XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SANH TRINH tƣ VUNG điêu KHIÊN d LOOP DNA TY THÊ CUA GA RI, GÀ ác, GÀ TRE

1.2 Cholesterol 1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol của trứng gà Cholesterol là chất béo steroid, nó kém tan trong nước nhưng tan nhiềutrong mỡ và có thể tạo este với axit

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên t nu e du v n

ĐAI HOC THAI NGUYÊN

TRƯƠNG ĐAI HOC SƯ PHAM 

VŨ THỊ NHƯ TRANG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ

SO SANH TRINH TƯ VUNG ĐIÊU KHIÊN D-LOOP DNA TY

THÊ CUA GA RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

LUÂN VĂN THAC SI SINH HOC

THÁI NGUYÊN, 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên t nu e du v n

ĐAI HOC THAI NGUYÊN

TRƯƠNG ĐAI HOC SƯ PHAM 

VŨ THỊ NHƯ TRANG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THÊ CUA

GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

Chuyên nganh : SINH HOC THƯC NGHIÊM

Mã số: 60.42.30

LUÂN VĂN THAC SI SINH HOC Ngươi hương dân khoa hoc : PGS TS Nguyên Trong lang

THÁI NGUYÊN, 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên t nu e du v n

Lơi cam đoan

Tôi xin cam đoan đây la công trinh nghiên cưu cua tôi Các kết quả , sôliêu nêu trong luân văn la trung thưc va chưa tưng đươc công bô trong bât kycông trinh nao khac

Tác giả luận văn Vũ Thị Nhƣ Trang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên t nu e du v n

LƠI CAM ƠN

Tác giả chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của PGS TS NguyênTrọng Lạng trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

Tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo KhoaSinh trương Đai hoc Sư pham Thai Nguyên , phòng thí nghiệm của Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam, phòng thí nghiệm công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam va môt sô gia đinh ơ Cao Thương - Tân Yên - Băc Giang đa tao điêu kiên giup đơ tân tinh trong viêc nghiên cưu t

hưc nghiêm của đề tài

Cuôi cung tac gia xin chân thanh cam ơn sư giup đơ cua Ban giam hiêu,Khoa Sau đai hoc , Ban chu nhiêm Khoa Sinh trương Đai hoc Sư pham Thái Nguyên đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành bảnluân văn nay

Tác giả Vũ Thị Nhƣ Trang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên t nu e du v n

Nhƣng tƣ viêt tăt

EDTA Ethylene diamine tetra – acetic acid

Cytochrome oxidase I

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên t nu e du v n

Danh muc cac bang

2.1 Kêt qua c hiêu cao va diên tich peak cholesterol chuân ơ 20

các nồng độ khác nhau

3.1 Kêt qua chiêu cao va diên tich peak cholesterol trong trưng 32

của các mẫu nghiên cứu

3.2 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mâu nghiên cưu 33

3.3 Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so 43

với gà Ri

3.4 Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với 43

gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus

gallus gôc Nhât mã số AB114078

3.5 Hê sô tương đông vê tr ình tự nucleotide vùng D -loop ơ 45

mâu nghiên cưu vơi môt sô mâu trên GenBank

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên t nu e du v n

Danh muc cac hinh

1.2 Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus 122.1 Đường chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak 20

3.4 So sánh trình tự đoạn D -loop của 3 mẫu gà Ri , Ác, Tre 41

với ga Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà

Gallus gallus gôc Nhât mã số AB114078

3.5 Quan hệ di truyền của một số giống gà 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên t nu e du v n

Lơi cam đoan

Lơi cam ơn

Danh muc cac bang

Danh muc cac hinh

MỤC LỤC

Mở đầu 1

1.Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm 3

1.1.1 Gà Á 4

1.1.2 Gà Ri 5

1.1.3 Gà Tre 6

1.2 Cholesterol 6

1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol của trứng gà 6

1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người 7

1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể 7

1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình thường 8

1.3 Đặc điểm DNA ty thể 10

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể 10

1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể 11

1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà 12

1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới 14

1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Nguồn gốc mẫu 18

2.1.2 Đia điểm thí nghiệm 18

2.2 Hoá chất và thiết bị 18

2.2.1 Hóa chất 18

2.2.2 Thiết bị sử dụng 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol 19

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 22

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật 22

2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose 25

2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR 26

2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 29

2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA 31

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 31

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 33

3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu 35

3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà 35

3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể 36

3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể 37

KÊT LUÂN VA ĐÊ NGHI 1 Kết luận 48

2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Sự phát triển nhanh chong của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đãtác động đến ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta về cơ cấu, quy mô, loạihình chăn nuôi Số đàn gia cầm có số lượng lớn và cơ sở chăn nuôi tập trungvới quy mô lớn tăng lên Một số giống gà nước ta có nhiều ưu điểm như phẩmchất thịt, trứng thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng thích nghi caovới nhiều điều kiện sống của địa phương, chống chịu tốt với điều kiện khí hậukhắc nghiệt

Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chấtvà tinh thần của con người được nâng cao Chất lượng bữa ăn trong gia đìnhđã được cải thiện rất nhiều Cũng chính vì lí do đó, hiện nay con người đãmắc rất nhiều bệnh khác nhau Trong đó, một trong những bệnh điển hình khichất lượng bữa ăn nâng cao đó là bệnh về tim mạch, xơ vỡ động mạch, huyếtáp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não Những bệnh đó chiếm khoảng 25% tổng số nguyên nhân tử vong ở các nướcphát triển thuộc thế giới tây phương Có nhiều nguyên nhân k hác nhau dẫn tớinhưng căn bênh như trên , nhưng một nguyên nhân rất quan trọng đó là dohàm lượng cholesterol trong cơ thể cao Khi chế độ ăn uống tha y đổi thì hàmlượng cholesterol cũng thay đổi theo Những nguồn thực phẩm giàucholesterol đó là những loại thức ăn có nguồn gốc động vật nhất là bầu dục,não, tim, lòng đỏ trứng Do sở thích và tình hình kinh tế, nhiều người rất

thích ăn trứng gà và coi đó là nguồn thực phẩm chính trong gia đình Trongtrứng, đặc biệt là lòng đỏ có hàm lượng cholesterol rất cao Có nhiều loạitrứng khác nhau như trứng gà, trứng chim, trứng vịt Mỗi giống gà khácnhau thì trứng có hàm lượng cholesterol cũng khác nhau Như vậy việc lựachọn loại trứng vừa đảm bảo dinh dưỡng vừa đáp ứng nhu cầu, sở thích củamỗi cá nhân mà vẫn bảo vệ sức khoẻ là rất quan trọng.

Đồng thời cùng với sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử, chúng tôimuốn xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà quanghiên cứu trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của các giống gà đó

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Xác định

hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang”.

D-2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 3 giống gà

- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của

3 giống gà

- Đánh giá quan hệ di truyền giữa các giống gà

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng gà Ri, gà Ác, gà Tre

- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của gà Ri, gà Ác,gà Tre

+ Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên

+ Nhân vùng D-loop bằng kĩ thuật PCR

+ Xác định trình tự vùng D-loop và so sánh trình tự đó giữa 3 giống gàtrên

- Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu với một sốgiống gà đã được công bố trình tự vùng D-loop

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết

luận rằng: gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus Gà

rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa Cơ

sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về đặc điểmhình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tậptính hoạt động

Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu:

Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, mào và dái tai lớn, mỏ hơicong và nhọn

Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ,mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ

Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu

Bộ gà (Galliformes)Họ Trĩ (Fasianidea)Chủng Gallus (giông ga Bankip )

Loài Gallus gallus.

Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba

Tư Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương củachâu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nướcAnh, sau đó là Mỹ, các giống gà này được lai tạo thành nhiều giống gà cónăng suất cao hơn

Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú,Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện naynhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gàĐông Tảo, gà Vàng …

1.1.1 Gà Ác

Gà Ác có tên khoa học là Gallus domestices brisson Đây là loại gà cỡ

nhỏ đặc biệt được thuần hoá và nuôi dưỡng như các giống gà khác, lông trắngmượt, toàn bộ da, mắt, thịt và xương, nội tạng đều đen, chân đen có 5 ngón

Trước đây, gà Ác được nuôi chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long vàmiền tây Nam Bộ vì mặc dù là giống gà được coi là vị thuốc quý có thể chữanhiều bệnh, nhưng không ai dám nuôi tràn lan vì khả năng cho thịt thấp màgiá thành lại cao Nhưng cuộc sống ngày càng đi lên, những đặc sản quý mớiđược biết hết giá trị của nó Gà Ác đã được nuôi nhiều ở miền Trung và miềnBắc như Nghệ An, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Đông Anh, HưngYên Lúc này thì người nuôi mới thấy rằng đây là giống gà nhanh nhẹn,chăm chỉ chịu khó nhặt nhạnh kiếm mồi, chịu lạnh tốt và có sức sống cao.Như thế có thể nuôi được cả quảng canh (nuôi chăn thả) hay nuôi thâm canh(nuôi chuồng) đều được cả Phân tích dưới góc độ khoa học, thịt gà Ác rấtgiàu axit amin, nhiều canxi, photpho, sắt, protit, lipit Trứng của chúng tuynhỏ (chỉ khoảng 29-30 g) nhưng tỉ lệ lòng đỏ lại rất cao, đến 34,2% [12]

Theo y học cổ truyền, thịt và xương gà Ác có vị ngọt, tính ấm, khôngđộc, có tác dụng bổ dưỡng cao Thịt gà Ác đặc trị các bệnh về phổi, thận, đau

lưng, ra mồ hôi trộm, chân tay yếu mỏi, tạng yếu, rất tốt cho người ốm dậy vàsau khi sinh.

Người ta đã thụ tinh nhân tạo thành công trên gà Ác để tạo ra giống gàcho nhiều trứng trong thời gian sớm nhất Theo PGS.TS Trịnh Công Thành,Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, đây là lần đầu tiên người ta ápdụng biện pháp thụ tinh nhân tạo trên giống gà Ác giữa dòng gà Ác có lôngchân và dòng gà Ác không có lông chân Kết quả, qua 5 thế hệ chọn lọc và tạodòng, nhóm nghiên cứu đã tạo ra 2 dòng gà Ác mới là gà Ác có lông chân vàgà Ác không có lông chân cho sản lượng trứng cao (38/100 con cho trứng) màtrước kia là 29/100 con cho trứng)

1.1.2 Gà Ri

Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta chiếm 70% tổng số gà

trong nước, có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus Bankiva hay Gallus

gallus Gà có ngoại hình thon, nhỏ, mỏ nhỏ, mào cờ có răng cưa, mào đỏ tươi

rất phát triển ở con trống; dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng Cổ thanh dài vừaphải, ngực lép, bụng thon, mềm, chân có hai hàng vải màu vàng có khi xenlẫn màu đỏ tươi Bàn chân có 4 ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống Màulông khác nhau ở con mái và con trống Con mái có màu lông màu vàng rơm,vàng đất, nâu nhạt và đốm Con trống có màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánhvà lông đuôi, lông bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất Ngoài ra còn có màu lôngkhác như lông trắng, hoa mơ, đốm trắng

Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc nhanh hơn gà Mía, Đông Tảo nên cókhả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh Gà Ri đẻ trứngsớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi Sản lượng trứng của gà mái trong mộtnăm từ 80-120 quả Khối lượng trứng bình quân là 38 – 42 g Gà Ri có khốilượng cơ thể ở tuổi trưởng thành như sau: con trống từ 1,800 g đến 2,500 g,con mái từ 1,300 g đến 1,800 g

Đây là giống gà thích hợp với khí hậu và điều kiện chăn nuôi quảngcanh ở nước ta Gà chịu khó kiếm ăn khi nuôi trong điều kiện chăn thả trongvườn hay ngoài đồng Hàng ngày người nuôi chỉ phải cho ăn rất ít, một vàinắm thóc vãi cho cả đàn khi gọi chúng về chuồng, ngoài ra chúng tự kiếm đủkhi được thả ngoài vườn [4], [7], [8].

1.1.3 Gà Tre

Là giống gà địa phương được nuôi ở một số tỉnh Nam Bộ ở Việt Nam.Kích thước của gà nhỏ con, gà trống có lông màu trắng, đuôi và cổ đen Gàmái màu vàng, thấp chân Gà trống và gà mái nhỏ hơn gà Ri Gà Tre có tậptính là hay bay và đậu trên hàng rào Người nuôi chủ yếu là nuôi làm cảnh.Trong những năm gần đây, nhà nước có nhiều dự án nhằm gìn giữ và bảo tồnquỹ gen của các loại gia cầm của nước ta

1.2 Cholesterol

1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol của trứng gà

Cholesterol là chất béo steroid, nó kém tan trong nước nhưng tan nhiềutrong mỡ và có thể tạo este với axit béo, nó không thể tan và không di chuyển

ở dạng tự do ở trong máu Cholesterol có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của cholesterol

Nhìn vào công thức cấu tạo ta thấy, cấu trúc cơ bản của cholesterol lànhân sterol được tổng hợp từ các phân tử axetyl - CoA và một phần phân tửcủa cholesterol là rượi cồn (alcohol) Cholesterol có ở nhiều loại thực phẩm

khác nhau như nội tạng động vật: tim, gan và đặc biệt trứng gà là loại thựcphẩm có chứa nhiều cholesterol, trong đo chu yêu la lòng đỏ trứng gà cònlòng trắng thì tuyệt nhiên không có hoặc rất ít [15], [18], [28].

1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở

người

Cholesterol là chất béo steroid rất cần thiết cho cơ thể, có ở màng tế bàocủa tất cả các mô trong cơ thể và được vận chuyển trong huyết tương của mọiđộng vật cũng như cơ thể người Cholesterol trong cơ thể người có 2 nguồngốc:

- Cholesterol hấp thụ qua đường tiêu hoá (cholesterol từ thức ăn) hay còngọi là cholesterol ngoại sinh (exogenous cholesterol)

- Cholesterol hình thành trong tế bào hay cholesterol nội sinh(endogenous cholesterol) và chủ yếu được hình thành từ gan [15], [28]

Tuy vậy, tất cả các tế bào trong cơ thể có khả năng tổng hợp một lượngnhỏ cholesterol Chất này tham gia hình thành cấu trúc tế bào Khi lượngcholesterol hấp thu qua đường tiêu hoá tăng sẽ dẫn đến tăng nhẹ nồng độcholesterol huyết tương Tuy nhiên, khi lượng cholesterol hấp thụ tăng sẽ ứcchế một trong những enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp cholesterol nộisinh Đây là một yếu tố trong cơ chế điều hoà ngược để điều chỉnh nồng độcholesterol trong máu Chính vì vậy nồng độ cholesterol trong máu dao độngkhoảng 15% do ảnh hưởng của cholesterol trong thức ăn Sự thay đổi lớn củahàm lượng cholesterol trong khẩu phần có thể dẫn đến làm thay đổi nồng độcholesterol trong máu tới 30% Đồng thời các chất béo bão hoà trong khẩuphần ăn cũng làm tăng cholesterol từ 15 - 25%

1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể

Khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể được chuyển thành cholicaxit tại gan Cholic axit sẽ kết hợp với các thành phần khác hình thành muốimật có tác dụng xúc tác trong quá trình tiêu hoá và hấp thụ các chất béo

- Một tỷ lệ nhỏ cholesterol được sử dụng theo các con đường:

+ Được tuyến thượng thận sử dụng để tổng hợp hormon vỏ tuyến thượng thận

+ Hình thành estrogen và progesterol tại buồng trứng

+ Được dịch hoàn sử dụng để tổng hợp testostereone

+ Cholesterol tham gia cấu trúc màng tế bào

+ Một lượng nhỏ cholesterol có mặt tại biểu bì của da Cùng với các chất béo khác, cholesterol tạo cho da các chức năng:

+) Kháng lại việc hấp thu các chất hoà tan trong nước+) Kháng tác động của nhiều hoá chất

+) Ngăn cản quá trình bốc hơi nước của da [15],[19], [28]

Như vậy cholesterol có vai trò rất quan trọng trong cơ thể khi hàm lượngcủa nó trong cơ thể ở mức phù hợp Ở người trưởng thành, cholesterol toànphần ở mức bình thường vào khoảng 4-5,6 mmol/lít Những người có mứccholesterol cao hơn mức này sẽ dẫn đến nhiều bệnh khác nhau

1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình thường

Người ta thấy rằng, cholesterol là nguyên nhân gây nên các bệnh timmạch, xơ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim,tai biến mạch máu não Trên thế giới cũng như ở nước ta, các bệnh về timmạch ngày càng tăng và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước.Đàn ông có nguy cơ bị bệnh tim cao hơn đàn bà Ở Mỹ, hàng năm có khoảng

6 triệu người bị bệnh tim và trong số này có khoảng 1,5 triệu bị đau tim vàtrong số này có khoảng 1/3 bị chết Khoảng 1/5 trong số các trường hợp đautim không hề có triệu trứng hay cảnh báo trước Tần suất đàn ông Mỹ bị chếtvì bệnh tim là khoảng 200/100.000 dân số Ở Anh, tỉ suất này là khoảng250/100.000 dân số [16], [21]

*Cơ chế gây bệnh xơ vữa động mạch của cholesterol

Xơ vữa thành mạch (xơ vữa động mạch) là hiện tượng bệnh lý của lớpnội mạc động mạch, đặc biệt là các động mạch lớn dẫn đến sự hình thành cácmảnh có nguồn gốc chất béo, phá vỡ cấu trúc thành mạch, làm hẹp mạch máuvà ngăn cản sự lưu thông của dòng máu Các biểu hiện bệnh ly tronggiai đoạn đầu là tổn thương các tế bào nội mạc và lớp tế bào dưới nội mạc Sựtổn thương thành mạch còn có thể do tác động cơ học của dòng máu và áp lựccủa động mạch nên vùng tổn thương.

Khi có hiện tượng tổn thương, các tế bào nội mạc sẽ giãn, sưng, phânchia Các tế bào cơ trơn thành mạch cũng có thể có phản ứng tương tự Tạithành mạch máu có hiện tượng tập trung nhiều tế bào do sự di chuyển của cáctế bào bình thường đến vùng tổn thương Ngay sau đó, các thành phần lipittrong máu, đặc biệt là cholesterol sẽ tích tụ lại trong các tế bào đang phâ nchia, hình thành các mảnh xơ Vì các mảnh này chứa một lượng lớncholesterol nên chúng thường được gọi là chất cholesterol lắng đọng

Tiếp theo sau của quá trình bệnh ly , các tế bào xơ xâm nhập vùng tổnthương và hình thành các mảnh xơ trong mạch máu

Tiếp theo là quá trình lắng đọng canxi làm canxi hoá các mảnh xơ Đếngiai đoạn này, các tổ chức mạch vùng tổn thương trở nên cứng nên được môtả bởi từ “xơ cứng động mạch” hoặc gọi đơn giản hơn là “hiện tượng cứngmạch máu”

Các động mạch bị xơ cứng gần như mất hoàn toàn khả năng tăng kíchthước (mất khả năng căng phồng) và dễ bị làm rách , làm thủng Các phần tưmảnh xơ (có bề mặt thô nhám) có thể di chuyển theo dòng máu dẫn đến nguy

cơ hình thành các cục máu và huyết khối Khi các huyết khối có mặt trongđộng mạch vành của tim hay các động mạch của não sẽ dẫn đến tắc độngmạch, rối loạn hoạt động của tim, não và gây tổn thương nặng nề cho cơ thểthậm chí gây tử vong Các ảnh hưởng tương tự cũng có thể xảy ra khi huyết

khối hình thành trong động mạch gan, động mạch thận, động mạch các chi,động mạch dạ dày, ruột [16], [21].

*Biện pháp điều chỉnh cholesterol trong máu

Để giảm hàm lượng cholesterol trong máu có nhiều biện pháp khác nhaunhư sử dụng các loại thuốc có chứa chất Simvastatine và chất Ezetimibe haycác loại thuốc có chứa Statin Nhưng một biện pháp hữu hiệu để điều chỉnhcholesterol trong máu là bằng chế độ ăn uống hợp lý

Do sở thích và sự thiếu hiểu biết về thành phần dinh dưỡng của các loại thực phẩm, một số người thường xuyên sử dụng một số lượng lớn các thực phẩm có chưa nhiều cholesterol như óc, gan, các loại thịt có chứa nhiều chấtbéo (thịt heo, gà, vịt, cá) và đặc biệt là trứng Có những người ăn thườngxuyên một lượng lớn trứng trong một thời gian dài mà không biết tới hậu quảmà nó sẽ gây ra Trứng là thức ăn rất bổ dưỡng cho cơ thể Tuy nhiên, chúng

ta chỉ nên ăn với một lượng hợp ly để góp phần đề phòng và giảm lượng cholesterol trong máu để tránh các bệnh về tim mạch

1.3 Đặc điểm DNA ty thể

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể

DNA ty thể (mtDNA) ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng Kích thướccủa bộ gen ty thể thay đổi khác nhau ở mức phân loại Bộ trở lên

Ở tế bào động vật kích thước của mtDNA nhỏ, cho tới nay đã xác địnhđược trình tự đầy đủ của bộ gen ty thể người, chuột, bò, tất cả đều có kíchthước khoảng 16,5 kb Mỗi tế bào có vào khoảng vài trăm ty thể Mỗi ty thể

có nhiều bản sao của DNA Nấm men có kích thước bộ gen ty thể khoảng 84

kb (ở S.cerevisiae), trong đó rất nhiều vùng không mang intron dài xen kẽgiữa các vùng exon Ở thực vật thì có sự biến động rất lớn về kích thước bộgen ty thể, mtDNA của thực vật có kích thước tối thiểu khoảng 100 kb Chức

năng của những vùng DNA được tăng thêm này chưa được xác định rõ ràng, nhưng dường như chúng chỉ là những vùng không mã hoá.

Kích thước của mtDNA ở động vật rất nhỏ nhưng tổ chức lại rất chặtchẽ mtDNA ở động vật không có vùng intron, có một số gen gối lên nhau vàhầu hết mỗi cặp bazơ đều có thể nằm trong một gen nào đó ngoại trừ vùng D-loop D-loop là vùng điều khiển của mtDNA trên đó có các promotor của quátrình sao chép và phiên mã của mtDNA [25]

1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể

DNA ty thể là vật chất di truyền nằm ngoài nhân di truyền theo dòng

mẹ Ở hầu hết động vật có xương sống bộ gen này có chiều dài khoảng 16800nucleotid, trong đó bao gồm những gen mã hoá protein, gen tRNA, gen rRNAvà vùng điều khiển – vùng không mã hoá duy nhất với các promoter để táibản và phiên mã mtDNA DNA ty thể có những đặc tính đáng quan tâm nhưsau:

(1) Tỷ lệ tiến hoá phân tử của chúng nhanh hơn khoảng 5 lần so vớibất kỳ một gen nhân nào

(2) mtDNA là một phân tử đơn bội mà không tái tổ hợp

Vùng điều khiển mtDNA là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA:chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao hơn gấp 5 – 10 lần so với các genkhác của mtDNA Trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là mộtcông cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hướng tiếnhoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài [29]

1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà

* Đặc điểm cấu trúc ty thể gà

Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của

mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp, chúng mã hóa cho 13

protein, 2 rRNA và 22 tRNA (trình tự này đã được lưu trữ GenBank) Các

protein tạo ra được sử dụng để vận chuyển điện tử và phosphoril hóa trong tythể Gen ty thể gà có các đặc điểm riêng, khác với lớp thú và lưỡng cư đó là:một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữahai gen tRNA (Cys) và tRNA (Asn) đều có ở tất cả động vật có xương sốngđã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà lại không có đặc điểm này.Đồng thời gen COI (cytochrome oxidase I) có mã mở đầu là GTG thay vìATG.

Trình tự đầy đủ này của hệ gene ty thể gà nhà là cơ sở cho nhiều côngtrình nghiên cứu về DNA ty thể của các giống, các loài thuộc bộ gà(Galliormes) Toàn bộ DNA ty thể gà nhà được lập thành sơ đồ như sau:

Hình 1.2 Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus

(Desjadins và Morais, 1990)ND: NADH đehidrogenazaCO: cytocrom oxidaza

H (Heavy strand): chuỗi nặng

L (Light strand): chuỗi nhẹ

* Đặc điểm di truyền của ty thể: Di truyền ty thể là di truyền theo

dòng mẹ Trong thực tế có đến 99% ty thể của tế bào con thừa hưởng từ tếbào mẹ Đó là do bào quan này nằm trong tế bào chất, khi có sự kết hợp giữatrứng và tinh trùng tạo thành hợp tử (tế bào con) thì tế bào con nhận chủ yếutế bào chất từ trứng của mẹ, trong đó có chứa ty thể, còn ty thể của tinh trùngkhi tham gia thụ tinh được loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc vàoubiquitin Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt haidòng ty thể của cả bố và mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này gọi là dị tế bàochất DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp Tốc

độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thểlà do ty thể thiếu hụt cơ chế sửa chữa DNA Tốc độ đột biến cao dẫn đếnnhiều biến dị trong ty thể Đặc biệt là vùng điều khiển D-loop của mtDNA làvùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA: chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệcao hơn gấp 5–10 lần so với các gen khác của mtDNA Trình tự nucleotit củavùng điều khiển mtDNA là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng

di truyền và sự phân hướng tiến hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài[29]

* Vai trò vùng D-loop trong phân loại gà

Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn:đoạn I, II và III Trong đó đoạn II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vịcấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phânloại họ Thông thường, vùng biến đổi nhiều nhất trong D-loop là đoạn III.Chính điều này đã làm cho vùng điều khiển của mtDNA có tốc độ tiến hóanhanh gấp 5-10 lần so với các gen khác của ty thể Vì vậy mà trình tựnucleotid của vùng D-loop là công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng ditruyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa các quần thể cùng loài

1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam

1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới ngành chăn nuôi gia cầm phát triển nhanh cả vềsố lượng và chất lượng Mỹ là nước đi đầu thế giới về ngành chăn nuôi giacầm, đặc biệt trong lĩnh vực tạo ra những giống gà cơ bản Sau Mỹ là Pháp,Trung Quốc, Anh, Đức, Hà Lan… Ở các nước Đông Âu, chăn nuôi gia cầmcũng phát triển, điển hình là Hungari và Bungari

Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể trên một số loài thuộc bộ Gà:Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của

mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp Với trình tự này, các nhà

khoa học đã có cơ sở để tiến hành nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữacác đối tượng thuộc bộ gà

Năm 1994-1995, Fumihito và cộng sự [20] đã nghiên cứu mối quan hệchủng loại giữa các loài gà rừng, công, trĩ, dựa trên phân tích đoạn điềukhiển ty thể Kết quả phân tích đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP)trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đưa ra một sơ đồ phânloại giữa các loài trên Đồng thời họ đã xác định được trình tự của 400nucleotid đầu tiên trên vùng điều khiển của mtDNA Kết quả nhận được đãchỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60 nucleotide trên vùng điều khiển của

mtDNA là điểm đặc trưng của giống Gallus.

Randi và cộng sự (1997) [29] đã phân tích trình tự của một phần đoạnđiều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam và đãchỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa hai giống này

Năm 1999, Kimball và cộng sự [23] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủcủa gen cytocrom b (1143bp) và đoạn siêu biến (350bp) của vùng điều khiểnmtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà Gô Haicây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trên hai đoạngen cho thấy sự khác nhau là rất ít

Zhang và đồng tác giả (2002) [31] đã giải trình tự 539 nucleotid đầu

tiên trong vùng D-loop của sáu chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus

gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố

trên ngân hàng gen quốc tế Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc củachúng dựa trên trình tự vùng D-loop

Komiyama T và đồng tác giả (2004) [24] đã tiến hành phân tích trình tựvùng D-loop ty thể từ máu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địaphương của Nhật Bản, đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà lông đỏ(Jungle Fowl) đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế làm nhóm ngoại.Trên cơ sở đó họ đã lập được cây phát sinh và kết quả cho thấy 3 chủngNaganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo Các kết quả này đã gợi ý rằng

3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình tháibên ngoài rất khác nhau Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từcác con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốcvà Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản Điều này dẫn đến giảthiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọicác vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á Như vậy cóthể thấy trình tự nucleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu đểđánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữacác quần thể địa lý

1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam

Cho đến nay, ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tửtrên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộngsự [11] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trênvùng điều khiển D-loop của 3 loài gà Lôi Việt Nam gồm: gà Lôi lam đuôi

trắng (L hatinhensis), Trĩ bạc (L nycthemera) và gà Lôi hông tía (L diardi).

Từ đó xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển D-loop củamtDNA của 3 loài gà Lôi Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấnđề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà Lôi nói trên.

Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạngen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam trong vectorpBluescript KS(-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotidevùng D-loop

Năm 2006, Địch Thị Kim Hương và cộng sự [5] đã xác định được trìnhtự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 2 mẫu gà Ác Tiềm và LươngPhượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucleotide giữa 2 đại diệntrên

Năm 2007, Lê Đức Long và cộng sự [6] đã giải trình tự và so sánh trìnhtự nucleotide vùng D-loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ ĐiệnBiên, Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theodự án gà sạch Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm

1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khácbiệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này

Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và cộng sự [14] đã giải trình tự và sosánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Saonuôi tại Thái Nguyên Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loopgồm 1220 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 16 vị tríkhác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này

Chương 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguồn gốc mẫu

Các mẫu trứng, máu đươc lây tư cac giống gà Ri, gà Ác, gà Tre đượcnuôi tại gia đình ông Nguyễn Văn Vân , thôn Đinh Gia , Cao Thương ,Tân Yên, Băc Giang

2.1.2 Đia điểm thí nghiệm

Các nghiên cứu về cholesterol được tiến hành tại phòng thí nghiệm củaKhoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam

Các thí nghiệm sinh học phân tử tiến hành tại phòng thí nghiệm côngnghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học vàCông nghệ Việt Nam

2.2 Hoá chất và thiết bị

2.2.2 Thiết bị sử dụng

Máy li tâm lạnh của hãng Hettich (Đức), tủ sấy của hãng Carbolite(Anh), cân điện tử (Thuỵ Sỹ, Anh), máy Gerhardht, tủ lạnh sâu – 20oCSanyo (Nhật), lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc), máy PCR MJ Reseach, Inc(Mỹ), máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Genetic Analyser(Applied Biosystems, Mỹ), bể ổn nhiệt (Tempette Junior Tech), hệ thống

sắc ký Alliance (hãng Waters, Mỹ), máy hút chân không Speed Vac Sc110A- Savant (Mỹ), pipetman và một số máy móc thiết bị khác.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol

* Cơ sở của phương pháp: chất béo trong thực phẩm (gồm cả cholesterol)

được chiết bằng chloroform Sau khi thủy phân lipit bằng KOH trong cồn,cholesterol được chiết lại bằng petroleum ether Dịch chiết được cô cạn bằngmáy cất quay chân không, sau đó được hòa tan lại bằng methanol Cholesteroltrong dịch chiết methanol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC) bằngcách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol trong mẫu với diệntích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol chuẩn (John Wiley and Sons, 2005)[22]

* Xác định hàm lượng cholesterol theo quy trình sau: Lấy ngẫu nhiên trứng

ở các giống gà thí nghiệm ở các lứa đẻ khác nhau và ở các con gà mái khácnhau trong cùng một giống Sau khi lấy được mẫu, ở mỗi mẫu: đập 5 quảtrứng vào cốc thủy tinh Sau đó đồng nhất lòng đỏ và lòng trắng Tiếp theo làcác bước:

+ Cân 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 25 ml

+ Thêm 5 ml methanol, vortex 5 phút

+ Thêm 10 ml chloroform, vortex 3 phút

+ Ly tâm, gạn lấy dịch trong bình gạn 250 ml

+ Chiết lại mẫu bằng 5 ml methanol và 10 ml chloroform trong 3 phút.+ Gộp dịch chiết vào bình gạn

+ Thêm 7 ml KCl 0,88%, lắc nhẹ và để tách lớp

+ Lọc lớp chloroform qua phễu chứa Na2SO4 khan vào bình cô quay.+ Cô quay đến khô ở 300C

+ Thêm 20 ml KOH 0,5M trong ethanol

+ Đun hồi lưu 30 phút trong cách thủy ở 600C.

+ Thêm 10ml n- heptane, đun hồi lưu thêm 2-3 phút, để nguội đến nhiệt

độ phòng

+ Chuyển toàn bộ dịch chiết sang một bình gạn, thêm 5 ml NaCL bãohòa, 10 ml nước

+ Chiết 2 lần cùng với 10 ml petroleum ether

+ Gộp dịch chiết và rửa 2 lần với 20 ml nước cất

+ Loại nước bằng Na2SO4 khan, cô quay ở 300C đến khô

+ Hòa tan và định mức 10 ml bằng methanol

+ Lọc qua màng lọc 0,45 m và bơm vào sắc kí lỏng

Cột sắc ký LunaC18 với nhiệt độ cột là 300C, tốc độ dòng là 1 ml/ phút,lượng mẫu bơm 10 l Bộ phận phát hiện (detector) đo độ hấp thụ tia UV ởbước sóng 208 nm của cholesterol chuyển thành tín hiệu ra máy tính đó là cácpeak, mỗi peak có độ cao và diện tích khác nhau, từ đó tính được hàm lượngcholesterol của mỗi mẫu [22]

Công thức tính hàm lượng cholesterol của mẫu nghiên cứu như sau :

X = A m  C s

 D  100

Trong đó:

X: Hàm lượng cholesterol (mg/ 100 g)

Am: Diện tích pic mẫu

As: Diện tích pic chuẩn

Cs: Nồng độ chuẩnD: Độ pha loãngm: khối lượng mẫu cân (g)100: Tính hàm lượng cholesterol trong 100 g mẫu [22]

Kêt qua vê chiều cao và diện tích của peak cholesterol chuẩn ở cácnồng độ khác nhau được thê hiên qua bang 2.1.

Bảng 2.1 Kêt qua chiêu cao va diên tich peak cholesterol chuân ơ

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật

* Nguyên tắc chung

Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh kết hợp với biệnpháp cơ học, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein.Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợpphenol: chloroform: isoamylalcohol với tỷ lệ thích hợp Cuối cùng DNA đượckết tủa bằng cồn tuyệt đối 100% và để lạnh sau đó thu lại bằng ly tâm

* Quy trinh tach chiêt

Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNAlà làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng Các phân tử DNA cóthể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóahọc (bị thủy phân bởi các enzyme phân giải thoát ra môi trường khi màng tếbào bị phá vỡ) Để đạt hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn mộtphương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiêncứu là rất quan trọng Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên

chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tổng số của Sambrook vàRussell [30].

Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 370C trong một giờ Trongđiều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽđược chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các proteinnhư fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng.Sau đó hút máu ra các eppendorf 1,5 ml rồi bổ sung đệm phosphate buffersaline (PBS) và ly tâm Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu.Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA vàSDS Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA

ra ngoài môi trường Thành phần EDTA sẽ liên kết với ion Mg2+, nhờ vậy màhoạt động của các nulease bị ức chế để bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của cácnuclease Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ cắt đứt các liên kếtpeptid trong phân tử protein làm cho protein bị phân hủy Hơn nữa pH kiềmcủa dung dịch đệm chiết làm DNA trở lên ổn định cấu trúc hơn do bản chấttích điện âm của nó, đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA vớiprotein histon

Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợpphenol: chloroform: isoamyl alcohol Chloroform làm tăng cường hoạt độngcủa phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấutrúc của DNA Đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách phanước với pha hữu cơ Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quátrình tách chiết Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein bị biến tínhvà pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, choloroform, isoamyl alcohol Pha nướcđược hút nhẹ nhàng sang ống mới Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn