộng sự, 1997, 1999)

Ngoài ra, nhiệt độ còn góp phần làm cho bào tử hoạt hóa và nảy mầm nhanh hơn, từ đó cùng với áp suất sẽ tiêu diệt chúng dễ dàng hơn (Damar và Balaban, 2006; Ballestra và Cuq, 1997)

Thông thường, nhiệt độ áp dụng kỹ thuật DPCD dao động trong khoảng từ 5oC đến 60 oC, hay dùng nhất là khoảng nhiệt độ từ 25-35oC (Damar và Murat O Balaban, 2006) Đối với việc vô hoạt bào tử thì nhiệt độ cần thiết cho quá trình hoạt hóa và nảy mầm bào tử là từ 80-90oC (Damar và Balaban, 2006; Ballestra và Cuq, 1997) Tuy nhiên, một hậu quả không thể tránh khỏi là nếu sử dụng nhiệt độ quá cao thì chất lượng của thực phẩm sẽ bị ảnh hưởng đáng kể, đặc biệt là các chỉ tiêu cảm quan

Nghiên cứu của Shimoda và cộng sự (2001) kết luận là hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật tăng cùng với việc tăng thời gian xử lý

Hình 3.10: Aûnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả vô hoạt S cerevisiae bằng DPCD

(○) 8 MPa; (●) 10 MPa Kết quả nghiên cứu của Hong và Pyun về động học quá trình vô hoạt L plantarum bằng kỹ thuật DPCD (1999) cho thấy nhiệt độ càng tăng thì tốc độ vô hoạt vi sinh vật càng tăng theo thời gian xử lý tại áp suất 70 kg/cm2

Hình 3.11: Aûnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ vô hoạt L plantarum bằng kỹ thuật

DPCD

Trước đó, năm 1997, Hong và các cộng sự khi nghiên cứu về vô hoạt khuẩn Lactobacillus sp trên sản phẩm kimchi cũng đã kết luận là hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật tăng cùng với sự tăng nhiệt độ xử lý

Hình 3.12: Aûnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ tiêu diệt Lactobacillus sp trên sản

phẩm kimchi bằng kỹ thuật DPCD (50 kg/cm2, tỷ lệ CO2 50%)

3.1.3.3 Thời gian xử lý

Thời gian xử lý cũng là một thông số kỹ thuật quan trọng trong quá trình tiến hành kỹ thuật DPCD Hầu hết mọi nghiên cứu đều kết luận rằng thời gian xử lý càng kéo dài thì hiệu quả vô hoạt vi sinh vật càng cao Cùng với áp suất và nhiệt độ, thời gian xử lý là một thông số được dùng để nâng cao ảnh hưởng ức chế, tiêu diệt vi sinh vật của kỹ thuật DPCD Thời gian kéo dài thì những ảnh hưởng của DPCD lên sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật sẽ diễn ra sâu sắc hơn, dẫn đến lượng vi sinh vật bị tiêu diệt nhiều hơn

Điều khiển và kiểm soát các thông số về thời gian là vô cùng quan trọng trong kỹ thuật DPCD Nếu thời gian xử lý đủ dài thì xác suất vi sinh vật còn sống sót sau khi xử lý bằng DPCD rất thấp

Cũng tương tự như quá trình thanh, tiệt trùng dùng nhiệt, vấn đề vô trùng tuyệt đối trong mẫu là khó có thể đạt được cho dù có kéo dài thời gian xử lý lên nhiều