Kỹ thuật nhân giống cây cọc rào (Jatropha curcas L.)

Tại Hội nghị quốc tế về năng lượng do APEC tổ chức từ ngày 29/4/2005 tại Vancouver, Canada, NLSH Biofuel đã được chọn để sử dụng trong ngành năng lượng cũng như ngành giao thông vận tải

A. MỤC ĐÍCH CHỌN ĐỀ TÀI

Hiện nay, do tình hình khủng hoảng năng lượng trên thế giới, vấn đề về

ô nhiễm môi trường toàn cầu ngày một gia tăng nên các nước đều có xu hướng đi tìm những nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ sạch hơn, an toàn và bền vững hơn, một trong số đó là nhiên liệu sinh học (NLSH) Đây

là dạng nhiên liệu có thểtái tạo được và để thay thế dần nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng bị cạn kiệt Nhiều quốc gia trong vòng 2 - 3 thập

kỷ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụng NLSH (xăng/diesel pha ethanol

và diesel sinh học), thay thế một phần xăng, dầu khoáng, tiến tới xây dựng ngành “xăng dầu sạch” ở quốc gia mình Hiện có khoảng 50 nước trên thế giới khai thác và sử dụng NLSH ở các mức độ khác nhau Nhìn chung, các nước trên thế giới đi theo hai hướng phát triển NLSH: ethanol nhiên liệu, được sản xuất chủ yếu từ ngô (Mỹ), mía đường (Brazil), sắn (Thái Lan), còn diesel sinh học (hay còn gọi là biodiesel) sản xuất từ cải dầu, hướng dương (châu Âu), cọ dầu (Đông Nam Á), dầu mỡ phế thải, Jatropha curcas L., tảo, (Đặng Tùng, 2007) Diesel sinh học nguồn gốc động thực vật được sản xuất năm 2005 đạt 4 triệu tấn và dự kiến đến năm 2010 sẽ tăng lên đến 20 triệu tấn Tại châu Âu , nhiều công ty đã nghiên cứu sản xuất diesel sinh học từ dầu đậu nành, dầu hạt cải, dầu hướng dương Các nước như Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha, Áo, Đan Mạch

đã đầu tư rất nhiều vào các chương trình NLSH Cây Cọc rào – Jatropha curcas L (JCL) hay còn được gọi là cây Dầu mè, Dầu lai, (tên tiếng Anh: Physic nut) thuộc họThầu dầu (Euphorbiaceae) Cây có nguồn gốc châu

Mỹ và được người dân nơi đây sử dụng như một loại dược liệu Cây dạng bụi, lưu niên, có thể cao tới 5m Đây là loài cây đa mục đích, tất cả các phần của cây đều có giá trị sử dụng Tuy nhiên, sản phẩm quan trọng nhất vẫn là hạt lấy dầu cho sản xuất diesel sinh học Cây JCL đã du nhập vào Việt Nam từ rất lâu, được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, trồng làm hàng rào và hạt được sử dụng để thắp sáng JCL có những ưu điểm về

điều kiện gây trồng, năng suất, hàm lượng dầu, về lợi ích môi trường và kinh tế và gắn chặt với đời sống và thu nhập cộng đồng nông thôn Chính

vì thế cây JCL đã được chọn là một trong các cây trồng để sản xuất dầu diesel sinh học – biodiesel (Saxena, 2007) JCL được biết đã có mặt tại Việt Nam, tuy nhiên năng suất hạt và hàm lượng dầu chưa được khảo sát đánh giá Hơn nữa, cho đến nay đã có rất nhiều giống cây JCL đã được chọn tạo và đưa vào thương mại hóa tại nhiều quốc gia như Ấn Độ, Brazil, Malaysia, Thái Lan, Việc nghiên cứu khảo nghiệm tính thích ứng của giống, so sánh đánh giá để tìm ra những giống phù hợp với điều kiện của nước ta là công việc trước tiên, kế đó là tìm biện pháp nhân nhanh giống cây JCL Đối với cây JCL có thể nhân giống hữu tính bằng hạt và nhân giống vô tính bằng giâm hom, nhân giống in vitro

Với những giá trị mà cây cọc rào mang lại cho nền kinh tế của nước ta, giúp giải quyết một phầnvề vấn đề ô nhiễm môi trường và sự thiếu hụt năng lượng thì việc mở rộng trồng cây cọc rào (Jatropha curcas L.) tại Việt Nam là vấn đề đáng được quan tâm Để cung cấp số lượng lớn giống cây trồng thì ta cần phải áp dụng các kỹ thuật nhân giống nào.

Đề tài: Kỹ thuật nhân giống cây cọc rào (Jatropha curcas L.) mà

nhóm chọn giúp tìm hiểu rõ hơn về đặc điểm sinh học, giá trị cây cọc rào

mà nó đem lại và đặc biệt là các kỹ thuật nhân giống, kỹ thuật trồng giúp đem lại nguồn giống lớn để mở rộng việc phát triển trồng cây cọc rào (Jatropha curcas L.) ở nước ta.

B. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I. Sơ lược về các đặc điểm của cây Cọc rào I.1 Phân loại khoa:

Phân họ: Crotonoideae

Tông: Jatropheae

Chi: Jatropha

Loài: Jatropha curcas L.

Jatropha theo tiếng Hi Lạp: iatros (bác sĩ) và trophe (thực phẩm)

I.2 Nguồn gốc và phân bố

Chi Dầu mè (danh pháp khoa học: Jatropha) là một chi của khoảng175 loài cây thân mọng, cây bụi hay cây thân gỗ (một số có lá sớm rụng, như dầu mè (Jatropha curcas L.) Các loài trong chi Jatropha có nguồn gốc từ Trung Mỹ, và đã được du nhập vào nhiều khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới khác, như Ấn Độ, châu Phi, Bắc

Mỹ, Xuất phát từ khu vực Caribe, chúng được các thương nhân Bồ Đào Nha đưa vàochâu Phi và châu Á như là các loài thực vật có giá trị làm hàng rào Các cây trưởng thành mang các cụm hoa đực và cái khá đẹp mắt đồng thời chúng lại không mọc quá cao.

Cây Jatropha curcas L., thuộc chi Jatropha, họ Thầu dầu Chi Jatropha có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, ghép từ hai chữ Iatrós (bác sĩ) và trophé (thức ăn), ám chỉ công dụng làm thuốc của cây này Curcas là tên gọi thông thường của cây Physic nut ở Malabar, Ấn Độ Tên thông dụng ở các nước hiện nay là Jatropha, ở Việt Nam gọi là cây Cọc giậu, Cọc rào, Cây li, Ba đậu nam, Dầu mè,…(Nguyễn Công Tạn, 2008).

Loài JCL dại phân bố nhiều ở vùng thung lũng á nhiệt đới khô nóng và vùng rừng mưa nhiệt đới ẩm, thường ở vùng đồi núi, đất dốc thung lũng

có độ cao 700-1600 m so với mực nước biển

JCL là một loài cây có lịch sử 70 triệu năm, nguồn gốc từ Mexico (nơi duy nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ, được người Bồ Đào Nha đưa qua CapeVerde, rồi lan truyền sang châu Phi, châu Á, sau đó được trồng ở nhiều nước, trở thành cây bản địa ở khắp các nước nhiệt

đới, cận nhiệt đới trên toàn thế giới (Nguyễn CôngTạn, 2008).

I.3 Đặc điểm hình thái – Đặc tính sinh học

(Hình a)

(Hình b)

(Hình c)

(Hình d) Ảnh : Cây Cọc rào (a) và một số bộ phận chính của cây

(b – hoa; c – quả; d – hạt)

Hình : Hình thái cây Jatropha curcas L.

a - cành đang ra hoa; b - vỏ cây; c - gân lá; d - hoa có nhuỵ; e - hoa có nhị;

f - mặt cắt ngang của quả xanh; g - quả; h - mặt cắt dọc của quả

(Hình a, c và f từ Aponte năm 1978; Hình d và e từ Dehgan năm 1984)

(Nguyễn Công Tạn, 2008)

JCL là cây gỗ nhỏ, có thể cao đến 5 m Cành xòe, có nhựa mủ, trên cành

có những vết sẹo Thân, vỏ, lá có nhựa nhớt, không màu Lá mọc so le, hình trái xoan, hơi tròn, chia 5-7 thùy nông với chiều dài và rộng khỏang

6-15cm Phiến lá dạng giấy lụa (Nguyễn Công Tạn, 2008) Cụm hoa tận cùng có màu vàng Hoa đơn tính, cùng gốc,đôi khi có hoa lưỡng tính Bộ nhị 10, xếp thành hai vòng riêng biệt, mỗi vòng 5, tạo thành cột đơn gần nhau Bộ nhụy có 3 vòi nhụy, dính với nhau ở khỏang 2/3 chiều dài,phần trên rời nhau và núm nhụy rẽ đôi (Dehgan và Webster, 1979) Quả non hìnhtrứng, lúc chín màu vàng, sau nâu xám, chứa hạt màu đen Thông thường, có 5 rễ được tạo ra khi hạt nảy mầm, một rễ chính và 4 rễ phụ Nếu trồng bằng phương pháp thông thường thì cây không có rễ cái (Nguyễn Công Tạn, 2008).

Cây JCL ưa ánh sáng, ưa khí hậu ấm áp, chịu khô hạn, có thể sống trong môi trường có lượng mưa trung bình năm 520-2000 mm, nhiệt độ bình quân năm 11-28oC.

Cây chịu được đất xấu, đất sỏi, đất đá vôi bạc màu Cây JCL nảy chồi rất

dễ, có thể giâm hom, nếu trồng bằng hạt, cây có rễ chính và rễ ngang, nếu giâm hom thì không có rễ chính.

Nói chung, sau khi trồng 3 năm, cây cao 3 m Với cây thực sinh, sau trồng 3-4 năm thì kết trái Thời gian ra quả bình thường là 6-20 năm, ít thấy hiện tượng ra quả cách năm Ra hoa từ tháng 3 đến giữa tháng 4, thời gian ra hoa kéo dài 4-5 tháng, chín vào tháng 8-9, quả khó rụng.

II. Mục đích trồng và ưu điểm nhận thấy của cây cọc rào

II.1 Mục đích trồng

Công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học (biofuel) đã phát triển từ lâu trên thế giới và đang là xu hướng sản xuất nhiên liệu thay thế của tương lai Đến nay, trên quy mô nhỏ nhưng Việt Nam đã bước đầu thử

nghiệm thành công chiết xuất dầu diesel từ hạt cây Cọc rào với tỷ lệ dầu đạt 32-37% dầu (Du, 2006)

Tuy nhiên, ở nước ta Cọc rào chủ yếu được trồng phân tán và không vì m

ục đích khai thác Mặt khác nhu cầu về nguồn nguyên liệu của cây này lại rất cao không chỉ ở trong nước mà trên cả thế giới, nên cần phải trồng C

ọc rào tập trung trên quy mô lớn Trong khi chưa có các biện pháp gây tr ồng thích hợp nhằm tiến tới trồng kinh doanh quy mô lớn

Nguyên nhân là do lá rụng vào mùa đông tạo thành lớp thảm thực vật, c

hất hữu cơ do lá rụng tăng cường hoạt động của giun đất xung quanh vù

ng rễ

cây, do đó cải thiện độ phì và khả năng dự trữ nước cho đất Vì vậy, khôn chỉ cho hiệu quả về kinh tế, cải thiện đời sống người dân tại các vùng đất bạc màu, phát triển cây Cọc rào còn góp phần phủ xanh những vùng

đồi khô hạn, cải tạo đất, bảo vệ môi trường (Tường, 2006 ; Satish,

2006)

II.2 Một số ưu điểm nhận thấy của cây Cọc rào:

• Năng suất dầu thu được trên 1ha lớn do cây có khả năng tạo hạt có

hàm lượng dầu cao

• Có thể trồng trên những vùng có lượng mưa thấp (500mm/năm) và có vấn

đề về đất ở những vùng có lượng mưa cao hơn hoặc được tưới nước thì năng suất đạt được còn cao hơn Vì thế có thể trồng ở hầu khắp các vùng ,

có thể sinh trưởng được trên vùng đất hoang hóa, sa mạc khi có sự hỗ

trợ về nước tưới

• Cọc rào là cây dễ gây trồng, sinh trưởng tương đối nhanh và mạnh mẽ

• Có thể sinh trưởng được trên các loại đất thuộc lưu vực sông, độ màu

• Cây Cọc rào không làm thức ăn cho động vật

• Do hàm lượng N cao nên được làm nguồn dinh dưỡng cho cây trồng

• Cây cho năng suất 0,4 tấn hạt/năm trong năm đầu tiên, tăng lên 5 tấn

hạt/

ha sau 3 năm

• Cây bắt đầu cho sản lượng hạt cao từ năm thứ 2 trở đi

• Chỉ trừ chi phí cho phân bón và vận chuyển, các công việc khác như trồ

ng cấy, chăm sóc, thu hái đều thuộc lao động giản đơn

• Nhiều bộ phận khác nhau của cây có giá trị về dược liệu: vỏ cây chứa

tanin, hoa hấp dẫn ong mật và do đó cây có tiềm năng cho tạo mật ong

• Vì là thực vật, một phần nữa do sinh trưởng nhanh Cọc rào sẽ

hấp thụ

cácbon từ khí quyển, dự trữ trong các mô sống và tích lũy trong

phần cacbon của đất, do đó đây là loài rất thân thiện với môi trường

• Có thể tạo cây con từ hạt sau 3 tháng hoặc bằng nhâm hom

Nhân hom bằng cành dễ dàng và đạt được sự sinh trưởng nhanh

• Cây trồng không yêu cầu khắt khe về loại đất.

Từ những lý do trên, phát triển trồng rừng cây Cọc rào sẽ đáp ứng được

2 yêu cầu cơ bản: cung cấp nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học

(biofuel) trên quy mô lớn, phủ xanh và cải tạo những vùng đất hoang

hóa nghèo kiệt khó khai thác Bên cạnh đó cây Cọc rào còn có thể trở

thanh đối tượng tiềm năng cho trồng rừng theo cơ chế phát triển sạch

2010 tăng lên 5,75% và năm 2020 là 20%.

Tháng 8/2004, Hội nghị các nước Châu Á mở rộng tổ chức tại Băng Cốc Thái Lan đã ra tuyên bố 8 điểm về sự hợp tác chia sẻ kinh nghiệm cùng nhau phát triển NLSH dùng cho giao thông vận tải.

Tại Hội nghị quốc tế về năng lượng do APEC tổ chức từ ngày 29/4/2005 tại Vancouver, Canada, NLSH (Biofuel) đã được chọn để sử dụng trong ngành năng lượng cũng như ngành giao thông vận tải của các nước APEC trong lộ trình sản xuất nhiên liệu thay thế dần cho xăng dầu khoáng.

27-Việc nghiên cứu sử dụng NLSH giờ đã trở thành xu thế phát triển tất yếu

ở nhiều quốc gia trên toàn cầu để thay thế dần xăng dầu khoáng trong các thập kỷ tới.

Dự báo ở cuối thế kỷ 21, năng lượng tái tạo (mặt trời, gió, địa nhiệt, thuỷ điện nhỏ, nhiên liệu sinh học) sẽ chiếm trên 50% của năng lượng thương mại (Đặng Tùng, 2007).

Để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đảm bảo an ninh năng lượng lâu dài

và phát triển bền vững, nhiều quốc gia trong vòng 2 - 3 thập kỷ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụng NLSH (xăng/diesel pha ethanol và diesel sinh học), thay thế một phần xăng, dầu khoáng, tiến tới xây dựng ngành

“xăng dầu sạch” ở quốc gia mình Hiện có khoảng 50 nước trên thế giới khai thác và sử dụng NLSH ở các mức độ khác nhau Nhìn chung, các nước trên thế giới đi theo hai hướng phát triển NLSH: ethanol nhiên liệu, được sản xuất chủ yếu từ ngô (Mỹ), mía đường (Brazil), sắn (Thái Lan), còn diesel sinh học sản xuất từ cải dầu, hướng dương (châu Âu), cọ dầu (Đông Nam Á), dầu mỡ phế thải, JCL, tảo,

Năm 2003 toàn thế giới đã sản xuất khoảng 38 tỷ lít ethanol thì đến năm

2005 đã sản xuất được 50 tỷ lít ethanol (trong đó 75% dùng làm NLSH)

và dự kiến đến 2012 là khoảng 80 tỷ lít ethanol Diesel sinh học nguồn gốc động thực vật được sản xuất năm 2005 đạt 4 triệu tấn và dự kiến đến năm 2010 sẽ tăng lên đến 20 triệu tấn.

Tại châu Âu , nhiều công ty đã nghiên cứu sản xuất diesel sinh học từ dầu đậu nành, dầu hạt cải, dầu hướng dương Các nước như Anh, Pháp, Đức,

Tây Ban Nha, Áo, Đan Mạch đã đầu tư rất nhiều vào các chương trình NLSH.

Giáo sư Klause Becker ở Đại học Stuttgart đã nhận đơn đặt hàng của Tập đoàn ô tô Daimler Chrysler của Đức nghiên cứu về cây JCL Giáo sư cho biết, cách đây 15năm, ông là một trong những người đầu tiên ở châu Âu cùng với một hãng tư vấn của Áo đã tiến hành nghiên cứu cây JCL ở Nicaragoa Loài cây này đã có cách đây 70 triệu năm nhưng chẳng được

ai quan tâm Sau khi có dự án của Daimler Chrysler, đã dấy lên cơn sốt JCL trên toàn thế giới.

Dầu diesel sinh học từ JCL đã được sử dụng vào các loại xe thông thường.

Dự báo đến năm 2030, xe ôtô trên toàn thế giới từ 500 triệu chiếc hiện nay lên 900 triệu chiếc, trong đó Trung Quốc có tới 190 triệu chiếc Diesel sinh học từ JCL là loại dầu cháy một cách sạch sẽ và sạch hơn bất kỳ một loại chất đốt diesel nào khác Cây JCL trồng được trên đất bị thoái hóa, sau 10 – 15 năm, có thể tái sử dụng diện tích này để trồng các loại cây khác vì cây JCL đã chặn đứng được tình trạng rửa trôi GS Klause Becker còn cho rằng: “ Ai có thể nói lên được những cái xấu, cái bất lợi của cây JCL,

tôi xin thưởng tiền cho người đó Các vị có thể vặn vẹo đủ thứ, lật ngược, lật xuôi, nhưng quả thật các vị không thể bới móc được điều gì xấu liên quan đến loại cây này” (Nguyễn Công Tạn, 2007).

Về hiệu quả giảm ô nhiễm môi trường, theo ông Boon thoong Ungtrakul, phụ trách dự án sản xuất dầu diesel sinh học tại Chieng Mai, Thái Lan cho biết, nếu sử dụng B100 (100% diesel sinh học), lượng khí thải giảm 50% so với diesel truyền thống, còn B20 (20% diesel sinh học + 80% diesel truyền thống), lượng khí thải giảm 20%.

Dầu diesel sinh học nói chung và dầu diesel sinh học từ hạt cây JCL nói riêng đã bắt đầu được sử dụng khá phổ biến ở các dạng B5, B10, B20, B30 và thậm chí B100 tại các nước như Đức, Anh, Tây Ban Nha, Mỹ, Ấn

Độ, Brazil,… Đặc biệt Đức lànước đi đầu, dẫn đầu về thị phần sản xuất và

sử dụng dầu diesel sinh học trên thế giới, chiếm 50% Gần đây nhất tại Anh, tàu hỏa cao tốc đầu tiên trên thế giới chạy bằng diesel sinh học (B20) có tên Virgin Voyager đã được đưa vào hoạt động (thisisdorset.net 2007).

Hiệu quả kinh tế của cây JCL được đánh giá là khả quan Ở Ấn Độ, trồng JCL trên vùng đất khô cằn, 1 cây cho 5 – 6 kg hạt, 1 ha trồng 2500 cây có thể đạt năng suất trên 10 tấn hạt/ha/năm Với hàm lượng dầu của hạt 38%, thì 1 ha JCL có thể sản xuất được 4,5 tấn dầu/năm Với giá bán hạt tính ra 2000 VND/kg thì giá trị thu được trên 1 ha đạt 20 triệu VND/năm Ở Trung Quốc, doanh nghiệp ký hợp đồng mua hạt JCL của nông dân với giá 1,6 NDT/kg, tức khoảng 3500 VND/kg Như vậy, với năng suất 10 tấn hạt/ha/năm thì 1 ha JCL đạt doanh thu tới 35 triệu VND/năm.

Cây JCL trồng được trên mọi loại đất, kể cả vùng sa mạc nóng bỏng ở Ai Cập, JCL vẫn phát triển tốt Ở các vùng đất dốc, đất nghèo kiệt, không trồng được các loại cây nông nghiệp khác, cây JCL vẫn phát triển tốt Chu

kỳ kinh tế của cây này là 30 – 50 năm Cây JCL còn cho sản phẩm phụ là phân hữu cơ, thức ăn chăn nuôi giàu đạm(sau khi khử độc), làm dược liệu, nuôi tằm lá sồi (Nguyễn Công Tạn, 2007).

Các nước nhiệt đới, á nhiệt đới đang phát triển mạnh cây JCL Thái Lan hiện có 1600 ha JCL, dự kiến sẽ tăng lên 320 nghìn ha trong vài năm tới Indonesia đặt mục tiêu đến năm 2010, nhiên liệu sinh học đáp ứng 20% nhu cầu năng lượng trong ngành điện và giao thông vận tải Ở nước này, các loại đất màu mỡ đều dành để trồng cây Cọ dầu, còn cây JCL sẽ trồng trên các loại đất khô cằn nhưng mức đầu tư chỉ bằng 10% sovới cây Cọ dầu Nhà khoa học Robert Manurung, Giám đốc Trung tâm nghiên cứuCông nghệ sinh học thuộc Viện Công nghệ Bandung cho biết, một số công ty nước ngoài đang xúc tiến dự án bao tiêu 1 triệu ha JCL với nông

dân của 3 tỉnh Papua, Kalimantan và Nusa Tenggara Mới đây, một công

ty Hà Lan đã đặt mua 1 triệu tấn dầu JCL nguyên chất Manurung và nhiều nhà nghiên cứu khác ở Indonesia dự báo rằng, JCL sẽ sớm soán ngôi cây Cọ dầu, trở thành nguồn năng lượng có khả năng thay thế nhiên liệu hóa thạch và dầu cọ, đồng thời có thể giúp nông dân nghèo ở các tỉnh miền đông quanh năm khô hạn có cơ hội làm giàu Theo Ủy ban quốc gia về nghiên cứu phát triển NLSH từ cây JCL của Indonesia, Chính phủ nước này có kế hoạch dành ít nhất 5 triệu ha đồi trọc lập các đồn điền trồng JCL, mía đường và sắn để sản xuất các loại NLSH.

Ấn Độ đã xác định JCL là cây cho hạt có dầu thích hợp nhất để sản xuất diesel sinh học Từ năm 2001, nhiều bang ở Ấn Độ đã có chương trình khuyến khích trồng JCL trên quy mô lớn ở các vùng đất hoang hóa, được nhà nước hỗ trợ giống và các nguồn vật tư đầu vào nhằm tạo việc làm, xóa đói giảm nghèo, phát triển bền vững xã hội nông thôn Ấn Độ Cơ quan kế hoạch của Chính phủ Ấn Độ đặt chỉ tiêu trồng 11 triệu ha cây JCL vào năm 2012 để có đủ nguyên liệu sản xuất diesel sinh học phối trộn theo tỷ lệ 20% Trong tương lai, Ấn Độ tiếp tục mở rộng trồng JCL trên phạm vi cả nước, đưa diện tích trồng trên 33 triệu ha, trong số hơn 133 triệu ha đất đang bị bỏ hoang

Myanma là nước phát triển trồng JCL với tốc độ nhanh Đến 2006, diện tích trồng JCL ở Myanma đã đạt 800.000 ha Trung Quốc là nước quan

tâm phát triển mạnh JCL trong vài năm gần đây, chủ yếu là 7 tỉnh gồm

Tứ Xuyên, Quý Châu, Vân Nam, Phúc Kiến, Quảng Tây, Quảng Đông và

đảo Hải Nam; trong đó, ở khu tự trị Quảng Tây, đến cuối năm 2007 đã

trồng

được 15 nghìn ha, dự định đưa lên khoảng 10 vạn ha trong vài năm tới

Các tỉnh khác có điều kiện đã có kế hoạch trồng JCL trên quy mô lớn

trong mấy năm tới.

Theo ước tính của Giáo sư Klause Becker, cho đến nay, cả thế giới đã

trồng

được khoảng 5 triệu ha JCL Hiện nay, có khoảng 1000 nhóm nghiên cứu

về diesel sinh học và JCL Cho đến thời điểm này, JCL vẫn là một cây dại,

mới được đưa vào đối tượng cây trồng được khoảng trên 15 năm, cũng

có thể coi JCL là cây nông nghiệp trẻ nhất trong lịch sử trồng cây nông

nghiệp của loài người.

III.2 Việt Nam

Nhu cầu sử dụng năng lượng của Việt Nam ngày càng gia tăng nhanh

chóng, tương thích với tốc độ phát triển kinh tế và sự phát triển dân số

Sản lượng năng lượng nước ta tiếp tục tăng cao Năm 2005 đã tiêu thụ

gần 27 triệu tấn dầu qui đổi, dự đoán tăng lên đến gần 37 triệu tấn vào

năm 2010 và 51 triệu tấn vào năm 2020 Trong đó, ngành công nghiệp có

tỷ lệ sử dụng năng lượng cao nhất chiếm 46%, vận tải chiếm 35%,

thương mại dịch vụ chiếm 12%, nông nghiệp chiếm 1% và các ngành

khác chiếm 6%.

Việt Nam là một nước được thiên nhiên ưu đãi, hội đủ các nguồn tài

nguyên năng lượng Tuy nhiên, khả năng khai thác, chế biến và sử dụng

nguồn tài nguyên năng lượng còn hạn chế Theo phân tích tình hình phát triển kinh tế và các nguồn cung cấp năng lượng, dự kiến trong thời gian tới (tính đến năm 2020) nước ta tiếp tục phải nhập khẩu các sản phẩm

dầu mỏ, trong khi giá dầu luôn có áp lực rất lớn đến phát triển kinh tế

(Thái Xuân Du, 2007).

Để giải quyết vấn đề này, nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất NLSH

đã được tiến hành: sản xuất diesel từ đậu tương, vừng, dầu phế thải; sản xuất ethanol từ mía, ngô, lúa, sắn, Việc nghiên cứu và sản xuất nhiên

liệu sạch sử dụng cho giao thông vận tải đã được giao cho một số cơ

quan như Petrolimex, Petro Việt Nam, Đại học kỹ thuật Đà Nẵng, và đã

có kết quả ứng dụng bước đầu đáng khích lệ.

Trong năm 2007, đề tài “Nghiên cứu gây trồng phát triển cây Cọc rào

(Jatropha curcas)” do Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện

Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện (2007 – 2010) đã thu thập

được 8 xuất xứ hạt JCL và tuyển chọn được 29 cây trội với các đặc tính

vượt trội về sinh trưởng, năng suất hạt (2,8-5,0 kg/năm) và hàm lượng

dầu trong hạt (25 – 39%).

Các vùng đã tiến hành khảo sát đánh giá là Đồng Nai, ĐăkLăk, Ninh

Thuận, Bình Thuận và Phú Thọ Các định hướng cho tiêu chuẩn lập địa,

chọn đất gây trồng trước hết tập trung cho các vùng đất cằn cỗi, suy

thoái, các vùng hoang hóa, đất cát khô hạn và thậm chí cả các vùng bãi

thải ô nhiễm Điều này sẽ đảm bảo là không cạnh tranh lấy mất đất canh tác nông nghiệp của dân, không ảnh hưởng tới vấn đề an toàn lương

thực tại các vùng triển khai dự án Ngược lại sẽ có tác động cải tạo môi

trường đất đai, và mang lại nguồn thu nhập ổn định cho cộng đồng

người nông dân thông qua việc gây trồng JCL.

Với tập hợp 8 xuất xứ thu thập được và 29 cây trội tuyển chọn được

trong năm 2007, đề tài đã xây dựng thiết lập vườn tập hợp các giống,

cây trội và tiến hành khảo nghiệm các xuất xứ tại Đại Lải, Ninh Thuận và Phú Thọ.

Các cây trội tuyển chọn rất có tiềm năng về năng suất hạt (2,8-5,0

kg/năm) và hàm lượng dầu béo Trung tâm đã ký văn bản thỏa thuận

hợp tác với Công ty Green Energy Vietnam (GEV) nhằm khảo nghiệm và

thử nghiệm cây trội và ứng dụng ngay các giống mới triển vọng nhất vào các dự án đầu tư sản xuất vùng nguyên liệu hàng nghìn ha tại Ninh

Thuận, Bình Định, Quảng Nam, Thừa Thiên Huế và Quảng Trị.

C. CÁC KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY CỌC RÀO

Với sự phát triển của công nghệ nhân giống, ngày nay có rất

nhiều cách để nhân giống cây cọc rào (Jatropha curcas L.) Gồm cả

phương pháp hữu tính và vô tính.

- Phương pháp hữu tính: nuôi trồng bằng hạt có hỗ trợ kỹ thuật.

- Phương pháp vô tính: phương pháp tách bụi, chiết cành, cắt đoạn thân, phương pháp cắt từng đoạn thân, hay cao hơn là kỹ thuật nhân giống

bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.

I. Kỹ thuật nhân giống hữu tính

I.1 Gieo ươm hạt

Trồng cây để khai thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt được sử dụng nhiều hơn Bởi những nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cây tạo thành từ nhân giống bằng giâm cành có đời sống ngắn hơn và khả năng chống hạn và bệnh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt Rễ của cây giâm cành phát triển yếu dễ bị gẫy đổ (Heller, 1996) Hạt trước khi đem gieo được lựa chọn là những hạt to, chắc, mẩy Hạt được ngâm nước qua đêm để làm tăng tỉ lệ nẩy mầm Hôm sau, hạt được gieo vào trong các bầu đất Hạt sẽ nẩy mầm sau khoảng 1 tuần và cây con có thể đem đi trồng sau 45 ngày Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thường

có 1 rễ cái và 4 rễ bên Cây trồng ngoài thực địa sẽ sinh sản sau khoảng 3 – 4 năm (Heller, 1996) Nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con không đồng nhất bởi cây cọc rào là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt có sự khác nhau về mặt di truyền Như xét tính trạng hàm lƣợng dầu trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có hàm lƣợng dầu trong hạt không ổn định, giao động từ 4 đến 40 % (Timir baran Jha và ctv, 2007) Trong khi kiểm tra chất lượng hạt giống là một việc khó khăn thì tỉ lệ sống và nẩy mầm của hạt thấp do đó nhân giống bằng phương pháp gieo hạt không thể đáp ứng đủ nhu cầy cây giống chất lượng tốt cho việc trồng cây trên qui mô công nghiệp.

- Trước khi gieo hạt, cần kiểm tra phần trăm hàm lượng dầu trong hạt mẫu Hàm lượng dầu khoảng 35% là đạt.

- Nên chọn những hạt phát triển tốt, không bệnh và những hạt lành để gieo.

- Nên chọn hạt đã thu hái không quá 3 tháng để có khả năng nảy mầm cao.

- Nên thu lượm hạt khi quả nang bắt đầu nứt vỏ Dùng hạt tươi sẽ nâng cao khả năng nảy mầm.

Hạt Cọc rào là loại hạt khô nên rất dễ bảo quản, tuy nhiên trong hạt có dầu nên thời gian lưu hạt có ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm Ngâm và lắc hạt giống trong nước 24 giờ trước khi gieo có tác dụng kích thích nảy mầm của hạt

Hạt nảy mầm kiểu epigial, khi hạt giống nứt nanh, gieo hạt vào túi bầu với phần rễ mầm (đầu núm hạt/phần trắng mới nhú ra từ hạt) hướng lên trên mặt đất (hướng về phía mặt trời) Đây là chỗ bắt đầu hình thành

rễ và được đặt hướng lên không khí, nhưng khi phát triển, nó sẽ uốn cong trở lại và đâm sâu vào đất Sau đó, trụ dưới lá mầm phát triển nâng hạt từ dưới mặt đất lên Việc đặt vị trí gieo hạt như vậy sẽ giúp sinh trưởng thân mạnh hơn và dẻo dai hơn

Ngoài ra, người ta còn dung cách: “Sôi” hạt, tức là ngâm hạt trong nước

ấm khoảng 40oC, trước khi gieo hạt Một lượng hạt thì 2 đến 3 lượng nước ấm Giữa khoảng thời gian ngâm nước và làm khô, nếu tách vỏ hạt thì tỷ lệ nảy mầm sẽ cao hơn là chỉ ngâm nước Khi màng hạt nứt sẽ xuất hiện rễ con mọc ra ngoài Sau 12 giờ ngâm nước, vớt hạt lên để xử lý KMnO4 nồng độ 0,5% trong 5-10 phút (hoặc dùng thuốc diệt nấm Belnat nồng độ 5% trong 10 phút), vớt lên ủ vài ngày cho nứt nanh rồi đem gieo thẳng vào ruộng hoặc cho vào bầu.

Hạt bắt đầu nảy mầm từ 3 ngày trở lên và hoàn toàn nảy mầm trong vòng 10 ngày.

Cây con 3 tháng tuổi có thể đem ra ươm trong bầu trồng hoặc trồng đại trà ngoài đồng.

Giống thành công bắt đầu với chất lượng con

giống tốt.

Nảy mầm của hạt giống phụ thuộc vào sự kết

hợp của nước, thoáng khí và nhiệt độ cao.

Ngâm trước, có khi không giúp cho sự nảy

mầm của hạt giống và thậm chí có thể có những tác dụng phụ Phân bón hoặc phụ gia khác làm ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm nhưng kích thích

tăng trưởng sau khi hạt nảy mầm thành cây con.

I.2 Phương pháp gieo hạt.

I.2.1 Gieo hạt trực tiếp trên đất

Gieo hạt trên đất là phương pháp rẻ nhất và dễ dàng nhất Tuy nhiên, mặc dù trồng trực tiếp và gieo hạt trực tiếp là phương pháp để giảm

thiểu chi phí trồng, những phương pháp này khá mạo hiểm.

1. Trong khoảng thời gian sáu tháng, ít nhất

ba tháng, cung cấp đủ nước để cây bắt đầu

ra rễ và hỗ trợ việc thành lập các cây con.

2. Trong năm đầu tiên, kiểm soát cỏ dại và các

cây trồng xen canh với nó

3. Mặc dù gia súc sẽ không ăn Jatropha, nhưng nó

có thể giẫm hư cây con

(Ảnh AVP Tanzania năm 2008)

Ngoài thực tế là gieo hạt trực tiếp chi phí thấp, nó

cũng tạo ra cây có rễ cái, đó là một lợi thế trong

mùa khô Tuyên bố này tuy nhiên vẫn phải được

chứng minh Mặc dù nó có vẻ hợp lý, hầu như không có bất kỳ bằng

chứng khoa học hoặc các thông tin khác ghi nhận rằng cây từ hạt giống

trực tiếp là vượt trội so với cây giống bằng cây con Trong thực tế, không

có nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng của hệ thống

rễ đến năng suất cây trồng.

I.2.2 Gieo hạt trực tiếp trong nền gieo trồng

(Ảnh của tác giả, Indonesia)

Phương pháp này có chi phí thấp, dễ thực hiện và dễ dàng thành công,

với điều kiện nền gieo trồng được chuẩn bị đúng cách

1. Nền gieo trồng nên được chuẩn bị với đất cát pha.

2. Đất phải được xới cho đến độ sâu ít nhất là 30 cm.

3. Lên luống, cần có hệ thống thoát nước phù hợp.

4. Nền gieo trồng nên được che phủ bằng rơm rạ (để bảo vệ chống lại

mưa) Cây Jatropha là cây ưa sáng, cung cấp có đủ nước, ánh sáng tốt

giúp cây con phát triển mạnh mẽ.

5. Những cây có thể được cấy ghép trong túi bầu sau 2-3 tuần hoặc sau

này (6-10 tuần) trực tiếp vào đất trồng

I.2.3 Gieo hạt trực tiếp trong túi bầu.

Hình ảnh chụp của tác giả Malaysia Đây là phương pháp tốt nhất để sản xuất cây giống Jatropha Tuy nhiên, chi phí đắt hơn các phương pháp trên, vì phải mua túi bầu, giá thể đất và chi phí vận chuyển đến khu vực trồng.

Gieo trong túi bầu nên được đặt gần khu vực đất trồng để giảm chi phí

vận chuyển và ảnh hưởng đến cây con.

1. Đặc biệt chú ý hỗn hợp có trong đất Đất chứa trong túi nên cần tơi xốp

để thoát nước tốt Loại bỏ những chất dinh dưỡng không cần thiết và

trong thực tế sẽ ảnh hưởng tiêu cực nảy mầm

Hỗn hợp của đất và cát và phân (1-1-1) thích hợp cho cây nẩy

mầm Phải đảm bảo nước và đất không chứa nồng độ muối cao.

Vật liệu có thể được sử dụng: cát, đất, phân, trấu, than bùn, than bùn

dừa,mùn dừa, mùn cưa…

2. Túi bầu không nên để quá lớn Khối lượng của khoảng 3/4 ltr là đủ để

cho phép các rễ để phát triển đủ Túi nhỏ hơn sẽ gây ra hệ thống rễ kém phát triển do bị hạn chế Nếu túi quá lớn sẽ ảnh hưởng đến rễ cây khi ta cấy ra ngoài đất trồng

3. Trong trường hợp hỗn hợp trong trong túi làm cho nước không thoát

được, tỷ lệ nảy mầm sẽ thấp

4. Cây có thể ở trong túi từ 6 tuần đến 3 tháng trước khi đưa ra trồng.

II. Kỹ thuật nhân giống vô tính

II.1 Nhân hom

Ở Nam Phi, người dân trồng cây dầu mè làm rào dậu hoặc trồng cây để chống xói mòn và bảo vệ đất thừờng sử dụng phương pháp nhân hom vì

ưu điểm của phương pháp này là nhanh chóng tạo được cây trưởng thành Cành được cắt từ các cây dầu mè đã trưởng thành cắm xuống đất, nếu được chăm sóc cẩn thận thì sau khoảng 2 đến 3 tháng là có được cây

đủ lớn để đem trồng Cây tạo ra từ phương pháp nhân hom sau khoảng 1 năm sẽ bắt đầu sinh sản (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006).

Cây Cọc rào có thể được nhân bằng cách cắt hom 20- 30cm và ra rễ trong thời gian rất ngắn Chất lượng ra rễ của hom thân bị ảnh hưởng lớn bởi

độ tuổi hom Tỷ lệ nảy mầm của hạt Jatropha curcas trong bảo quản cây

hom Cọc rào có ưu điểm là cho quả sớm ngay từ năm 1- 2, năng suất cao, tuy nhiên, khả năng chịu hạn kém hơn so với cây gieo từ hạt (không tạo

rễ cọc, chiều dài rễ bằng ½- 1/3 chiều dài rễ cây từ hạt (Mike, 006), khả năng kháng sâu bệnh kém.

Ưu điểm lớn nhất của phương pháp giâm hom có thể được lấy từ cây giống tốt, nguồn năng suất cao Có thể làm ra nhiều cây con mới

giống hệt nhau từ một cây mẹ hoặc một nhóm các cây bố mẹ được lựa

chọn để nhân giống.

Sử dụng phương pháp giâm hom trong nhiều túi là một cách tốt nhất để xây dựng một vườn ươm Jatropha curcas Có sự linh hoạt vào thời gian

trồng và cây con có thể được phân loại.Mất khoảng 6 -10 tuần để phát

triển một cây mới từ một hom (Hình ảnh Mallaysia)

Sử dụng các cành có đường kính tối đa 3-4 cm, dài 4-6 mắt Màu sắc của

gỗ nên có màu xám Gỗ màu xanh lá cây là cây non và dễ dàng bị tấn

công bởi nấm.Dùng dao sắc hoặc kéo để tạo một vết cắt sạch Không sử dụng một dao rựa bởi vì nó sẽ làm hỏng hom Cắt cành hơi nghiêng

Sau khi cắt, rửa hom trong nước với 1-2grams carbendazim / lít để bảo

vệ hom từ không bị tấn công của nấm (Việc này dễ dàng hơn và thực tế

hơn so với khử trùng dao hoặc kéo của bạn sau mỗi lần cắt với ethanol)

Để hom đã cắt trong bóng râm khoảng 1-2 giờ.

Trước khi trồng hom đã cắt vào trong túi đã chứa đất, dùng cây chọc

một lỗ nhỏ vào bầu đất.

Đặc biệt chú ý phải xử lí hỗn hợp đất Đất trong túi cần tơi xốp và thoát

nước tốt Hạn chế sử dụng nhiều chất dinh dưỡng không cần thiết có thể ảnh hưởng tiêu cực rễ Than bùn từ dừa là một nguyên liệu tốt, nhưng

tốn kém Hỗn hợp của đất và cát và phân theo tỉ lệ (1-1-1) Trước khi bắt đầu một vườn ươm lớn cần trồng thử trong các môi trường đất khác

nhau tại địa phương Vật liệu có thể được sử dụng: cát, đất, phân, trấu,

than bùn, than bùn dừa, than củi, mùn cưa.

Sau khi đặt hom, tưới phun sương Không cần ánh sáng mặt trời trực

tiếp những ngày đầu tiên (không có lá), đặt chúng trong một khu vực

bóng mờ trong 10 ngày tiếp theo và duy trì độ ẩm đủ cao, không phải

bằng cách tưới nước nhưng đặt chúng trong một nhà kính Độ ẩm càng

cao giúp ra rễ nhanh hơn các rễ

Trong các thử nghiệm người ta cắt với các đường kính khác nhau Theo

Đại học lâm nghiệp và viện nghiên cứu Tamil Nadu tại Ấn Độ kết luận

kích thước của cành giâm không có ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng

cuối cùng sau khi cấy

4 tháng sau khi trồng(cm )

6 tháng sau khi trồng(cm )

gia tăng chiều cao%

Việc sử dụng các kích thích tố rễ.Thử nghiệm khác nhau đã được thực

hiện để nhận biết sự cần thiết các hormone cho sự phát triển của rễ Khi

có một bộ rễ tốt và điều kiện môi trường thích hợp, kích thích tố rễ không cần thiết.

II.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro

Tuy nhiên, do những biện pháp trên có nhược điểm là việc sử dụng hạt để nhân giống sẽ cho chất lượng giống không đồng đều, do cây JCL có khả năng giao phấn, hạt không duy trì được đặc tính di truyền tốt vốn có của

nó mà phôi của hạt nhiều khi bị biến dị, cho ra những cây kém chất lượng Chính vì vậy, để có số lượng lớn cây giống với chất lượng cây tốt, đồng nhất về mặt di truyền đáp ứng được yêu cầu mở rộng nhanh diện tích trồng cây JCL thì tốt nhất là sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro kết hợp với ex vitro

Năm 1995, M Sujatha và N Mukta đã phát triển kĩ thuật tái sinh cây dầu

mè từ nhiều bộ phận khác nhau của cây như phần trụ dưới lá mầm, cuống lá và lá Sự tạo thành chồi non bất định được chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trường MS bổ sung 2,22 M BA và 4,9 M IBA Sau đó mô sẹo được tái sinh gián tiếp trên môi trường MS bổ sung 0,44 M BA và

0,49 M IBA Chồi non hình thành được nuôi và tạo rễ trong môi trường

MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho đến khi phát triển thành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm.

Năm 2005, M Sujatha và các cộng sự đã thành công trong nhân giống in vitro cây dầu mè bằng phương pháp tạo cụm chồi Nghiên cứu đã tạo chồi non bằng cách nuôi nách lá cây dầu mè trên môi trường MS bổ sung TDZ nồng đô 2,3 – 4,5 % sau đó chuyển sang môi trường MS bổ sung IBA

và BA Hiệu quả tạo chồi cao 10 – 12,3 chồi/mẫu cấy Việc tạo chồi bất định từ lá thu được bằng cách nuôi mẫu lá trên môi trường bổ sung 8,9 – 44,4 M BA + 4,9 M indole-3-butyric acid (IBA) để tạo thành mô sẹo có màu trắng xanh, các chồi bất định sẽ được tạo thành sau khoảng 3 tuần sau đó chuyển sang môi trường bổ sung 8,9 M BA + 2,5 M IBA.

Phương pháp phát sinh phôi từ tế bào soma (somatic embryogenesis) một công cụ mạnh của nghành công nghệ sinh học để tạo giống cây trồng – đã được áp dụng thành công lần đầu tiên trên cây dầu mè bởi Timir baran Jha và các cộng sự (Timir baran Jha và ctv, 2007) Sự phát sinh phôi soma được tạo ra bằng nuôi mẫu lá trên môi trường MS có các chất kích thích sinh trưởng thực vật Kinetin và IBA, phôi được khích thích phát triển bằng cách bổ sung thêm adenine sulphate trong môi trường Các phôi soma chín sẽ tạo các cây non trên môi trường ½ MS Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 – 16 tuần Đây là nghiên cứu tiền đề cho những nghiên cứu về chuyển gen trên cây dầu mè về sau.

- Mục đích và yêu cầu nhân giống in vitro

- Mục đích: Nghiên cứu khả năng nhân giống nhanh cây dầu mè

(Jatropha curcas L.) in vitro nhằm tạo nguồn giống cây ban đầu sạch bệnh có tính đồng nhất về mặt di truyền đáp ứng yêu cầu cây giống phục vụ cho nhu cầu sản xuất.

o Vô trùng mẫu nuôi cấy để tạo nguồn nguyên liệu ban đầu

o Khảo sát môi trường khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy in vitro cây

o Khảo sát quá trình tái sinh cụm chồi cây dầu mè in vitro

II.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo

mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh, được phân chia và cấy chuyền

để nhân giống Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi và rễ (White và Nobercourt, 1939) Và các kết quả nghiên cứu

về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988)

Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ của các nhân tố nói

trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ.

II.2.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực vật Ở nước ta ngành này mới được chú ý và phát triển khoảng 15 – 20 năm trở lại đây Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển những cơ sở lý thuyết về

tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1996) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định:

- Đó là tính toàn thể của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện

và cả lai tạo giống cây trồng

- Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt).

- Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (khoai tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch, ).

- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm.

- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo - Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen.

- Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống.

- Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai.

- Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thể của tế bào.

Đồng thời việc nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước

ta từ nay tới năm 2010 là: tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1996).

II.2.3 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm sau: Nuôi cấy mô giống như nhân giống vô tính vì phương pháp này tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ về mặt di truyền Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống từ hạt So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất.

II.2.4 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Theo Trần Thị Dung (2003), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn:

Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống

in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả.

Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các

mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy

nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời

gian sinh trưởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh

chồi.

Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ

số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các

chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,…), các chất bổ

sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố

nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy,

người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm

chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi

giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường

ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi

riêng lẽ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm

hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.

Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng

của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng

dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dƣỡng,

do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng

như ruộng sản xuất.

II.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

II.2.5.1 Mô nuôi cấy

Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như:

Mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả

non…, khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hormon thích hợp đều

có khả năng tạo mô sẹo Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có

khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau

Do đó kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào

nuôi cấy Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có

vai trò quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được

kết quả, hoặc thu được những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí

cây có thể ngưng phát triển ở một giai đoạn nhất định (Nguyễn Đức

Lượng, 2002) Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu

nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi

bên và mô phân sinh đỉnh

II.2.5.2 Vô trùng trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và

vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân

chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau

vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy

sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần Khác với thí nghiệm vi sinh có thể

kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô

thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công Để đảm bảo điều kiện

vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:

- Vô trùng mô cấy

- Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy

- Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt

môi trường nuôi cấy

Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi

khuẩn, nấm Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng

các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy Các chất kháng sinh ít được sử dụng

vì tác dụng không triệt để và ảnh hưởng xấu lên sự sinh trưởng của mô

cấy Ngoài ra, người ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt

như: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn Street

(1974), đưa ra khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt

nấm khuẩn để xử lý mô cấy như sau (Trần Văn Minh, 2004):

Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt

nấm, khuẩn, với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trước khi xử lý cần

rửa sạch bằng xà phòng và nước máy Sau khi xử lý xong, mô cấy được

rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ

những phần bị tác nhân vô trùng trước khi đặt mô cấy lên môi trường

nhằm tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy (Trần Văn Minh, 2004).

II.2.5.3 Điều kiện nuôi cấy

nhiệt độ thích hợp cho Streptocapus là 120C (Appelyren và Heide, 1972), với nhiều loài cây Begonia nhiệt độ thích hợp là 15 – 240C (Heide, 1965;

Fonnesbad, 1974) Tuy nhiên nhiều đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ

cao, bởi vì nhiệt độ cao có thể làm cho chức năng kích thích tạo chồi của

Cytokinin giảm Hầu hết, những thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật được

thực hiện trong phòng thí nghiệm khống chế nhiệt độ, một vài loài cây

như Lily sự hình thành thể giò được thực hiện bằng tăng cường sử dụng chu kỳ nhiệt độ ngày và đêm Những người trồng cây công nghiệp cũng

sử dụng nhiệt độ để duy trì khả năng sinh trưởng khi yêu cầu nhiệt cho

cây non còn thấp Nuôi cấy ở ngăn lạnh làm giảm sinh trưởng và làm

giảm giá thành cần thiết do cấy truyền, những cây nuôi cấy này được di

chuyển từ ngăn lạnh đến nơi bắt đầu nhân chồi lại khi yêu cầu nhân

giống tăng (Hartmann và ctv, 1997)

 Ánh sáng:

Ảnh hưởng của ánh sáng có thể được chia ra trong sự tác động của

cường độ ánh sáng (bức xạ hoạt động quang hợp), thời gian chiếu sáng

(quang chu kỳ) và chất lượng ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển của

thực vật Cường độ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp,

ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố,

mức cường độ ánh sáng điển hình cho vi nhân giống là từ 40 – 80

μmol/m2/giây trong nuôi cấy vươn thân, nhưng cường độ ánh sáng bên trong các bình nuôi cấy có thể thấp hơn nhiều Kiểu nút đậy kín có thể

làm giảm sự truyền ánh sáng vào trong bình cấy, các loài cây khác nhau

thì yêu cầu mức độ ánh sáng khác nhau, biên độ ánh sáng này rất thấp so với bức xạ bên ngoài và trong nhà kính (600 – 1200 μmol/m2/giây) Bức

xạ ánh sáng cao hơn trong nuôi cấy dị dưỡng có thể làm mất diệp lục

(Chlorophyll) và hoại tử lá (Hartmann và ctv, 1997) Rất nhiều nghiên

cứu có hệ thống về tác động của quang chu kỳ trong sự phát triển mô

nuôi cấy, nhưng chiều dài ngày dài hơn từ 12 – 16 giờ thường là thích

hợp nhất Phản ứng quang chu kỳ của hoa có thể đƣợc tạo ra trong in

vitro, chồi cây cẩm chướng có thể ra hoa bằng cách xử lý 16 giờ chiếu

sáng, nhưng các thực vật còn lại chỉ 12 giờ là đã có thể ra hoa

(Hartmann và ctv, 1997).

Chất lượng ánh sáng là chức năng của đèn chiếu sáng trong nuôi cấy và

kiểu bình cấy được sử dụng Thông thường trong các phòng nuôi cấy mô

sử dụng đèn ánh sáng trắng hoặc ánh sáng trắng pha đỏ, chất lượng ánh sáng bị ảnh hưởng bởi chất lượng đường truyền của bình và kiểu nút

đậy Bình thủy tinh không truyền được ánh sáng có bước sóng ngắn hơn

290 nm, trong khi đó bình polycarbonate không truyền được ánh sáng có bước sóng ngắn hơn 390 nm, mặc dù đây là những số đo khác nhau,

nhưng ánh sáng có bước sóng quang trọng nhất cho quang hợp và sự

phát sinh quang hình thái là từ 400 – 800 nm Chất lượng ánh sáng cũng làm thay đổi phản ứng sinh trưởng của chồi in vitro Nuôi cấy cây phong

lữ (Pelargonium) trong ánh sáng đỏ làm tăng chiều dài chồi hơn so với

ánh sáng trắng, trong khi đó ánh sáng xanh làm giảm sự kéo dài chồi,

ngược lại khả năng quang hợp cao nhất khi chồi cây Bulo (Betula) đặt

trong ánh sáng xanh so với ánh sáng trắng hoặc đỏ, ánh sáng xanh cũng kích thích phát sinh diệp lục và gia tăng kích thước lá Người ta cho rằng

chất lượng ánh sáng là quan trọng trong giai đoạn thuần hóa cây non và

có thể bị kích thích bởi xử lý ánh sáng xanh trước khi di chuyển cây từ

nuôi cấy Chất lượng ánh sáng cũng có thể tác động gián tiếp lên sự phát triển chồi, là nguyên nhân làm các yếu tố môi trường phát triển trong

nuôi cấy thay đổi (Hartmann và ctv, 1997) Nhìn chung ánh sáng kiềm

hãm sự phát triển của rễ và có vài chỉ dẫn rằng ngăn không cho ánh sáng

từ vùng rễ thì có lợi cho việc hình thành rễ (Hartmann và ctv, 1997)

 Không khí:

Các chất khí có tác động lên sự phát triển chồi trong nuôi cấy in vitro bao gồm oxy, carbon dioxide và ethylene Các nhà trồng cây thương mại

không nỗ lực làm thay đổi mức không khí trong nuôi cấy, tuy nhiên tất cả

sự đóng kín và nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí được ở

một vài mức độ khác nhau, thường có sự thúc đẩy tăng trưởng thông

qua lỗ thông khí bị đóng kín hoặc cung cấp qua màng lọc trao đổi khí

(Hartmann và ctv, 1997).

II.2.5.4 Môi trường nuôi cấy

Trong tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần

chính sau đây:

- Các muối khoáng đa lượng

- Các muối khoáng vi lượng

- Các Vitamin

- Đường làm nguồn cacbon

- Các chất điều hòa sinh trưởng

Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần

xác định như acid amin, EDTA, hoặc không xác định như nước dừa, dịch

chiết nấm men…vào trong môi trường tùy theo nhu cầu riêng của từng

đối tượng nuôi cấy Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, có thể phân loại ra 3 môi trường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: White, Knop

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: B5, Gamborg

- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: MS (Mura shige – Skoog)

II.2.5.5 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy

Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng

sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết

đến các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác Chất điều hoà sinh trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát

triển và những quá trình sinh lý, hoá sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trường (Bùi Trang Việt, 2000)

 Auxin:

Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh

trưởng của ống phấn (Bùi Trang Việt, 2000).

Sự vận chuyển auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phân hoá, auxin giúp kéo dài và phân chia tế bào, các hiện tượng hướng động,

ưu thế ngọn, lão suy, rụng, đậu, tăng trưởng và chín của quả….(Nguyễn

Văn Kế, 2000) Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu Sự kéo

dài của tế bào rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi Hiệu ứng auxin giảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ưu và

trở nên độc ở các nồng độ quá cao Tất cả cây trồng đều tổng hợp được

chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo giai đoạn phát triển của chúng

Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần

nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm Một vài chất

này đã thể hiện các đặc tính tương tự như các đặc tính của chất auxin,

nhưng thường với các liều lượng thấp hơn, hơn nửa chúng ít bị kiểm

soát bởi các enzyme và có thể có một tác động kéo dài trong đó có NAA

Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí quan trọng, hai tính chất được nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế

bào và sự hình thành rễ (Trần Văn Minh, 2004) Auxin chẳng những kích thích sự tăng trưởng của chồi non mà còn khởi phát cho sự tạo mới Ở

nồng độ thấp và thường dùng kết hợp với cytokinin thì auxin khởi phát

mô phân sinh ngọn, vượt quá nồng độ giới hạn thì auxin ngăn cản sự

phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên (Bùi Trang Việt, 2000)

 Cytokinin:

Các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự

hiện diện của auxin Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự

hình thành chồi non nhưng lại ức chế sự tạo rễ (Dương Công Kiên, 2002).

Sự sinh trưởng tổng hợp Cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất

khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ) Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái

và trong rễ Tuy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất Vì vậy khi rễ bị tổn thương thì thấy nụ phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin Nó hoạt

hoá sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện trong sự phối hợp với

auxin (Trần Văn Minh, 2004) Trong nuôi cấy mô, cytokinin thể hiện các

tính chất cho phép chúng ta giải quyết những khó khăn trong việc duy trì

sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào

trong con đường phân hoá (Trần Văn Minh, 2004)

 Gibberellin:

Hiệu ứng chính của các gibberellin là kéo dài thân, kích thích sự kéo

dài lóng Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu

bì Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế

bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin Xử lý gibberellin làm tăng

năng suất mía cây và đường (do kích thích sự kéo dài lóng) Gibberellin

liều cao (hay phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá