PHưƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH vật một số vấn đề THưỜNG gặp TRONG QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH vật

Ủ ở 37±1 0 C/18h±2h Đối với mẫu sản phẩm cacao hoặc sản phẩm chứa cacao hơn 20%: thêm vào BPW 50g/L Casein không sử dụng casein acid hoặc 100g/L Skim milk powder bột sữa gầy sau khoả

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT & MỘT SỐ VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG QUÁ

TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

Nội dung

PHẦN 1: Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật PHẦN 2: Các vấn đề thường gặp trong quá trình phân tích VSV

PHẦN 1

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

10 gram mẫu + 90 gram SPW Đồng nhất mẫu

trong máy dập mẫu trong 30s

Chuyển 1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 2 đĩa

V ( n1  0,1n2 ) d

C

∑ C: tổng số khuẩn lạc đếm được ở tất cả các đĩa PCA

V: Số ml dịch mẫu được cấy chuyển.(1ml)

d: nồng độ pha loãng đầu tiên cấy vào đĩa

n 1 : số đĩa có 10 -300 khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng đầu

n 2 : s ố đĩa có 10 - 300 khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng sau

TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ ISO 4833: 2003 / TCVN 4884:2005

10 gram mẫu + 90 gram SPW (Saline peptone water).

Đồng nhất mẫu trong máy dập mẫu trong 30s

Chuyển 1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 2 đĩa

Đổ thêm 5ml VRB đã đƣợc làm nguội 45 – 47 0 C

Để yên chờ đông đặc

ĐỊNH LƢỢNG COLIFORMS ISO 4832: 2006 / TCVN 6848:2007

10 gram mẫu + 90 gram SPW Đồng nhất mẫu

trong máy dập mẫu trong 30s

Chuyển 1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 2 đĩa

dịch mẫu với môi trường

- N ếu nghi ngờ vi khuẩn bị tổn thương, ủ đĩa ở

37 0 C/4h sau đó chuyển sang ủ ở 44 0 C/18-24h

Cấy chuyển 10ml mẫu ở độ pha loãng

10 -1 vào 3 ống chứa10ml LSBII

và cấy 1ml ở 10 -1 10 -2 10 -3 vào 3 ống chứa10ml LSBI

Cân 10 gram mẫu + 90 gram SPW Đồng nhất mẫu trong máy dập mẫu trong 30s

10

Ủ các ống 37±1 0 C/24 - 48h

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc ít hơn

300, khuẩn lạc điển hình của

có mầu đen hoặc xám, bóng, lồi có d=1-2,5mm, đƣợc bao quanh bởi 1 vòng trong và/hoặc 1 vòng đục

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường BHI (Brain Heart Infusion broth ) ủ ở 37 o C± 1 o C /24h ± 2h

ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI DƯƠNG TÍNH COAGULASE

∑C: tổng số khuẩn lạc có phản ứng coagulase +/các đĩa

V: Số ml dịch mẫu được cấy /đĩa.(0,1ml)

d: nồng độ pha loãng đầu tiên cấy vào đĩa

n 1 : số đĩa được chọn ở nồng độ pha loãng đầu

1 /20±2h trong điều kiện kỵ khí

(Tủ kỵ khí hoặc dùng Anaerocult jar

kết hợp với Anaerocult A)

-Đổ 10 - 15 mL môi trường TSC

(Tryptose sulfite cycloserine )

kỵ khí ở 37 0 C/18-24h Chuyển nhanh 5 giọt từ môi trường FTB

vào môi trường Lactose suphite

bằng cách dùng pipet tiệt trùng Ủ ở điều kiện hiếu khí ở 46±0,50 0 C/18-24h N

1 Khi ống Durham chứa 1/4 khí và có

kết tủa đen tạo thành : dương tính 

là C perfringens

2 Khi ống LS sau ủ có kết tủa đen,

nhưng gas có ít hơn ¼ ống dulham 

Ủ ở điều kiện hiếu khí

1 Khi ống Durham chứa 1/4 khí và có

kết tủa đen tạo thành : dương tính 

là C perfringens

2 Không thoả mãn điều kiện 1: âm tính

 không phải là C perfringens

Chuyển 0.1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 2 đĩa DRBC (Dichloran rose bengal chloramphenicol)

Chuyển 0.1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 2 đĩa DG18 (Dichloran 18 %

Cân 25g mẫu cho vào túi PE vô trùng , thêm 225 mL

BPW (Buffer peptone water) Đồng nhất mẫu

trong 30giây Ủ ở 37±1 0 C/18h±2h

Đối với mẫu sản phẩm cacao hoặc sản phẩm chứa

cacao (hơn 20%): thêm vào BPW 50g/L Casein

(không sử dụng casein acid) hoặc 100g/L Skim

milk powder (bột sữa gầy) sau khoảng 2h ủ hoặc

0.018g Brilliant Green nếu sản phẩm nhiễm vi

khuẩn Gram dương

Đối với những thực phẩm chua (acid) và chứa

thành phần gây chua: bảo đảm rằng pH không nhỏ

hơn 4,5 trong suốt giai đoạn tiền tăng sinh

ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP.

ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005

và BPLS (Brilliant green phenol red lactose sucrose agar)

BPLS: Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella

có màu hồng, môi trường xung quanh có màu

Lấy khuẩn lạc thuần từ TSA thực hiện các phản ứng ngƣng kết huyết thanh: Tự ngƣng kết, ngƣng kết kháng nguyên thân O, ngƣng kết kháng nguyên màng nhầy Vi, ngƣng kết kháng nguyên tiêm mao H

ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP.

ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005

Xác định kháng nguyên H: Từ khuẩn lạc trên TSA cấy vào motility

agar và ủ ở 37 o ± 1 o C/24h±3h  Tiến hành thí nghiệm ngưng kết

Cân 25g mẫu +225g ASPW (Alkaline

Ủ 37 o C/6h (sản phẩm đông lạnh) hoặc 41,5 o C/6h (mẫu tươi, khô, ướp muối)

Lấy 1mL dịch của tăng sinh chọn lọc lần 1 vào ống nghiệm chứa 10 mL ASPW Ủ ở 41,50 C ±1 0 C/18h ± 1h

(Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar)

và TSAT (Tryptone sucrose tetrazolium agar) Ủ ở 37 ± 1 0 C/24±3h

ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS

ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008

1 Khuẩn lạc Vibrio cholera điển hình trên

TCBS có đặc điểm:nhẵn trơn, màu vàng (sucrosec dương tính), đường kính 2-3mm

2 Khuẩn lạc Vibrio parahaemolytycus

điển hình trên TCBS có đặc điểm:

nhẵn trơn, màu xanh (sucrose âm tính), tròn, đường kính 2-3mm

3 Khuẩn lạc Vibrio cholera & Vibrio

có đặc điểm:nhẵn trơn, màu đỏ

SNA 1%

ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS

ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008

2 Quan sát di động: Cấy khuẩn lạc từ SNA

vào ống nghiệm ASPW và ủ ở 37± 1 0 C /1- 6h Quan sát sự di động bằng tiêu bản giọt treo

Nếu oxidase cho kết quả dương tính và Gram

âm, hình phẩy, di động  Khẳng định sinh hoá: ADH, ODC, LDC, ONPG, TSI, Indole, Dãy muối 0%, 2%, 4%, 6%,8%, 10%

Thực hiện ngưng kết kháng huyết thanh cho

và O139.

ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS

ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008

Sau khi ủ, chuyển 0,1mL dịch mẫu sang ống nghiệm chứa 10 mL Fraser broth Ủ ở 37 o ± 1 o C/48 ± 3h

Từ môi trường nuôi cấy tăng sinh lần 1

& lần 2 dùng que cấy có vòng, cấy ria dịch mẫu trên đĩa môi trường ALOA

và PALCAM Ủ ở 37 ± 1 o C/48 ± 3h

ALOA

ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES

ISO 11290-1: 1996/Amd 1:2004)

1 Trên môi trường thạch PALCAM

đặc trưng màu xanh Olive hay xanh xám, tâm đen và lõm xuống ở trung tâm sau 48h ủ, bao quanh khuẩn lạc môi trường có màu đen, đường kính khoảng 1,5-2 mm

2 Trên môi trường ALOA khuẩn lạc có

khuẩn lạc có quầng sáng bao quanh sau khi ủ ở 24 - 48h.

ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES

ISO 11290-1: 1996/Amd 1:2004)

2 Nếu khuẩn lạc phân lập không tốt, chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên các đĩa này cấy lại trên đĩa TSYEA khác Các thử nghiệm sinh hóa phải được thự hiện trên các khuẩn lạc thuần

2 Nhuộm Gram (Gram dương, que ngắn

và mảnh, tế bào có màu xanh tím của violet)

3 Thử nghiệm di động nếu cần (giọt treo

và thạch mềm (molity agar) Di động hình tán dù ở 25±1 o C/48h

ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES

ISO 11290-1: 1996/Amd 1:2004)

Lấy khuẩn lạc mọc từ đĩa TSYEA cấy vào môi trường

Sheep blood agar Ủ ở 37 ± 1 o C/24h ± 2h

Lấy khuẩn lạc mọc từ đĩa TSYEA cấy vào các ống nghiệm

chứa đường Xylose, Rhamnose Ủ ở 37 ± 1 0 C/24h ± 2h

Rhamnose dương tính, Xylose âm tính

ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES

ISO 11290-1:1996/Amd 1:2004

CAMP dương tính với Staphylococcus

Báo cáo KQ: Phát hiện

phát

hoặc không hiện L.

monocytogenes/25g

mẫu

PHẦN 2

MỘT SỐ VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG

PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

1 -BIỂU HIỆN BẤT THƯỜNG

CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Môi trường agar

không đông

-Quá nhiệt

-pH quá thấp

-Khối lượng agar không đủ

- Agar không tan

-Không được lắc kỹ khi đun tan

-Nước không đạt chất lượng

-Pha tạp các thành phần khác

-Đo pH không đúng nhiệt độ

-Máy đo pH không được hiệu chuẩn Màu môi trường

thay đổi

42

-Quá nhiệt

-Nước không đạt chất lượng

-Môi trường khô/thành phần không đạt CL

-Không đúng pH

-Pha tạp các thành phần khác

43

Môi trường

bị kết tủa

-Quá nhiệt

-Nước không đạt chất lượng

-Môi trường khô/thành phần không đạt CL

-Không đúng pH Môi trường

- Môi trường khô/thành phần không đạt CL

-Pha/tổng hợp không đúng công thức

- Bình chứa/ống đĩa không sạch

1 -BIỂU HIỆN BẤT THƯỜNG

CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Tính chọn lọc kém -Quá nhiệt

-Môi trường khô/thành phần không đạt CL

-Pha/tổng hợp không đúng công thức

-Chất bổ sung cho vào khi quá nóng hay không đúng nồng độ

2 - Tiêu chuẩn về nước, loại nước và ứng dụng của

từng loại nước trong phân tich theo TCVN 4851:1989

(ISO 3696:1987)

Nước tinh khiết dùng cho các ứng dụng thông thường như pha chế hoá chất, pha loãng mẫu, pha dung dịch đệm, cấp nước cho các máy phân tích sinh hoá, huy ết học, miễn dịch…

Loại 1

Độ dẫn điện = 0,055 µS/cm

“Siêu tinh khiết”

Nước siêu tinh khiết dùng cho những ứng dụng cao cấp như sắc ký lỏng (HPLC), sắc ký ion (IC), phổ hấp thu nguyên tử (AAS), ICP-

MS, sinh học phân tử

Nước tinh khiết (Nước RO) dùng rửa dụng cụ, cấp nước cho nồi hấp tiệt trùng, bể điều nhiệt, máy rửa dụng cụ…

Loại 2

0,055 µS/cm < Độ dẫn điện < 1 µS/cm

Loại 3

“Tinh khiết”

1 µS/cm < Độ dẫn điện < 5 µS/cm

Nước pha môi trường vi sinh:

- Đé dÉn ®iÖn : <0.25 uS/cm

- Tổng VSV hiÕu khÝ 22 o C : <100 CFU/ml (TCVN 6404)