Đánh giá phương pháp định lượng bilirubin trên máy phân tích khí máu GEM 4000

Đồ thị so sánh kết quả định lượng bilirubin toàn phần trên máy Gem 4000 và máy AU 2700...42 .1 Phương pháp định lượng bilirubin trên máy GEM 4000 có độ chính xác và xác thực tương tự như

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

…… ***……

TRẦN THANH KHOA

§¸NH GI¸ PH¦¥NG PH¸P §ÞNH L¦îNG BILIRUBIN TR£N M¸Y PH¢N TÝCH KHÝ M¸U GEM 4000

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2009-2013

Hướng dẫn khoa học:

TS Trần Thị Chi Mai

Hà Nội-2013

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý đào tạo đại học trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS-Trần Thị Chi Mai – Trưởng

khoa xét nghiệm Sinh Hóa – Bệnh viện Nhi Trung Ương, người cô đã hết lòng hướng dẫn em trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị trong khoa xét nghiệm Sinh Hóa – Bệnh viện Nhi Trung Ương đã giúp đỡ em rất nhiệt tình, tạo mọi thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, những người đã sinh thành và nuôi dạy tôi, cùng với những người thân trong gia đình, anh em bè bạn đã chia sẻ động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập.

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2013

Sinh viên

Trần Thanh Khoa

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các

số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất

cứ công trình nghiên cứu nào khác

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2013

Sinh viên

Trần Thanh Khoa

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

Hb Hemoglobin

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

NCCLS National Committee on Clinical Laboratory Standards

POCT Point-of-Care Testing

(Xét nghiệm tại chỗ chăm sóc bệnh nhân)

PXN Phòng xét nghiệm

MỤC LỤC

MỤC LỤC HÌNH 6

MỤC LỤC BẢNG 6

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 HEMOGLOBIN 4

1.2 CHUYỂN HÓA HEMOGLOBIN VÀ CHUYỂN HÓA BILIRUBIN 5

1.4 THIẾT BỊ XÉT NGHIỆM TẠI CHỖ (point of care testing) 23

1.5 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP VỀ MẶT KĨ THUẬT (ANLYTICAL EVALUATION OF METHODS) 26

CHƯƠNG 2 31

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31

2.2 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TOÀN PHẦN 31

Bảng 2.1 Cách pha các mẫu dùng cho thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính 33

Bảng 2.2 Độ chính xác ngắn hạn 34

Bảng 2.3 Độ chính xác dài hạn 34

Hình 3.2 Đồ thị đánh giá độ tuyến tính của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy AU 2700 37

Bảng 3.1: Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy Gem 4000 38

Bảng 3.2 Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy AU 2700 38

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chính xác ngắn hạn của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700 39

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ chính xác dài hạn của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700 40

Hình 3.3 Đồ thị so sánh kết quả định lượng bilirubin toàn phần trên máy Gem 4000 và máy AU 2700 42

.1 Phương pháp định lượng bilirubin trên máy GEM 4000 có độ chính xác và xác thực tương tự như phương pháp tham chiếu sử dụng tại phòng xét nghiệm 48

.2 Có thể sử dụng phương pháp định lượng bilirubin trên máy GEM 4000 cho việc chẩn đoán, theo dõi điều trị vàng da sơ sinh một cách kịp thời ở cả những cơ sở y tế tuyến dưới 48

MỤC LỤC HÌNH

Hình 3.2 Đồ thị đánh giá độ tuyến tính của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần

trên máy AU 2700 37

Hình 3.3 Đồ thị so sánh kết quả định lượng bilirubin toàn phần trên máy Gem 4000 và máy AU 2700 42

MỤC LỤC BẢNG MỤC LỤC BẢNG 6

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Bảng 2.1 Cách pha các mẫu dùng cho thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính 33

Bảng 2.2 Độ chính xác ngắn hạn 34

Bảng 2.3 Độ chính xác dài hạn 34

Bảng 3.1: Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy Gem 4000 38

Bảng 3.2 Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy AU 2700 38

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chính xác ngắn hạn của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700 39

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ chính xác dài hạn của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vàng da sơ sinh là một trong các tình trạng bệnh lý phổ biến nhất cần

sự chăm sóc y tế ở trẻ sơ sinh Khoảng 60% trẻ sơ sinh đủ tháng và 80% trẻ

sơ sinh non tháng xuất hiện vàng da trong 2 - 4 ngày đầu của cuộc sống [17].Với phần lớn trẻ sơ sinh, vàng da không do bất kỳ bệnh lý nào mà do sự giảmbài tiết bilirubin (vàng da sinh lý) Vàng da sinh lý không gây hại và tự mất đi

ở phần lớn trẻ sơ sinh Tuy nhiên nồng độ bilirubin tự do cao có thể gây tổnthương não không hồi phục nếu không điều trị Các di chứng bao gồm chứngbại não, giảm thính lực và các vấn đề chuyển động của mắt Điều quan trọng

là mức độ bilirubin tăng cao trong máu của trẻ sơ sinh phải được xác địnhnhanh chóng và điều trị kịp thời

Vàng da sơ sinh là tình trạng phổ biến ở Việt Nam nhưng chưa đượcnhận biết và đánh giá đúng bởi mức gia đình trẻ, do vậy làm chậm đưa trẻ đikhám và các bác sĩ ít kinh nghiệm thường chậm trễ trong chẩn đoán và chậmchuyển trẻ đến cơ sở điều trị thích hợp Có rất ít các thiết bị xét nghiệm và cácbiện pháp điều trị vàng da cho trẻ em ở các cơ sở y tế tuyến dưới tại ViệtNam Ở các nước phát triển, trẻ sơ sinh vàng da được lấy máu gót chân đểđịnh lượng bilirubin, việc này do điều dưỡng hoặc nhân viên xét nghiệm đượctập huấn thực hiện Dựa vào kết quả định lượng bilirubin để chẩn đoán xácđịnh và bác sĩ sẽ đưa ra quyết định liệu pháp ánh sáng có cần thiết không, kếtquả bilirubin cũng là thông số theo dõi kết quả điều trị Tuy nhiên, ở ViệtNam các thiết bị phân tích bilirubin cần một lượng máu nhỏ chỉ có ở một sốbệnh viện chuyên khoa nhi Đứng trước sự nghiêm trọng của bệnh vàng da sơsinh, một yêu cầu đặt ra đối với các bác sỹ lâm sàng và các nhà hóa sinh làlàm sao để chẩn đoán sớm, chính xác đối với bệnh này Việc chẩn đoán sớm

có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong điều trị, tiên lượng tình trạng bệnh đốivới bệnh nhân nhi

Bilirubin toàn phần bao gồm bilirubin liên hợp (trực tiếp) và bilirubin

tự do (gián tiếp) Các phương pháp truyền thống phân tích định lượngbilirubin sử dụng thuốc thử diazo của Ehrlich và hiện nay phương pháp diazocải tiến thường được dùng định lượng bilirubin toàn phần (muối diazo vàthuốc thử caffein) Bilirubin trực tiếp hay bilirubin liên hợp được định lượngbằng thuốc thử diazo không có caffein Bilirubin tự do hay bilirubin gián tiếpđược tính bằng hiệu của bilirubin toàn phần và bilirubin liên hợp Dạngbilirubin tự do khi tăng cao trong máu có thể qua hàng rào máu não gây tổnthương thần kinh

Ở trẻ sơ sinh, bilirubin tự do chiếm phần lớn bilirubin huyết thanh, cóthể được tính toán từ bilirubin toàn phần và bilirubin liên hợp hoặc đơn giản

là định lượng bilirubin toàn phần do xem như bilirubin liên hợp là không đáng

kể Bilirubin toàn phần có thể định lượng bằng phương pháp Diazo trên máyhóa sinh tự động Beckman Coulter tại Khoa Sinh Hóa, Bệnh viện Nhi trungương Phương pháp này đã được thiết lập cho phần lớn các máy hóa sinh tựđộng và kết quả có thể truy nguyên với các phương pháp tham chiếu do vậy

có thể so sánh với kết quả của các phòng xét nghiệm khác

Người ta đã phát triển kỹ thuật phân tích bilirubin cho các thiết bị xétnghiệm tại chỗ (point of care testing devices) Các thiết bị này được thiết kế

để định lượng bilirubin ngay tại nơi chăm sóc bệnh nhân, tức là không phải tạiphòng xét nghiệm trung tâm của bệnh viện Thuận lợi của các thiết bị xétnghiệm tại chỗ là thời gian trả kết quả nhanh, lượng mẫu cần cho phân tích ít(dùng ống mao quản) nên tránh được việc thoái hóa bilirubin do chậm phântích và tránh thiếu máu do thầy thuốc vì phải lấy máu nhiều lần với lượng lớn

để làm xét nghiệm Tuy nhiên, các thiết bị xét nghiệm tại chỗ trước đây sửdụng bệnh phẩm là huyết thanh nên đòi hỏi nhân viên của khoa lâm sàng phải

ly tâm mẫu máu trước khi phân tích Máy phân tích khí máu GEM 4000 tíchhợp kỹ thuật phân tích bilirubin toàn phần đã xuất hiện trên thị trường gầnđây Việc định lượng bilirubin trên máy GEM 4000 sử dụng mẫu máu toànphần do vậy không đòi hỏi ly tâm trước khi phân tích Loại máy này có khảnăng áp dụng cho các bệnh nhân sơ sinh và khắc phục được nhược điểm củacác thiết bị định lượng bilirubin tại chỗ trước đây

Hiện khoa sơ sinh bệnh viện Nhi trung ương đã được trang bị máy đokhí GEM 4000 Thời gian trả kết quả nhanh và việc chỉ cần một lượng máunhỏ làm cho thiết bị này có thể rất thích hợp cho việc chẩn đoán, theo dõi điềutrị vàng da sơ sinh một cách kịp thời ở cả những cơ sở y tế tuyến dưới Việcđịnh lượng bilirubin tại phòng xét nghiệm trên máy phân tích hóa sinh tựđộng đòi hỏi lấy máu tĩnh mạch, việc bảo quản và vận chuyển không đúng sẽlàm bilirubin thoái hóa, gây kết quả thấp giả tạo và thời gian trả kết quả phảitính bằng giờ Thay vì phải gửi mẫu máu tĩnh mạch đến phòng xét nghiệm đểđịnh lượng bilirubin, chúng ta có thể chỉ cần một mẫu máu mao mạch và thờigian trả kết quả chỉ tính bằng phút khi tiến hành định lượng bilirubin trên máyGEM 4000 Tuy nhiên, để kết quả phân tích bilirubin trên máy GEM 4000 cóthể được sử dụng để đưa ra các quyết định chẩn đoán và điều trị vàng da sơsinh, cần phải đánh giá xem phương pháp này có độ chính xác và xác thựctương tự như phương pháp tham chiếu sử dụng tại phòng xét nghiệm hay

không Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá phương pháp định

lượng bilirubin trên máy phân tích khí máu GEM 4000” nhằm mục tiêu:

Thẩm định phương pháp định lượng bilirubin toàn phần bằng phươngpháp quang phổ trực tiếp trên máy GEM 4000

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Chức năng hemoglobin

Hemoglobin (Hb) là một protein phức tạp có nhóm ngoại là hem Hbđảm nhận chức năng kết hợp với oxy ở phổi, vận chuyển và giải phóng oxy ở

tổ chức, nhận CO2 từ tổ chức đưa về phổi Ngoài ra Hb còn là một trong các

hệ đệm quan trọng của cơ thể

1.1.2 Cấu tạo phân tử Hb

Hb là đại phân tử có 4 tiểu đơn vị Mỗi tiểu đơn vị là một globin kếthợp với nhân Hem Hem là một sắc tố chứa sắt hóa trị II Chính nhờ ion sắt

mà Hb có thể gắn và giải phóng oxy Globin là một chuỗi polypeptid Cónhiều loại globin thuộc hai họ α và họ không α Tùy theo sự kết hợp các chuỗi

mà có các Hb khác nhau

- Hai chuỗi α kết hợp hai chuỗi β (α2β2) tạo thành Hb A

- Hai chuỗi α kết hợp hai chuỗi γ (α2γ2) tạo thành Hb F

- Hai chuỗi α kết hợp hai chuỗi δ (α2δ2) tạo thành Hb A2

Ở người lớn bình thường chủ yếu là Hb A, ngoài ra còn:

- Hb A2 chiếm tỉ lệ 2-3.5% Kí hiệu α2δ2 hay αδ/αδ

- Hb F (còn gọi là huyết sắc tố bào thai vì chiếm tỉ lệ rất cao ở giai đoạncuối của thai nhi và sơ sinh) Kí hiệu α2γ2 hay αγ/αγ

- Một số huyết sắc tố ở thời kì phôi thai và thời kì đầu của bào thai

+ Huyết sắc tố Gower I gồm 2 chuỗi ξ và 2 chuỗi ε

+ Huyết sắc tố Gower II gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi ε

+ Huyết sắc tố Porland gồm 2 chuỗi ξ và 2 chuỗi γ

Ở trẻ sơ sinh sẽ có tỉ lệ Hb F rất cao và tỉ lệ này sẽ giảm dần khi lớnlên Sự khác biệt về cấu trúc giúp ái lực của Hb F với oxy cao hơn so với Hb

A Do đó bào thai có Hb F giúp lấy được oxy từ máu của mẹ vì bào thai chưathể tự hô hấp Khi đẻ ra thì trẻ tự hô hấp bằng phổi nên Hb F được thay thếbằng Hb A, do Hb A liên kết với oxy lỏng lẻo hơn nên khả năng liên kết vàphân ly là rất linh hoạt, đảm bảo sự vận chuyển và trao đổi khí hiệu quả

1.2 CHUYỂN HÓA HEMOGLOBIN VÀ CHUYỂN HÓA BILIRUBIN 1.2.1 Sự thoái hóa hemoglobin, chuyển hóa bilirubin [1]

 Sự thoái hóa hemoglobin và chuyển hóa của bilirubin

Hồng cầu già bị phá hủy trong lách giải phóng Hb và Hb được thoái hóa.Bình thường có khoảng 90% lượng Hb được thoái hóa trong tổ chức liên võng,ngoài hệ thống tuần hoàn Hb thủy phân giải phóng globin và hem Globin làprotein nên thủy phân thành các acid amin Những acid amin này chủ yếu đượctái sử dụng để tổng hợp protein Những acid amin không được tái sử dụng sẽ bịthoái hóa Còn hem được mở vòng ở vị trí carbon alpha với sự tham gia củaenzym hemoxygenase Enzym này của microsom gắn với cytocrom P-450 cócoenzym là NADPH và cần một phân tử oxy, giải phóng ra CO và ion sắt III.Ion sắt được vận chuyển đến transferrin Sản phẩm tạo thành của phản ứng này

là biliverdin có màu xanh Ở người và một số động vật khác biliverdin tiếp tục

bị khử thành bilirubin nhờ enzym biliverdin reductase

Hình1.1 Sự thoái hóa của hemoglobin và chuyển hóa của bilirubin

Bilirubin tạo thành không tan trong nước có ái lực cao với lipid vàalbumin của huyết thanh Bilirubin được vận chuyển vào máu và kết hợp vớivới albumin của huyết thanh Tới gan, bilirubin nhanh chóng được tách rakhỏi albumin huyết thanh Bilirubin đi vào tế bào gan Trong tế bào ganbilirubin kết hợp với acid glucoronic dưới dạng UDP glucuronat tạo thànhbilirubin liên hợp Enzym xúc tác cho phản ứng liên hợp là glucoronyltransferase Bilirubin liên hợp được bài tiết vào đường dẫn mật về túi mật và

là thành phần chính của sắc tố mật Bilirubin liên hợp phản ứng trực tiếp với

Biliverdin

Hb

Hem

aa (tái sử dụng hoặc thoái hóa)

NADP +

NADPHH +

NADP +

Bilirubin tự do Máu

Chu trình

2UDP glucoronat Glucuronyl transferase

2 UDP Bilirubin liên hợp

Gan

Ruột

Urobilinogen Urobilin (phân)

gan 2 glucuronat

Ruột-8 H +

muối diazo tạo thành chất màu azo gọi là phản ứng Van der Bergh

Bilirubin glucuronid từ túi mật xuống ruột, nhờ các enzym của vikhuẩn đường ruột thủy phân tách glucoronat và bilirubin bị oxy hóa thànhurobilinogen Urobilinogen tiếp tục oxy hóa thành stecobilinogen Hai sắc tốnày đào thải ra phân và bị khử thành urobilin và stecobilin tương ứng Ở phânngười bình thường urobilin và stercobilin tạo cho phân có màu vàng Khoảng20% urobilinogen và stercobilinogen được tái hấp thu vào tĩnh mạch cửa vềgan tái tạo lại sắc tố mật Quá trình này gọi là chu trình gan-ruột Một phầnsắc tố mật bị lọc qua thận và đào thải qua nước tiểu và bị khử thành urobilin

và srecobilin Hai chất này cũng tạo ra màu của nước tiểu người bình thường

Trẻ sơ sinh những ngày đầu sau khi sinh do thiếu các enzym của vi khuẩnđường ruột bilirubin không bị khử ở ruột mà tự oxy hóa thành biliverdin

1.2.2 Ý nghĩa lâm sàng [1]

Lượng bilirubin trong huyết thanh là kết quả của sự cân bằng giữa hìnhthành bilirubin do thoái hóa Hb và khả năng liên hợp bilirubin của gan Ngườibình thường bilirubin toàn phần dưới 1 mg%, trong đó tự do là 0.8 mg% vàliên hợp chỉ dưới 0.2 mg% Sự tăng bilirubin toàn phần trong huyết tương gây

ra vàng da Vàng da có thể chia làm 3 nhóm nguyên nhân chính: Vàng datrước gan, vàng da tại gan và vàng da sau gan

enzyme trong hồng cầu.

Vàng da trước gan còn do tăng phá hủy các thành phần hem không phảicủa Hb ở gan và một số mô khác Hầu hết các trường hợp vàng da trước ganchức năng gan bình thường

Vàng da ở trẻ sơ sinh: Loại này có lượng bilirubin toàn phần huyếtthanh trên 15 mg% xuất hiện vài ngày sau sinh hoặc trên mức trên 10 mg%sau khi sinh hai tuần Những nguyên nhân chính của loại vàng da này do: Tanmáu sau khi sinh, gan của trẻ chưa hoàn thiện nên các enzym của gan chưa đủ

về số lượng cũng như chức năng gây thiếu hụt tạm thời enzymglucoronyltransferase Những đứa trẻ bình thường bilirubin tăng cao hai, bangày sau sinh, rồi giảm nhanh, trở về trạng thái bình thường Khi nồng độbilirubin cao kéo dài trên hai tuần hoặc tiếp tục tăng trên 15 mg% có thể làvàng da bệnh lý

 Vàng da tại gan

Vàng da do thiếu hụt hoàn toàn enzyme liên hợp bilirubin ở tế bào gangặp trong hội chứng Crigler-Najar và thiếu hụt một phần enzyme liên hợp gặptrong hội chứng Gilberts Trong vàng da do các bệnh bẩm sinh di truyền này,bilirubin tự do tăng cao

Vàng da xuất hiện khi tế bào gan bị hủy hoại hoặc do sự bài tiết sảnphẩm từ tế bào bị tổn thương Trong vàng da này bilirubin liên hợp tăng nhiềuhơn Hay gặp do viêm gan bởi các nguyên nhân do virus, do nhiễm độc

 Vàng da sau gan

Còn gọi vàng da do tắc mật, gây cản trở mật xuống ruột Những nguyênnhân gây tắc mật phổ biến nhất là do sỏi đường mật, u đầu tụy hoặc u các cơquan khác chèn vào đường mật Vàng da sau gan tăng bilirubin liên hợp là

chủ yếu Lượng bilirubin tới ruột giảm nên phân bạc màu nhưng có nhiềubilirubin ra nước tiểu, nên nước tiểu có màu vàng đậm Trong những trườnghợp tắc mật kéo dài, gan có thể bị tổn thương, khả năng liên hợp giảm Nênnhững trường hợp này bilirubin liên hợp có thể tăng nhưng không cao nhưtrong những trường hợp vàng da sau gan với chức năng gan bình thường

1.2.3 Vàng da ở trẻ sơ sinh

Rối loạn gây ra bệnh vàng da ở trẻ sơ sinh được phân loại dựa vào sựtăng bilirubin tự do hoặc bilirubin liên hợp trong máu

1.2.3.1 Tăng bilirubin tự do trong máu

Nguyên nhân của việc tăng bilirubin tự do ở trẻ sơ sinh là do vàng dasinh lý ở trẻ sơ sinh, bệnh tan máu và hội chứng tăng bilirubin ở trẻ bú mẹ

 Vàng da sinh lý ở trẻ sơ sinh

Trẻ thường bị vàng da trong vòng vài ngày sau khi sinh, tình trạng nàyđược gọi là vàng da sinh lý của trẻ sơ sinh Bilirubin cao nhất trong 3-5 ngàysau khi sinh và vẫn còn cao trong 2 tuần tiếp theo Bilirubin thường là thấphơn 5 mg/dL, với 90% bilirubin tự do Yếu tố gây vàng da sinh lý là do tăngtạo bilirubin ở trẻ sơ sinh vì các tế bào hồng cầu có đời sống ngắn hơn, sựxuất hiện của "shunt bilirubin”, đó là bilirubin có nguồn gốc từ các nguồnkhông phải hồng cầu, giảm bilirubin liên hợp do thiếu hụt enzym glucuronyltransferase trong vài ngày đầu tiên sau khi sinh, do tăng sự hấp thụ củabilirubin tự do trong ruột do β-glucoronidase hoặc khi trẻ sơ sinh bú mẹ,pregnanediol, các axit béo tự do và các chất ức chế khác của quá trình liênhợp bilirubin có trong sữa mẹ [5, 18, 19]

 Bệnh tan máu

Bệnh tan máu ở trẻ sơ sinh là do bất đồng nhóm máu hệ Rh của mẹ vàcon Nhóm máu của mẹ là Rh âm trở nên nhạy cảm với thai nhi Rh dương từlần mang thai trước hoặc truyền máu Rh dương Trẻ bị vàng da với trongngày đầu tiên hoặc ngày thứ hai sau khi sinh và dễ bị vàng da nhân Chẩnđoán xác định bằng xét nghiệm Coombs ở trẻ sơ sinh, nhóm máu Rh dương ởtrẻ sơ sinh và máu Rh âm ở người mẹ Các bệnh thiếu máu tán máu đi truyềnhiếm gặp khác, chẳng hạn như thiếu hụt glucose-6-photphate (G6PD), cũng

có thể dẫn đến tăng bilirubin tự do trong máu [5, 18]

 Hội chứng bilirubin máu tăng cao liên quan đến sữa mẹ (Breast

Milk Hyperbilirubin)

Đây là loại tăng bilirubin gặp khoảng 30% ở trẻ sơ sinh bú sữa mẹ Đó là

do α-glucuronidase trong sữa mẹ, thủy phân bilirubin liên hợp trong ruột.Bilirubin tự do ưa mỡ hơn, sẽ được hấp thu một cách thụ động Bệnh kéo dàitrong một vài tuần và được xử lý bằng cách ngừng cho con bú [5, 18]

1.2.3.2 Tăng bilirubin liên hợp

Hội chứng này được đặc trưng bởi tăng bilirubin máu trong đó bilirubinliên hợp vượt quá 1.5 mg/dL (24 µmol/L) Thường gặp nhất là viêm gankhông rõ nguyên nhân ở trẻ sơ sinh và hẹp đường mật Bệnh sử gia đình cóthể hữu ích trong chẩn đoán thiếu α-antitrypsin, xơ hóa nang, galactosemia,không dung nạp fructose di truyền và tyrosinosis Nên định lượng nồng độtyrosine huyết thanh và α-antitrypsin Nên tìm các chất khử không phảiglucose trong nước tiểu nếu nghi ngờ galactosemia, chẩn đoán xác định bởi

sự vắng mặt của enzym UDP galactose-1-phosphate uridyl transferase trong

tế bào và mô, như tế bào hồng cầu và gan Thử nghiệm huyết thanh học có thểcần thiết cho chuẩn đoán bệnh viêm gan A, B, C do adenovirus, coxsackie

virus, cytomegalovirus, herpes simplex, rubella, và do toxoplasma Có thểthực hiện sinh thiết gan, nhưng hình ảnh giải phẫu bệnh trong cả hai bệnhviêm gan và hẹp đường mật với các tế bào gan khổng lồ và tế bào tạo máungoài tủy là tương tự nhau [5, 16].

 Viêm gan nguyên phát ở trẻ sơ sinh

Khoảng 75% trường hợp viêm gan ở trẻ sơ sinh là viêm gan tế bàokhổng lồ vô căn, một rối loạn không rõ nguyên nhân đặc trưng bởi vàng da ứmật Có xu hướng gia đình có thể phản ánh qua di truyền lặn NST thường.Vàng da xuất hiện trong vòng 2 tuần đầu tiên Đứa trẻ ra đời khỏe mạnh, lêncân tốt Gan và lách sau đó trở nên to và phân trở nên nhạt màu,aminotransferase huyết thanh thường >400 U/L, thời gian prothrombin kéodài Ứ mật là vấn đề nổi bật Điều quan trọng phải loại trừ tắc mật ngoài gannhư hẹp đường mật bằng phương pháp scan HIDA [5, 15]

 Hẹp đường mật

Hẹp đường mật là một nhóm các rối loạn mắc phải đa dạng liên quanđến đường dấn mật ngoài gan hoặc ống dẫn mật trong gan Nguyên nhân gâybệnh có thể do cytomegalovirus, reovirus III, Epstein-Barr virus, rubella,thiếu α-antitrypsin, hội chứng Down và trisomy 17 hoặc 18 [5]

Hẹp đường mật ngoài gan có thể bao gồm tất cả hoặc một phần củađường mật ngoài gan Tần suất bệnh là 1 trên 10000 trẻ sơ sinh sinh, nữthường thường gặp nhiều hơn so với nam Vàng da và ngứa thường xuất hiệntrong tuần đầu tiên Phân và nước tiểu có màu nước chè Nếu vàng da kéo dàihơn 14 ngày tuổi, cần định lượng bilirubin và kiểm tra màu sắc phân, nếu màusắc không phải là màu xanh lá cây hoặc màu vàng, nhiều khả năng là hẹpđường mật Xác định sớm tình trạng này là điều cần thiết để những trẻ sơ sinhnày được thực hiện phẫu thuật mở thông ruột chủ phẫu thuật cần được thực

hiện sớm trước 60 ngày sau khi sinh Nếu phẫu thuật không thành công, cóthể lựa chọn ghép gan để điều trị Trẻ mắc bệnh này khó có thể sống hơn 3năm trừ khi tổn thương được phẫu thuật thành công [5].

Vàng da thường xuất hiện trong vài ngày đầu tiên sau khi sinh.Bilirubin huyết thanh cao và cholesterol trong huyết thanh có thể rất cao vàdẫn đến sự hình thành của u vàng (xanthomas) Tổn thương mô bệnh học củagan không đặc hiệu, ít đường mật, tế bào khổng lồ, viêm và xơ hóa Trẻthường sống đến tuổi thiếu niên nhưng thường phát triển chậm [19]

1.3 CÁC KĨ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN

 Phương pháp thuốc thử Diazo

Hiện tại, phương pháp định lượng bilirubin thường được sử dụng tại cácphòng xét nghiệm hóa sinh lâm sàng là phương pháp dựa trên phản ứng diazo.Trong phản ứng này, bilirubin phản ứng với acid diazo sulfanilic (thuốc thửdiazo) để tạo thành sản phẩm màu Acid diazo sulfanilic phản ứng ở cacbonmethylen trung tâm của bilirubin để phân chia các phân tử, tạo thành một hỗnhợp hai chất đồng phân của azodipyrroles (azobilirubin) Phản ứng này có thểxảy ra ở pH khác nhau Phương pháp ban đầu của Malloy-Evelyn được thựchiện ở pH 1-2 Tại pH này azobilirubin có màu tím đỏ có độ hấp thụ cực đại tạibước sóng 560 nm Tốc độ phản ứng của thuốc thử diazo với các loại bilirubinkhác nhau cũng khác nhau Bilirubin liên hợp phản ứng rất nhanh và δ-bilirubinphản ứng chậm hơn Tốc độ phản ứng của bilirubin tự do phụ thuộc vào pH Đểtăng tốc độ phản ứng ở pH = 6, người ta thường thêm vào một chất được gọi làchất gia tốc Trong phương pháp Malloy-Evelyn, methanol được sử dụng làmdung môi của bilirubin tự do, nhưng hiện nay nhiều hóa chất khác được sửdụng, chẳng hạn như dimethyl sulfoxide và chất tẩy không chứa ion Phương

pháp Malloy-Evelyn hiện ít được sử dụng bởi vì một số vấn đề như các hiệuứng của chất nền, lượng lớn protein tủa bởi methanol (gây ra độ đục), ảnhhưởng của Hb và thời gian phản ứng tương đối dài Các hợp chất khác được sửdụng làm chất gia tốc bao gồm sodium benzoate caffeine, dyphylline, natrisulfat dodecyl và chất xúc tác bề mặt [7, 12].

Phương pháp Jedrassik- Grof được thực hiện ở pH gần 6,5 nhưng độhấp thụ của phản ứng được đo sau khi kiềm hóa hỗn hợp phản ứng, phổ hấpthụ của azobilirubin được chuyển sang một màu xanh mạnh hơn, đo tại 600

nm Phương pháp Jendrassik- Grof ban đầu sử dụng natri benzoat caffein đểhòa tan bilirubin tự do, từ đó định lượng bilirubin toàn phần [11]

Phương pháp thuốc thử Diazo đã được tự động hóa Tuy nhiên, phươngpháp Jendrassik-Grof sử dụng 4 thuốc thử riêng biệt, trong khi các phươngpháp phân tích được sử dụng phổ biến nhất hiện nay được thiết kế chỉ sử dụnghai thuốc thử Hơn nữa, acid azosulfanilic và các thuốc thử acid ascorbic chỉ ổnđịnh một thời gian ngắn trong ngày Để cải thiện hydroxylamine đã được thaythế cho acid ascorbic Mặt khác các thuốc thử diazo khác như dichlorophenyl-2,4 hoặc muối 2,5-diazonium dichlorophenyl đã được sử dụng trong các hệmáy tự động Một loại muối diazo khác thường được sử dụng nhiều trong máyphân tích tự động là 2,5-dichlorophenyldiazonium tetrafuoroborat (DPD), phảnứng rất nhanh với bilirubin trong môi trường acid Trong hệ máy của Roche,DPD trong môi trường axit mạnh được sử dụng cùng với một tác nhân hòa tan

để tăng tốc độ phản ứng và tránh kết tủa protein Hệ thống của Abbot sử dụng2,4-dichloroaniline làm thuốc thử diazo [7]

 Phương pháp quang phổ trực tiếp

Phương pháp này áp dụng cho các mẫu của trẻ sơ sinh dưới 3 thángtuổi, vì ở trẻ lớn và người lớn có carotenoid trong máu cũng hấp thụ ánh sáng

tại bước sóng 454 nm Tuy nhiên cần phải phân biệt sự hiện diện củaoxyhemoglobin, bởi vì oxyhemoglobin cũng hấp thụ ở 454 nm Điều nàyđược loại bỏ bằng cách trừ đi độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm, bởioxyhemoglobin hấp thụ như nhau ở hai bước sóng này Phương pháp này cầnphải có quang phổ quang kế có khả năng đo tại bước sóng 454 nm và 540 nm.Phương pháp quang phổ trực tiếp có thể thực hiện ngay cả khi có pha loãnghay không pha loãng huyết thanh với dung dịch đệm phù hợp Khi sử dụngphương pháp này, người ta giả định rằng chỉ có bilirubin tự do trong mẫu thử

và chất gây nhiễu duy nhất là Hb [17]

Phương pháp quang phổ trực tiếp hiện đã được đưa vào máy phân tíchkhí máu để đo bilirubin trong máu toàn phần Trong máy phân tích khí máuRadiometer ABL735, nhiều phép đo hấp thụ được thực hiện trên máu toànphần trong khoảng trên 128 bước sóng (từ 478 nm đến 672 nm) Các tế bàohồng cầu bị phá vỡ nhờ rung động siêu âm và độ hấp thụ của dịch huyết tánđược đo một cách chính xác Bởi vì hồng cầu không có bilirubin, bilirubinhuyết tương được tính toán bằng cách sử dụng hệ số pha loãng dựa trênhematocrit để tính sự pha loãng huyết tương bởi dịch trong hồng cầu Nồng

độ bilirubin sau đó được hiệu chuẩn bằng cách loại bỏ sự hấp thụ ánh sángcủa Hb Máy phân tích có khả năng hiệu chỉnh cả Hb người lớn và trẻ em, hailoại Hb có phổ hấp thụ khác nhau Gần đây một đánh giá đa trung tâm chothấy thiết bị này có sự tương đồng tốt với phương pháp định lượng của phòngthí nghiệm Phương pháp này cũng cho kết quả chấp nhận được đối với mẫubệnh phẩm của người lớn Phương pháp quang phổ trực tiếp nhanh chóng vàthuận tiện khi sử dụng trong các thiết bị xét nghiệm tại chỗ (POCT) [20]

Máy đo bilirubin xuyên qua da cũng sử dụng nguyên tắc quang phổ trực

tiếp Đây là thiết bị không xâm lấn để đo bilirubin ở trẻ sơ sinh Ban đầu cácthiết bị đo bilirubin qua da đo độ vàng của da bằng cách đo mật độ quang học

của ánh sáng màu xanh và màu xanh lá cây phản xạ từ da Phương pháp này bịảnh hưởng bởi sắc tố da BiliCheck meter và JM103 meter là hai loại thiết bị đã

có mặt trên thị trường Với BiliCheck meter, ánh sáng trắng được truyền lên da,

và ánh sáng phản xạ được phân tích Độ hấp thụ từ các chất ảnh hưởng (Hb,melanin và độ dày của da) được loại bỏ bằng tính toán độ hấp thụ ánh sáng bởibilirubin trong mao mạch Nhiều nghiên cứu chứng minh thiết bị đo bilirubinqua da cho kết quả là chính xác, tương đồng với kết quả trong phòng thínghiệm, đặc biệt là khi nồng độ bilirubin thấp hơn 240 μmol/L (14 mg/dL).Tuy nhiên, các thiết bị này không thể thay thế phương pháp đo lường bilirubinhuyết thanh tại phòng thí nghiệm trong việc quyết định lựa chọn điều trị, nhưng

có thể dùng để định lượng bilirubin huyết thanh của trẻ sơ sinh [17]

 Phương pháp enzyme [10]

Phương pháp enzym để xác định bilirubin đã được phát triển bằng cách

sử dụng bilirubin oxidase được cô lập từ Myrothecium verucaria MT-1.Enzym xúc tác quá trình oxy hóa bilirubin thành biliverdin Phản ứng nàyđược theo dõi bằng cách đo độ giảm hấp thụ quang ở bước sóng 405 hoặc 460

nm Sodium dodecyl sulfate hoặc natri cholate được đưa vào trong xét nghiệmđịnh lượng bilirubin toàn phần để phân tách bilirubin ra khỏi albumin và đẩynhanh tốc độ phản ứng

Phương pháp enzym đã được tự động hóa và các kết quả của phươngpháp enzym tương đồng với kết quả của phương pháp Jendrassik-Grof Tuynhiên sự khác biệt đã được quan sát thấy trong các mẫu với nồng độ bilirubinliên hợp cao và điều này có thể khắc phục bằng cách đo ở bước sóng 425 nmthay vì 465 nm

Ban đầu Hb được cho là nguyên nhân gây nhiễu âm tính, nhưng thêmEDTA vào thuốc thử làm giảm ảnh hưởng này

Một số phương pháp khác để đo bilirubin toàn phần đã được mô tả.Phương pháp huỳnh quang dựa trên sự phát huỳnh quang của bilirubin khigắn với protein hoặc chất tẩy, phương pháp điện hóa và phương pháp hóaphát quang dựa trên phản ứng của bilirubin và peroxinitrite cũng được mô tả.Tuy nhiên không phương nào trong số này tiện lợi trong thực hành thườngquy tại phòng xét nghiệm [10].

 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [13, 14]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được phát triển để phân tách

và định lượng bốn thành phần bilirubin, bao gồm α-bilirubin (bilirubin tự do),β-bilirubin (bilirubin liên hợp một gốc glucuronat), γ-bilirubin (bilirubin liênhợp hai gốc glucuronat) và δ-bilirubin (bilirubin gắn chặt với protein) Nhữngphương pháp này cũng có khả năng phát hiện photoisomers được tạo ra trongquá trị liệu trình ánh sáng (phototherapy) Phương pháp này cho thấy tronghuyết thanh của bệnh nhân vàng da ứ mật phần lớn là δ-bilirubin và γ-bilirubin

và β-bilirubin tương ứng là 24% và 13% Phần còn lại 27% là bilirubin tự do.

Độ chính xác và xác thực của phương pháp HPLC không đủ để xem chúng làphương pháp tham chiếu Việc hiệu chuẩn HPLC là một vấn đề

 Phương pháp quang phổ

Bilirubin tự do và liên hợp cũng có thể được ước tính bằng kỹ thuậtquang phổ màng khô Trong các phương pháp sử dụng hệ thống hóa học khô,bilirubin tự do và liên hợp được đo đồng thời Các mẫu được xử lý bằngcaffeine benzoat natri và chất hoạt động bề mặt phân tách bilirubin tự do rakhỏi albumin Bilirubin tự do và bilirubin liên hợp sau đó liên kết với mộtpolymer cation được gọi là sự nhuộm màu Sự tương tác này của bilirubin vớithuốc gắn màu gây ra một sự thay đổi phổ hấp thụ làm cả hai dạng bilirubin

có độ hấp thụ phân tử tương tự nhau tại 400 nm, nhưng ở 460 nm bilirubin tự

do có một độ hấp thụ phân tử cao hơn Nồng độ bilirubin liên hợp và tự dođược xác định bằng cách đo phản xạ tại hai bước sóng này Nồng độ của δ-bilirubin được tính từ sự khác biệt giữa bilirubin toàn phần (theo phương phápmàng khô diazo) và tổng số của bilirubin liên hợp và bilirubin tự do đo bằngphương pháp dịch chuyển phổ hấp thụ [17]

 Phương pháp enzym

Các phương pháp enzym sử dụng bilirubin oxidase cũng đã được sửdụng để đo lường các loại bilirubin Bilirubin trực tiếp phản ứng ở pH 3,7 vàbilirubin toàn phần phản ứng ở pH 7,2 Trong trường hợp không có các chấttẩy rửa, bilirubin liên hợp và δ-bilirubin bị oxy hóa bởi bilirubin oxidase ở pHacid và bilirubin tự do bị oxy hóa ở pH kiềm Bằng cách thay đổi pH và bổsung các chất tẩy, ta có thể đo được tất cả ba loại Bilirubin toàn phần được

đo ở pH 10,0 trong sự có mặt của SDS, bilirubin trực tiếp được đo ở pH 3,7

và bilirubin tự do được đo ở pH 10 khi không có SDS Phương pháp này cókết quả tương đồng với phương pháp HPLC Trong cách tiếp cận khác để đobilirubin liên hợp, phản ứng của bilirubin oxidase với δ-bilirubin và bilirubin

tự do được giảm bằng cách cho thêm vào natri florua và N-acetycystein

Morimoto và cộng sự đo độ giảm hấp thụ quang ở bước sóng 450 nm do quátrình oxy hóa của bilirubin liên hợp bởi bilirubin oxidase trong sự có mặt củaacid methylene phosphonic, EDTA và 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl Có đến 5% bilirubin tự do có thể bị oxy hóatrong phương pháp [10].

 Phương pháp Diazo

Khi không có chất gia tốc (VD: thuốc thử caffeine), các loại bilirubinkhông phải bilirubin tự do phản ứng với thuốc thử diazo Bilirubin loại nàyphản ứng này gọi là bilirubin trực tiếp Tuy nhiên, hiện giờ người ta đã biếtrằng một lượng bilirubin tự do và δ-bilirubin cũng phản ứng trong điều kiệnnày Ngay cả ở pH thấp, một tỷ lệ nhỏ bilirubin tự do sẽ phản ứng với thuốcthử diazo, đặc biệt là nếu nồng độ natri nitrit cao Ủ huyết thanh với HCl đãđược khuyến cáo để làm giảm phản ứng của bilirubin tự do Tuy nhiên điềunày cũng làm giảm phản ứng của các loại bilirubin liên hợp và δ-bilirubin.Bằng cách cẩn thận lựa chọn các điều kiện phản ứng, có thể đo bilirubin trựctiếp và phương pháp tương quan tốt với phương pháp HPLC [7]

 Phương pháp khác

Phương pháp sắc kí lớp mỏng và phương pháp điện di mao quản dùngphân tách và định lượng các loại bilirubin cũng đã được mô tả Tuy nhiên,không phương pháp nào trong số này có ích trên lâm sàng, bởi vì việc xácđịnh tất cả các loại bilirubin không cung cấp thêm giá trị chuẩn đoán nào

 Free unconjugated bilirubin

Phần bilirubin tự do không gắn với albumin là không đáng kể ở người lớn,nhưng có thể cao ở trẻ sơ sinh Phần này liên quan đến sinh bệnh học của chứngvàng da nhân Dựa trên nguyên tắc “free unconjugated bilirubin” nhanh chóng bị

oxi hóa bởi horseradish peroxidase, trong khi phần bilirubin gắn albumin được

bảo vệ khỏi phản ứng này Hai loại máy phân tích “free unconjugated bilirubin”

đã có trên thị trường, đây là máy UB và FloPro Với máy UB, mẫu phải phaloãng 42 lần, máy FloPro mẫu chỉ cần pha loãng 2 lần [10]

Phương pháp Jendrassick-Grof sử dụng cafein benzoate để hòa tan cácloại bilirubin có độ lặp tốt được khuyến cáo như phương pháp tham chiếu Vìtính đặc hiệu của phương pháp định lượng bilirubin trực tiếp và toàn phầnkhông cao, nồng độ đúng của bilirubin trực tiếp và gián tiếp của trong huyếtthanh không được khẳng định chắc chắn Phương pháp HPLC có thể phântách và định lượng các loại bilirubin, giúp chúng ta hiểu biết rõ hơn về thànhphần bilirubin trong máu Kết quả của phương pháp HPLC cho thấy trongmáu người khỏe mạnh dưới 5% bilirubin là loại liên hợp và có rất ít δ-bilirubin So với HPLC, phần lớn các phương pháp diazo cho kết quảbilirubin liên hợp cao hơn nồng độ thực của nó Hơn nữa, phương pháp HPLCcòn cho thấy có cả những chất không phải là bilirubin trong máu cũng phảnứng với thuốc thử diazo Một số chất có trong nước tiểu như mesobilifuscin,uroerythrin có ảnh hưởng đến phản ứng phân tích bilirubin trong nước tiểu vàngười ta cho rằng có thể các chất này hoặc những hợp chất tương tự có thể cótrong huyết tương

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các phương pháp hóa học cho kết quảbilirubin trực tiếp dưới 15% bilirubin toàn phần ở người khỏe mạnh có thể làcác phương pháp có kết quả xác thực nhất Với phương pháp diazo, lượngbilirubin trực tiếp có trong huyết thanh người khỏe mạnh tham gia phản ứngphụ thuộc vào thời gian và nhiệt độ phản ứng

Thuận lợi hàng đầu của phương pháp Jendrassick-Grof là độ nhạy và

độ chính xác cao do hệ số hấp thụ phân tử của azobilirubin cao hơn trong môi

trường kiềm Phương pháp ít bị nhiễu bởi Hb, phản ứng lên màu nhanh,khoảng tuyến tính rộng Phương pháp Jendrassick-Grof thường dùng acidascorbic làm giảm nhiễu của Hb và sử dụng mẫu trắng bệnh phẩm để giảmnhiễu của các chất màu nội sinh.

Việc sử dụng máy định lượng bilirubin để định lượng bilirubin toànphần chỉ có ích với trẻ sơ sinh vì sự có mặt của các carotenoid trong máungười lớn có thể gây nhiễu nhiều trong phương pháp này Tuy nhiên, các thiết

bị này dễ sử dụng, chỉ cần lượng mẫu nhỏ, có độ chính xác và xác thực tốtnếu máy được bảo dưỡng đều đặn Gần đây một số máy khí máu còn địnhlượng cả bilirubin bằng phương pháp quang phổ trực tiếp làm cho việc địnhlượng bilirubin trở nên dễ dàng hơn, một số nghiên cứu còn cho thấy các thiết

bị này có thể sử dụng cho cả trẻ lớn và người lớn

Không có phương pháp nào được xem như là tiêu chuẩn vàng cho địnhlượng bilirubin Tại thời điểm hiện nay, không có lý do rõ ràng nào cho việclựa chọn phương pháp diazo, enzyme, quang phổ hay phương pháp O’Leary

Vì tất cả các phương pháp đều có độ chính xác chấp nhận được và có thể tựđộng hóa nên việc lựa chọn sử dụng phương pháp nào là tùy thuộc vào thiết bị

và sự quyết định của phòng xét nghiệm

Phương pháp dry-film định lượng bilirubin toàn phần, liên hợp và tự do

là tương đồng với phương pháp diazo Độ lệch giữa phương pháp dry-film vàJendrassick-Grof về bilirubin trực tiếp được cho là do phương pháp dry-film

có thể phân biệt giữa bilirubin glucuronid (liên hợp) và δ-bilirubin, cả hai loạiđều phản ứng với thuốc thử diazo với mức độ khác nhau Phương pháp dry-film không bị nhiễu bởi carotenoid và ít nhiễu bởi Hb Phương pháp này hiệnnay là phương pháp duy nhất được sử dụng thường quy trong phòng xétnghiệm để định lượng các loại bilirubin liên hợp, tự do và δ-bilirubin thay vì

phân loại bilirubin là trực tiếp hoặc gián tiếp [6].

Phương pháp đo bilirubin qua da đã được phát triển không còn bị ảnhhưởng bởi màu sắc của da và có độ tương đồng tốt với kỹ thuật định lượngbilirubin trong máu Tuy nhiên, cần lưu ý là các phương pháp định lượngbilirubin qua da và trong máu không đo lường cùng một loại thông số.Phương pháp định lượng bilirubin qua da định lượng bilirubin di chuyển từmáu vào mô Do vậy, phép đo bilirubin qua da có phải là chỉ điểm cho lượngbilirubin từ máu vào não hay không vẫn còn là một câu hỏi

Một vấn đề có thể có ý nghĩa hơn việc chọn các phương pháp địnhlượng bilirubin hiện có đó là việc lựa chọn chuẩn thích hợp Nhiều phươngpháp không đúng hoặc có sự khác biệt là do sự khác biệt về chuẩn sử dụng.Nhiều khuyến cáo đề xuất sử dụng chuẩn bilirubin được tạo từ huyết thanh.Tuy nhiên, phòng xét nghiệm cũng nên kiểm tra chuẩn từ huyết thanh so vớichuẩn bilirubin tinh khiết từ National Institute for Standard and Technology.Các loại bilirubin liên hợp đã được tổng hợp và có trên thị trường Các nghiêncứu cho thấy chúng phản ứng với thuốc thử diazo tương tự bilirubin liên hợpglucoronat và vì vậy có thể sử dụng cho phép chuẩn để định lượng bilirubintrực tiếp trong các máy phân tích

1.3.4 Mẫu bệnh phẩm

Định lượng bilirubin toàn phần bằng phương pháp diazo đòi hỏi sử dụnghuyết thanh hoặc huyết tương Bilirubin rất nhạy cảm và dễ bị phá hủy bởiánh sáng và nhiệt độ Do vậy mẫu máu cần được bảo vệ tránh ánh sáng trước

và trong quá trình phân tích Nồng độ bilirubin có thể giảm 30% đến 50%trong 1 giờ nếu mẫu để ngoài ánh sáng trực tiếp Nếu mẫu được phân tách vàbảo quản ở chỗ tối, huyết thanh/huyết tương ổn định được 2 ngày ở nhiệt độphòng, 4 ngày ở 4oC và không thời hạn ở -20oC Việc đông và rã đông nhiều

lần không có ảnh hưởng đáng kể [25].

1.3.5 Yếu tố nhiễu [7]

Độ đục của mẫu, Hb, các ion kim loại và một số loại thuốc như L-dopagây nhiễu với phương pháp Diazo Mặc dù các ion kim loại, đặc biệt là kẽm,

có thể gây nhiễu trong thực hành trong lâm sàng, nhưng nhiễu do ion kim loại

được xem là không quan trọng Nhiễu bởi độ đục và tăng lipid máu giảm đi

caffeine hay các chất surfactant khác được sử dụng Ảnh hưởng do nồng độprotein cao (paraproteinemia) đã được báo cáo gây ra tăng giả tạo với cácphương pháp đo bilirubin toàn phần trên máy của Roche và được cho là dohình thành kết tủa

Chất indican nồng độ cao trong tăng ure máu, có thể phản ứng vớithuốc thử diazo và cho kết quả cao giả tạo Phương pháp sử dụng muốidiazonium dichlorophenyl bị ảnh hưởng nhiều nhất và phương pháp axitsulfanilic diazotized ít bị nhiễu nhất Ảnh hưởng của indican có thể giảm bằngcách rút ngắn thời gian phản ứng

Tán huyết có thể gây nhiễu trong các phương pháp Diazo bởi một số cơchế: Nhiễu với phản ứng diazo, nhiễu với phổ hấp thụ và phá hủy cácbilirubin trước khi phản ứng Mức độ nhiễu phụ thuộc vào công thức củathuốc thử bilirubin và nhiễu có thể là dương tính hay âm tính Ở trẻ sơ sinh,phương pháp phổ biến nhất lấy máu định lượng bilirubin ở mao mạch gótchân và phương pháp này thường gây vỡ hồng cầu Giá trị trung bình của HB

tự do trong mẫu máu mao mạch gót chân là 1.62 g/L, và điều này có thể gây

ra nhiễu âm tính đáng kể khi bilirubin được đo bằng phương pháp sử dụng2,5-dichlorophenyl diazonium tetra fluoroborate (DPD)

Lipid máu tăng gây tăng bilirubin giả tạo Huyết thanh đục gây ảnhhưởng với phép đo quang và không nên trực tiếp phân tích Việc sử dụng các

ống chứa hạt gel để thu thập mẫu không làm thay đổi đáng kể nồng độbilirubin sau 1 tuần.

1.3.6 Khoảng tham chiếu của Bilirubin

Khoảng tham chiếu của bilirubin thay đổi thùy theo phương pháp địnhlượng Đối với hầu hết các phương pháp diazo, khoảng tham chiếu củabilirubin ở người lớn khỏe mạnh là tới 26 µmol/L (15 mg/L), với trung bình là

12 µmol/L (7 mg/L) Ở cả hai giới giá trị trung bình tăng sau tuổi dậy thì Sautuổi dậy thì, ở nam giới giá trị trung bình cao hơn rõ rệt so với nữ giới nhưngkhông có ý nghĩa lâm sàng Nồng độ bilirubin giảm nhẹ từ khoảng 60 tuổi [24]

Nồng độ bilirubin liên hợp tăng lên đến 3.5 µmol /L (2 mg/L) ở trẻ sơ sinh 1 tháng tuổi và bilirubin liên hợp vẫn giữ ở mức này khi lớn lên

Nồng độ bilirubin có thay đổi theo nhịp ngày đêm Trong thời gianmang thai, nồng độ bilirubin tự do huyết thanh thấp hơn khoảng 55% so vớiphụ nữ không mang thai Sự thay đổi này là do giảm nồng độ albumin trongthời kỳ mang thai Một sự thay đổi nhỏ theo mùa cũng đã được mô tả (thấphơn vào mùa hè) Ở trẻ bú mẹ, nồng độ bilirubin cao (lên đến 253 µmol/L) sovới trẻ bú bình Khi đói bilirubin huyết thanh có xu hướng tăng, sau 48 giờnhịn ăn, bilirubin huyết thanh tăng 240% [8]

1.4 THIẾT BỊ XÉT NGHIỆM TẠI CHỖ (point of care testing)

1.4.1 Thiết bị xét nghiệm tại chỗ

Xét nghiệm tại chỗ hiện đang phát triển nhanh và được sử dụng trongnhiều đơn vị chăm sóc sức khỏe như khoa hồi sức cấp cứu, khoa phẫu thuật,khoa cấp cứu, khoa nhi để theo dõi cả bệnh nhân cấp tính và bệnh nhân mãntính Xét nghiệm tại chỗ được định nghĩa là bất cứ xét nghiệm nào được thựchiện tại thời điểm mà kết quả xét nghiệm có thể giúp đưa ra các quyết định