BÁO CÁO DI TRUYỀN THỰC VẬT LY TRÍCH DNA TỪ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT

Kiểm tra chất lượng DNA:1.Định tính DNA bằng phương pháp điện di  Để kiểm tra kết quả ly trích có thu được DNA hay không, chúng tôi tiến hành điện di các mẫu DNA đã ly trích trên gel ag

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM

I Phần giới thiệu

II Nguyên tắc và yêu cầu

III Một số hoá chất thông dụng dùng trong ly trích axít nucleic

IV Quy trình ly trích DNA sử dụng CTAB

V Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)

VI Phương pháp ly trích DNA từ bào thực vật (lá bưởi):

VII Phương pháp ly trích DNA từ bào động vật (tôm):

I Phần giới thiệu:

 DNA - vật liệu mang thông tin di truyền, là yếu tố mở đầu cho

mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử

 ly trích DNA nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc bao

bọc của tế bào, để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng sinhhọc phân tử

 Trong phạm vi bài báo cáo, chúng ta tìm hiểu quá trình ly trích

DNA từ tế bào thực vật và động vật

II.Nguyên tắc và yêu cầu

 Ly trích DNA là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gen

đều tiến hành với DNA (hay RNA)

 DNA ly trích được cần đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên

vẹn về cấu trúc để thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theotrong công nghệ gen thực vật và động vật

 Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA , tuỳ thuộc mục đích

nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp tách DNA cho phùhợp

Phương pháp hóa học Hợp chất tẩy SDS và Proteinase

3 Hòa tan DNA

Trong dd buffer TE

(pH 8) => DNA

không biến tính

4 Loại bỏ các thành phần không phải là DNA

Proteinase K: loại

bỏ protein

ethanol 95% hoặc isoproanol ủ ở – 20 0 C

7 Làm khô DNA

Bằng ethanol 70% => loại các muối và dấu vết isopropanol Sấy khô hay để qua đêm => tránh ảnh

hưởng của ethanol còn sót lại

Độ nguyên vẹn

Độ sạch Nồng độ axít nucleic

Kiểm tra chất lượng DNA:

1.Định tính DNA bằng phương pháp điện di

 Để kiểm tra kết quả ly trích có thu được DNA hay không, chúng

tôi tiến hành điện di các mẫu DNA đã ly trích trên gel agarose0.8% Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 20 phút Gel saukhi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại (UV) Nếu mẫu cóDNA thì băng DNA sẽ phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di

Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinhsạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA

Kiểm tra mẫu bằng phương pháp điện di:

 Sau khi thu được sản phẩm ly trích, có thể tiến hành kiểm tra kết

quả ly trích bằng phương pháp điện di trên agarose dựa trên đặc tính tích điện âm của DNA, vì vậy, khi được đặt vào điện trường

trong dung dịch có pH trung tính, DNA sẽ bị hút về cực dương(anod) và bị đẩy khỏi cực âm (catod)

Kiểm tra mẫu bằng phương pháp điện di:

 Trong quá trình điện di, các phân tử DNA sẽ được phân loại

theo kích thước, các phân tử nhỏ sẽ bị hút về cực dương trước

do các phân tử nhỏ đi qua lỗ gel dễ dàng hơn Có thể nói khoảng

cách mà đoạn DNA đi qua sẽ tỉ lệ nghịch với trọng lượng phân tửcủa nó

 Thông qua bước điện di kiểm tra kết quả ly trích có thể cho ta

biết được độ nguyên vẹn cao DNA khi các băng DNA gọn, tậptrung và rõ nét Qua kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA cũng xácđịnh được mức độ tinh sạch của sản phẩm DNA ly trích được

2 Định lượng DNA bằng quang phổ kế

 Các mẫu DNA ly trích sau khi đã định tính được kiểm tra độ tinh

sạch và ước lượng hàm lượng DNA bằng cách đo mật độ quang

OD (optical density) với bước sóng 260nm và 280nm bằng máyquang phổ kế với độ pha loãng 100 lần Hàm lượng DNA đượctính theo công thức:

 DNA (ng/µl) = [(62.9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100

 DNA được xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong

khoảng 1.7 đến 2.2

Hình ảnh sợi DNA trong ống nghiệm

III Một số hoá chất thông dụng dùng trong ly trích axít nucleic

Dung dịch đệm Tris Tạo môi trường ly trích có pH

8.0, pH giúp này giúp DNA ổnđịnh

CTAB (Cetryl Ammonium

Bromide)

Phá vỡ vách tế bào và màng nhân

Chloroform Làm biến tính Protein; tách lớp

dung dịch sau ly tríchIsoamyl Alcohol Giúp mẫu không bị sủi bọt trong

khi vortex hay ly trích tốc độ cao

III Một số hoá chất thông dụng dùng trong ly trích axít nucleic (tt)

Isopropanol ở -200C Kết tủa DNA

Nước cất hoặc dd buffer TE Giúp DNA không bị biến tính

SDS - Sodium Dodecyl Sulfate Phá vỡ màng tế bào

Proteinase K Loại bỏ các protein; phân giải các

enzyme nuclease

IV Quy trình ly trích DNA sử dụng phương pháp CTAB:

 Được sử dụng để chiết suất DNA đạt chất lượng cao và

với số lượng lớn

 Quy trình ly trích DNA sử dụng phương pháp CTAB:

1 Chọn mẫu từ 0,5 – 3g hoặc nhiều hơn, rửa sạch, lau khô

2 Nghiền mẫu trong Nitơ lỏng

3 Xử lý mẫu trong CTAB

4 Ủ 1 giờ ở 60oC => phá vở màng sinnh chất, màng nhân

5 Ly tâm ở 9000 rpm trong 10 phút thu lấy dịch nổi

6 Xử lý dung dịch thu được với Chloroform/Isoamyl alcohol

10 phút => làm biến tính protein

7 Ly tâm với 9000 rpm trong 10 - 15 phút, thu lấy dịch nổi

8 Xử lý dung dịch thu được với enzyme Rnase => thu được

DNA tinh khiết

9 Kết tủa với dung dịch Isopropanol tỷ lệ 1:2/3

 Quy trình ly trích DNA sử dụng phương pháp CTAB (tt):

10 Để lắng, rửa, sấy khô, hòa tan trong nước cất hoặc dung

dịch TE bảo quản ở 40C để sử dụng hoặc lâu dài ở (-200Cđến 800C

VIII Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)

 PCR là phương pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA trong

ống nghiệm Đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra hàng triệu đoạnDNA đồng nhất từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA,protein, polysacharide, DNA không có chức năng và DNA cóchức năng di truyền Người ta còn gọi đó là kỹ thuật tạo dòngDNA invitro

 PCR được dùng rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực về sinh học.

PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiềuchu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau:

Bước 1: Biến tính (Denature)

 Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 – 95 độ C) trong

vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép táchhoàn toàn thành 2 mạch đơn

 Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng

hợp 2 mạch bổ sung mới

Bước 2: Bắt cặp (Annealing)

 Phản ứng của primer tác động lên dây nền, các primer này gắn

vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template để

có phân tử DNA mới

 Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp đến mức cho phép các

primer bắt cặp được với khuôn, nhiệt độ này dao động trongkhoảng 30 – 70 độ C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút,tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) củacác primer sử dụng

 Bước 3: Kéo dài (Extension)

 Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ - 3’

của 2 primer nhờ hoạt động của polymerase

 Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA

IX Phương pháp ly trích DNA từ tế bào thực vật

3 Nguyên tắc

 Để tiến hành ly trích DNA từ tế bào thì ta phải tiến hành phá bỏ

màng tế bào và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏlượng protein chứa trong dịch tách, loại bỏ RNA và sau cùng làkết tủa DNA bằng cồn Tủa sau khi thu được được hòa tan lạitrong dung dịch đệm TE hoặc nước cất vô trùng tùy theo mụcđích nghiên cứu

 Khác với ly trích tế bào động vật, khi ly trích tế bào thực vật thì ta

phải tiến hành loại bỏ đường thành phần có nhiều trong mô thựcvật Ở đây ta dùng phương pháp tách CTAB tức là dùng dungdịch đệm CTAB để tách DNA ra khỏi mô thực vật Chất này chỉhòa tan DNA chứ không hòa tan được đường, nhờ vậy mà có thểloại bỏ đường ra khỏi dịch chiết tách DNA

3.1 Phá bỏ màng tế bào và màng nhân

 Người ta có thể phá bỏ màng tế bào và màng nhân bằng phương

pháp hóa học hay cơ học Ở đây chúng ta dùng phương pháp cơhọc, nghiền nát bằng máy xay và dùng nitơ lỏng để phá bỏ tế bàothực vật

3.2 Chiết DNA và loại bỏ protein

 Sau khi phá bỏ màng tế bào và nhân thì dùng dung dịch đệm

CTAB để hòa tan DNA Nhưng trong dịch chiết có lẫn protein vàRNA nên để thu nhận được DNA tinh sạch ta phải tiến hành bướcloại bỏ protein và RNA Ở đây thường dùng phenol, chloroform

và isoamylalcohol

• Phenol có tác dụng làm biến tính protein và không hòa tan axít

nucleic

• Chloroform cũng có tác dụng làm biến tính protein nhưng nó còn

có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol ra khỏi phần dung dịch cóchứa DNA

• Isoamylalcohol có tác dụng ổn định giữa hai pha nước và pha

chloroform

3.3 Kết tủa CTAB và DNA

 Để loại bỏ CTAB thì cần phải kết tủa CTAB và DNA rồi sau đó

hòa tan DNA trong dung dịch NaCl mà tủa CTAB không tan trongdung dịch này

3.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch DNA

 Sau khi loại bỏ CTAB bằng dung dịch HCl 1M, ta tiến hành kết

tủa DNA bằng Ethanol nguyên chất lạnh, để tăng khả năng kết tủa

ta có thể pha thêm dung dịch muối CH3COONa 3M (2 thể tíchEthanol/thể tích dung dịch cần tủa, 0.1 thể tích dung dịch muối/thể tích dung dịch cần tủa Ngoài ra còn có thể tủa bằngisopropanol (0.8-1 thể tích Isopropanol/ thể tích dung dịch cầntủa

 Muối lẫn trong DNA sẽ ảnh hường đến kết quả các thí nghiệm sau

này nên người ta thường tiến hành rửa tủa DNA bằng dung dịchethanol 70%

4 Các bước tiến hành

4.1 Nghiền nhỏ mẫu thực vật

 Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g lá lúa (được làm

đông lạnh trước khi dùng) xay cho đến khi thành bột mịn

 Chuyển bột lá mía vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước

rồi cho vào cốc 50 ml nitơ lỏng Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng

4.2 Sử dụng dung dịch đệm CTAB để tách DNA và loại bỏ protein

 Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu lá lúa đã

được xử lí trên rồi tiến hành lắc nhẹ

 Ngâm trong bể nước nóng ở 56 độ trong vòng 20 phút

 Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở

nhiệt độ phòng Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ốngdùng để quay ly tâm và tiến hành quay ly tâm ở nhiệt độ phòng(2800 rpm, 20 phút)

 Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2

ml

 dung dịch CTAB 10% đã được hâm nóng ở 70 độ.Sau đó trộn

đều

 Cho 20 ml Chloroform: isoamyl alcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở

nhiệt độ phòng.Sau đó quay ly tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm,

20 phút) Thu lớp nước trên vào ống nghiệm mới

4.3 Kết tủa CTAB và DNA

 Cho 30 ml (1.5 thể tích dung dịch thu được ở thí nghiệm trên)

đệm kết tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng DNAmàu trắng đục nổi lên

 Quay ly tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút) Loại bỏ phần

dịch lỏng thu phần kết tủa

4.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch DNA

 Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56oC NaCl

1M và cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phânhủy RNA

 Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa DNA

 Quay ly tâm, lấy phần tủa

 Cho 20ml cồn 70 %, quay ly tâm, lấy phần tủa

 Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay ly tâm lấy phần tủa

 Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô DNA

Lúc này DNA sẽ chuyến sang trong suốt không màu

 Hòa tan DNA thu được vào 2ml đệm TE, bảo quản ở -20oC cho

thí nghiệm tiếp theo

4.5 Tiến hành kiểm tra chất lượng dung dịch ly trích

X Phương pháp ly trích DNA từ tế bào động vật:

2 Nguyên tắc

 Có thể ly trích DNA từ các nguyên liệu khác nhau như máu, nước

bọt, mô cơ, lông, tóc (còn nguyên chân tóc, chân lông) và các loại

mô khác Có nhiều phương pháp ly trích khác nhau Tuy vậy

nguyên tắc chung khi ly trích DNA động vật là:

• Tách tế bào có nhân ra khỏi vật mang;

• Phá vỡ tế bào, màng và phân hủy protein, giải phóng DNA ra

khỏi nhân

• Tách DNA ra khỏi đệm và bảo quản ở 4oC

3 Các bước tiến hành: tùy theo nguyên liệu khác nhau mà có thể

áp dụng một số bước tiến hành như sau:

3.1 Ly trích DNA từ mô thực vật

1 Cắt mô thành từng miếng nhỏ Nghiền mô trong nitơ lỏng để

thành bột mịn Cho mẫu vào ống nghiệm chờ cho nitơ bay hơihết Cho khoảng 100 mg mẫu vào tuýp Eppendorfs loại 1,5 ml

2 Thêm 500 μl đệm STE, hòa trộn nhẹ nhàng Bổ sng 12 μl

proteinase K (nồng độ 10 mg/ml) và 37 μl SDS 10% Trộn đềuhỗn hợp ủ trong 2 giờ ở 55oC, thỉnh thoảng lác nhẹ

3 Thêm 1 lượng dung dịch PCI bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ để ở

nhiệt độ phòng trong 5 phút Ly tâm 9000 rpm trong 5 phút

4 Chuyển phần dịch nổi sang tuýp Eppendorfs sạch Lặp lại 3 và 4

lần nữa

5 Thêm một lượng dung dịch CI bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ, để ở

nhiệt độ phòng 5 phút Ly tâm 9000 rpm trong 5 phút Chuyểnphần dịch nổi sang tuýp Eppendorfs sạch

6 Thêm một lượng Sodium acetate 3M bằng 1/10 lượng mẫu và

một lượng Ethanol bằng 2,5 lần lượng mẫu ở -20oC ít nhất trong

2 giờ hoặc qua đêm Ly tâm 9000 rpm trong 10 phút

7 Rửa sạch bằng Ethanol 70%, hút sạch Ethanol

8 Hòa tan kết tủa bằng 500 μl dung dịch TE, bảo quản ở 4oC

9 Tiến hành kiểm tra chất lượng dung dịch ly trích

3.2 Ly trích DNA từ máu bằng Chelex:

1 lấy 100 μl máu tươi, hoặc 1 miếng giấy, vải thấm máu kích thước

0,5 x 0,5 cm cho vào tuýp Eppendorfs

2 Thêm 1 ml đệm chiết PSP (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM

Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) lắc đều, sau đó để yên ở nhiệt độ

phòng trong 30 phút Ly tâm 15000 prm trong 5 phút Thu kết

tủa

3 Lập lại bước 2 khoảng 2 – 3 lần

4 Thêm 130 μl Chelex, bảo quản ở 4oC đến -20oC

3.3 Ly trích DNA từ máu từ muối:

1 Lấy khoảng 0,1 ml máu tĩnh mạch cho vào tuýp Eppendorfs có

chứa 25 μl EDTA 0,4 M, lắc đều

2 Thêm vào tuýp Eppendorfs đệm phá hồng cầu (1 mM NH4CO3,

115 mM NH4Cl) Ly tâm 500 rpm Thu kết tủa, loại bỏ phần dịchnổi phía trên

3 Thêm vào 200 μl đệm phá hồng cầu (100 mM Tris-HCl pH 7.6,

40 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2% SDS, 0,05 Sodium azdieNaN3) Lắc đều

4 Thêm 20 μl proteinase K (10 mg/ml) Ủ ở 50oC trong 2 giờ

5 Thêm 80 μl NaCl bão hòa 6M Lắc mạnh bằng Vortex Ly tâm

5000 rpm trong 10 phút, thu dịch nổi trên cho vào tuýpEppendorfs sạch

6 Kết tủa bằng Ethanol tuyệt đối

7 Hòa tan kết tủa bằng dung dịch TE, bảo quản ở 4oC đến -20oC

8 Tiến hành kiểm tra chất lượng dung dịch ly trích