BÁO cáo kỹ THUẬT NHÂN GIỐNG vô TÍNH cây TRỒNG

Như vậy bất cứ một tế bào nào cũng có thể phát triển thànhmột cây hoàn chỉnh và đó cũng là cơ sở của phương pháp nuôi cấy in vitro.Về mặt di truyền phân tử có thể nói rằng toàn bộ quá tr

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

II

III

MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI

Chùm Ngây có giá trị hết sức to lớn về dinh dưỡng và chữa bệnh lại là cây dễtrồng, rẻ tiền, dễ sử dụng nên Tổ chức Lương –Nông (FAO) và Tổ chức Y tế thếgiới (WHO) đã gọi Chùm Ngây là cứu tinh của loài người trong thế kỉ 21, cây củathế giới thứ ba, cây của người nghèo trên toàn thế giới Tiến sĩ Albert Sanchez -nhà khoa học Mỹ có nhiều đóng góp trong việc chữa trị ung thư bằng các sản phẩm

tự nhiên, đồng thời là nhà sáng lập tổ chức Cứu hành tinh (Saving the PlanetFoudation) hết sức tin tưởng vào cây Chùm Ngây.[3]

Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, những hiểu biết về cây Chùm Ngây dầndần đã được mở rộng trong giới nghiên cứu khoa học, kinh tế, nông thôn Tuynhiên vẫn chưa có dự án nào có quy mô rộng lớn đầu tư cho bảo tồn và khai tháctiềm năng kinh tế của cây Chùm Ngây.[3]

Thành phố Hồ Chí Minh là một trong những nơi tiêu thụ rau lớn nhất cả nướcnhưng hiện tại sự phổ biến của rau Chùm Ngây hầu như vẫn chưa được rộng rãi.Chùm Ngây gần như chỉ xuất hiện ở các hệ thống siêu thị lớn như Big C,Coopmart, Cửa hang rau sạch với giá thành khá đắt (10000-15000đ/100 gr) nênkhông nhận được nhiều sự quan tâm từ phía người tiêu dùng.[3]

Từ các lý do kể trên, bài viết này nhằm mục đích giới thiệu rộng rãi, nâng cao sựhiểu biết của mọi người về các giá trị dinh dưỡng cũng như dược học quý giá củacây Chùm Ngây Đồng thời giới thiệu một số kỹ thuật nhân giống, Kỹ thuật trồng-chăm sóc làm tiền đề cho các hướng nghiên cứu, bảo tồn, phát triển phổ biến câyChùm Ngây.[7]

GIỚI THIỆU CHUNG

Chùm Ngây-loài thực vật thân gỗ phổ biến nhất trong chi Chùm ngây với danh

pháp khoa học Moringa oleifera.Đây là một loài cây quý được biết đến nhiều nơi

trên thế giới Nó có xuất sứ từ vùng sơn cước Hy Mã Lạp Sơn tây bắc Ấn Độ vớilịch sử phát hiện và sử dụng hơn 4000 năm nay bởi các giá trị thực phẩm và dượchọc vô cùng quý giá của nó.[5]

Ở Việt Nam, cây Chùm ngây đã được phát hiện và mọc hoang từ lâu đời nhưngmãi cho đến năm 1989,ông Jaap T Brand (người Hà Lan)-điều phối viên của Ủyban Hợp tác Khoa học Kỹ thuật Hà Lan-Việt Nam khi ấy đang hợp tác với ViệnKhoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam nghiên cứu về cây khoai tây và thửnghiệm một số giống rau, sau chuyến đi Philipin đã mang về một giống rau có têngọi kalamonga (tên gọi khác của cây Chùm ngây) Ông đã tặng ông Trương VănHộ-kĩ sư của Viện 9 hạt kèm theo cả vỏ cây rau đó để trồng thử nghiệm Và quacác cuộc nghiên cứu sau đó thì các giá trị kinh tế to lớn của cây Chùm ngây mớiđược phát hiện và phát triển ở Việt Nam.[6]

Cây Chùm Ngây được Tổ chức WHO đánh giá là một loại cây hữu dụng bậc nhấtthế giới Bộ Y tế Việt Nam ngày 28/4/2011 đã có công bố trên cổng thông tin điện

tử và đánh giá “Chùm ngây là một loại cây “thần diệu” sẽ là cứu tinh của loàingười thế kỷ 21” Cây Chùm Ngây có rất nhiều công dụng thực tế qua kết quảnghiên cứu của lương y Nguyễn Công Đức(Đại học Y dược-2006) và một số nhàkhoa học như Lockett(2000), Fuglie LJ(1999) Chùm ngây chứa hơn 90 chất dinhdưỡng tổng hợp với nhiều giá trị thực phẩm và dược học khác nhau.[3]

Tuy nhiên ở Việt Nam, hiện nay hệ thống bảo tồn, gìn giữ, xây dựng, phát triểnnguồn gen và giống cây này vẫn chưa được phổ biến Do vậy, bài viết sau đâynhằm giới thiệu rộng rãi loài cây quý đến với đông đảo mọi người cũng như cungcấp một số thông tin khoa học cần thiết cho các tiền đề nghiên cứu xa hơn, chủ yếu

gồm các phần: Phân bố, giới thiệu cây giống, phân loại khoa học, kỹ thuật nhângiống (hữu tính và vô tính), kỹ thuật chăm sóc, các sâu bệnh hại thường gặp ở câyChùm ngây cũng như giá trị kinh tế của loài này.

Tên thông thường:

Africa

Benin: Patima, Ewé ilé

Burkina Faso: Argentiga

Cameroon: Paizlava, Djihiré

Chad: Kag n’dongue

Ethiopia: Aleko, Haleko

Ghana: Yevu-ti, Zingerindende

Asia

Cambodia: Ben ailéIndia: Sahjan, Murunga, Moonga Philippines: Mulangai

Sri Lanka: MurungaTaiwan: La Mu

Thailand: Marum

South and Central America,

Caribean

Brazil: CedroColombia: AngelaCosta Rica: Marango

English: Drumstick tree, (Horse) radish tree, Mother’s best friend, West Indian benSpanish: Ben, Árbol del ben, Morango, Moringa

French: Bèn ailé, Benzolive, Moringa

Riêng ở Việt Nam: Chùm Ngây

Nhà Phật gọi là cây Độ Sinh (Tree of Life )

Các nhà dược học, các nhà khoa học nghiên cứu thực vật học, dựa vào hàm lượng dinh dưỡng và nguồn dược liệu quí hiếm được kiểm nghiệm, đã không ngần ngại

đặt tên cho nó là cây Thần Diệu ( Miracle Tree) [3]

II PHÂN BỐ

Cây có khả năng phân bố rộng từ cận nhiệt đới khô ẩm đến vùng rừng ẩm.Bản địacủa cây Chùm ngây là ở vùng sơn cước Hi Mã Lạp Sơn ở Tây bắc Ấn Độ nhưngngày nay được trồng rộng rãi ở Châu Phi, Trung Mỹ, Nam Mỹ, và Đông Nam Á(Campuchia, Malaysia, Indonesia)

Bản đồ phân bố cây Chùm Ngây trên thế giới

Cây Chùm ngây (Moringa oleifera) có ở Việt Nam ta từ lâu đời (mọc hoang nhiều

nhất ở vùng đất cát khô ven biển Khánh Hóa, Ninh Thuận, Bình Thuận, PhúQuốc, ) nhưng cách đây vài chục năm khi hạt giống Chùm ngây được mang vềViệt Nam gieo trồng có mục đích và sau các cuộc nghiên cứu thì các giá trị kinh tếcủa nó mới được phát hiện [4]

Bản đồ phân bố cây Chùm ngây ở Việt Nam

III GIỚI THIỆU CÂY GIỐNG

Là loài cây thân gỗ, sinh trưởng nhanh, có khả năng tái sinh chồi và hạt mạnh.Códạng sống là cây phân cành thấp, cao từ 10-12m Cây thích hợp với nhiều loại đất

từ chua nhẹ đến trung tính, sinh trưởng tốt nhất trên đất pha cát, có thể chịu đượcđất sét, có khả năng chịu khô hạn tốt, chịu lượng mưa 480-4000 mm/năm, nhiệt độ18,7-28,5oC và pH 4,5-8

Rễ: Hệ thống rễ phát triển mạnh, nếu được trồng từ hạt, rễ cái phình to như củ,

màu trắng với hệ thống những rễ bên thưa, dài, đâm sâu, lan rộng Nếu trồng bằngcách giâm cành, hệ thống rễ sẽ không được như vậy

Thân: Có vỏ màu trắng xám, dày mềm, sần sùi, nứt nẻ, gỗ mềm và nhẹ Khi bị

thương tổn thân rỉ ra nhựa màu trắng, sau chuyển dần thành màu nâu

Lá: Lá kép lông chim 3 lần, lá trưởng thành có thể dài đến 45 cm, rộng 20-30 cm,

các lá phụ dài khoảng 1.2-2.5 cm, rộng 0.6-1 cm

Hoa: Hoa màu trắng hơi ngả vàng mùi thơm, to, cuống hoa dài 1-2cm, lá bắc hình

sợi Hoa có 5 lá đài nhỏ màu xanh, hình tam giác, 5 cánh hoa màu trắng, gần bằngnhau, lõm vào trong giống hình 1 cái muỗng, dài 1,5cm, rộng khoảng 0,5cm Bộnhị:gồm5 nhị thụ màu vàng xen với 5 nhị lép, nhị thụ nằm đối diện với cánh hoa,nhị lép nằm xen kẽ cánh hoa; bao phấn 2 ô, hướng ngoài Bộ nhụy: 3 lá noãn dínhvới nhau tạo thành 1 ô, đính phôi trắc mô; bầu noãn thượng

Quả: Quả nang treo, dài 25-30 cm (có khi đến 55 cm), màu xanh hơi gồ lên ở chỗ

có hạt, ngang 2-3 cm, có hình dáng giống quả đậu Cô ve, có 3 mảnh, dọc theo quả

có khía rãnh

Hạt: Khoảng 26 hạt/1 trái, Quả cho nhiều hạt tròn, màu nâu đen, đường kính

khoảng 1 cm, mỗi hạt có 3 gốc cạnh với những cánh mỏng màu hơi trắng, trọnglượng mỗi hạt khác nhau, trung bình khoảng 3000-9000 hạt/kg

Ở Việt Nam cây trổ hoa vào tháng 1-3.Cây ra hoa rất sớm, thường ra ngay trongnăm đầu tiên sau khoảng 6-8 tháng trồng và cho quả từ thân và nhánh.Cây khoảng

12 năm tuổi cho hạt tốt nhất Quả chín, hạt giống phát tán khắp nơi theo gió vànước, hoặc được mang đi bởi những động vật ăn hạt Trong điều kiện thuận lợi,cây sinh trưởng, phát triển nhanh, có thể tăng trưởng chiều cao từ 1-2 m/năm trongvòng 3-4 năm đầu Tuy nhiên trong một thử nghiệm ở Tanzania cây có thể cao 4,1

m trong năm đầu tiên.[3]

Dạng sống Lá

Chùm hoa Hoa

IV PHÂN LOẠI THỰC VẬT

Họ chùm ngây (Moringaceae R Br Ex Dumort.) chỉ có duy nhất một chi Moringa gồm 13 loài được chia thành 3 nhóm dựa vào hình dạng và nơi phân bố

Nhóm 1:

Đặc điểm: Cây lớn thân phình giống bình chứa nước, hoa nhỏ đối xứng tỏa tròn

Gồm:

- Moringa drouhardii, Moringa hildebrandtii phân bố ở Madagascar

- Moringa ovalifolia phâm bố ở Namibia và vùng cực Tây Nam Angola

- Moringa Stenopetala phân bố ở Kenya và Ethiopia

Nhóm 2:

Đặc điểm: Cây có thân mảnh mai, hoa màu sang, đối xứng song phương

Gồm:

- Moringa concanensis, Moringa oleifera: Phân bố ở Ấn Độ.

- Moringa peregrina: Phân bố ở Hồng Hải, Ả rập, Horn of Africa.

Nhóm 3:

Đặc điểm:Cây bụi, cây cỏ, hoa đối xứng song phương nhiều màu sắc

Gồm:

- Moringa arborea: phân bố ở Tây Bắc Kenya

- Moringa borziana: phân bố ở Kenya and Somali

- Moringa longituba phân bố ở Kenya, Ethiopia, Somali Moringa pygmaea: phân

bố ở Bắc Somalia

- Moringa rivae:phân bố ở Kenya and Ethiopia

- Moringa ruspoliana: phân bố ở Kenya, Ethiopia, Somali.

Trong đó 2 loài phổ biến nhất là: Moringa oleifera và Moringa stenoptala Chùm Ngây tên khoa học Moringa oleifera Lamk thuộc chi Moringa, họ

Moringaceae Trong đó, Moringa là tên chi, được Latin hóa từ tên bản xứ gốc tiếngTamil murungakkai, oleifera có nghĩa là chứa dầu, được ghép bởi gốc từ olei- (dầu)

và -fera (mang, chứa) Tên đồng nghĩa là Moringa pterygosperma Gaertn.

(pterygosperma: phôi có cánh, tên kháng sinh pterygospermin cũng từ đây mà có),

Guilandina moringa L., Moringa moringa (L.) Small

B KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG

I Nhân giống hữu tính:

1 Gieo hạt:

a Chuẩn bị hạt giống:

Kỹ thuật thu hái hạt giống:

Cây trồng trên 18 tháng bắt đầu ra hoa kết quả, độ tháng 02 hằng năm thì thu háitrái để làm giống Nên lấy giống từ những lâm phần hoặc cây mẹ trên 06 tuổi trởlên

Lưu ý trong thu hái, chọn trái đã già, to, tròn đều, màu vỏ chuyển từ màu xanhsang màu thẩm mốc, không lấy những trái đã nứt, hoặc có sâu đục hoặc bị bệnhnấm, không bẻ cả cành mà nên có dụng cụ thu hái để chọn những trái đạt yêu cầu

và giữ lại những trái chưa đạt để thu tiếp

Xử lí hạt sau thu hái:

Quả sau khi mang về phải phân loại, loại bỏ những quả nhỏ cùng tạp vật, phơi khô dưới nắng nhẹ 2-3 ngày.Khi thấy trái có hiện tượng nứt thì đưa phơi trong bóng mát.Không phơi trực tiếp ngoài nắng vì hạt có dầu sẽ giảm tỉ lệ nảy mầm Sau khi hạt đã bung ra hết khỏi trái thì sàng loại bỏ các tạp chất và thu hạt để đưa vào dụng

+ Hàm lượng nước sau chế biến: 8%

Bảo quản hạt giống (nếu cần):

- Bảo quản thường: đựng hạt vào thùng gỗ hoặc đựng trong các hộp nhựa có nắp hoặc túi PE hàn kín, bảo quản trong điều kiện môi trường bình thường có thể kéo dài sức sống của hạt đến 6 tháng, nhưng tỷ lệ nảy mầm giảm đến 20%

- Bảo quản ở nhiệt độ khô mát (10 độ C), ẩm độ của hạt khi đưa vào bảo quản từ 8-9% có thể duy trì sức sống của hạt đến 1 năm Tỷ lệ nảy mầm >75%, nhưng để sang nằm thì tỉ lệ nảy mầm còn 20-30%

b Kỹ thuật gieo ươm:

Kiểm nghiệm hạt giống:

- Ngâm trong nước ấm 45oC để nguội dần trong 10-12 giờ

- Nền kiểm nghiệm: trên giấy thấm hoặc trên cát

- Nhiệt độ : 25 – 30 oC

- Ánh sáng tự nhiên, hoặc ánh sáng điện

- Thời gian nẩy mầm sớm nhất: 3 ngày sau khi gieo

- Thời gian kết thúc nẩy mầm: 7 ngày sau khi gieo

Phương pháp xác định nhanh sức sống của hạt: mổ hạt những hạt chắc và nội nhũ màu trắng là những hạt còn sống, những hạt nội nhũ màu vàng hoặc xám là những hạt đã chết

- Ngâm hạt trong nước ấm (2 sôi + 3 lạnh) + 20 ml T2 – chế phẩm từ tỏi để diệt trừnấm bệnh, trong 24h.

- Sau 24h, vớt hạt ra, rửa sạch chất nhờn, cho vào vải ẩm để ủ, đặt túi hạt trongbóng tối, nếu mùa đông ở miền Bắc cần thắp bóng điện 100w để làm tăng tỉ lệ nảymầm của hạt

- Hàng ngày nhúng nước cho đạt độ ẩm

- Sau khi ủ 2 ngày cần kiểm tra và đảo hạt, đảo nhẹ nhàng cẩn thận tránh gãy mầm.Lựa chọn hạt nứt nanh, rễ nhú ra khỏi vỏ hạt đem gieo vào bầu

- Các hạt chưa nứt, đem rửa lại với nước ấm cho sạch nhớt, tiếp tục ủ Thôngthường sau 5 ngày thì hạt sẽ nẩy mầm hết

 Lưu ý: Nhiệt độ nẩy mầm tối ưu từ 30 độ C đến 35 độ C.

Cho hạt đã nảy mầm vào bầu:

- Công thức trộn bầu 1: 70/100 đất bột + 20/100 trấu hun + 10/100 phân chuồnghoại mục (có thể thay thế phân chuồng hoại mục bằng: 30g phân hữu cơ vi sinh,hoặc 150g phân giun quế cho 1 bầu )

- Giá thể gieo hạt phải được xử lý sát trùng, diệt trừ nấm hại: pha 200ml T2 +500ML chế phẩm EM5 trong bình 10 lít nước phun cho bầu đất, phun định kỳ 7-10ngày phun một lần

- Bầu gieo hạt: kích thước 14 x 16 là phù hợp,

- Hạt đặt vào bầu đất, rễ nằm ngang, phủ một lớp đất bột mỏng 1-2 cm lên phíatrên

Hoặc có thể ươm trực tiếp hạt vào bầu Vùi hạt vào bầu đã chuẩn bị với độ sâukhoảng 2-3 cm, ém đất nhè nhẹ, tưới nước cầm chừng, giữ ẩm và tuyệt đối không

để ướt sũng.[8]

 Ưu nhược điểm:

- Cây không giữ được đặc tính tốt từ cây mẹ

Các bước phát triển của hạt giống Chùm Ngây

II Nhân giống vô tính:

1 Giâm cành:

Chọn cành giâm: Chọn các nhánh từ cành chính trên những cây khỏe mạnh, lấy

đoạn từ gốc đến hết phần bánh tẻ, không lấy phần ngọn Gốc cành được ngâmtrong nước tránh cho cành mất nước

Cắt cành giâm: Chọn các đoạn thân cành có đường kính từ 2-3cm, cành được cắt

với chiều với chiều dài từ 10-15cm, mang 2-3 cặp lá, cắt bớt phiến lá Các vết cắtnên cắt xéo, tránh bầm dập

Ngâm cành giâm vào thuốc trị nấm: Sau khi cách ra từng đoạn cành nhúng cành

giâm vào thuốc trị nấm như: Rovral…theo liều lượng ghi trên bao bì của thuốc,thời gian ngâm 20-30 phút

Nhúng gốc cành vào thuốc kích thích ra rễ như: IBA, NAA, NAA+IBA(tỷ lệ 1:1),nồng độ kích thích tố thích hợp từ 2.000-3.000pm, và giâm ngay vào bầu ươm đãsoi lỗ

Cắm cành giâm vào bầu đất: Hỗn hợp gồm tro trấu (25%), cát sông (75%), hạt cát

khô, hỗn hợp được trộn đều và cho vào bầu Bầu đất cần được đặt trong nhàpolyetylen có hệ thống phun sương không liên tục, 1 giờ phun 2 phút trong 2 tuầnđầu, sau 15 ngày tưới 5-6 lần/ ngày đảm bảo ẩm độ thường xuyên trên 80% trongtuần lễ đầu, sau 45 ngày có thể cho cây ra trồng trong chậu hoặc thay bầu đất nuôicây

Chăm sóc cành giâm: Trước khi chuyển cây ra bầu đất nên tưới nước ướt đẫm,

xới nhẹ, xé bỏ vỏ bầu đất cũ đưa cành giâm vào bầu đất mới Thành phần bầu đấtgồm: tro trấu, đất mặt, phân chuồng Bầu đất cần được tưới đủ ẩm trước khi cắmcành giâm đã có rễ vào bầu, líp đặt bầu ươm cành giâm cần được che nắng trongthời gian đầu, dần dần cho cành giâm tiếp xúc với nắng nhẹ, sau đó tăng dần lượngchiếu sang để cành giâm ra rễ mạnh hơn và đưa dần cành giâm ra ánh sáng hoàn

toàn Khi cành giâm đã phát triển mạnh có thể bón phân pha loãng để giúp cây sinhtrưởng tốt hơn [4]

 Ưu nhược điểm:

Ưu điểm:

- Giữ nguyên được đặc tính di truyền của cây mẹ

- Tạo ra cây giống sau trồng sớm ra hoa kết quả

- Thời gian nhân giống nhanh

- Có thể nhân nhiều giống mới từ một nguồn vật liệu giới hạn ban đầu

Nhược điểm

Đối với những giống cây ăn quả, nhất là những giống kho ra rễ, sử dụng phương pháp này đòi hỏi phải có những trang thiết bị cần thiết để có thể khống chế được điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và ánh sáng trong nhà giâm

2 Nuôi cấy mô:

a.Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào:

i Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào:

Cơ sở của sự phân hóa và phản phân hóa tế bào là tính toàn năng của tế bào.Mỗi tế bào đã chuyên hóa đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ nhiễm sắcthể) giống với toàn bộ các tế bào khác trong một cơ thể trưởng thành và giống tếbào hợp tử Nếu những tế bào đã chuyên hóa để trong điều kiện nhất định tế bào đó

có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.Đặc tính đó của tế bào gọi là tínhtoàn năng của tế bào Như vậy bất cứ một tế bào nào cũng có thể phát triển thànhmột cây hoàn chỉnh và đó cũng là cơ sở của phương pháp nuôi cấy in vitro.Về mặt

di truyền phân tử có thể nói rằng toàn bộ quá trình phát triển cá thể của cây từ hợp

tử cho đến khi cây chết ở tuổi tối đa đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tửADN đặc trưng cho loài Đời sống của cây là quá trình thực hiện dần dần chươngtrình di truyền đó

Cơ sở thứ hai của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào là sự biệt hóa và phảnbiệt hóa của tế bào Sự biệt hóa tế bào là quá trình tế bào chuyển từ giai đoạn sinhtrưởng tế bào sang giai đoạn chuyên hóa chức năng Các tế bào trong giai đoạn này

đã có các đặc trưng khác nhau về cấu trúc và chức năng Sự phản phân hóa tế bào

là quá trình diễn ra ngược lại, các tế bào đã biệt hóa trong các mô chức năng khôngmất đi khả năng phân chia mà trong những điều kiện nhất định chúng có thể quaytrở lại đóng vai trò như mô phân sinh và có khả năng phân chia để cho ra các tếbào mới.[5]

ii Quy trình nhân giống In vitro:

Nhân giống in vitro là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phậncủa cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ởđiều kiện vô trùng có môi trường thích hợp và được kiểm soát

Một quy trình nhân giống in vitro bao gồm 5 giai đoạn nối tiếp, mỗi giai đoạnđều có vai trò rất quan trọng vì nếu thất bại ở một giai đoạn nào đó thì sẽ dẫn đếnthất bại cả quy trình Các giai đoạn chính trong quy trình nhân giống in vitro:

Giai đoạn 1: Tạo mẫu sạch in vitro:

Trong giai đoạn này người ta thường sử dụng các loại hóa chất như: HgCl2,NaClO, Ca(OCl)2, H2O2… để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vikhuẩn và tạo sự chủ động về nguồn mẫu cấy Nguồn mẫu ban đầu có thể là chồi,hạt hoặc các bộ phận khác của cây Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn vậtliệu sạch để đưa vào nuôi cấy ở các giai đoạn tiếp theo

Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

-Mục tiêu để tạo ra các chồi mới từ mô nuôi cấy, về nguyên tắc thì tất cả các bộphận của cây như thân, rễ, lá, hoa đều có khả năng nuôi cấy để tái sinh thành cây.Tuy nhiên, một số các yếu tố như tuổi sinh lý của mô, thời điểm thu mẫu, mẫu non

hay già đều có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh Các chỉ tiêu đánh giá kết quả là:

Tỉ lệ mẫu nhiễm thấp, tỉ lệ mẫu tái sinh cao, chồi sinh trưởng tốt

Giai đoạn 3: Nhân nhanh:

Nhóm các chất điều hoà sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin, Gibberellin,… và cácchất phụ gia khác như nước dừa, chuối, khoai tây,… có vai trò rất quan trọng, vìchúng thúc đẩy sự phân hoá cơ quan, đặc biệt là chồi Mục tiêu của giai đoạn này

là tạo ra số lượng chồi, chồi sinh trưởng và phát triển tốt nhất để chủ động sản xuấtlượng lớn cây giống cung cấp cho thị trường

Giai đoạn 4: Tạo cây con hoàn chỉnh

Khi các chồi đạt kích thước nhất định từ môi trường nhân nhanh được cấy chuyểnsang môi trường tạo rễ Thông thường, trong môi trường tạo rễ hàm lượngCytokinin giảm xuống, ngược lại tăng hàm lượng Auxin Các chất ĐHST như: α -NAA, IBA, IAA ở nồng độ 0,1 - 5,0 mg/l thường được sử dụng để tạo rễ cho hầuhết các loài cây trồng Ở giai đoạn này, cây mô rất nhạy cảm với độ ẩm, ánh sáng

và dễ nhiễm bệnh do hoạt động của lá và rễ mới sinh ra vì vậy phải lưu ý đến yếu

tố môi trường trong nuôi cấy

Giai đoạn 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm

Ở giai đoạn này, cây được huấn luyện cho thích nghi dần dần với môi trường bênngoài Chú ý đảm bảo độ ẩm, chế độ ánh sáng (tránh ánh sáng trực xạ cho cây controng 2 - 3 tuần đầu), những ngày sau chế độ chăm sóc như cây hom hoặc cây ươm

từ hạt ngoài vườn ươm

iii Các yếu tố ảnh hưởng:

Môi trường nuôi cấy: Một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng

trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy Thànhphầnn này thay đổi tuỳ theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấynhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi Môitrường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy Tuy nhiên, tất cả cácmôi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa lượng, khoáng vilượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vậtchúng quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in vitro

Do vậy, khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trường thích hợp cho

sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và vớitừng đối tượng nuôi cấy cụ thể:

- Nhóm các nguyên tố đa lượng: Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố

muối khoáng như: N, P, K, S, Mg và Ca, được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chấtgiữa các tế bào thực vật với môi trường và xây dựng nên thành tế bào.Môitrường nhiều Nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi, với môi trườngnhiều Kali sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ

- Nhóm các nguyên tố vi lượng: Nguyên tố vi lượng là những nguyên tố

khoáng được sử dụng ở nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co,

Mn, Bo,…Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưngchúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển củamô.Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mônuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp Hàmlượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vàotừng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy

- Nguồn cacbon: Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu,

vì vậy buộc phải bổ sung nguồn cacbon để mẫu nuôi cấy có thể tổng hợpđược các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia Thông thường nguồn cacbon bổsung là đường Sucrose và glucose

- Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cfn thiết cho sự tăng

trưởng và phát triển của chúng Chúng cfn vitamin để xúc tác các quá trìnhbiến dưỡng khác nhau.Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vàivitamin trởthành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng Các vitaminthường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acidnicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol

- Các chất điều hòa sinh trưởng: có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng trong

nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen.Miller là người đfu tiên nhận thấy tỉ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phânhoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy Cả auxin và cytokinin đều được bổsung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệhormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay tạo rễ không giống nhau.[5]

b Các bước nuôi cấy invitro ở Chùm Ngây

i Nguyên liệu thực vật và khử trùng:

Hạt giống được khử trùng bằng cách ngâm trong 0,1% thủy ngân clorua (w/v) 2phút và 20% trong NaOCl (v/v) trong 5 phút, sau đó rửa lại 3 lần bằng nước cất vôtrùng Khử trùng bề mặt một lần nữa bằng cách ngâm trong 20% NaOCl(v/v) trongvòng 2 phút, sau đó rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng

Giống được trồng vô trùng trong môi trường MS cơ bản.Giống sau khi cấy xongđược nuôi trong vùng tối ở nhiệt độ 26±20C trong vòng 15 ngày Sau khi nảy mầmcây con được chiếu ánh sáng liên tục ở 2,500 lux bằng đèn huỳnh quang

Môi trường nuôi cấy: MS cơ bản gồm hữu cơ, muối vô cơ, vitamin Chất điều hòasinh trưởng với những nồng độ mong muốn bằng cách hòa tan chúng với 1NNaOH và tạo ra thể tích cần thiết với nước cất và bảo quản ở 40C trong tủ lạnh để

sử dụng trong tương lai

Tái sinh gián tiếp: Lấy từ cây con qua hạt giống phát triển với những bộ phận

khác nhau như lá, trụ trên lá mầm, trụ dưới lá mầm, và lá mầm được sử dụng đểcảm ứng mô sẹo

Cảm ứng mô sẹo: Các mẫu cấy tạo mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường MSđược làm giàu với các mức độ khác nhau (0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2.0mg/L) 2,4-D,TDZ, IAA, NAA Môi trường MS phụ với sự điều hòa sinh trưởng khác nhau được

sử dụng kết hợp tương ứng với liều lượng 2.0±0.5 và 2.5±1mg/l như IAA+BAP,2,4-D+Kinetin và NAA+Kinetin, cũng như 0,1 g/l myoinositol được thêm vào mỗimôi trường Để tăng nhanh hơn nữa quá trình tạo mô sẹo thì sau 3-4 tuần nuôitrong môi trường mới giống như trên Quan sát sau 1 tuần

Quá trình nuôi ủ trong vòng 4 tuần trên trong phòng mát dưới ánh sáng huỳnhquang trong 16h ở nhiệt độ 26±20C Và sau 3-4 tuần chuyển sang nuôi trong môitrường mới giống trên lần thứ 2

Sự phát sinh phôi soma và chồi:

Chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ khác nhau được sử dụng để tạo phôi soma

và tái sinh chồi Nuôi trong môi trường MS bổ sung riêng lẻ với BA, Kinetin vàNAA ở các mức độ khác nhau(0.5, 1.5, 2.0 và 2.5mg/l) và cũng như môi trườngkết hợp MS+BAP (3.0 mg/l) +NAA (1.0mg/l) và MS+Kinetin(1.0 mg/l)+NAA(3.0 mg/l)

Tái sinh trực tiếp:

Cảm ứng chồi:

Cây giống nảy mầm gồm 3-4 đốt được sử dụng làm thí nghiệm Lấy mô từ mắt haytrụ dưới lá mầm chuyển đến một môi trường cảm ứng tạo chồi bao gồm MS muối

và bezyl adenine purine(BAP), Kinetin và benzyl adenine(BA) với nồng độ khácnhau(0, 0.1, 0.5, 1.0,1.5 và 2.0 mg/l) để xác định ảnh hưởng của nó lên quá trìnhtạo chồi

Dữ liệu được ghi lại về chiều dài chồi, số lá, số chồi mỗi cây

Cảm ứng rễ:

3 Rễ thu được được cấy truyền nhiều lần, trong môi trường MS cơ bản với rễ đã được kích thích tố Chồi nách được cảm ứng từ mắt và mô ở trụ dưới lá mầm sau đó được cảm ứng rễ bao gồm MS muối, IAA, IBA và NAA với nồng độ khác nhau( MS 0, ½ MS, 0.05, 1.0, 1.5 và 2.0 mg/l) để điều chỉnh tốc độ tăng trưởng Dữ liệu liên quan đền số rễ mỗi chồi và chiều dài rễ được ghi sau 7 ngày chuyển vào môi trường cảm ứng rễ Cây con được chuyển đến chậu.

Cây cứng bắt nguồn từ: Cây con mang rễ được chuyển tới túi nhựa chứa cát tiệt trùng, nước, phủ bằng túi nilon trong suốt và giữ một phần ánh sáng trong phòng tăng trưởng xung quanh nhiệt độ (26±2 0 C), dần dần đục lỗ túi nilon để giảm độ ẩm sau 15 ngày, túi nilon được cắt bỏ, những cây còn sống được nuôi giữ trong nhà kính thêm 15 ngày nữa Những cây con cứng cáp sau

đó được chuyển ra ngoài đất [2]

c Kết quả:

Tái sinh gián tiếp:

Sự tương tác của các nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau tác động đếnthời gian tạo mô sẹo Mô lấy từ những bộ phận khác nhau( trụ dưới lá mầm, trụtrên lá mầm, lá mầm, lá) cũng khác nhau đáng kẻ trong quá trình tạo mô sẹo trongmôi trường có các chất điều hòa sinht rưởng khác nhau

Khi sử dụng chất điều hòa sinh trưởng là 2,4 D chứng minh được cơ quan mà cóthời gian bắt tạo mô sẹo nhanh nhất là sử dụng cơ quan là lá mầm là 6.10±0.26ngày.

Đối với các chất TDZ trung bình thời gian bắt đầu tạo mô sẹo 9.15±0.55C, trongkhi IAA, NAA đều có quá trình bắt đầu tạo mô sẹo dài (tương ứng 18.17±1.17 và

2,4-D và Kinetin 2.0+1.0 mg/L bắt đầu tạo mô sẹo trong thời gian ngắn

(8.3±0.71 ngày) so với các kết hợp khác (Table 3, Fig1)

Auxin và citokinin được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp cùng với nông độ khácnhau ảnh hưởng tới quá trình bắt đầu tạo mô sẹo.[2]

Tái sinh trực tiếp:

Chiều dài chồi

Ảnh hưởng bới nồng độ và các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau.Chiều dài chồi tối đa (4.31±0.49 cm) khi dùng mô cấy là trụ dưới lá mầm nuôi cấy

trên môi trường MS có bổ sung Kinetin Chiều dài chồi ngắn nhất (2.18±0.31cm)khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BAP Tương tự đối với Node;Khi Kinetin ở nồng độ thấp 0.1 mg/L và 0.5 mg/L chiều cao đạt tương ứng tối

đa 7.0±0.58 và 6.27±0.41 cm Nhưng các Node lại đạt chiều cao thấp hơn so vớihypocotyls rõ nhất là Kinetin 0.5 mg/L(Fig 2).Sự gia tăng nồng độ làm giảmchiềudài ở Node lẫn hypocotyls Nếu là BA, BAP thì chiều dài luôn nhỏ hơn khi sửdụng Kinetin là 1 nữa (Table 4)

Số lá:

Hypocotyls: Các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau ở các nồng độ khác nhau và

sự kết hợp của nó cùng với việc sử dung các bộ phận khác nhau ảnh hưởng đến sốlá.Table 4 cho ta thấy hypocotyls mọc lá tối đa (16.0±0.5) khi nuôi cấy với chấtđiều hòa sinh trưỡng Kinetin 0.5 mg/l, trong khi ở nồng độ cao 2.0 mg/l số lượng

lá giảm 3.00±0.58 lá Do vậy ta có thể nói nồng độ Kinetin tăng thì số lượng lágiảm

Khi sử dụng BAP 1.0mg/l hypocotyls sản xuất số lượng lá tối đa (17.67±1.45).Qua bảng ta cũng thấy số lượng lá tạo ra khi sử dung BAP và Kinetin là gần nhưnhau, còn BA tạo ra số lượng lá ít hơn (6.53±0.77) dù ở nồng độ nào

Node: Khi nuôi cấy trên môi trường có chất điều hòa sinh trường là Kinetin1.0mg/l

số lượng lá tối đa (19.33±0.67) Ở nồng độ thấp hơn Kinetin + 0.1 mg/L hoặc 0.5mg/L cho số lá tương ứng 11.67±0.88 và 17.33±1.20

Còn Node khi sử dụng chất điều hòa sinh trưởng lá Kinetin trung bình cho số lálà(11.99±0.79) Khi sử dụng BAP, BA đều cho số lượng lá ít hơn tương ứng6.27±0.88 và 6.33±0.98

Và một vài kết quả đã được thực hiện khác:

Rễ mọc từ trụ dưới lá mầm khác nhau khi cấy trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng khác nhau.[2]