phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm bằng phương pháp pcr

KHÁI NIỆM PHƯƠNG PHÁP PCRKhái niệm  PCR là phương pháp khuếch đại in vitro trong ống nghiệm một trình tự DNA dựa trên một trình tự DNA đích ban đầu bằng một cặp mồi primers và enzym DN

ĐỊNH TÍNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP PCR (Polymerase Chain

Reaction)

Khái niệm chung về phương pháp PCR

Phương pháp phát hiện Salmonella bằng

PCR

Phương pháp phát hiện V cholerae bằng

KHÁI NIỆM PHƯƠNG PHÁP PCR

Khái niệm

 PCR là phương pháp khuếch đại in vitro (trong

ống nghiệm) một trình tự DNA dựa trên một

trình tự DNA đích ban đầu bằng một cặp mồi

(primers) và enzym DNA polymerase

 Khuôn DNA (template)là trình tự DNA đích đặc trưng cho đối tượng cần phát hiện

 Mồi (pimers): là một trình tự DNA hay RNA

ngắn bắt cặp với mạch khuôn DNA có mang

một đầu 3’- OH tự do giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới

Trong một phản ứng cần có 2 mồi

KHÁI NIỆM CÁC THUẬT NGỮ

 Bắt cặp bổ sung : là sự kết hợp giữa hai mạch

DNA đơn hay một mạch DNA đơn với RNA khi

trình tự hai mạch này tương đồng đối song song

(A-T, G-C)

 DNA polymerase là enzym tổng hợp mạch DNA mới từ một mạch khuôn Trong phương pháp PCR thường sử dụng Taq DNA polymerase là một

enzym chịu nhiệt

 Biến tính : là sự chuyển từ DNA mạch kép thành hai mạch DNA đơn dưới tác dụng của tác nhân

biến tính

Trong PP PCR tác nhân biến tính là nhiệt

 Lai : là sự bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA theo

KHÁI NIỆM (tt)

 Khuếch đại : là sự nhân bản các đoạn DNA Trong

PP này, sự khuếch đại thông qua các chu kỳ nhiệt độ

Độ lớn của đoạn DNA được khuếch đại bằng kích

thước nằm giữa hai mồi

 Điện di : là quá trình phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau trong gel agarose dưới tác

dụng của dòng điện 1 chiều

 Thang DNA (DNA marker) là phương tiện để đo kích thước các đoạn DNA Đây là hỗn hợp các

đoạn DNA có kích thước khác nhau đã biết

 Cặp base ( base pair - bp): cặp base bổ sung trong DNA mạch đôi

CÁC BƯỚC TRONG QUÁ TRÌNH

KHUẾCH ĐẠI

 Phản ứng PCR được thực hiện thông qua nhiều chu kỳ

nhiệt liên tiếp gồm các bước như sau:

 Bước 1: Biến tính : làm cho hai mạch của DNA tách rời nhau

ra dưới tác dụng của nhiệt Nhiệt độ biến tính luôn cao hơn

nhiệt nóng chảy (Tm) của khuôn DNA Thường thực hiện ở

nhiệt độ 92-95 o C

 Bước 2: Lai : nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn DNA Nhiệt độ lai dao động trong

khoảng 40-70 o C

 Bước 3: Kéo dài: nhiệt độ được tăng lên đến nhiệt độ tối ưu

cho taq DNA polymerase hoạt động (72 o C) tổng hợp hợp kéo dài mạch mới từ đầu 3’OH của mồi

 Chu kỳ tiếp theo sẽ quay lại bước 1 sau khi kết thúc

bước 3 của chu kỳ trước

CÁC BƯỚC CỦA PHẢN ỨNG PCR

Biến tính bản mẫu Nhiệt

độ (C o ) Mồi bắt

cặp

Chu kỳ 2

Chu kỳ 1

Tổng hợp DNA

Thời gian (phút)

SƠ ĐỒ PHẢN ỨNG PCR

THÀNH PHẦN THAM GIA TRONG

PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI PCR

 Khuôn DNA

 Mồi (primers): gồm một mồi xuôi và một mồi ngược có nồng độ bằng nhau

 dNTP là hỗn hợp gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTP

Các thành phần này có nồng độ bằng nhau

 Taq DNA polymerase

 MgCl2 là thành phần không thể thiếu, có tác dụng

làm tăng ái lực kết hợp mồi – khuôn và dNTP – Taq polymerase

Nồng độ phụ thuộc từng qui trình khuếch đại

 Đệm phản ứng: gồm Tris – HCl, Tween 20(NH4)SO4, KCl và các chất tăng cường khuếch đại

THU NHẬN KHUÔN DNA

 DNA nằm trong nhân tế bào, bên trong màng tế bào vi khuẩn hay trong vỏ bọc của virus

 Giải phóng DNA bằng cách phá huỷ màng tế

bào, màng nhân, vỏ virus …

 Tác nhân phá màng để giải phóng DNA có thể là nhiệt, lysozym hay các chất tẩy mạnh Trong phân tích vi sinh thường sử dụng tác nhân là

nhiệt

 Khuôn DNA có thể được tinh sạch hoạt không

MỒI

 Là thành phần quyết định tính chuyên biệt cho

đối tượng cần phân tích

 Mồi được thiết lập dựa trên một trình tự DNA

được biết trước

Được thiết lập trên một gen đặc trưng cho đối tượng cần phân tích

 Độ lớn sản phẩm khuếch đại là khoảng cách

giữa hai mồi

 Nên chọn mồi cho sản phẩm khuiếch đại

200-1000bp

 Tm của hai mồi tương đương nhau

 Nên chọn mồi có tỉ lệ G + C > 50% 10

QUI TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

BẰNG PCR

 Gồm các bước cơ bản như sau

– Tăng sinh : để làm tăng số lượng VSV  tăng độ nhạy của phương pháp

– Xử lý khuôn DNA

– Khuếch đại : làm giàu số lượng DNA mục tiêu

– Điện di : phân tích sản phẩm khuếch đại trên gel

agarose

– Nhuộm DNA với ethidium bromide trên gel, đọc kết

quả dưới đèn UV

– Kết quả dương tính : có sản phẩm khuếch đại phù hợp

kích thước được thiết kế

– Kết quả âm tính : không có DNA được khuếch đại hay kích thước tạo ra không phù hợp kích thước thiết kế

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÊN GEL

AGAROSE

T: thang DNA, 1,3,4,5,6,8,9,10,11: Mẫu cho kết

quả dương tính với sản phẩm khuếch đại 380bp,

2,7: Mẫu âm tính

Ưu, nhược điểm của phương pháp PCR

 Ưu điểm

– Thời gian cho kết quả nhanh: 24-28 giờ

– Có thể phát hiện VSV khó nuôi cấy

– Hoá chất dễ bảo quản, dễ tìm

– Ít tốn công lao động

CÁC VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM ĐÃ ÁP

DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR

14

Vi sinh vật Loại thực phẩm Thời gian

(giờ)

Độ nhạy (CFU/phản ứng)

Độ nhạy (CFU/25g mẫu)

E coli Thịt heo, sữa, rau, cá 12 90 10

E coli (ETEC) Thịt heo, sữa tươi, rau cải, 14 700 5

E coli O157:H7 Thịt heo, sữa tươi, rau cải 16 32 10

Salmonella spp. Thịt thủy sản 12 90 3

V cholerae Thịt thủy sản 14 30 10

V para. Thịt thuỷ sản 16 370 10

Các ứng dụng đã được nghiên cứu triển khai tại ĐH KHTN

TPHCM

PHÁT HIỆN

THỰC PHẨM BẰNG

PCR

THIẾT BỊ, VẬT DỤNG

 Tủ ấm 37oC: tăng sinh Salmonella

 Máy luân nhiệt (thermocycler): khuếch đại

 Máy ly tâm eppendorf 1.5ml: xử lý khuôn DNA

 Máy lắc ống nghiệm

 Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn có điện thế

HOÁ CHẤT – VẬT TƯ

được thiết lập trên gen invA có trình tự là:

HOÁ CHẤT – VẬT TƯ

Axit acetic băng 1.14ml

QUI TRÌNH

qua đêm

vào eppendorf  ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút

 đổ bỏ dịch  rửa sinh khối 2 lần với nước cất vô trùng  ly tâm để bỏ phần nước  cho vào 0.5ml nước cất hay đệm TE  đun sôi

cách thủy 10 phút  dịch mẫu (khuôn) DNA

QUI TRÌNH (tt)

Đệm phản ứng 44 l Taq DNA polymerase 1 l

QUI TRÌNH (tt)

sản phẩm sau khuếch đại  trộn đều

100ml TAE  đun tan  cho vào 5 l dd ethidium bromide  cho vào khay có gắn các lược để tạo giếng  chờ gel đông đặc

 bỏ lược  ngâm vào đệm TAE

vào giếng  điện di ở điện thế 100V

trong khoảng 1 giờ

DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

phẩm 520bp

phẩm, hay xuất hiện các vạch khác kích

thước trên

KHUYẾN CÁO

việc trước và sau khuếch đại

sau khuếch đại được thực hiện tại các khu vực khác nhau

phải có găng tay khi tiếp xúc hoá chất này

QUI TRÌNH PHÁT HIỆN V CHOLERAE

BẰNG PCR

Salmonella, các điểm khác là

– Trình tự mồi:

Mồi 1: 5’-TGAAATAAAGCAGTCAGGTG-3’

Mồi 2: 5’-GGTATTCTGCACACAAATCAG-3’

Nồng độ mồi: 10pM/l

– Chương trình khuếch đại: nhiệt độ lai mồi và khuôn DNA là 55oC

– Sản phẩm khuếch đại có kích thước 777bp