Nghiên cứu đặc điểm gen h5 và n1 của virus cúm a h5n1 phân lập tại việt nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới

Tính cấp thiết của đề tài Cúm gia cầm thể độc lực cao Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI do virus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN CÔNG NGHỆ

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Ngày tháng năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Bích Nga

vi vii viii

1.1.2 Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao của virus

1.1.4 Biến đổi thành phần gen hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm

kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1

9

1.2.3 Chức năng các phân đoạn trong hệ gen 14 1.3 CẤU TRÖC, CHỨC NĂNG CỦA HEMAGGLUTININ VÀ

NEURAMINIDASE

15

v

1.6.4.2 Triệu chứng bệnh cúm gia cầm ở người 29 1.6.5 Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 29 1.6.6 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào 31 1.6.7 Phương thức lây truyền của virus cúm gia cầm 32

1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VIRUS CÖM GIA CẦM A/H5N1 TẠI VIỆT

3.1 THU NHẬN VÀ LƯU GIỮ GEN H5 CỦA VIRUS CÖM A/H5N1 50

v

TRONG VECTOR TÁCH DÒNG

3.1.1 Tách ARN tổng số và thực hiện RT-PCR 50 3.1.2 Dòng hoá sản phẩm và lưu gen H5 trong vector tách dòng 52 3.1.3 Giải trình tự và phân tích thành phần amino acid của HA (H5) so

sánh về thành phần nucleotide và amino acid với các chuỗi đăng ký

trong Ngân hàng gen

54

3.1.4 Phân tích vị trí điểm cắt protease, bám dính thụ thể, epitope và

glycosyl hoá của polypeptide H5 trên cơ sở trình tự amino acid suy

3.2 XÁC ĐỊNH CÁC PHÂN NHÁNH NHÓM KHÁNG NGUYÊN (CLADE)

XUẤT HIỆN MỚI TẠI VIỆT NAM

73 3.2.1 Kết quả sự hình thành phân nhóm kháng nguyên mới 1.1 của clade 1 74 3.2.2 Kết quả sự hình thành phân nhóm kháng nguyên mới của clade 2.3.2

và 2.3.4

76

3.3 THU NHẬN, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ LƯU GIỮ GEN N1 CÁC CHỦNG

VIRUS CÚM A/H5N1 TRONG VECTOR TÁCH DÒNG

79

3.3.1 Thực hiện RT-PCR thu nhận gen N1 79 3.3.2 Dòng hoá sản phẩm gen N1 trong vector tách dòng 81 3.3.3 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid của gen N1 83

3.3.3.1 Phân tích thành phần nucleotide gen N1 83

3.3.3.2 Phân tích thành phần amino aicd gen N1 85 3.3.4 Phân tích đột biến trượt-xoá gen của N1 qua thời gian tiến hoá 89 3.3.5 Phân tích mối quan hệ phả hệ gen N1 của các chủng virus cúm

A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2011

92

DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ 114 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate Deoxy Nucleotide Triphosphate ddNTP dideoxy Nucleotide Triphosphate dideoxy Nucleotide Triphosphate

DNA Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic

FAO Food and Agricultural Organization Tổ chức nông lương thế giới

HI Hemagglutination Inhibition Phản ứng ngưng kết hồng cầu HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao

LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp

MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis Phân tích di truyền tiến hoá phân tử

NEP Nuclear Export Protein Nuclear Export Protein

NS Non-structural protein Protein không cấu trúc

OIE Office International des Epizooties Tổ chức dịch tễ thế giới

PA Polymerase acidic protein Protein PA

PB1 Polymerase basic protein 1 Protein PB1

PB2 Polymerase basic protein 2 Protein PB2

RT-PCR Revertranscription Polymerase Chain

Reaction

Phản ứng trùng hợp chuỗi PCR ngược

SPF Specific Pathogen Free Không tác nhân mầm bệnh

WHO World Health Organization Tổ chức Y thế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thống kê số lượng người bị nhiễm và chết do cúm gia cầm qua

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự 47

Bảng 3.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới sử dụng chuỗi H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

54

sánh

56

Bảng 3.3 Kết quả tổng hợp phát hiện 41 vị trí sai khác amino acid của

chuỗi H5 so sánh ở 32 chủng phân lập tại Việt Nam từ năm 2004

- 2011

64

acid (dưới đường chéo) của gen H5

68

H5 và các nhóm kháng nguyên giai đoạn 2004 – 2011 trong nghiên cứu

78

2004-2011 đã giải trình tự và cung cấp chuỗi gen N1 sử dụng để so sánh nucleotide và amino acid

83

2004-2011 đã được giải trình tự và đăng ký gen N1

97

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á 6

Hình 1.2 (A) Hình thành genotype trong quá trình tiến hóa từ các nguồn gen

khác nhau (B) Các genotype bắt đầu từ khi mới xuất hiện thể độc lực cao HPAI tạo thành từ các trao đổi chéo tiến hóa tạo genotype mới tại Việt Nam từ 2001 – 2007

8

Hình 1.3 Quá trình tái tổ hợp và sự hình thành các genotype của virus cúm

A/H5N1

8

Hình 1.4 (A)Ảnh các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính

trên kính hiển vi điện từ truyền qua (B) Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (C) Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP của virus cúm

12

(antigenic drift) ở virus cúm A

23

Hình 1.7 Minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên”

(antigenic shift) của virus cúm A

24

Hình 1.8 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng vật chủ của biến chủng virus

cúm A

30

Hình 1.9 Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào 31

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 41

Hình 3.1 Điện di sản phẩm RT-PCR gen H5 của 14 chủng virus cúm

A/H5N1trên thạch agarose 1%

51

Hình 3.2 Kết quả tách dòng ADN tái tổ hợp gen H5 của 14 chủng virus

cúm A/H5N1 và điện di trên agarose 1%

53

Hình 3.3 Trình bày so sánh trình tự amino acid chuỗi polypeptide H5 của 33

chủng (có 14 chủng phân lập 2004-2011 tại Việt Nam thuộc nghiên cứu này) với các chủng liên quan có trong Ngân hàng gen trong danh sách liệt kê ở Bảng 3.1

61

Hình 3.4 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 xác

lập dựa trên thành phần nucleotide gen H5 sử dụng chương trình MEGA4.0

70

Hình 3.5 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 dựa

trên thành phần amino acid của polypeptie H5 sử dụng chương

71

trình MEGA4.0

Hình 3.6 Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm kháng nguyên mới clade 1.1

của clade 1 dựa trên thành phần nucleotide gen H5

74

Hình 3 7 Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm mới của clade 1 và 1.1 dựa

trên thành phần amino acid của H5

75

Hình 3.8 Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm mới của clade 2.3 2.1 và

2.3.4.3 dựa trên thành phần nucleotide của H5

77

Hình 3.9 Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm mới của clade 2.3.2 và 2.3.4

dựa trên thành phần amino acid của H5

77

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR gen N1 trên thạch agarose 1%

của 14 chủng:virus cúm A/H5N1

80

Hình 3.11 Kết quả tách dòng các DNA tái tổ hợp và điện di trên thạch

agarose 1% gen N1 của 14 chủng virus cúm A/H5N1

81

cúm A/H5N1 thu thập qua các năm 2004 -2011

89

Hình 3.13 Vị trí của các nucleotide protein N1 có đột biến trượt-xoá ở các

chủng nghiên cứu (2004 - 2011) so với các chủng liên quan trong Ngân hàng gen

90

Hình 3.14 Vị trí các amino acid của chuỗi polypeptide N1 có đột biến

trượt-xoá ở 14 chủng nghiên cứu (2004-2011) so sánh với các chủng liên quan có trong Ngân hàng gen

91

Hình 3.15 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ nguôn gốc phả hệ giữa các chủng

cúm A/H5N1 dựa trên phân tích thành phần nucleotide gen N1 sử dụng chương trình MEGA4.0

94

Hình 3.16 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ nguôn gốc phả hệ giữa các chủng

cúm A/H5N1 dựa trên phân tích thành phần amino acid polypeptise N1 sử dụng chương trình MEGA4.0

96

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) do virus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ

lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh Virus cúm A/H5N1 là một phân type trong

nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và

Neuraminidase (NA) trên bề mặt capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên HA có 16 phân type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 phân type (ký hiệu từ N1 đến N9)

Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm HA có khả năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt

là “vùng kháng nguyên 2” (vị trí 152 – 157) và điểm cắt của enzym protease ở vị trí

chuỗi nối giữa HA1 và HA2) hoặc tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch

Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic (N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm

Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây dịch cúm gia cầm

đã bùng phát ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam Dịch cúm gia cầm liên tục tái phát hàng năm với tốc độ lây lan nhanh và diễn biến phức tạp tại nhiều quốc gia Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 có thể xâm nhiễm gây bệnh ở người với tỉ lệ tử vong rất cao và đang trở thành mối đe dọa nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng

Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm bắt đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm

2003 đầu năm 2004 và đã nhanh chóng lan rộng ở hầu hết các địa phương trong cả nước Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ cầm đã bị chết hoặc bị tiêu hủy gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi Năm 2011 và những tháng đầu năm 2012 đến nay, dịch cúm A/H5N1 bùng nổ với clade clade 2.3.2.1 xuất hiện mới tại Việt Nam,

làm cho tình hình dịch tễ mối quan hệ lây nhiễm và phòng chống bằng vaccine càng phức tạp hơn

Tìm hiểu sự thay đổi phân tử các vật liệu di truyền của virus cúm A/H5N1, đặc biệt là đặc điểm phân tử phân đoạn gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) ở các chủng phân lập trên gia cầm tại Việt Nam trong giai đoạn 2004 đến nay là cần thiết, nhằm đánh giá cấu trúc gen, khả năng tiến hoá của virus liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên để từ đó có thể đưa ra những dự báo về dịch tễ học ở mức độ phân

tử, định hướng sử dụng nguồn gen kháng nguyên để sản xuất và sử dụng vaccine phòng bệnh cúm gia cầm thích hợp đạt hiệu quả

Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 phân lập tại

Việt Nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới”

2 Mục tiêu của đề tài

1- Giải mã toàn bộ phân đoạn gen kháng nguyên H5 và N1 một số chủng virus cúm

A/H5N1 thu nhận tại một số địa phương của Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011

2- Lưu giữ các gen H5 và N1 trong vector tách dòng để làm nguồn vật liệu cho

nghiên cứu tiếp theo làm nguyên liệu để tạo vaccine thế hệ mới

3- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử các gen kháng nguyên H5 và N1, xác định

mối quan hệ phả hệ với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đây là công trình giải trình tự toàn bộ gen H5 và N1 theo cặp trong hệ gen của từng chủng của virus cúm A/H5N1 đại diện của một số địa phương tại Việt Nam được phân lập theo thời gian từ năm 2004 – 2011

Các kết quả phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ trong nghiên cứu này cho thấy sự đa nhiễm các clade của virus cúm gia cầm ở từng thời điểm, từ khi xuất hiện tại Việt Nam đến nay, đó là clade 1, 1.1, clade 2.3.4 (2.3.4.3) và clade 2.3.2 (2.3.2.1) tại Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật RT-PCR và giải trình

tự chuỗi nucleotide để phân tích thành phần gen

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Do hệ gen của virus cúm A/H5N1 là hệ gen phân đoạn, luôn biến đổi và thích ứng - đặc biệt là hai gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1), việc theo dõi thông tin di truyền của virus cúm A/H5N1 là hết sức cần thiết, vì đây là những dữ liệu cung cấp thông tin về sự tiến hóa của virus và khả năng tái tổ hợp tạo nên một biến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm

Xác định trình tự nucleotide và phân tích đặc điểm sinh học phân tử của toàn bộ phân đoạn gen kháng nguyên H5 và N1 của gia cầm, thuỷ cầm ở một số chủng phân lập qua các năm từ 2004 đến nay sẽ là cơ sở dữ liệu quan trọng để tìm hiểu về dịch tễ học và mối quan hệ nguồn gốc tiến hoá của loại virus cúm gia cầm lưu hành ở Việt Nam và thế giới trong thời gian qua Việc phân tích trình tự nucleotide và amino acid của các chủng virus cúm A/H5N1 còn có ý nghĩa lớn trong việc xác định biến đối di truyền của các chủng tại các địa phương khác nhau, các vùng địa lý và quốc gia khác nhau, giúp cho việc sưu tập và duy trì các chủng theo đặc tính di truyền và nghiên cứu tiến hoá, từ đó có thể biết dịch tễ học ở mức độ sinh học phân tử

Mặt khác, do virus cúm có khả năng biến đổi kháng nguyên cao, có thể chủng virus phân lập ở đầu và cuối ổ dịch đã khác nhau về bộ mã di truyền và đặc tính kháng nguyên, vì vậy, cần phải có một số lượng các chủng đa dạng theo thời gian tạo tiền đề định hướng giám sát nguồn gốc dịch bệnh So sánh giống và khác nhau của trình tự nucleotide và amino acid từ các chủng phân lập hàng năm, giúp chúng ta tìm hiểu những vùng gen thường thay đổi và không thay đổi trong toàn bộ hệ gen, góp phần xác định được loại vaccine phù hợp cho công tác phòng chống dịch cúm gia cầm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÖM

1.1.1 Virus cúm và phân loại virus cúm

Virus cúm chủ yếu gây bệnh đường hô hấp ở người và động vật được phân thành các nhóm:

1/ Nhóm virus cúm A (Influenza A virus) thường tồn tại trong các loài vật (gia cầm, ngựa, gà, vịt, ngỗng, ngan và các loài chim di cư hoang dã) sau đó tiếp xúc với con người và gây bệnh cho loài người Virus cúm A có thể gây nên những vụ dịch hoặc những trận đại dịch toàn cầu

2/ Nhóm virus cúm B (Influenza B virus) thường tồn tại trong cơ thể con người, chủ yếu gây bệnh ở người, một số ít tồn tại trong loài hải cẩu

3/ Nhóm virus cúm C (Influenza C virus) tồn tại trên người và lợn

Ba nhóm virus cúm A, B, C được nhận diện bởi sự khác nhau trong cấu trúc kháng nguyên bề mặt, phức hợp protein cũng như vai trò gây bệnh khác nhau trên động vật có xương sống Virus cúm A và B có kháng nguyên bề mặt là protein hemagglutinin (HA), còn ở cúm C là HEF(hemagglutinin esterase fusion)

4/ Nhóm Thogotovirus gây bệnh cho động vật, người và động vật không xương sống (muỗi, rận biển) Kháng nguyên bề mặt của Thogotovirus là GP (glycoprotein)

Virus cúm A được định type phụ dựa vào phản ứng huyết thanh học của các glycoprotein bề mặt HA và NA Hiện nay, người ta đã xác định được 16 phân type HA (H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9) Từ năm 1980, việc xác định phân type HA

đã được tiêu chuẩn hóa cho tất cả các virus cúm type A từ gia cầm, chim, ngựa và người Huyết thanh từ gia cầm và chồn sương sau khi mắc bệnh và kháng thể đơn dòng được dùng để xác định sự có mặt kháng nguyên của virus cúm trong từng phân type Kháng thể đơn dòng được dùng trong nghiên cứu chi tiết về các epitope trong từng kháng nguyên như so sánh HA của các virus H1N1 từ gà tây và lợn để thiết lập mối quan hệ về tính kháng nguyên của các HA của chúng [18]

1.1.2 Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao của virus cúm A/H5N1

Năm 1959, lần đầu tiên phát hiện chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh ở gia cầm được coi là chủng cổ điển Sau thời gian gần 40 năm không xuất hiện, vào năm 1996, virus cúm A/H5N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc) cho thấy đây là chủng đã tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cầm trong những năm vừa qua [126] Chủng virus nguyên thuỷ này cung cấp nguồn gen HA (H5) cho quá trình tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997, nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hồng Kông được kiến tạo từ virus cúm A có ở chim cút [57] Riêng nguồn gen NA (N1) trong cấu trúc của gen đã có hiện tượng xóa đi 57 nucleotide mã hóa cho 19 amino acid, tại vùng đầu N của protein

neuraminidase và đột biến “xóa gen” của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus

cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người [86]

Năm 1997, virus cúm A/H5N1 gây bệnh tại Hồng Kông làm chết 6 người trong tổng số 18 người bị nhiễm Do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1 nguyên thủy gốc Quảng Đông không còn gia cầm cạn để gây bệnh, tưởng như virus đã biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng ở vùng Nam Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái tổ hợp hình thành biến chủng mới [33], [120] Trong các năm 1997 đến 2002, các biến chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều đặc tính kháng nguyên khác nhau của phân type H5 được hình thành tạo nên clade 1 có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi sau đó bị đào thải trong những năm

2001 - 2002 Tiếp tục trong năm 2002 - 2003, gen mã hóa kháng nguyên H5 có những

đột biến mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift) để tạo nên

biến chủng có tính gây bệnh cao, đặc biệt đối với vịt, và có khả năng lây nhiễm sang người [56] Đặc tính thích ứng và gây bệnh trên người càng ngày càng cao dần, cùng với độc lực tăng cường đối với đa vật chủ để rồi hình thành nhiều biến chủng xâm nhập xuống các nước phía Nam châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan [34], [45]

Tại Việt Nam, virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện từ năm 2001, nhưng đến cuối năm 2004 mới chính thức được công bố [5], [7] Virus H5N1 thể độc lực cao và H5N2,

H9N3 thể độc lực thấp đã được phân lập ở ngỗng và vịt từ năm 2001 và 2003 [122] Phân tích phả hệ cho thấy nhóm virus này không phải clade 1 thuộc phân dòng Quảng Đông đã gây bệnh ở người vào cuối năm 2003 [71] Tiến hóa chủng/phân type và phân dòng tái tổ hợp mới thường xuất phát từ phía của Nam Trung Quốc [107], [118], [122] Sau giai đoạn 1997 - 2003, virus cúm A/H5N1 đã đạt đến mức độ hoàn thiện về đặc tính gây bệnh trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao đối với gia cầm và người trong các năm 2004 - 2005 [107] Tuy nhiên, xét về di truyền học phân tử và tính kháng nguyên, các chủng virus H5N1 giai đoạn 1997 - 2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng Đông [34] và bắt đầu phân hóa ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 - 2005 (Hình 1.1)

Hình 1.1 Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á Các mũi tên chỉ

vùng xuất phát và thời điểm lan truyền của virus [45]

Từ cuối năm 2005, ngoài phân dòng chính Quảng Đông tiếp tục lưu hành, còn có nhiều phân dòng khác của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được hình thành, đó là sự xuất hiện của phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage), tràn ngập châu Á bao gồm Trung Quốc,

Hồng Kông, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan [78], [107], tràn sang Trung Á, châu Âu và châu Phi có tính gây bệnh cao đối với người [47], 106]

Các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến và Thanh Hải có cấu trúc gen N1 không

thay đổi nhiều, nhưng trong gen H5 có motif amino acid ở vùng chuỗi nối của điểm cắt

protease là (-RRRK-) đã giảm mất một lysine (K) so với các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông [107], vì thế kể từ năm 2006 đến nay, có nhiều chủng virus cúm A/H5N1 thuộc nhiều clade khác nhau cùng tồn tại gây bệnh trên thế giới, trong đó có Việt Nam

[94] Trong các năm 2006 - 2008, dịch cúm gia cầm xảy ra không ác liệt như những năm 2003 - 2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng cúm A/H5N1 có biến động kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học có thể đã trở nên phức tạp hơn [53], [128]

1.1.3 Sự hình thành genotype của virus cúm A/H5N1 trên thế giới và Việt Nam

Kể từ khi cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện ở ngỗng tại Quảng Đông

(A/Gs/CN/Gd1/1996(H5N1) [126], cho đến nay có tất cả 12 genotype được hình thành(Hình 1.2A)

Từ năm 2002 trở lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã không còn tồn tại (đó là các genotype A, C, D, E) nhưng thêm nhiều genotype kế tiếp, bao gồm GD, A, B, C, D, E, X(X0-X3), V, Y, W, Z(Z+) và G, tiếp tục tiến hóa xuất hiện

và tồn tại 8 genotype của H5N1 (V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+) [85]

Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh cao ở các nước Đông Nam Á là

bằng chứng của sự đột biến “lệch kháng nguyên” của virus cúm A/H5N1 [125]

Các chủng virus A/H5N1 phân lập tại Việt Nam năm 2004 - 2006 thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu là genotype Z, gần đây xuất hiện thêm genotype G nhưng được phân biệt thành 2 nhóm: nhóm N (North) phổ biến ở phía Bắc Việt Nam và nhóm S (South) phân bố ở phía Nam [94], [107] Từ năm 2001 đến 2007, đã có 9 nhóm

di truyền là VN1 – VN9 (genotype) xuất hiện hoặc xâm nhập vào Việt Nam, được xác định dựa trên phân tích trao đổi chéo các phân đoạn để tái tổ hợp hình thành genotype

[117] (Hình 1.2B), theo đó dựa trên thành phần H5 chúng thuộc vào các clade khác nhau

Hình 1.2 (A) Hình thành các genotype trong quá trình tiến hóa từ các nguồn gen khác nhau,

(B) Các genotype bắt đầu từ khi mới xuất hiện thể độc lực cao HPAI tạo thành từ các trao đổi

chéo tiến hóa tạo genotype mới tại Việt Nam từ 2001 – 2007 [117]

Hình 1.3 Quá trình tái tổ hợp và sự hình thành các genotype của virus cúm A/H5N1 [45]

Các nhóm di truyền và clade, cụ thể đó là: VN1, năm 2001 (clade 3), VN2, năm

2003 (clade 5), VN3, các năm 2003 – 2007 (clade 1), VN4, từ năm 2005 (clade 2.3.2), VN5, năm 2005 (clade 0), VN6, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN7, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN8, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN9, từ năm 2007 (clade 2.3.4) [117] Các chủng thuộc clade 7, dòng Á - Âu đã được xác định ở Lạng Sơn năm 2007 - 2008 và biến mất sau đó [95] và clade 2.3.2 xuất hiện từ 2009 đến nay [42], [117] Một số chủng virus chỉ xuất hiện rồi biến mất trong vòng một năm và chỉ trao đổi nguồn gen trong quá trình tiến hoá (Hình 1.3), một số khác chỉ tồn tại vài năm rồi sau đó không phát hiện được, số khác mới xâm nhập gần đây, chẳng hạn như phân dòng 2.3.4 có nguồn gốc từ Phúc Kiến và phân dòng 2.3.2 phát hiện năm 2009 có nguồn gốc từ vùng

hồ Thanh Hải (Trung Quốc) hiện nay có xu hướng tiến hoá nội bộ tạo nên nhiều chủng biến đổi khác nhau

Genotype Z phổ biến hầu hết các nước trong khu vực châu Á Đặc điểm của genotype Z là các gen NA và NS đều bị mất đoạn, và vùng chuỗi nối HA1-HA2 (điểm cắt protease) của protein HA (H5) mang nhiều aminno acid qui định độc lực của virus Tuy nhiên, một số virus phân lập tại vùng phía Nam Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây và Hồ Nam) có sự đa dạng hơn của các type Z, V, W và G Sự xuất hiện của genotype G có thể do quá trình tái tổ hợp của genotype W và genotype Z [36]

1.1.4 Biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các clade của virus cúm A/H5N1

Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm A/H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng nguyên dẫn đến ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vaccine

Virus cúm gia cầm lưu hành tại Việt Nam đa dạng về kiểu hình HA liên quan nhiều đến đặc tính kháng nguyên, trong đó clade 1 và clade 2 được xác định gây bệnh cho người và clade 2 cũng đã phát triển thành các clade khác nhau trên cơ sở thay đổi về một số amino acid [13]

Thông báo của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho biết, hiện nay đã phát hiện các phân nhánh virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao thuộc clade 1.1 và 2.3.2.1 (9] Các phân nhánh này không phải là mới xuất hiện mà

do trong quá trình tiến hoá tự nhiên được hình thành Clade 1.1 có nguồn gốc từ clade

1 trước đây Phân nhánh 2.3.2.1 được tiến hoá từ clade 2.3.2 đã được phát hiện từ chim hoang dã sau đó là gia cầm Trung quốc (Hunan, Qinghai), Mông Cổ, Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào và Hồng Kông và mới đây là Việt Nam [124]

Hiện nay, clade 1.1 đã thay thế cho clade 1 ở phía Nam nước ta Trong năm

2011, clade 2.3.2.1 đã được phát hiện ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và vùng duyên hải miền Trung thay thế cho clade 2.3.4 trước đây [50, 123, 124](Phụ lục 3)

Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1 tại Việt Nam và Campuchia cũng cho thấy có sự hình thành clade 1.1 Clade 1.1 đã được phát hiện ở gia cầm của Việt Nam tại phía Nam, ở gia cầm và người tại Campuchia gây chết 9/9 người từ cuối 2010 đến nay [123] Cho đến nay, sau gần 10 năm xuất hiện tại Việt Nam, virus cúm gia cầm A/H5N1 đã trở thành một tác nhân nguy hiểm cho gia cầm

và cộng đồng và là mối nguy cơ lại càng gia tăng khi vaccine hiện nay không có đáp ứng miễn dịch đối với các chủng virus thuộc các clade mới xuất hiện năm 2011 Kết quả thí nghiệm của Cục Thú y liên quan đến clade 2.3.2.1 xuất hiện năm 2011 cho thấy, sau khi công cường độc 100% gà bị chết trong vòng 3 ngày và 20% vịt chết trong vòng 7 ngày Như vậy nhóm virus này có độc lực cao với gà hơn đối với vịt (nhánh cũ có thể gây chết 60 – 70% vịt) (http://www.cucthuy.gov.vn/)

Hiện tại chưa phát hiện thấy virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở người Tuy nhiên vấn đề chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1 này, như vậy, gia cầm hoàn toàn bỏ ngỏ không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ đáng lo ngại gây bệnh trên người [124] Do đó, việc quan trọng cần làm là phải tăng cường công tác giám sát virus cúm ở gia cầm, chủ động áp dụng các biện pháp phòng chống dịch thích hợp Mục đích nhằm ngăn chặn sự lây truyền dịch ở gia cầm và ngăn chặn lây truyền

từ gia cầm sang người

1.2 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA VIRUS CÚM A

Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA, protein enzym cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix) Lipid tập trung ở màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một

ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi RNA nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn Vỏ của virus được cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các gai khác nhau nhô lên từ bề mặt của virus, mỗi gai

có độ dài từ 10 - 14 nm Các gai này được cấu tạo bởi các glycoprotein Có hai loại glycoprotein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Các gai HA thường nhiều hơn và xen kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4-5):1

Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt (Hình 1.4B), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp xếp theo trật tư: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2) [91], [103] Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.4C)

Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có độ dài từ 10.000 - 15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng virus cúm A) và có

cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus

HA có chức năng giúp virus bám dính vào tế bào cảm nhiễm và làm xâm nhập vật liệu di truyền của virus vào bên trong tế bào NA có chức năng thúc đẩy sự lắp ráp

để giải phóng virus từ các tế bào cảm nhiễm Các glycoprotein HA và NA quyết định tính kháng nguyên đặc hiệu của từng phân type virus khác nhau và cũng là vị trí để các loại thuốc kháng virus trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng diệt virus Đồng thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính kháng nguyên trong sản xuất vaccine Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbohydrate [91]

(A)

Hình 1.4 (A) Ảnh các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi

điện từ truyền qua (Nguồn: Dr Erskine Palmer, Centers for Disease Control and Prevention

Public Health Image Library), (B) Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (hemagglutinin: phân tử

kháng nguyên HA, neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA, PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị

phức hợp enzym polymerase của virus), (C) Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP

của virus cúm (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge)

Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm trong lịch sử ở động vật và người [70], [121] Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới truyền lây trong quần thể sinh vật, cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người (zoonotic infections) Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc

lực cao nhất cho các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học là chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc trao đổi gen thông qua H9N2 (trên lợn) [65], [126]

H5N1 thể độc lực cao gây chết phôi gà gần như ngay lập tức nên không thể sử dụng nguồn phôi gà để sản xuất vaccine vô hoạt cho gia cầm Để khắc phục điều này,

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các mạng lưới phòng thí nghiệm của WHO đã kiến tạo thành công hướng sản xuất vaccine H5N1 bằng phương pháp di truyền ngược (reverse genetics -based technology) Đây là phương pháp tạo virus nhân tạo tái tổ hợp gen của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm có khả năng gây miễn dịch nhưng không gây bệnh Tuy nhiên do virus cúm gia cầm A/H5N1 có nhiều biến đổi nội gen và xảy ra nhanh nên việc sản xuất vaccine cũng gặp không ít khó khăn

1.2.2 Cấu trúc hệ gen của virus cúm A

Nhóm virus cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên tục, nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho một loại protein của virus

Hai đầu 5' và 3' của RNA của hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn, đó là AGUAGAACAAGG và 3'-UCG(U/C)UUUCGUCC [70] Sáu phân đoạn (từ 1- 6) mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho một loại protein riêng biệt, phân đoạn 7 và

5'-8 mã hoá cho từng phần của gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối-ghép (splicing) sẽ được dịch mã tổng hợp protein [70] Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) RNP kết hợp với 3 loại polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của virus

Protein kháng nguyên bề mặt là HA thuộc protein màng type I liên quan đến sự bám dính của virus và là thụ thể của virus, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus

Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu hiện đặc tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus theo dạng liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein

Protein mang hoạt tính enzym là NA thuộc protein màng type II có chức năng của một enzym cắt thụ thể để virus thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào

Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của virus có chức năng

"gắn" vào màng tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình nhân lên

và giải phóng virus

Protein màng không được glycosyl hóa là MA mang tính chất protein đệm, bao gồm M1 và M2 có vai trò bao gói RNA của hệ gen virus và là kênh vận chuyển các thành phần của virus qua màng

Một protein khác là protein không cấu trúc NS (non-structural protein) gồm hai tiểu phần NS1và NS2, có vai trò bảo vệ hệ gen của virus, nếu thiếu chúng virus sinh ra không hoàn chỉnh, trở thành virus thiểu năng

1.2.3 Chức năng các phân đoạn trong hệ gen

Phân đoạn 1 mã hoá cho enzym polymerase PB2 (polymerase basic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã,

có độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84 kDa (thực tế là:

87 kDa) [70]

Phân đoạn 2 mã hoá cho enzym polymerase PB1 (polymerase basic protein 1) là tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNA transcriptase), có độ dài 2341 nucleotide, với trọng lượng phân tử tính toán là 87 kDa (thực tế: 96 kDa) [30]

Phân đoạn 3 mã hoá cho enzym kéo dài phiên mã PA (polymerase acidic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) tham gia tổng hợp RNA, có độ dài 2233 nucleotide, trọng lượng phân tử theo tính toán là 83 kDa (thực tế: 85 kDa)

[30]

Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA) điều khiển quá trình tổng hợp hemagglutinin (protein gây ngưng kết hồng cầu) Có 16 loại HA, trong đó chỉ có H1, H2, H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người Virus mang gen H5, H7 và H9 có thể

lây nhiễm từ chim sang người HA được phân bố rải rác trên bề mặt của virus, là protein gắn virus vào thụ thể của tế bào, gây ngưng kết hồng cầu và tham gia vào quá trình khởi đầu xâm nhiễm của virus HA có phân tử lượng là 63 kDa (nếu không được glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA1 là 48kDa và HA2 là 29 kDa) [108], chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type virus, đối với H5N1

63kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H5N1 là 1350 – 1410 bp [32]

Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1 và M2 Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có chức năng bao gói

và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus Tiểu phần M2 là protein nội màng, có chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của virus, trọng lượng phân tử tính toán của M1 là 28 kDa (thực tế: 25kDa), và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa), phân đoạn M

có độ dài khoảng 1027 bp [63]

Phân đoạn 8 là gen NS có độ dài ổn định trong tất cả các chủng cúm A, mã hoá cho hai tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2 Tiểu phần NS1 có chức năng vận chuyển mRNA ra tế bào chất, dịch mã, là protein kháng interferon và tiểu phần NS2 có vai trò vận chuyển RNP ra khỏi nhân, trọng lượng phân tử tính toán NS1 là 27 kDa (thực tế: 25 kDa), của NS2 là 14 kDa (thực tế: 12kDa), NS có độ dài 890 bp [84]

1.3 CẤU TRÖC, CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN HEMAGGLUTININ VÀ NEURAMINIDASE

1.3.1 Protein hemagglutinin (HA)

Protein hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) là kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A [73], có vai trò đặc biệt quan trọng

trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của virus Gen

mã hóa kháng nguyên HA là một glycoprotein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể ngăn cản sự ngưng kết

đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI, Hemagglutinin Inhibitory test) Có 16 phân type HA đã được phát hiện, trong đó có 3 phân type (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm đã xảy ra trong lịch sử [91]

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc hemagglutinin (lipid bilayer of envelope: Lớp màng bao lipid kép,

4 Major antigenic variable regions: 4 vùng biến đổi kháng nguyên chính, Receptor site: vị trí

bề mặt màng tế bào đích [27]

Gen HA gồm 2 đoạn là HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho gồm một dãy các amino acid là arginine và lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm cắt của protease Đây là vùng quyết định độc lực của virus hay tính gây bệnh của H5N1 Phần HA1 và HA2 bộc lộ ra ngoài màng và có khả năng làm ngưng kết hồng cầu

HA 1

HA 2

Màng bao lipid kép

và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm[109].

Trên phân tử HA có hai vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C Vùng kỵ nước ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi

HA trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc amino acid từ 186-211 của HA2) có nhiệm vụ neo giữ phân tử protein trên vỏ virus [38] Sự biến đổi trong gen mã hoá cho kháng nguyên HA là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hằng năm

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau [116]

Nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều của gen kháng nguyên hemagglutinin H5 của virus gây bệnh ở gà và H9 ở lợn, cũng như H5 của virus thích ứng gây bệnh trên người cho thấy : virus cúm gà thích hợp với loại tế bào có thụ thể HA chứa acid sialic liên kết với đường galactose góc quay α-2,3, trong khi ở lợn và người virus cúm

có thụ thể thich hợp ở góc quay α-2,6 Vị trí amino acid 226 (aa 226) của tiểu đơn vị

HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu Ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ

thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của

galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A) Ở các chủng virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2 gây bệnh ở người, vị trí này trên protein HA là leucine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,6 sialic acid có mặt ở tế bào biểu mô đường hô hấp dưới của người [108] Các tế bào cảm thụ với virus cúm A của lợn có cả hai loại thụ thể này, do đó lợn được coi là vật chủ trung gian để virus cúm A tiến hóa thích ứng lây nhiễm sang người [108]

Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: glutamine 222, glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ [73] Đặc biệt, một số chủng virus cường độc A/H5Nx, A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh) [25], [68]

Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA [73] Protein HA kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus Vì thế HA được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus vừa là đích của bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm và là cơ sở trong điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay [64], [73]

Chuỗi oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình riêng biệt, đặc trưng cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng [58], [115] Chuỗi này chứa một số amino acid mang tính kiềm (basic amino acid) làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình phân type Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới [66] Nếu ở điểm cắt của protease càng có nhiều amino acid kiềm (arginine và lysine) thì khả năng HA được phân cắt càng lớn, và quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúm A [27], [115]

Đối với phân type H5N2 chuỗi nối này có cấu trúc VPQRKRKTR Đối với các phân type H vô độc (hoặc nhược độc) của H5N1, H5N2, H5N3, H4N6 và H11N1, loại hình của chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRETR [65], [129] Đối với các chủng H5 cường độc, cấu trúc của chuỗi nối là TPQRERRRKKR, trong đó RRRKK quyết định tính gây bệnh của H5N1 Sự đột biến „„giãn nở” chuỗi nối giữa HA1 và HA2 mã hóa cho các amino acid kiềm có liên quan đến tiến trình tăng cường độc lực của virus và ở các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông (Guangdong-like sublineage), các amino acid thông

thường là -RRRKK- [39], [86] còn ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến (Fujian-like sublineage) các amino acid của vùng chuỗi nối là -RRRK- [6], [9]

Mức độ gây bệnh của virus cúm A còn phụ thuộc rất lớn đến chức năng hoạt động của vùng tiếp nhận enzym protease để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic acid [108] Virus cúm A không có gen tổng hợp enzym protease, mà phải nhờ vào

hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm virus Càng có điểm cắt protease hoàn chỉnh và cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzym tham gia cắt thụ thể, thì virus mới nhanh chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện quá trình nhân lên tạo nhiều virus mới và mức độ gây bệnh cũng vì thế mà nặng nề hơn Khi cơ thể gia cầm bị đa nhiễm

nhiều vi khuẩn, đặc biệt là tụ cầu khuẩn Staphylococcus và liên cầu khuẩn Streptococcus, thì hoạt động tương tác gây bệnh của virus cúm A càng mạnh mẽ

hơn, do các loại cầu khuẩn này có nhiều protease trợ giúp cho virus cúm trong quá trình thực hiện cắt hemagglutinin khỏi thụ thể để gây bệnh [35]

1.3.2 Protein neuraminidase (NA)

Protein neurominidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18), là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [24], [116] Phân

tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid

- Tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh

quá trình cởi vỏ bọc “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn [116]

- Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu

Virus cúm hình thành nên cơ chế để vượt qua sự bảo vệ của mucin đường hô hấp Chức năng của NA liên quan đến khả năng của virus xuyên qua màng nhầy do phân cắt liên kết giữa mucin và sialic acid, vốn là mối liên kết ngăn cản sự xâm nhập của virus vào các thụ thể chức năng trên tế bào đích [40], [89] Mặt khác, NA có thể phá vỡ trục liên kết màng nhầy và IgA, tạo nên trạng thái ức chế miễn dịch cục bộ từng phần, nâng cao khả năng lây nhiễm của virus cúm và viêm phổi kế phát do vi khuẩn

[29] Đột biến trong gen NA thường làm thay đổi hoạt tính của enzym này [55]

Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ Do đó, NA

là đích tác động của các loại thuốc, hóa dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể [22], [32] Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của

cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [46]

Sự đột biến trượt - xóa gen (slippage-mediated deletion) qua các giai đoạn tiến

hóa là hiện tượng đột biến đặc biệt được phát hiện ở gen NA (N1) và đã được chứng minh rằng thông qua loại hình đột biến xoá gen này, virus cúm A/H5N1 tạo nên một subtype N1 mới có độc lực cao hơn [73], [86]

Trong quá trình tiến hoá của giai đoạn 1996 - 1997, cấu trúc gen NA có hiện tượng xoá đi 57 nucleotide mã hoá cho 19 amino acid và sau đó lại tiếp tục xoá lệch đi

60 nucleotide (mã hoá cho 20 amino acid) tại vùng đầu tận cùng N của protein

neuraminidase Sự đột biến „„xoá gen‟‟ kiểu này của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người [86]

Gen N1 của virus cúm A/H5N1 đã trải qua nhiều giai đoạn tiến hoá cho đến khi hình thành thể độc lực cao HPAI thì độ dài của gen chỉ còn lại 1350 nucleotide so với gen N1 trước đó có độ dài 1410 nucleotide Trong hệ gen của virus cúm A, chức năng của gen NA chịu trách nhiệm trong quá trình tổng hợp neuraminidase

Gen NP chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp nucleoprotein (giúp phân biệt 3 loại A, B, C) Gen M chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp matrix protein

Gen NS chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp protein không cấu trúc structural protein) Các gen còn lại là PA, PB1, PB2 là các thành phần tạo nên các RNA polymerase

(non-Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở nghiên cứu và ứng dụng đối với các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [118]

Phân tích hệ gen của các phân lập cúm gia cầm A/H5N1 cho thấy NA, HA và NS1 thường biến đổi nhất trong hệ gen của virus cúm gia cầm [96] Biến đổi trượt xóa amino acid trong protein NA vùng cuống (NA-stalk) có thể làm thay đổi đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1 dẫn đến mở rộng phạm vi vật chủ cảm nhiễm [119]

1.4 CÁC YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH ĐỘC LỰC

Trong đa số trường hợp độc lực virus do nhiều gen quyết định, nhưng một gen (hoặc đột biến trong một gen) cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến độc lực của chúng Chuỗi nối giữa HA1 và HA2 chứa một số amino acid mang tính kiềm được mã hoá bởi một chuỗi oligonucleotide, là điểm cắt của protease và là vùng quyết định độc lực của virus [53] Các HA của virus cúm gia cầm độc lực thấp có một amino acid arginine (R)

ở vùng phân cắt [90] HA của virus độc lực thấp chỉ bị phân cắt trong một số ít cơ quan, do đó chỉ gây bệnh nhẹ hoặc gây bệnh không biểu hiện triệu chứng Ngược lại, virus cúm gia cầm độc lực cao có các amino acid mang tính kiềm ở vùng phân cắt, được nhận diện bởi các protease nội bào Protease nội bào có mặt ở khắp nơi nên dễ

dàng gây nhiễm virus cho cơ thể [66] HA của tất cả các virus cúm gia cầm gây chết người đều có khả năng phân cắt cao Điều này chứng tỏ các amino acid mang tính kiềm

ở vùng phân cắt của HA là yếu tố cần thiết quyết định độc lực của loại virus này

Protein NS1 cũng đóng vai trò như một yếu tố độc lực của virus nhờ khả năng thoát khỏi tác động của IFN (interferon) trong quá trình lây nhiễm virus cúm A [75] do

ức chế sự tổng hợp IFN Cùng với việc ngăn chặn đáp ứng của IFN, protein NS1 còn liên kết đặc hiệu với protein của tế bào nhiễm và phá vỡ chức năng của chúng [96] Sự đột biến xoá đi 15 nucleotide (vị trí 263 - 277) của NS làm gia tăng độc tính của virus cúm A/H5N1 [83]

Nhóm RNA-polymerase bao gồm protein PB1, PB2 và PA cũng liên quan đến độc lực của virus cúm A Một số đột biến có thể nâng cao hoạt lực của polymerase và làm tăng độc lực của virus cúm A/H5N1 chủng độc lực cao đã được phát hiện trên chuột [52] Chủng virus cúm A/H5N1 có độc lực trên chuột mã hoá Lysine ở vị trí 627 trong PB2, trong khi đó các chủng A/H5N1 không độc lực trên chuột mã hoá glutamic acid ở vị trí này [59], [77]

Các gen M2 và PB1-F2 có liên quan đến sự thích ứng của virus H5N1 trên vật chủ mới, cũng như sự lây truyền giữa các loài [72], [107] Protein PB1-F2, được tạo thành bởi một khung đọc mở của gen PB1 của virus cúm A, đã làm gia tăng độc lực của virus trên chuột [127] Protein PB1-F2 làm tăng độc lực của virus cúm A do gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở các đại thực bào, do đó làm giảm đáp ứng

miễn dịch của cơ thể vật chủ đối với sự lây nhiễm của virus cúm A [37]

1.5 CÁC PHƯƠNG THỨC BIẾN ĐỔI KHÁNG NGUYÊN

Đặc tính cơ bản của virus cúm A là hệ gen luôn biến đổi, sự thay đổi kháng nguyên theo thời gian tồn tại giúp cho virus lưu hành rộng rãi trong tự nhiên ở nhiều loài vật chủ khác nhau [91]

Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [125]

1.5.1 Hiện tượng «lệch kháng nguyên»

«Lệch kháng nguyên» (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra

trong các phân đoạn gen/hệ gen của virus, chủ yếu là ở phân đoạn 4 của phân đoạn HA

(Hình 1.6) Do virus cúm A ký sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế “đọc và sửa bản sao” (proof-reading) trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích, cho nên

sự thiếu hụt enzym sửa chữa RNA dẫn đến các enzym sao chép phụ thuộc RNA sẽ có

thể thêm nucleotide (đột biến thêm), làm mất đi (đột biến xoá) hoặc thay thế (đột biến điểm) [12] một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA

chuỗi đơn mới trong quá trình nhân lên của virus [41], [91]

biến (đột biến điểm) Tần suất xảy ra đột biến điểm (point-mutation) rất cao, cứ mỗi

10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleotide sai khác [103] Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra đều chứa một hoặc hai đột biến điểm trong hệ gen của nó và như vậy, các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có gen HA với những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch

Sự chuyển dịch lệch kháng nguyên cũng có thể xảy ra với gen NA NA có chứa nhiều phần dư amino acid quan trọng, những phần dư này khi đột biến sẽ làm cho virus kháng lại các thuốc ức chế neuramidase Các đột biến này thường xảy ra tại các vị trí amino acid R152K, E119V, H274Y, R292K Đột biến tại vị trí H274K liên quan đến vấn đề kháng thuốc Oseltamivir (Tamiflu) [76] Lysine (K) thay thế cho arginine (R) ở

vị trí 292 của NA sẽ đưa đến sự kháng thuốc hoàn toàn Đột biến R thành K gắn liền với sự trao đổi nucleotide AGA thành AAA trong gen NA

có thể trao đổi cho nhau, để có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap)

các phân đoạn gen giữa hai chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại thành một hệ gen mới, tạo ra các dạng khác nhau của RNA hệ gen ở các hạt virus mới sinh ra, hỗn hợp từ thành phần các phân đoạn của hệ gen từ những virus ban đầu Kết quả là tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh [35], [61], [85]

1.5.3 Hiện tƣợng glycosyl hoá

Thông thường, các virus cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng có mức độ đột biến điểm cao làm thay thế một số nucleotide tại những vị trí mà ở đó có thể tạo nên các amino acid mới có khả năng tiếp nhận carbon hydrate tạo nên hiện tượng glycosyl hoá (glycosylation) Hay nói cách khác, ở virus cúm A (và A/H5N1), glycosyl

hoá là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate (oligosaccharide) vào với amino acid

asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một

số polypeptide khác Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí NXS hoặc NXT (trong đó, N: asparagine, X: amino acid bất kỳ, trừ proline, S: serine hoặc T: threonine) Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh

ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể khỏi bị nhiễm virus Hiện

tượng «lệch kháng nguyên» sinh ra do đột biến điểm ở một vị trí nào đó hình thành nên

bộ mã của asparagine, tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hoá xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA

và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hoà

sự nhân lên của virus [24]

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus

cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa

có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh cho

người, và rất có thể virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp (vay mượn) gen HA hay NA, hoặc cả

hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở người, để tạo ra một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòng chống [23], [56], [74]

1.6 BỆNH CÖM GIA CẦM

1.6.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gia cầm lần đầu tiên được mô tả như là bệnh dịch tả gia cầm và được Perroncito báo cáo vào năm 1878 ở Italia, khi đó bệnh bị nhầm lẫn với dạng nhiễm trùng huyết cấp tính của bệnh tụ huyết trùng gia cầm [4]

Từ những năm 1500 - 1978 có khoảng 13 đại dịch cúm đã được ghi nhận, điển hình là các năm 1878, 1818, 1957, 1968 và 1977 [112]

Theo lịch sử ghi nhận, đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 - 1919 do virus cúm A/H1N1, đại dịch cúm châu Á năm 1957 - 1958 do virus cúm A/H2N2, dịch cúm

Hồng Kông năm 1968 - 1969 do virus cúm A/H3N2, đại dịch cúm Nga năm 1977 do

virus cúm A/H1N1 [11] và gần đây nhất là đại dịch cúm do virus cúm A/H1N1 vào năm 2009

- Năm 1959, phát hiện virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gà tại Scotland, có thể coi đây là biến thể H5N1 đầu tiên trên thế giới

- Năm 1996: virus cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện ở ngỗng tại Quảng Đông

- Năm 1997: Dịch cúm tại Hồng Kông do virus cúm A/H5N1 lần đầu tiên gây bệnh cho cả người và gia cầm [33], [105], [121]

Cuối năm 2003, những đợt cúm gà do virus cúm A/H5N1 đã liên tiếp xảy ra ở nhiều quốc gia thuộc Đông Nam Á và Đông Á (Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Campuchia, Indonesia ) virus gây bệnh đã được phân lập và định type, chủ yếu là H5N1 có độc lực cao

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số người bị nhiễm cúm gia cầm từ năm 2003 đến ngày 06/07/2012 thì toàn thế giới đã có 607 trường hợp người mắc cúm A subtype H5N1, trong đó có 358 trường hợp đã tử vong, riêng Việt Nam có

123 người mắc, trong đó có 61 người tử vong (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Thống kê số lượng người bị nhiễm và chết do cúm gia cầm qua các năm

Ai Cập 0 0 0 0 0 0 18 10 25 9 8 4 39 4 29 13 39 15 10 5 168 60 Indonesia 0 0 0 0 20 13 55 45 42 37 24 20 21 19 9 7 12 10 7 7 190 158

Việt Nam 3 3 29 20 61 19 0 0 8 5 6 5 5 5 7 2 0 0 4 2 123 61

Tổng số 4 4 46 32 98 43 115 79 88 59 44 33 73 32 48 24 62 34 29 18 607 358

Ghi chú: M: số người mắc, C: số người chết

Nguồn: Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO, July 6, 2012

Cho đến nay chỉ có hai biến chủng virus có cấu trúc kháng nguyên H5 và H7 được xem là loại có độc lực cao gây bệnh ở gia cầm, đã tạo nên tái tổ hợp phân type H7N7 gây đại dịch cúm gà ở châu Âu và H5N1 ở châu Á Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng chứa H5 và H7 đều gây bệnh và chính bản thân H7N7 hoặc H5N1 cũng tồn tại nhiều biến chủng vô độc hoặc độc lực thấp H5N1 mới xuất hiện gần đây ở các nước châu Á là một phân type có độc lực cao, được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gà trong những năm 1996 - 2010 [81]

Tháng 6/2009, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công bố đại dịch cúm do virus cúm A/H1N1 trên toàn thế giới

1.6.2 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới

Bệnh cúm A/H5N1 còn có nhiều tên gọi khác nhau: Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (HPAI - highly pathogenic avian influenza); Bệnh cúm chim (Bird Flu) Trong dân gian thường gọi là “cúm gà”

Virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959, có thể coi đây là chủng virus cổ điển (danh pháp: A-Ck-Scotland-59(H5N1), số đăng ký trong Ngân hàng gen: X07869)

Dòng virus A/H5N1 năm 1996 phân lập từ ngỗng (Quảng Đông - Trung Quốc)

là virus cúm A/H5N1 hiện đại mới xuất hiện [43] Đặc biệt sự khác biệt của gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) đã có những thay đổi lớn trong thành phần chuỗi gen và kháng nguyên miễn dịch Kể từ khi xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997), đến nay virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết ở người Mặc dù về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây bệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1 đã được phát hiện trước đây [69], [128]

Một biến thể mới của H5N1 khác biệt so với chủng virus Gs-Gd1-1996(H5N1) (dòng Quảng Đông) xuất hiện từ 2005 đó là chủng Phúc Kiến và đã trở thành chủng cúm gia cầm phổ biến tại nhiều tỉnh ở Trung Quốc và lây lan sang Hồng Kông, Lào,