Nghiên cứu ảnh hưởng của một số nồng độ trong quy trình nhân nhanh giống khoai tây củ siêu bi nhằm tạo giống sạch bệnh

Tình hình nghiên cứu khoai tây ở Việt Nam Bên cạnh những thành tựu và giá trị kinh tế của to lớn mà khoai tây manglại, có nhiều vấn đề phát sinh trong qua trình trồng và chăm sóc, đó là

PHầN 1: Mở đầu1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trên thế giới, khoai tây (solanum tuberosum L.) đợc coi là nguồn lơng

thực quan trọng, có giá trị dinh dỡng và giá trị kinh tế cao, chiếm vị trí khôngnhỏ trong nền kinh tế quốc dân của nhiều nớc trên thế giới Hiện nay khoaitây đựơc xếp là cây lơng thực đứng hàng thứ t sau lúa mì, lúa nớc và ngô Đây

là cây lơng thực quan trọng trong cơ cấu cây trồng vụ đông do có các u điểm

nh thời gian sinh trởng ngắn (80 - 100 ngày), cho năng suất cao (15 - 30tấn/ha), củ giàu dinh dỡng (protein; đờng; lipít; các loại vitamin B1; B2; B3;các loại khoáng quan trọng (kali, canxi, magie) và nhiều nhất là vitamin C (20– 50mg%) (Tạ Thu Cúc, 2000) [2] Khoai tây là loại rau có nhiều năng lợng,

cứ 1 kg khoai tây cho 848 kcal Cây khoai tây vốn là một cây a lạnh có nguồngốc ở vùng cao nhiệt đới (từ 1000 m trở lên) Trải qua quá trình chọn lọc vàthuần hoá, nó đợc trồng ở các vùng khí hậu khác nhau bao gồm các vùng ôn

đới, á nhiệt đới và nhiệt đới với các điều kiện sinh thái khác nhau từ vùng

đồng bằng đến vùng núi cao

ở Việt Nam, khoai tây đợc coi là nhóm cây lơng thực có tầm quantrọng đứng thứ ba sau lúa và ngô Trong quá trình phát triển kinh tế xã hội,nhu cầu tiêu thụ khoai tây của thị trờng nói chung, đặc biệt là các đô thị, khucông nghiệp, khu du lịch, sẽ ngày càng tăng Việt Nam có khả năng phát triểnmạnh khoai tây, đây là cây trồng vụ Đông lý tởng cho đồng bằng Bắc Bộ,miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên ở miền Bắc nớc ta, khoaitây đợc trồng sau hai vụ lúa, đã góp phần cải tạo và nâng cao độ phì nhiêu cho

đất, hạn chế lây lan của sâu bệnh Đồng thời, việc luân canh nh vậy mang lạihiệu quả kinh tế cao cho ngời nông dân Tuy nhiên, khoai tây cha đợc pháttriển đúng với tiềm năng của nó Diện tích trồng khoai tây ở Việt Nam còn rấtkhiêm tốn, dao động quanh 33000 ha (2003) Năng suất bình quân còn thấp12,5 tấn/ha Năng suất khoai tây ở các nớc nh Pháp, Đức, Hà Lan đều xấp xỉ

40 tấn Nguyên nhân chính của hiện tợng này là do trồng khoai tây bằng củgiống truyền thống qua nhiều năm đã thoái hoá không có chất lợng, làm yếudần tính chống chịu của khoai tây qua sinh sản vô tính, làm tăng tỷ lệ nhiễmbệnh đặc biệt là virus, làm giảm năng suất của khoai tây Dẫn đến chi phí caitrong sản xuất và không chủ động Chính vì vậy, việc nghiên cứu tạo củ giốngmini sạch bệnh trong sản xuất giống khoai tây ở Việt Nam là rất bức thiết

Bởi vậy, vấn đề đặt ra là cần phải cung cấp đủ nguồn nguyên liệu đápứng cả về số lợng và chất lợng cho việc sản xuất giống khoai tây siêu bi cung

cấp đầy đủ cho bà con nông dân Do đó, trong những năm qua các nhà khoahọc đã và đang tìm kiếm phơng pháp thích hợp nhất với việc ứng dụng cácthành tựu khoa học trong nhân giống cây khoai tây nhập nội Một trong cácphơng pháp đó là nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro Đây làphơng pháp thể hiện tính u việt trong việc nhân nhanh một dòng chọn lọc, cóphẩm chất tốt, hàm lợng thành phần hoá học có tác dụng dợc lý cao, tạonguồn cây giống đồng đều, sạch bệnh, giữ đợc các đặc tính quý của nguyênliệu ban đầu với hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với phơng pháp nhângiống truyền thống Xuất phát từ ý nghĩa khoa học trên, chúng tôi đã tiến hành

đề tài : “Nghiên cứu ảnh hởng của một số nồng độ trong quy trình nhân nhanh giống khoai tây củ siêu bi nhằm tạo giống sạch bệnh”.

1.2 Mục tiêu, ý nghĩa

1.2.1 Mục tiêu

Xác định đợc nồng độ tối u của α - NAA, HgCl2, BAP tới khả năngsống của mầm không bị nhiễm, khả năng sinh trởng chồi và khả năng tạo củ

bi trong nuôi cấy invitro của hai giống khoai tây: Solara, Diamant

1.2.2 ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- ý nghĩa thực tiễn: kết quả nghiên cứu thành công sẽ ứng dụng trongviệc sản xuất giống khoai tây củ bi bằng phơng pháp invitro tạo đợc nhữngcây sạch bệnh, năng suất cao, giảm giá thành củ giống cho ngời sản xuất

- ý nghĩa khoa học: xác định đợc nồng độ tối u của α - NAA, HgCl2,BAP bổ sung vào môi trờng nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tâyinvitro Đồng thời nhằm đáp ứng nhu cầu về giống khoai tây củ siêu bi sạchbệnh cho nghiên cứu

1.2.3 Đối tợng và phạm vi nghiên cứu

1.2.3.1 Đối tợng nghiên cứu

Đề tài đợc nghiên cứu trên hai giống khoai tây nhập nội:

1.2.3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật của Trung tâm Thông Tin

và ứng dụng tiến bộ Khoa học công nghệ thuộc sở Khoa học công nghệ BắcNinh

1.2.3.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ 29 / 03 / 2010 đến 04 / 06 / 2010

PHầN 2 tổng quan tài liệu2.1 Khái quát về khoai tây

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố

2.1.1.1 Nguồn gốc

Khoai tây có nguồn gốc hơn 8000 năm trớc tại những khu vực nhiệt đớicao của Peru nơi mà khoảng 5500 loài khoai tây đã đợc trồng bởi nhiều thế hệ ngời dân tại vùng này Theo Bucaxôp thì cây khoai tây đợc xác định có nguồn gốc ở Nam Mỹ thuộc các nớc Chile, Peru, Bôlivia (Tạ Thu Cúc ; 2000) [2]

Theo các tài liệu cổ thì khoai tây hoang dại đợc ngời dân dãy Andess ởNam Peru và Bắc Bôlivia từ 3000 - 4000 năm trớc công nguyên Sau khi thuầnhoá khoai tây đợc lan rộng khắp miền núi dãy Adess (Nguyễn Quang Thạch,1993)

Khoai tây đợc du nhập vào Việt Nam từ 1890 và chủ yếu trồng ở Đồngbằng Sông Hồng (Trơng Văn Hộ, Lê Thị Tuyết, Phạm Xuân Tùng, VanderZaag, 1988) Trớc năm 1970, diện tích khoai tây của nớc ta còn rất thấp, chỉkhoảng 3000ha và chỉ đợc xem nh một loại rau (Trơng Văn Hộ, 1990) [8].Nhờ cuộc cách mạng xanh ở miền Bắc, lúa xuân thay thế lúa chiêm, cùng với

sự ra đời của vụ đông mà cây khoai tây ở Việt Nam đợc chuyển vị trí từ mộtcây rau sang một cây lơng thực quan trọng Diện tích trồng khoai tây của nớc

ta đợc tăng lên nhanh chóng Thậm chí, có giai đoạn (1987) Bộ Nông nghiệp

đã đánh giá cây khoai tây là cây lơng thực quan trọng thứ hai sau lúa, có vaitrò vừa là cây lơng thực vừa là cây thực phẩm, đồng thời là cây xuất khẩu cógiá trị kinh tế cao

Sau một giai đoạn dài biến động thăng trầm, gần đây tình hình sản xuấtkhoai tây ở Việt Nam có chiều hớng giảm sút nghiêm trọng cả về diện tích vàsản lợng Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự giảm sút đó là do thiếu giống mới

có năng suất, chất lợng cao, sử dụng giống cũ đã thoái hoá nên năng suất thấp(khoảng 10 tấn/ha) trong khi năng suất khoai tây ở Pháp là 35 tấn/ha, Hà Lan

45 tấn/ha, Mỹ 65 tấn/ha (Leviel, 1986) Để khắc phục hiện trạng này, giảipháp đầu tiên và phù hợp nhất phải làm là thay thế giống khoai tây thoái hoá.Cần phải thiết lập và hoàn thiện hệ thống sản xuất khoai tây giống gốc ở ViệtNam có chất lợng cao, đáp ứng nhu cầu cho sản xuất khoai tây hiện nay

2.1.1.2 Phân bố

Khoai tây là cây a khí hậu mát mẻ, hiện nay nó đợc trồng ở khắp các

n-ớc trên thế giới Vào thế kỷ 11 (khoảng năm 1570) ngời Tây Ban Nha chinh

phục Châu Mỹ từ đó đợc đa đến các vùng khác nhau trên thế giới Khoai tây

đợc trồng ở Tây Ban Nha năm 1561, đợc nhập vào Ailen (1580 - 1658), vàoAnh (1590), vào Đức (1651), vào Pháp (1596), vào Nga (1700)

ở Việt Nam, nhiều tài liệu cho rằng cây khoai tây đợc trồng từ năm

1890 do ngời Pháp mang đến Năm 1901, khoai tây đợc trồng ở Tú Sơn - HảiPhòng, năm 1907 đợc trồng ở Trà Lĩnh - Cao Bằng, năm 1917 đợc trồng ở Th-ờng Tín - Hà Tây Hiện nay khoai tây đợc trồng ở khắp cả nớc, đặc biệt là cáctỉnh đồng bằng châu thổ sông Hồng, Đà Lạt Lâm Đồng Diện tích trồng khoaitây ngày càng phát triển phục vụ đủ nhu cầu trong và ngoài nớc

2.1.2 Đặc điểm sinh học

2.1.2.1 Vị trí phân loại

Cây khoai tây thuộc chi gennus solanum sectio lenlota gồm 180 loại, cókhả năng cho củ Cây khoai tây thuộc nhóm thân thảo, họ cà, thuộc loàisolanum tuberosum L Theo tổng kết hiện nay có khoảng 20 loài khoai tây th-

ơng phẩm ở thể tứ bội (2n = 4x = 48), có khả năng sinh trởng phát triển và chonăng suất cao [4] Và nó đợc phân loại theo bảng dới đây:

Khoai tây (Solanum tuberosum L) thuộc loài S Tuberosum, chi Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta.

2.1.2.2 Đặc điểm sinh thái

Cây khoai tây yêu cầu khí hậu mát mẻ, ôn hoà Nhiệt độ là một yếu tốquan trọng ảnh hởng trực tiếp đến sinh trởng và phát triển của khoai tây Mỗithời kỳ sinh trởng và phát triển chúng yêu cầu nhiệt độ khác nhau Nhiệt độthích hợp cho hạt nảy mầm là từ 18 - 20°C, nhiệt độ thích hợp nhất cho thân láphát triển là 20 - 22 °C ở thời kỳ sinh trởng dinh dỡng nó có thể thích ứng vớibiên độ nhiệt độ từ 10 - 25 °C, rộng hơn so với giai đoạn sinh trởng sinh thực.Lor (1960) đã chứng minh rằng nhiệt độ càng cao thì khối lợng thân, lá, củcàng giảm

Khoai tây là cây a sáng, cờng độ ánh sáng thích hợp cho khoai tây sinhtrởng và cho năng suất cao là từ 40.000 - 60.000 lux Thời kỳ từ cây non đếngiai đoạn hình thành củ khoai tây đòi hỏi ánh sáng ngày dài (trên 14h ánhsáng/ngày đêm) để quang hợp và tích luỹ chất dinh dỡng, đồng thời ra hoa,

đậu quả Thời kỳ sinh trởng sinh thực và khi củ bắt đầu hình thành, cây khoaitây cần có thời gian chiếu sáng ngắn

2.1.2.3.Đặc điểm hình thái

 Rễ

Khoai tây thuộc loại rễ chùm (nếu trồng từ củ), có rễ cọc (nếu trồng từ

hạt), từ rễ cọc sẽ phát triển thành nhiều rễ phụ khác Phần lớn rễ tập trung ở độsâu 30 - 40 cm, rễ còn phát triển cả trên củ nhng ngắn và ít phân nhánh

Rễ khoai tây phát triển mạnh ở thời kì ra hoa (ở dới mặt đất lúc này hìnhthành củ và củ bắt đầu lớn)

 Thân

Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo zich zắc, có 3 - 4 cạnh, cao

trung bình từ 40 - 70 cm đến 1 - 1,2 m, tuỳ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiệnchăm sóc mà chiều cao cây có thể khác nhau

Thân khoai tây thờng có màu xanh hoặc xanh nhạt hay xanh đậm, đôi khi

có màu phớt hồng hoặc tím tuỳ thuộc vào từng giống Trên thân có lớp lông tơmềm (khi cây còn non), cứng dần và rụng theo thời gian sinh trởng

 Lá

Lá khoai tây tơng tự nh lá cà chua, nhng khác một số điểm là: thuộc láphức tạp, bản lá to, mọc cách xẻ lông chim, có 3 - 7 đôi mọc đối xứng quatrục và một lá lẻ trên cùng (lá chét đỉnh)

Lá khoai tây dài khoảng 10 - 15 cm, mặt lá phẳng hoặc gợn sóng, bản láthờng to hơn lá cà chua Màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiệnchăm sóc mà có thể có màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt

 Củ khoai tây

Củ khoai tây là bộ phận thực phẩm cho con ngời Củ khoai tây còn có tên

gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ đợc hình thành là do thân phát triển dới

đất, trong điều kiện bóng tối

Hình dạng củ khoai tây có thể là tròn, elip, tròn dài, đôi khi hình vuông.Màu sắc củ tuỳ thuộc vào từng giống, có thể là màu trắng, trắng nhạt, vàng,vàng nhạt Trên củ có nhiều mắt ngủ nhng phân bố không đều, số lợng mắt

ngủ nhiều hay ít tuỳ thuộc vào từng giống Trên mắt ngủ có mi mắt và mắt: mimắt dài hay ngắn, mắt nông hay sâu là do đặc tính di truyền của giống trênmỗi mắt thờng có 2 - 3 mầm ngủ và thờng tập trung nhiều trên đỉnh củ tuỳthuộc từng giống, thời vụ, đất trồng và điều kiện chăm sóc mà có trọng lợng

- một củ khoai tây cỡ vừa có khoảng hơn một nửa lợng vitamin mà con ngờicần trong một ngày Theo Burton (1974) sử dụng 100g khoai tây có thể đảmbảo ít nhất 8% nhu cầu protein, 3% nhu cầu năng lợng, 10% nhu cầu Fe, 10%nhu cầu vita min B1, 20 - 50% nhu cầu vitamin C của ngời trong 1 ngày Chínhvì vậy khoai tây vừa là cây lơng thực, vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh d-ỡng cao Ngoài vai trò làm lơng thực, thực phẩm và thức ăn gia súc, khoai tâycòn là nguồn cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến

2.1.3.2 Giá trị kinh tế

Theo FAO, sản lợng khoai tây thế giới hàng năm đạt khoảng 300 triệu

tấn chiếm 60 - 70% tổng sản lợng, lúa chiếm 50% tổng sản lợng cây củ(FAO, 1995)

Về diện tích trồng khoai tây, đứng đầu là Cộng hoà Liên bang Nga(3,5 triệu ha), Ba Lan (1,5 triệu ha), ấn Độ (1 triệu ha) Các quốc gia còn lại

đều có diện tích trồng khoai tây dới 1 triệu ha (FAO, 1996) Về sản lợng, đứng

đầu là Trung Quốc (trên 40 triệu tấn/năm), tiếp đến là Ba Lan (24 triệutấn/năm), Hoa Kỳ (20 triệu tấn/năm) và ấn Độ (17 triệu tấn/năm) (FAO,1996) [21] Hiện nay ở nhiều nớc nhiệt đới, khoai tây cha đợc coi là cây lơngthực vì có nhiều khó khăn trong sản xuất và bảo quản Vì vậy mà sản lợngkhoai tây của Châu á chỉ chiếm 7,5%, Châu Phi 0,7%, Châu Mỹ La tinh2,6% tổng sản lợng khoai tây của thế giới Sản lợng khoai tây của các nớccông nghiệp hóa chiếm 70% tổng sản lợng khoai tây của thế giới (Tạ Thu Cúc,2000)

Theo Beukema, Varder Zaag (1979) thì cứ 1kg khoai tây cho 480 kalo.Nếu sử dụng 100g khoai tây thì có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu về protein,10% nhu cầu về vitamin C mỗi ngày Tinh bột của khoai tây còn đợc dùngtrong công nghiệp dệt, sợi, gỗ ép và giấy ở một số nớc phát triển, ngời ta còndùng khoai tây làm thức ăn gia súc, đặc biệt là trong công nghệ tạo acid hữucơ (lactic, citric), các dung môi hữu cơ (ethanol, butanol, axeton) (Grion,

1986, dẫn theo Nguyễn Quang Thạch, 1993) [10] Gần đây ngời ta còn pháthiện ra chất PPO (Poly phenol oxydase) trong vỏ khoai tây có tác dụng chốngbám dính làm cho vi khuẩn không xâm nhập vào trong tế bào gây bệnh PPO

đợc coi là thứ vũ khí chống lại vi khuẩn trong đó có cả HIV (theo Thừa ThiênHuế năm 2000) Khoai tây còn là cây cải tạo đất rất tốt trong các hệ thốngluân canh và đợc dùng làm thuốc Thân lá khoai tây bào chế ra thuốc giảm

đau, an thần, chữa bệnh thần kinh So sánh về năng suất chất khô trên một đơn

vị diện tích trồng trọt thì khoai tây cho năng suất cao hơn lúa mỳ 3,04 lần; lúanớc 1,33 lần và ngô 2,2 lần Ngoài tiêu thụ trong nớc, khoai tây còn là mặthàng có giá trị xuất khẩu

2.1.4 Tình hình nghiên cứu khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam

2.1.4.1 Tình hình nghiên cứu khoai tây trên thế giới

Thấy đợc tầm quan trọng của khoai tây với nền sản xuất lơng thực và

đời sống của con ngời, các nhà khoa học trên thế giới đã coi chúng là mộttrong những đối tợng nghiên cứu chính Từ những năm 90 của thế kỷ 20,khoai tây là đối tợng ứng dụng công nghệ sinh học đứng thứ 2 sau cây thuốclá Với nỗ lực không ngừng để tạo ra giống mới mang đặc tính chống chịu,thích nghi cao với điều kiện ngoại cảnh, các giống mới kháng bệnh (do nấm,virus gây ra), các giống kháng côn trùng đồng thời không ngừng phục tráng,cải lơng các giống khoai tây truyền thống, ngành sản xuất khoai tây đã thực sựphát triển và bùng nổ khắp thế giới Các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu,ứng dụng hàng loạt các phơng pháp, kỹ thuật công nghệ hiện đại trên nhiều

đối tợng khoai tây nh : các kỹ thuật chọn lọc bằng chỉ thị phân tử, nuôi cấy

đỉnh sinh trởng, chuyển gen kháng virus, kháng các bệnh do vi khuẩn nấmgây ra, dung hợp tế bào trần, nuôi cấy bao phấn Trên thế giới, xu hớng rất đ-

ợc quan tâm là tạo đợc các cây khoai tây chuyển gen mang các tính trạngmong muốn Diện tích khoai tây chuyển gen không ngừng tăng lên, đứng đầu

là Mỹ Cây khoai tây đợc chuyển các gen kháng virus X, Y , gen kháng bệnh

do nấm gây ra, chuyển các gen kháng sâu, côn trùng các gen làm tăng sản ợng protein, tinh bột , đem lại hiệu quả kinh tế, tiềm năng xuất khẩu lớn trên

l-thế giới Sự tổ hợp các nghiên cứu, các kỹ thuật tiên tiến đã không ngừng tạo

ra các giống khoai tây mới sạch bệnh, chất lợng cao, đồng thời tăng năng suất,sản lợng khoai tây trên toàn thế giới

Việc sử dụng củ nhỏ đã đợc quan tâm từ lâu vì nó cho hệ số nhân giốngcao Gregory (1956) là ngời đầu tiên nghiên cứu về chất kích thích tạo củkhoai tây kích thớc nhỏ bằng kỹ thuật in vitro Tuy nhiên, việc sản xuất theocác phơng pháp trên gặp một số khó khăn là thờng chỉ sản xuất đợc một vụtrong năm và rất phụ thuộc vào nguồn cây in vitro

Gần đây, hãng American Ag - Tec áp dụng công nghệ Quantum tubercho phép sản xuất hàng triệu củ nhỏ cho một năm, rút ngắn đợc thời gian tạo

củ nhỏ cho một năm, đặc biệt rút ngắn đợc thời gian tạo củ trong 40 - 50 ngày.Theo ông Robert Britt, giám đốc công ty American Ag - Tec thì một công ty

có thể sản xuất đợc khoảng 10 - 20 triệu củ/năm Điều này có nghĩa là chỉ cần

2 năm có thể nhân giống phổ biến cho diện tích khoai tây rộng lớn

2.1.4.2 Tình hình nghiên cứu khoai tây ở Việt Nam

Bên cạnh những thành tựu và giá trị kinh tế của to lớn mà khoai tây manglại, có nhiều vấn đề phát sinh trong qua trình trồng và chăm sóc, đó là vấn đềdịch bệnh, củ giống bị thoái hóa, năng suất thấp, kỹ thuật chăm sóc cha hoànthiện Đây là những thách thức lớn của ngành nông nghiệp vì nó ảnh hởng lớntới chất lợng và sản lợng của cây trồng Do đó nhiều công trình nghiên cứuthực hiện nhằm mục đích tạo giống khoai tây sạch bệnh, ổn định cho sản lợngcao, chất lợng tốt và đáp ứng nhu cầu giống cho bà con nông dân Ngày nay,những công trình nghiên cứu về khoai tây tập trung vào hoàn thiện kỹ thuậtcanh tác, các vấn đề làm giảm năng suất khoai tây: dịch bệnh, chất lợng củgiống Việc nghiên cứu nhằm nâng cao chất lợng và sản lợng tạo củ giốngmini sạch bệnh trên khoai tây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô mới chỉ là bớc đầunghiên cứu Có một số công trình nghiên cứu trên đối tợng khoai tây đã đợccông bố

Tác giả Nguyễn Quang Thạch và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu cải lơnggiống khoai tây Arkersegen - một giống thích ứng với điều kiện nớc ta nhngrất mẫn cảm với virus Y và nấm Phitoprola Kết quả chọn lọc đợc giống mớichống chịu PVY và mang các đặc tính mong muốn [9]

Tác giả Nguyễn Thị Kim Thanh (2004) tiến hành nghiên cứu ảnh hởng củamột số nhân tố sử dụng trong nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh trởng củacây khoai tây invitro bằng cách sử dụng các tác nhân: nhiệt độ thấp (6oC) + đ-

ờng Saccaroza (5%) + đờng Glucoza (5%) Kết quả đều làm chậm khả năngsinh trởng của cây khoai tây invitro của các giống nghiên cứu so với giống đốichứng.

Các tác giả Dơng Tấn Nhựt, Phan Hoàng Anh, Trần Thị Ngọc Hơng, PhanXuân Hơng (2005) tập trung nghiên cứu sự hình thành củ khoai tây bi(solanum tuberosum L) invitro trực tiếp từ đốt thân dới ảnh hởng của muối

nitrat và nồng độ đờng sucroze trong môi trờng Kết quả nghiên cứu cho thấy:hàm lợng nitrat và nồng độ đờng là hai yếu tố kích thích và tác động lên sựhình thành củ khoai tây mini in vitro

Tác giả Nguyễn Quang Thạch đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ khícanh trong nhân giống khoai tây ở điều kiện chính và trái vụ Nghiên cứu nàynhằm giải quyết vấn đề thiếu và thoái hóa giống khoai tây tại Việt Nam, đồngthời giảm giá thành và cho tỉ lệ sống cao nhất của củ giống

ảnh hởng của bình nuôi, thế hệ cây và thiosulphat bạc đến sinh trởng, hệ

số nhân và chất lợng khoai tây in vitro là nghiên cứu đã đợc tiến hành củacác tác giả Nguyễn Thị Hơng, Nguyễn Thị Sơn, Trần Thị Thanh Minh(2005) [5]

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Đính (2006) về ảnh hởng của việcphun bổ sung kali lên lá vào các giai đoạn sinh trởng khác nhau đến một sốchỉ tiêu sinh lý – sinh hoá của giống khoai tây KT3 đã góp phần nâng caonăng suất, phẩm chất của củ khoai tây

Các hớng nghiên cứu khác nhau đã và đang đợc tiến hành trên khoaitây đặt cơ sở khoa học cho phép có thể thực hiện đợc các nghiên cứu nângcao chất lợng khoai tây giống, nhằm tạo giống khoai tây cho sản lợng cao,sạch bệnh

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào (NCMTB) thực vật là phơng pháp sử dụng các điềukiện nhân tạo để duy trì sự sống của tế bào thực vật trong điều kiện invitro Mục đích chung của NCMTB thực vật là sử dụng các điều kiện nh

ánh sáng, nhiệt độ, thành phần dinh dỡng, chất điều hoà sinh trởng để

điều khiển quá trình sinh trởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theomục tiêu đặt ra [14]

2.2.1 Vài nét về lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

NCMTB thực vật đã hình thành từ vài thập kỷ trớc mà cơ sở của nó đợcbắt đầu từ những thí nghệm đầu tiên của Harberlandt (1898 - 1902) khi ông đacác giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm “mọi cơ thể sinhvật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành Các tế bào đãphân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó làtrứng sau khi thụ tinh và là đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơthể” [11] Và Harberlandt là ngời đầu tiên đề xớng ra tính toàn năng của tế bào(totipotency), nghĩa là bất kỳ một tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều cókhả năng tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiệnthuận lợi Tiếc thay, các thí nghiệm của ông đã không thành công

Năm 1922, Kotte và Robbins lập lại thí nghiệm của Harberlandt với đỉnhsinh

trởng tách từ đầu rễ một cây hoà thảo Trong môi trờng lỏng gồm muốikhoáng và glucose, đầu rễ phát triển mạnh tạo hệ rễ gồm cả rễ phụ Nhng chỉsau một thời gian rễ phát triển chậm dần rồi ngừng hẳn mặc dù đã thay đổimôi trờng [20] Năm 1934, White đã duy trì đợc đỉnh sinh trởng của đầu rễ

cà chua (Lycopersicon esculentum) trong một thời gian khá dài trên môi

tr-ờng lỏng có chứa đtr-ờng, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men Sau đó

ít lâu, White chứng minh là có thể thay nớc chiết nấm men bằng hỗn hợp baloại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Piridoxin (B6) và Nicotinic axit Cùngthời gian đó, Went và Thiamin tìm ra và tinh chế đợc chất kích thích sinh tr-ởng đầu tiên là IAA Năm 1939, Gautheret và Nebecout đã duy trì đợc sựsinh trởng của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trong một thời gian dài trên

môi trờng thạch rắn [22] Năm 1941, Overbeck chứng minh tác dụng của nớcdừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Datura) Trong thời gian này, nhiều chất

điều hoà sinh trởng thuộc nhóm auxin đã đợc tổng hợp thành công nh α napthyl acetic axit (NAA) và chất 2,4 - Dichlorphenoxy acetic axit (2,4 - D)[14]

-Trong khoảng thời gian 1954 - 1959, kỹ thuật NCMTB đơn đã đợc pháttriển và hoàn thiện dần Năm 1954, Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân củatinh dịch cá bẹ có tác dụng kích thích sinh trởng rất rõ rệt trong nuôi cấynhững mảnh mô thân cây thuốc lá Ông cho rằng chất có hoạt tính là sản phẩmphân giải, và một năm sau, chất đó đợc tổng hợp thành công, đợc Skoog gọi làkinetin do có tác dụng kích thích sự phân bào Việc phát hiện ra NAA, 2,4-D,kinetin cùng với các loại vitamin và nớc dừa là những bớc tiến có ý nghĩa

trong giai đoạn thứ hai của NCMTB thực vật Nickell (1956) đã duy trì đợc sựsinh trởng liên tục huyền phù cây đậu trắng (Phaseolus vulgarisi) Melcher và

Beck đã nuôi các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổsung chất dinh dỡng định kỳ Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo

đợc cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng

đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp [15] Năm 1957, Skoog và Miller

đã chứng minh sự biệt hoá của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tuỷthuốc lá phụ thuộc nồng độ tơng đối của tỷ lệ auxin/cytokinin và từ đó đa raquan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan thực vật.Trong giai đoạn mới từ năm 1960 trở lại đây, cùng với việc NCMTB đơn,

tế bào trần (protoplast), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn đợc phát triểnmạnh Các kỹ thuật lai tế bào soma bằng dung hợp tế bào trần và các kỹ thuậtchuyển gen đợc phát triển và thu đợc những thành tựu đáng kể

ở nớc ta, NCMTB phát triển từ những năm 1980 và đạt đợc những kết quảkhích lệ trong nhân giống in vitro các cây khoai tây, cây hoa Phong lan, Hồng,Cúc ; một số cây công nghiệp nh Bạch đàn, Keo; cây dợc liệu nh Thông đỏ

Đến nay, NCMTB thực vật trở thành một công cụ không thể thiếu của CNSHhiện đại nhất là trong lĩnh vực ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, tạo giống

và nhân giống thực vật

2.2.2 Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

NCMTB thực vật ngày càng đợc hoàn thiện với nhiều kỹ thuật Tuỳ theomục đích và đối tợng thực vật mà sử dụng kỹ thuật NCMTB thực vật cho phùhợp Theo quan điểm hiện nay, NCMTB thực vật bao gồm sáu kỹ thuật sau :

 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời:

Phơng pháp này để nghiên cứu điều kiện sinh trởng đối với một bộphận hoặc một mô của cây in vitro, tạo thành mô sẹo phục vụ cho cácnghiên cứu cơ bản nh chọn dòng tế bào; đột biến xoma và ứng dụng phânhoá tế bào, cơ quan

 Nuôi cấy mô phân sinh:

Đợc dùng trong các trờng hợp tạo những giống cây sạch bệnh và nhângiống in vitro; tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicin và nghiên cứu quátrình hình thành cơ quan

 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo (Callus) là một khối các tế bào phát sinh vô tổ chức và có hình

dạng không nhất định Nuôi cấy mô sẹo đợc ứng dụng trong nhân giống invitro ở những thực vật mà phơng pháp nhân giống bằng đỉnh sinh trởng ít cóhiệu quả hoặc không thực hiện đợc; làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn;thu nhận các chất có hoạt tính sinh học; nguyên liệu cho chọn tạo giống tế bào

đột biến, chọn dòng tế bào chịu mặn, chịu bệnh và nghiên cứu hình thành cơquan

 Nuôi cấy phôi:

Nuôi cấy phôi vô tính hiện nay đợc xem nh một kỹ thuật mang lại nhiềuhiệu quả Phơng pháp này đợc dùng để phá trạng thái ngủ nghỉ của hạt, thửsức sống của hạt, duy trì phôi yếu

 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn:

Phơng pháp này dùng để tạo dòng thuần, nghiên cứu sự biểu hiện của genlặn, chọn dòng đột biến

 Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần

Nhằm nghiên cứu cấu trúc tế bào, ảnh hởng của các điều kiện khác nhaulên quá trình sinh trởng, phát triển và phân hoá tế bào Phơng pháp này đợc sửdụng trong việc chọn dòng tế bào

2.2.3 Các yếu tố ảnh hởng tới nuôi cấy mô tế bào thực vật

Sự sinh trởng và phát trởng của thực vật in vitro đợc quy định bởi một sốnhân tố phức tạp nh: các yếu tố trong môi trờng; những yếu tố vật lý và cácchất điều hoà sinh trởng, các vitamin

2.2.3.1 ảnh hởng của các yếu tố trong môi trờng nuôi cấy

Môi trờng NCMTB thực vật có nhiều loại khác nhau nh môi trờng MS(Murashige và Skoog), môi trờng Knop, Gamborg… Tuy nhiên, các môi trờng

đều bao gồm các thành phần chính sau:

dụng ở nồng độ cao hơn sẽ ức chế sự sinh trởng phát triển của mô nuôi cấy[18] Ngoài ra, các đờng khác nh Maltose, Glucose, Fructose ít đợc sửdụng

 Thành phần khoáng

Sau đờng, chất khoáng là nhóm dinh dỡng quan trọng không kém cho sựphát triển in vitro Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rờikhông khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Cho đến nay rấtnhiều môi trờng dinh dỡng muối khoáng đợc tìm ra nh môi trờng MS( Murashige và Skoog, 1962), môi trờng Knop (1974), Gamborg (1968) Trong đó, môi trờng MS đợc đánh giá là phù hợp nhất đối với đa số các loàithực vật, nó chứa đủ thành phần khoáng đa lợng và vi lợng cho cây phát triển[14] Ngày nay, có nhiều môi trờng đợc cải tiến từ môi trờng MS

Trong môi trờng nuôi cấy, nguồn Nitơ vô cơ đợc cung cấp dới dạng NO3

-và NH4+ Đồng thời có thể sử dụng các dạng nitơ hữu cơ nh axit amin Một số

ít trờng hợp nitơ có thể đợc cung cấp dới dạng ure Đối với photpho thì haidạng thờng dùng nhất là NaH3PO4.7H2O và KH2PO4 Nồng độ photpho trongmôi trờng biến thiên từ 0,15 - 4 mM Nguyên tố Kali thờng đợc cung cấp chomôi trờng nuôi cấy dới dạng muối KNO3, KCl, KH2PO4 Nồng độ K+ biếnthiên từ 2 - 2,5 mM Canxi cũng đợc cung cấp dới dạng muối Ca(NO3).4H2Ohoặc CaCl2.6H2O hoặc CaCl2.2H2O Nồng độ Ca2+ trong môi trờng từ 1 - 3,5

mM Magiê đợc cung cấp dới dạng MgSO4.7H2O với nồng độ từ 0,5 - 3 mM

Đối với các muối khoáng vi lợng nh Mn2+, Bo2+, Zn2+, Cu2+ đợc cung cấp với ợng nhỏ [11]

l- Nớc

Nớc là một thành phần quan trọng trong môi trờng nuôi cấy Nó chiếm95% trong môi trờng dinh dỡng Nớc đợc sử dụng là nớc đợc trng cất hailần

 ánh sáng

ánh sáng có tác động mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôicấy Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy phụ thuộc vào chu kỳ, cờng độ,thành phần quang phổ của ánh sáng [17] Cờng độ ánh sáng thích hợp chonhiều loại mô trong giai đoạn tái sinh là 2000 - 3000 lux

 Nhiệt độ

Tuỳ thuộc vào loài thực vật mà nhiệt độ nuôi cấy là khác nhau nhng nhiệt

độ thích hợp là 25 2± 0C Nhiệt độ này có ảnh hởng tích cực tới quá trình sinhtrởng và phát triển của đa số các loài thực vật nuôi cấy Trong một số trờnghợp, nhiệt độ lạnh lại có ảnh hởng tốt hơn chẳng hạn xử lý bao phấn lúa ở 40Cthì hiệu suất tạo mô sẹo sẽ tăng [13] Nhiệt độ cao còn ảnh hởng tới sinh trởngcủa các mô nuôi cấy thông qua tác động lên cấu trúc của các chất điều hoà sinh tr-ởng thực vật nh phân huỷ IAA và GA [20]

 Độ pH

Độ pH ảnh hởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dỡng vào tếbào Giá trị pH thay đổi làm thay đổi chiều hớng và tốc độ của nhiều phản ứngsinh hoá, quyết định hấp thụ cation và anion của tế bào, ảnh hởng đến áp suấtthẩm thấu của tế bào [12] pH khoảng 5,5 - 6 là thích hợp với nhiều loại mônuôi cấy Khi pH thấp sẽ hoạt hoá enzyme hydrolaza dẫn tới kìm hãm sự sinhtrởng và phát triển, đồng thời kích thích sự hoá già của tế bào [15]

2.2.3.3 ảnh hởng của các chất điều hoà sinh trởng và vitamin

Các chất điều hoà sinh trởng ở thực vật là những chất có bản chất hoá họckhác nhau nhng đều có tác dụng điều tiết quá trình sinh trởng, phát triển củacây Chúng bao gồm các phytohoocmon và các chất điều hoà sinh trởng tổnghợp nhân tạo Phytohoocmon là những hoocmon đợc tổng hợp trong thực vậtvới liều lợng nhỏ ở các cơ quan và từ đó đợc vận chuyển tới các cơ quan khác.Còn các chất điều hoà sinh trởng tổng hợp nhân tạo là các chất đợc tổng hợpbằng con đờng hoá học, có hoạt tính sinh lý tơng tự nh các phytohoomon Cácchất điều hoà sinh trởng có hai loại là chất kích thích sinh trởng và chất ức chếsinh trởng Trong nuôi cấy mô thờng dùng là chất kích thích sinh trởng nhân tạothuộc nhóm auxin và cytokinin

 ảnh hởng của auxin

Auxin là hợp chất chứa nhân indol trong phân tử Trong nuôi cấy in vitro,auxin có tác dụng kích thích sinh trởng kéo dài tế bào, thúc đẩy sự sinh trởngcủa mẫu thông qua hoạt hoá sự phân chia và làm giãn tế bào, kích thích quátrình tổng hợp và trao đổi chất, điều hoà sự phân chia rễ và chồi Nồng độNAA thấp sẽ dẫn tới sự hình thành rễ phụ, nồng độ auxin cao sẽ dẫn tới hìnhthành mô sẹo Tuy nhiên nếu quá cao sẽ ức chế sự phát triển của rễ Các chấtthuộc nhóm auxin thờng dùng là IBA, NAA và 2,4-D.

 ảnh hởng của Cytokinin

Cytokinin là chất điều hoà sinh trởng có tác dụng tăng sự phân chia tếbào Các cytokinin thờng gặp là BAP và kinetin Trong đó kinetin là dẫn xuấtcủa bazơ nitơ adenin BAP là cytokinin đợc tổng hợp nhân tạo Chúng cũng cótác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bàophân sinh với sự phát triển chồi từ mô sẹo nuôi cấy Nồng độ cytokinin thờng

đợc sử dụng là 0,5 - 2mg/l Nếu nồng độ thấp hơn thì biểu hiện hiệu quả kíchthích kém, khả năng tạo chồi giảm Ngợc lại, cytokinin ở nồng độ cao sẽ hoạthoá hình thành chồi bất định gây ra hiện tợng mọng nớc và kìm hãm quá trìnhtạo rễ

Trong nuôi cấy in vitro thì sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có tác dụngquyết định đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mô nuôi cấy Các tỷ lệauxin/cytokinin khác nhau sẽ có tác dụng không giống nhau đối với sự phânhoá của mô nuôi cấy Nếu tỷ lệ này cao thì thích hợp cho hình thành rễ, cònthấp sẽ hình thành chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi chophát triển của mô sẹo

Ngoài auxin và cytokinin còn có nhiều chất điều hoà sinh trởng khác nhGiberellin, etylen, axit ascorbic Giberellin có tác dụng kích thích kéo dài tếbào nhất là thân và lá Etylen và axit ascorbic là chất ức chế sinh trởng có tác dụng đốivới hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật [11]

 ảnh hởng của vitamin

Vitamin là chất xúc tác quan trọng trong các phản ứng enzyme Mặc dùtất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổnghợp đợc hầu hết các loại vitamin nhng thờng không đủ về số lợng do đó phải

bổ sung thêm vào môi trờng một số vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B nh

vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6 Trong đó vitaminB1 đợc coi là cần thiết nhất đối với sự sinh trởng và phát triển của tế bào thựcvật.

2.2.4 ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro

Qua lịch sử phát triển lâu dài, đến nay nuôi cấy mô tế bào thực vật có rấtnhiều ứng dụng thực tiễn Trong đó, nhân giống in vitro đợc coi là phơng pháphữu hiệu nhất Nhân giống in vitro là lĩnh vực sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tếbào thực vật để nhân giống cây trồng trong ống nghiệm Với phơng pháp nàyhoàn toàn có thể tạo ra một quần thể cây trồng đồng đều giữ nguyên đặc tínhcủa cây mẹ, có hệ số nhân giống và hiệu quả kinh tế cao, không tốn diện tíchnhân giống Hiện nay, đã có nhiều quy trình nhân giống in vitro của nhiều loàithực vật Nhìn chung, các quy trình gồm 5 giai đoạn [11], [18]:

 Giai đoạn 1: Chọn mẫu

Lựa chọn đối tợng (có thể là thân, lá, củ) thích hợp để làm mẫu Kết quảcủa quy trình phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính của mẫu Quan trọng nhất vẫn

là đỉnh sinh trởng, chồi nách, sau đó là hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ Mô chọn

để nuôi cấy thờng là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ đợc các

đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định Cây đợc chọn để lấy mẫu thờng

là cây u việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao Tuỳ mục đích nuôi cấy và đặc tínhcủa loài mà chọn mẫu phù hợp Bên cạnh đó phải chú ý tới tuổi mẫu, thời gianlấy mẫu, mùa vụ

 Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng

Mẫu phải đợc khử trùng trớc khi cấy vào môi trờng nuôi cấy Việc khửtrùng mẫu trong điều kiện vô trùng sẽ làm giảm khả năng nhiễm bệnh củamẫu nuôi cấy Tuỳ theo sự tiếp xúc của mẫu với môi trờng mà lựa chọn hoáchất, chế độ khử trùng cho phù hợp Sau khi khử trùng, cấy mẫu vô trùng vàomôi trờng nhân tạo trong ống nghiệm hoặc trong bình nuôi Các mẫu nếukhông bị nhiễm vi khuẩn, nấm hoặc virus sẽ đợc lu giữ trong phòng với nhiệt

độ, ánh sáng thích hợp, nếu là nuôi cấy mô sẹo thì đợc để trong tối Sau mộtthời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào là môsẹo, hoặc cơ quan hoặc phôi vô tính có đặc điểm gần nh phôi hữu tính Giai

đoạn này thờng kéo dài 2 - 12 tháng

 Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Thành phần và điều kiện môi trờng nuôi cấy phải đợc tối u hoá nhằm đạt

đợc mục đích nhân nhanh Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng