Bài tiểu luận các phương pháp cải tiến giống vi sinh vật trong công nghiệp

Để chọn được giống VSV thuần chủng, bước đầu tiên là phân lập chúng từcác nguồn tự nhiên như: nước, không khí, đất, các mô động thực vật, các vật liệu hữu cơ vô cơ đã bị phân huỷ ít nhiều. Bằng những kỹ thuật VSV cổ điển từthời L. Pauster và R.Kochđã đề ra . Nhiều phương pháp đặc biệt chủng giống thuần khiết dùng cho công nghiệp đã được phát triển trên cơ sở những kỉ thuật vi sinh vật cổ điển này, nhất là trong việc tìm chất sản xuấtchất kháng sinh mới.

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỈ THUẬT MÔI TRƯỜNG

 oOo 

VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP.

BÀI TIỂU LUẬN NHÓM 4

Môn : VI SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Ths Trần Quốc Huy

TPHCM, tháng 9 năm 2015

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỈ THUẬT MÔI TRƯỜNG

 oOo 

VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP.

BÀI TIỂU LUẬN NHÓM 4

Môn: VI SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Ths Trần Quốc Huy

Nhóm sinh viên thực hiện

TPHCM, tháng 9 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi xin trân thành cảm ơn Ths Trần Quốc Huy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn

và giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian học tập.Một lần nữa nhóm chúng tôi xin trânthành cảm ơn thầy

Mặc dù bài tiểu luận đã hoàn thành nhưng khó tránh những sai sót.Mong rằng sẽnhận được đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để bài tiểu luận hoàn thiện hơn Từđó,chúng tôi sẽ có thêm nhiều kinh nghiệm để thực hiện những bài tiều luận tiếp theocũng như đồ án sau này và nghề nghiệp tương lai

Sau cùng chúng tôi xin chúc Ths Trần Quốc Huy và toàn thể các thầy cô trongKhoa thật dồi dào sức khỏe, niềm vui để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình làtruyền đạt kiến thức của mình cho thế hệ mai sau

Trân trọng cảm ơn!

NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi xin cam đoan:

4

Bài tiểu luận do các thành viên trong nhóm cùng chung tay làm việc,có sự phân công

rõ ràng và công bằng giữa các thành viên trong nhóm Đồng thời, không sao chép bất cứbài tiểu luận của bất kì ai Các nội dung trong bài báo cáo đã được tham khảo kỉ lưỡngtrước khi đưa vào bài tiều luận.Chúng tôi sẽ chịu hoàn toàn trách nhiệm trước thầy vàKhoa về những cam đoan này

Bảng 2.1 : Một số sản phẩm sinh ra thông

qua các vi khuẩn chứa các gene người

được tạo dòng nhờ phương páp kỉ thuật

2

Bảng 3.1 : Các loại protein trị liệu tạo ra

do E coli hay nấm men S cerevisiae 23-24

4 Hình 2.2: Các tác nhân vật lí gây độ biến 6-7

5 Hình 2.3: Các tác nhân hóa học gây đột biến 8

6 Hình 2.4: Các loại vi sinh vật được cải tiến cho năng suất cao 10

Hình 2.9: Sơ đồ thí nghiệm tạo dòng vi khuẩn mang

ADN tái tổ hợp có chứa gen Insulin ở người 16

12

Hình 2.10: (a) Joshua Lederberg (trái) và E.L.

Tatum; (b) E coli tiếp hợp Hai tế bào kết hợp nhau

bằng một cầu nối, thể cho bên trái và thể nhận bên

MỤC LỤC

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

LỜI MỞ ĐẦU

Trong sự phát triển của Nghành Công Nghệ Sinh Học ngày nay Vi sinh vật đang

dần chiếm ưu thế về số lượng các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vựccông nghiệp Và có thể nói ứng dụng của vi sinh vật trong công nghiệp ngày nay là rấtlớn nó được sử dụng rộng rãi trong công nghệ lên men( rượu, bia, sữa chua, ),sản xuấtcác chế phẩm sinh học phục vụ cho con người

Trên cơ sở những kiến thức đã được học trong môn học: nhóm chúng tôi đã được

giao thực hiện đề tài “Các phương pháp cải tạo giống vi sinh vật trong công nghiệp”

với mục đích là tìm hiểu thêm đề nâng cao kiến thức đã học cho bản thân và các bạn Mặc

dù đã cố gắng do kiến thức còn hạn hẹp và thời gian thực hiện không được nhiều nên đềtài của chúng tôi còn rất nhiều hạn chế và sai sót

Đề tài này nhóm chia làm 5 phần như sau:

Phần I : Phân lập các giống vi sinh vật thuần chủng: Tạo cơ sở cho việc cải tạo

giống sau này

Phần II: Các phương pháp cải tạo giống vi sinh vật trong công nghiệp : Ở đây trình

bày ba phương pháp cơ bản nhất

• Phương pháp gây đột biến

• Phương pháp tái tổ hợp

• Phương pháp lựa chọn thường xuyên

Phần III: Các yêu cầu của cải tạo giống

Phần IV: Ứng dụng của các phương pháp cải tiến giống trong sản xuất công nghiệp Phần cuối: Sẽ trình bày một số thành tựu cải tiến giống vi sinh vat.

Chúng tôi mong sự góp ý của Ths Trần Quốc Huy, các thầy cô trong khoa và các bạn

để bài luận này hoàn thiện và ngày càng tốt hơn

NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

Page | 11

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Muốn cải tạo một giống vi sinh vật nào đó, trước hết ta phải có nguồn giống muốn thế ta phải phân lập vi sinh vật thuần chủng từ nguồn gốc tự nhiên Sau đó, tiến hành cải tạo chúng bằng các biện pháp nhân tạo.

I PHÂN LẬP GIỐNG VI SINH VẬT THUẦN CHỦNG

Để chọn được giống VSV thuần chủng, bước đầu tiên là phân lập chúng từ cácnguồn tự nhiên như: nước, không khí, đất, các mô động thực vật, các vật liệu hữu cơ vô

cơ đã bị phân huỷ ít nhiều Bằng những kỹ thuật VSV cổ điển từ thời L Pauster và R.Koch đã đề ra Nhiều phương pháp đặc biệt chủng giống thuần khiết dùng cho công

nghiệp đã được phát triển trên cơ sở những kỉ thuật vi sinh vật cổ điển này, nhất là trongviệc tìm chất sản xuất chất kháng sinh mới

Hình 1.1: “Ông tổ” của nghành vi sinh vật học

Theo kỹ thuật VSV cổ điển, việc phân lập các chủng thuần khiết mất nhiều công

sức và chậm Ngày nay người ta dùng phương pháp “sàng lọc” vừa nhanh vừa có hiệu

quả

Nguyên lý của phương pháp “sàng lọc” là:

Trước hết người ta kiểm tra sơ bộ hỗn hợp các giống VSV từ mẫu tự nhiên như đấthoặc nước, cỏ cây chẳng hạn…pha loãng tạo thành các huyền phù pha có độ loãng từ1/10 đến 1/100, rồi gieo dung dịch trên lên bề mặt hộp petri đựng môi trường thạch dinh

Page | 12

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

dưỡng và đã cấy một chủng VSVkiểm định có tác dụng đối kháng.Chỉ có những chất nàotrong đất sinh chất đối kháng với chủng kiểm định, nghĩa là có tính chất kháng sinh thìsau khi nuôi sẽ tạo ra vùng ức chế đặc hiệu trên đĩa thạch Ta tách khuẩn lạc của chủng ấy

và đem nuôi cấy, thử chất sinh ra và xác định tiếp theo

Cũng có thể đơn giản là đặt các mẫu lên các điểm khác nhau trên mặt thạch dinhdưỡng (nếu muốn tìm vi khuẩn) hoặc của thạch khoai tây (nếu muốn tìm nấm), đã cóchủng kiểm định được nuôi cấy từ trước Giữ đĩa thạch ở 28-37oC trong khoảng 2 ngày,quan sát vùng bị ức chế và quyết định công việc phân lập các chủng vi sinh vật có tácdụng tiếp theo

Phương pháp này thường dùng hai kiểu kỹ thuật:

• Lấy một mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định

• Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với một chủng kiểm định

Cấy những chủng đã được phân lập bằng những đường vạch trên mặt thạch dinhdưỡng trong hộp petri Sau đó cấy chủng kiểm định theo đường song song hoặc vuônggóc với đường vạch của chủng nghiên cứu Đặt hộp petri vào tủ ấm với nhiệt độ thích hợpvới chủng kiểm định Tác dụng kháng sinh của mẫu thử sẽ được xác định ở vùng mặt

Page | 13

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

thạch không bị mờ tại các giao điểm đường cấy của chủng bị ức chế Phương pháp nàychủ yếu được sử dụng trong việc tìm chủng sản xuất các chất kháng sinh Từ nguyên lý cơbản phương pháp đã được cải tiến và ngày một phong phú hơn

Để chọn các chủng sản xuất các acid amin người ta đã sử dụng kiểu chọn lọc theo

kỹ thuật penicilin Trong phương pháp này các điều kiện được lựa chọn sao cho các tế

bào hoang dại có thể phát triển trong môi trường dinh dưỡng thiếu một acid amin nào đó

và bị giết chết bằng pennixilin Chúng ta đã biết, penicilin chỉ có tác dụng lên các tế bàođang sinh trưởng.Các tế bào cần acid amin không sinh trưởng được nên sống sót Đối với

những vi khuẩn mẫn cảm với penicilin thì dùng chất kháng sinh khác

Để phân lập những chủng có tính chất đặc biệt (như chuyển hoá steroit), người tadùng hỗn hợp của nhiều chủng vi sinh vật đem nuôi cấy trong cùng một môi trường cóchất mà ta muốn thực hiện sự biến đổi Sau khi nuôi ta chiết xuất và các sản phẩm, phântích theo các phương pháp sắc ký

Page | 14

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Các chủng thu được qua phân lập được gọi là chủng nguyên thủy, chủng hoang dại hay chủng tự nhiên Các chủng này chưa hẳn đã đáp ứng đầy đủ các yêu cầu dùng cho sản xuất công nghiệp Thông thường các chủng này được nghiên cứu tuyển chọn tiếp dựa vào các điều kiện sinh lý, sinh hoá và các điều kiện tích hợp để sao cho có hoạt tính cao và thực hiện được quá trình lên men có tính kinh tế.

Những chủng vi sinh vật nguyên thủy đạc biệt là các chủng có hoạt tính siêu tổng hợp - tổng hợp thừa các sản phẩm trao đổi chất bậc 1 và bậc 2 có đặc điểm là không bền vững, thường hay bị biến đổi các tính chất ban đầu Vì thế mới cần tới các phương pháp cải tiến giống vi sinh vật đề đáp ứng các nhu cầu đăt ra đó.

II CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT

TRONG CÔNG NGHIỆP

Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho năng suất cao: Yêu cầu đối với giai đoạnnày là tuyển chọn được chủng tổng hợp sinh khối cần thiết, với lượng đáng kể và hoạttính cao Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất, nước, lương thực, thực phẩm….Tuy nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông thường, chỉ tổng hợp một lượngnhỏ sinh khối, người ta cần tiến hành gây đột biến bằng phương pháp sinh học, lý, hóahọc…để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợp sinh khối” như: Phương pháp gây độtbiến, phương pháp tái tổ hợp, phương pháp lựa chọn giống thường xuyên

2.1 Phương pháp đột biến nhân tạo

2.1.1 Đặc điểm của phương pháp chọn lọc đột biến

Các thành tựu của Công nghiệp vi sinh vật không thể tách rời với những tiến bộnhảy vọt của khoa học kỉ thuật trong chọn lọc các chủng có năng suất cao

Phương pháp này có các đặc điểm:

• Thu nhận kết quả rất nhanh

• Chỉ đánh giá sản phẩm thu được, không quan tâm các biến đổi sinh lí, sinh hoá

• Tạo ra các chủng có năng suất cao

• Khắc phục một số nhược điểm của chủng ban đầu

• Làm biến đổi bản chất hoá học các chất trong chủng ban đầu

Quá trình chọn giống các chủng Penicillium chrysogenum ở Mỹ có thể lấy làm ví dụ

điển hình cho phương pháp này Từ dòng ban đầu có sản lượng 60mg/l, chọn các đột biếnngẫu nhiên được dòng 150mg/l và sau đó sử dụng các đột biến nhận được do tác động tia

X và UV Việc chọn lọc theo nguyên tắc: lấy dòng có sản lượng cao nhất đem gây đột

Page | 15

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

biến rồi chọn chủng Vi nấm Penoicillium chrysogenum suất cao nhất Qua nhiều bước

trung gian cuối cùng tạo được dòng E.15.1 có sản lượng 7000mg/l

Phương pháp chọn giống đột biến được sử dụng để tạo các chủng sản sinh ra nhiều

axit amin (như glutamic axit) hay các nucleotit Ngoài ra còn có thể nhận các đột biến liên

quan đến cơ chế điều hoà trao đổi chất:

• Các đột biến cơ cấu (constitutive mutants): tạo sản phẩm không cần chất cảm ứng

(inducer)

• Các đột biến kháng ức chế ngược là các đột biến tạo sản phẩm nhiều mà không bị

ức chế bởi sản phẩm cuối (end product repression)

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Hình 2.2: Các tác nhân vat lí gây độ biến

Trong các tác nhân vật lý dùng vào mục đích này là tia cực tím hay là tia tử ngoại.Người ta dùng đèn thạch anh phát ra tia cực tím chiếu lên dịch huyền phù, giống vi sinhvật được chuẩn bị trong môi trường đẳng trương, đựng trong hộp petri mở nắp và cókhuấy hoặc lắc Khoảng cách từ đèn UV đến dịch huyền phù vi sinh vật, thời gian chiếu

và cường độ bức xạ được điều chỉnh sao cho số tế bào bị tiêu diệt và số sống sót tối đavào khoảng 0,2-0,5%

2.1.2.2 Những tác nhân hoá học:

Page | 17

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Hình 2.3: Các tác nhân hóa học gây đột biến

Dùng các tác nhân hoá học có thể tới mức các thể đột biến cần tìm xuất hiệntrong khoảng 105-108 tế bào Nồng độ hoá chất và thời gian chiếu xạ là do thực nghiệmxác định, làm sao cho chỉ còn một số rất nhỏ tế bào vi sinh vat sống sót Những chủng saukhi chịu tác dụng của các tác nhân đột biến được rửa bằng nước đẳng trương vô khuẩn vàsau nhiều lần pha loãng liên tiếp được cấy chuyền nhiều lần trên hộp petri để khảo sát đặctính mới của chúng Việc cấy chuyền được thực hiện bằng kỹ thuật đóng dấu:dùng condấu nhung chuyển khuẩn lạc từ hộp petri này sang hộp petri khác

2.1.3 Phát hiện các thể đột biến có hiệu quả

Muốn phát hiện các đột biến có hiệu quả cần có hệ thống chọn lọc để tìm thấy cácđột biến hiếm hoi trong khối rất lớn các dạng không đột biến Các hệ thống chọn lọc độtbiến có nhiều phụ thuộc vào các đột biến khác nhau Liên quan đến chọn lọc đột biến ở visinh vat, người ta đưa ra khái niệm lực phân giải (resolving power) Khái niệm này dùng

để chỉ khả năng phát hiện các đột biến rất hiếm so với không đột biến

Page | 18

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

2.1.3.1 Phương pháp đề kháng:

Ở vi khuẩn các tác nhân chọn lọc thường là thuốc và phage Các đột biến được dễdàng phát hiện trên môi trường agar có thuốc hay phage ở dạng các khuẩn lạc được mọclên

2.1.3.2 Phương pháp làm giàu chậm:

Việc phát hiện đột biến khuyết dưỡng khó khăn hơn Dung dịch vi khuẩn pha loãngđược cấy lên bề mặt môi trường agar tối thiểu để mọc rời thành khuẩn lạc Một lớp môitrường tương tự được đổ lên trên, phủ lớp mỏng Hộp petri được ủ để các khuẩn lạc bìnhthường mọc lên Sau đó, đổ phủ thêm một lớp môi trường dinh dưỡng có chất bổ sung và

ủ tiếp cho chất bổ sung khuếch tán Các đột biến khuyết dưỡng sẽ mọc sau khi có chất bổsung, nên khuẩn lạc nhỏ hơn do mọc chậm

2.1.3.3 Phương pháp làm giàu hạn chế:

Là dạng đơn giản của phương pháplàm giàu chậm Các vi khuẩn được cấy trên môitrường tối thiểu có một ít bổ sung Trong điều kiện đó các đột biến khuyết dưỡng mọc đếnkhi hết chất dinh dưỡng bổ sung thì dừng, nên tạo khuẩn lạc nhỏ Các vi khuẩn bìnhthường tiếp tục mọc tạo khuẩn lạc to

2.1.3.4 Phương pháp làm giàu nhờ penicillin:

Được áp dụng cho các vi khuẩn.Penicillin có tác dụng diệt các vi khuẩn bìnhthường khi phân chia Các vi khuẩn được cho vào môi trường tối thiểu có penicillin Các

vi khuẩn đang tăng trưởng bị diệt chỉ có các tế bào đột biến không tăng trưởng còn sốngsót Sau đó hỗn hợp được cấy lên môi trường không có penicillin thì các đột biến khuyếtdưỡng mọc lên với tỷ lệ tương đối cao hơn

2.1.3.6 Phương pháp in

Các vi khuẩn được cấy để mọc rời từng khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng tốithiểu Các khuẩn lạc đột biến không mọc lên được Căn cứ vào đột biến không mọc ở bảnsao tách các đột biến khuyết dưỡng

Page | 19

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

2.1.4 Thành tựu

Phương pháp này đã đem lại những thành tích ngoạn mục, góp phần tích cực cho

sự phát triển của công nghiệp lên men vi sinh như:

• Chủng Penicillium chrysogenum ban đầu có năng suất 60 mg/l và nay đạt 60000

mg/l, hơn chủng ban đầu đến 1.000 lần

• Chủng Corynebacterium glutamicum tạo glutamic axit đạt hơn 200g/l so với ban

đầu chỉ có 20g/l

• Chủng Serratia marcescens sinh ra biotin đạt 600mg/l.

• Riboflavin(vitamin B2) là sản phẩm thương mại được tổng hợp bằng phương pháplên men và phương pháp hoá học Sản xuất riboflavin do 2 chủng vi nấm

Eremothecium ashbyii và Ashbya gossypii với sản lượng hơn 20 g/l, gấp 40000 lần

nhu cầu của nó

• Sản xuất vitamin B12 trong công nghiệp do các chủng vi khuẩn Propionibacterium shermanii hoặc Pseudomonas denitrificans Các chủng đột biến này sản sinh một

lượng sản phẩm lớn hơn rất nhiều so với nhu cầu của tế bào, thậm chí lớn hơn

nhiều lần khối lượng khô của nó Pseudomonas denitrificans sinh ra vitamin B12

gấp 100000 lần nhu cầu của nó