Luận văn: Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum

Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện tĩnh, chúng tôi th

Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thị Ngọc Anh, những lời truyền đạt của côthật sự bổ ích cho em trong quá trình em làm luận văn tại trường.

Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô đã giúp đỡ chúng em về mặt hóachất phục vụ cho việc thực hiện đề tài

Em cảm ơn cô Thùy Dương - bộ môn Công nghệ Sinh học của trường Đại học Báchkhoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em về nguồn vi sinh vật sử dụng trong đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm,trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất về mọi mặt giúpchúng em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng muốn bày tỏ sự cảm ơn đến tất cả các bạn bè của tôi, họ đã giúp đỡ, đặc biệt

là cho tôi thấy được sự gắn bó, sự chia sẻ, sự cảm thông cũng như là những giây phút thư giãntrong khi làm việc

Tôi xin cảm ơn với tất cả lòng chân thành

Tp HCM, ngày 07 tháng 01 năm 2008

Phan Anh Tuấn

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Acetobacter xylinum (A xylinum) là một vi khuẩn Gram âm, có thể sản xuất một loại

polysaccharide ngoại bào được gọi là cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có khả năng đượcứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và các lĩnh vực khác Để ứng dụng cellulose vikhuẩn một cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào và ổn định.Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm đã được phát hiện và ứngdụng thực tế Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực

phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều

kiện tĩnh, chúng tôi thực hiện khảo sát các yếu tố sau:

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum trên môi trường

Hestrin-Schramm (HS)

- Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum.

Để khảo sát sự sinh tổng hợp cellulose, A xylinum được nuôi cấy dưới điều kiện tĩnh

trên môi trường HS ở các điều kiện khác nhau nhằm rút ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho

chủng A xylinum có sẵn Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với quá trình tạo cellulose của vi khuẩn A xylinum được tiến hành và thấy rằng, trong khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất tổng hợp cellulose của chủng A xylinum này là thích hợp nhất, lượng cellulose đạt được có

thể ~5,2 gl-1 Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon bằng cách thay đổinguồn carbon trong thành phần môi trường nuôi cấy, chọn được nguồn carbon thích hợp nhất

cho chủng A xylinum sinh tổng hợp cellulose là mannitol Lượng cellulose đạt được ~7,4 gl-1

Để chọn ra nguồn nitơ tốt nhất cho sự tổng hợp cellulose, một thí nghiệm được thực hiện vớinguồn carbon là mannitol, nguồn nitơ được thay đổi, kết quả cho thấy cao nấm men cho kếtquả tạo cellulose tốt nhất Lượng cellulose đạt được ~8 gl-1 g Khi khảo sát ảnh hưởng đồng

thời của mannitol và cao nấm men lên quá trình tổng hợp cellulose của A xylinum, hàm lượng

cellulose thu được có thể đạt được ~8,5 gl-1khi thành phần môi trường HS được điều chỉnhvới hàm lượng mannitol 15,5 gl-1và hàm lượng cao nấm men là 6,5 gl-1, pH môi trường đượcchỉnh xung quanh giá trị 5,0

Với kết quả thu được trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A xylinum

có tại Phòng Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh vớimục đích thu nhận cellulose nên bao gồm các thành phần sau: 15,5 gl-1mannitol; 6,5 gl-1caonấm men; 5,0 gl-1Na2HPO4; 1,115 gl-1acid citric; pH được điều chỉnh về 5,0 là thích hợp cho

quá trình nuôi cấy Các kết quả quả thí nghiệm này cung cấp những thông tin hữu ích cho sựphát triển khả năng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp.

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 C ELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULOSE 3

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 3

2.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn 3

2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose 6

2.2 S INH TỔNG HỢP CELLULOSE TỪ VI KHUẨNA XYLINUM 10

2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A xylinum 10

2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 11

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose 13

2.3 Ứ NG DỤNG CỦA CELLULOSE VI KHUẨN 24

2.3.1 Thực phẩm 24

2.3.2 Y học 25

2.3.3 Các ngành công nghiệp khác 25

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

3.1 N GUYÊN LIỆU 28

3.1.1 Chủng vi sinh vật 28

3.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 28

3.2 T HIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 29

3.2.1 Khảo sát quá trình nhân giống 29

3.2.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose 30

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum 30

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum 31

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum 31

3.3 C ÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 33

3.3.1 Số lượng vi khuẩn 33

3.3.2 Hiệu suất cellulose 33

3.3.3 Phân tích thống kê 34

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

4.1 K HẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨNA XYLINUM 35

4.2 K HẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CELLULOSE 36

4.3 K HẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA P H LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨNA XYLINUM 38

4.4 K HẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨNA XYLINUM 40

4.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 40

4.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 43

4.5 T ỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ 45

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 K ẾT LUẬN 49

5.2 Đ Ề NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn 4

Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) 6

Hình 2.3: SEM của A xylinum 8

Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum 11

Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 12

Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A xylinum 13

Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và có khuấy đảo 15

Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo 16

Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A xylinum 35

Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7 36

Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A xylinum 39

Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn carbon thay đổi 42

Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn nitơ thay đổi 44

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các vi sinh vật cĩ khả năng tổng hợp cellulose 7

Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC 16

Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC của A xylinum IFO 13693 17

Bảng 2.4: Aûnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của 23

Bảng 2.5: Các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cellulose vi khuẩn 26

Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và nguồn nitơ 33

Bảng 3.2: Bảng mã hố các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 34

Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu 47

Bảng 4.2: Bảng mã hố các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 47

DANH MỤC VIẾT TẮT

- Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện

nuôi cấy có khuấy đảo)

- A xylinum: Acetobacter xylinum

- A xylinus: Acetobacter xylinus

- ATP: adenosine triphosohate

- BASYC®: bacterial synthesised cellulose

- Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose

- cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc

- CS: cellulose synthase

- CSL: corn steep liquor

- DAP: diamon phosphate

- PTS: Phosphatransferase

- PGA: Phosphogluconic acid

- S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích

- SEM: Scanning electronic microscopy

- St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện nuôi

cấy tĩnh)

- SA: Sulfate amon

- UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase

- UDPG: Uridine diphosephoglucose

- YPM: Yeast extract Peptone Mannitol

- YE: Yeast extract – cao nấm men

Chương 1: MỞ ĐẦU

Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là bộ khung xươngquan trọng trong cơ thể thực vật Không những cellulose được tổng hợp bởi thực vật, màcellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn Một trong

những loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là A xylinum Cellulose vi

khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngànhkhoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nướcthải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng được

nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et al., 2000).

Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làmnhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, một ứng dụng củacellulose vi khuẩn mới được phát hiện gần đây là khả năng ứng dụng làm màng bao thực

phẩm chống vi sinh vật rất hiệu quả (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993) Việc ứng

dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung và làm màng bao thực phẩm nóiriêng đòi hỏi phải có được các nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, và phùhợp với tính chất của các ứng dụng Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy khi nuôi cấy dưới

điều kiện có khuấy đảo thì hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A xylinum sẽ cao hơn khi

nuôi cấy tĩnh Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống visinh vật trong công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulose thu được phải ở dạng màng Với mục

đích đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter

xylinum” dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh với mong muốn thu được các kết quả hữu ích cho các

nghiên cứu trong tương lai

Trong nội dung thực hiện, chúng tôi tập trung khảo sát các yếu tố sau:

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum trên môi trường

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A xylinum.

- Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men thu nhận cellulose vi khuẩn nhằm nâng cao

hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum.

Với kết quả thu được, phần nào sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho các nghiêncứu tiếp theo, đầy đủ hơn để có thể ứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô côngnghiệp

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn.

Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A xylinum lần đầu tiên được báo cáo bởi Brown et al (1986) Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát

hiện và quan sát thấy một khối rắn mà theo ông lúc đó khối rắn này không nằm trong các kếtquả nghiên cứu ông dự định trước Khối rắn này khó bị phân hủy và giống với mô động vật

Hợp chất đó sau này được xác định là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum (Brown et al., 1986).

Đến nửa thế kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi

khuẩn Đầu tiên, Hestrin et al (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp cellulose Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được A xylinum tổng

hợp trong môi trường có đường và ATP Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấu trúccủa cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi polymer do cácglucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan

Saxena (1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A xylinum bằng việc giải

trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đếnquá trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa Từ đó đến nay đã có nhiều công trìnhnghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn

1.1.2.1 Cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liênkết β-1,4-glucan Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành thớ sợithứ cấp, có bề rộng 1,5 nm Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợicellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loài thực vật Các thớ sợi thứ cấp kết lại thànhnhững vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải Dải có chiều dày 3 –

4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al., 2000) Các dải siêu mịn của cellulose vi

khuẩn có chiều dài từ 1 µm đến 9 µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ

các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001)

Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000)

1.1.2.2 Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP)

Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose baogồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau DP của cellulose thựcvật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 – 6000 Tuy nhiên, trongmột số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn có thể đạt 16000 đến 20000 phân tử glucose

(Watanabe et al., 1998) Đường kính của bacterial cellulose chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2).

1.1.2.3 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn.

Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúccủa cellulose vi khuẩn Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được kích thước

và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại, phổRaman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose

(Bielecki et al., 2001).

Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại cấutrúc tinh thể riêng biệt, cellulose Iα và Iβ Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai

loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993) Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinh khiếtthu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể Iα tinh

khiết từ nguồn này Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A xylinum chứa nhiều

tinh thể Iαhơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60% Tỉ lệnày có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môitrường (Yamamoto & Horii, 1994) Ngược lại Iβchủ yếu có trong thành phần cellulose hìnhthành nên thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai Ở đó, cellulose Iαchỉ chiếm khoảng 20%

Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng trong việc xácđịnh các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên cứu về sựtương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose được thực hiện

1.1.2.4 Tính chất của cellulose vi khuẩn (El-Saied et al., 2004; Bielecki et al.,

2001)

- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thànhphần tỉ lệ Iαcao

- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I

- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc

- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin vàhemicellulose

- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thểphục hồi

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt

- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao,ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao

- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một sốsản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian Đặc biệt vi khuẩn

có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉcực nhỏ

- Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách

tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A xylinum Từ đó có thể kiểm

soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose

Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001)

1.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose.

Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A xylinum

được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất vàđược tập trung nghiên cứu nhiều nhất Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinhvật khác nhau là khác nhau Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năngtổng hợp cellulose

Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose

(Jonas et al., 1998)

Vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học

Acetobacter Lớp màng ngoại bào

Dải cellulose

Để giữ vi khuẩn trong môi trườnghiếu khí

Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Alcaligenes Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Pseudomonas Các sợi không tách biệt Sự kết bông trong nước thải

Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc Sự kết bông trong nước thải

Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất cellulose Đặc biệt là A xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất tạo

cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng…

1.1.3.1 Phân loại A xylinum

A xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylynus.

A xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước quả (Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ (Faparusi et al., 1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà (Hermann et al., 1928).

1.1.3.2 Đặc điểm hình thái của A xylinum.

 A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di

động, không sinh bào tử Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hayxếp thành chuỗi

 Nếu A xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng biến đổi

thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánhhoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính mộtcách đáng kể

 Khuẩn lạc của A xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa

khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩnlạc nhẵn

Hình 2.3: SEM của A xylinum (Forge & Preston, 1977)

1.1.3.3 Đặc điểm sinh lý của A xylinum (Jonas et al., 1998)

 Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O

 Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men

 Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer

 Chuyển hóa glucose thành acid gluconic

 Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton

 Không sinh sắc tố nâu

 Tổng hợp cellulose

1.1.3.4 Đặc điểm sinh trưởng của A xylinum

Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vận chuyển chấtdinh dưỡng và oxi đến tế bào Tuy nhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp vi khuẩn cóthể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV

A xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất Chẳng hạn chủng A xylinum BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993) trong khi chủng A xylinum IFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993)… A xylinum có thể chuyển hóa glucose thành

acid gluconic, điều này là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2đơn vị trong quá trình nuôi cấy.

Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển từ 250C đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3 Theo

Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A xylinum phát triển là 5,5 và không phát triển ở nhiệt độ

370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu Theo Maccormide et al (1996) cho rằng A xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ 120C đến 350C và có thểphát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên tới 10%

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ, khuẩn lạcnhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày Khi già tế bào mọc dính thành cụm, và chúngmọc theo đường cấy giống

A xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung thêm acid

acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu suấttổng hợp cellulose

1.1.3.5 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A xylinum.

Màng cellulose được sản xuất bởi A xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát triển và

tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên

 Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn (Bielecki et al., 2001).

 Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới được bề mặt

giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí Do đó chỉ những tế bào gần ranh giới

lỏng khí của môi trường mới sản xuất cellulose (Krystynowicz et al., 2002; Watanabe et al., 1998)

 Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A xylinum trên cơ chất và bảo

vệ vi khuẩn trước những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất

 Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nên khả năng chống chịu vớinhững thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi sinh vật gâybệnh…) trong môi trường sống tăng lên

 Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV 23% vi khuẩn aceticđược bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiếu tia UV

(Bielecki et al., 2001).

1.2 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A xylinum

1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A xylinum

Theo Ross et al (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn từ glucose thành

các sợi kết tinh đòi hỏi phải có sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDP-Glucose), sau đó

là một phản ứng tổng hợp cellulose và cuối cùng là sự tập hợp lại thành sợi cellulose nhỏ đểhình thành nên các dải tinh thể cellulose

UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp cellulose trong A xylinum.

Như sơ đồ duới đây, quá trình sinh tổng hợp UDP-Glucose từ glucose là một quá trình trảiqua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme Những bước này là sự phosphoryl hoá củaglucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thành glucose-6-phosphate, sự izomer hoá củaglucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase, và sự tổng hợpUDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase UDP-Glucose pyrophosphorylase đóng

vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum trong khi các chủng

A xylinum đột biến không có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla &

Kjosbakken, 1981)

Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum (Canon & Anderson, 1991)

1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum trên được chia thành hai giai đoạn

chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh

1.2.2.1 Giai đoạn polymer hóa

Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucosethành glucose-6-phosphate (Glc-6-P) Sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM) tiếp tụcchuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông qua phản ứngisomer hóa Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyển hóa

thành UDP-Glucose Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và celluloseđược tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase(Iguchi et al., 2000).

Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo cellulosetheo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thànhfructose–1-phosphate Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa thành fructose-1,6-biphosphate nhờ enzyme fructose–1-phosphatekinase Sau đó, enzyme phosphoglucoseisomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự nhưtrên để tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000)

Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn (Iguchi et al., 2000)

1.2.2.2 Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucan Các chuỗi glucan kếthợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals Lớp chuỗiglucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kếthydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhautạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi và đượcphun ra ngoài môi trường thông qua các lỗ trên bề mặt của vi khuẩn (hình 2.6) Ảnh chụp

kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 – 80 lỗ sắp xếp thành hàng dọc

chiều dài của tế bào (Ross et al., 1991) Các lỗ này chính là các vị trí sinh tổng hợp cellulose

trên bề mặt tế bào Đây là những lỗ có đường kính khoảng 3,5 nm sắp xếp song song theođường thẳng dọc trục vi khuẩn Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa enzym tổng hợpcellulose Mỗi tiểu phần 10 nm tạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1.5 nm

Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A xylinum

(Iguchi et al., 2000)

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose.

1.2.3.1 Kiểu nuôi cấy

Có 2 kiểu nuôi cấy thường được sử dụng để sản xuất cellulose vi khuẩn, đó là nuôi cấytĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo

a) Nuôi cấy tĩnh

Đối với nuôi cấy tĩnh, người ta sử dụng những khay nhựa đã chuẩn bị môi trường và

tiến hành nuôi cấy chủng A xylinum ở điều kiện tĩnh.

Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp xếpthẳng hàng trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu xuống môitrường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với nhau tạo thành tấm cellulosetrên bề mặt canh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu oxy

Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tĩnh cho sản lượng thấp vàmang tính thủ công Do đó, để sản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sản xuấthàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn (Edwards, 1995)

b) Nuôi cấy có khuấy đảo

Tiến hành nuôi cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịch môi trường, có cánh khuấy,thổi khí oxy hoặc lắc Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển theo chiều sâucủa môi trường Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, elip…

Đây là kĩ thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứngdụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới

được sản xuất với sản lượng thấp Sản xuất cellulose từ A xylinum bằng phương pháp nuôi

cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại, trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính không ổnđịnh khi nuôi cấy Tính không ổn định được thể hiện bởi sự mất khả năng sản xuất cellulose

và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến không có khả năng sản xuất

cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et al., 1997).

Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A xylinum được gắn vào những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme et

al (1998) đã giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy bằng cách cung cấp

vào môi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit, silicagel, cát biển, những hạt thủytinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào được tối

ưu tuỳ theo mức độ khuấy, cũng như mức độ lắc của khay (Yoshinaga et al., 1997).

Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer sinhhọc, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của phương pháp

nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002) Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng cellulose dày được

tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm, celluloselại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những khối không đều, dạng viên kết haydạng cầu kích thước từ 10 µm đến 1000 µm

Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (trái) và có khuấy đảo (phải)

BC, mặc dù rất khó xác định chính xác kích thước của mỗi sợi Hình thái này có được có thể

do dòng chảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển không ngừng của môi trường khi nuôi cấydưới điều kiện có khuấy đảo Những thay đổi về hình thái học có liên quan đến những thayđổi trong cấu trúc vi mô như trọng lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần Iα, bảng 2.2 chothấy rõ điều này

Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuơi cấy tĩnh (a) và nuơi cấy cĩ khuấy đảo (b)

(Watanabe et al., 1998) Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC (Watanabe et al., 1998)

a Xác định bằng phương pháp chụp nhiễu xạ tia X

b Ước lượng bằng phương pháp chụp nhiễu xạ tia X kích thước của mặtphẳng tinh thể học

c Xác định bằng CP/MAS13C NMR

Do những khác biệt về cấu trúc mà St-BC và Ag-BC có những tính chấtcó liên quan tới những ứng dụng thương mại cũng khác nhau như trình bày ởbảng 2.3

Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC (Watanabe et al., 1998)

Đặc trưng Ag-BC St-BC

Khả năng giữ nước (g nước/g

Giá trị của chức năng duy trì lọc được định nghĩa là lượng phân tử CaCO3bị giữ trên

tờ giấy cellulose Phân tử nhỏ hơn và phân tán hơn của Ag-BC bị phân hủy cĩ hiệu quả hơnphân tử của St-BC trong việc giữ lại các hột nhỏ vì phân tử của Ag-BC bị phân hủy cĩ bề mặthiệu dụng rộng hơn suốt quá trình lọc trong sản xuất giấy Trong trường hợp của chất ổn địnhnhũ tương, phân tử Ag-BC bao phủ bề mặt của những giọt dầu rộng hơn và nhũ tương chứatrong Ag-BC ổn định hơn

Do đĩ, Ag-BC thể hiện nhiều đặc tính phù hợp hơn cho những ứng dụng cơng nghiệphơn St-BC(Watanabe et al., 1998)

1.2.3.2 Ảnh hưởng của thiết bị đến năng suất tạo thành cellulose vi khuẩn

Phương pháp sản xuất cellulose vi khuẩn truyền thống là nuơi cấy tĩnh, nhưng phươngpháp này địi hỏi phải cĩ diện tích lên men lớn và thời gian lên men dài Do đĩ một số phươngpháp khác được khảo sát để thay thế cho phương pháp nuơi cấy tĩnh

Thùng lên men khuấy trộn được dùng rộng rãi trong sản xuất cellulose vi khuẩn, nuơicấy liên tục cĩ bổ sung ethanol làm tăng tốc độ tổng hợp cellulose gấp 2 lần so với nuơi cấy

mẻ Hơn nữa trong điều kiện nuơi cấy cĩ khuấy đảo, dễ dàng kiểm sốt các yếu tố mơi trường.Tuy nhiên, khĩ khăn của quá trình nuơi cấy lắc là cellulose sinh ra tích lũy trong mơi trườnglàm cho mơi trường cĩ độ nhớt cao dẫn đến khĩ kiểm sốt quá trình khuấy trộn và sục khí.Các viên huyền phù cellulose cĩ độ giữ nước cao, nhanh chĩng chống hết thể tích mơi

trường, gây khĩ khăn cho vi sinh vật phát triển tạo cellulose (Klemm et al., 2001; Yoshinaga

et al., 1997).

Một số thiết bị lên men sản xuất cellulose vi khuẩn:

a) Ajinomoto

Được đặt tên theo tên một công ty, phương pháp này sử dụng môi trường bề mặt nhằmcải thiện sự tổng hợp của cellulose Các tế bào đầu tiên được nhân giống trong thiết bị có sụckhí trước khi được cho vào các khay tĩnh Sau 3 ngày trong thiết bị suc khí, mật độ tế bào vàokhoảng 2x107 (tế bào/ml) Lúc này, dịch lên men được chuyển vào các khay có sục khí Sosánh với quá trình lên men thông thường tạo cellulose thì thiết bị nay fcho năng suất cao hơn140% Sản phẩm có khả năng giữ nước thấp và chứa khoảng 10% lượng sucrose ban đầu

(Okiyama et al., 1992).

b) Weyerhauser

Được đặt tên theo tên của một công ty Mỹ phát minh ra, một quá trình được phát triển

để sản xuất sợi có kích thước nhỏ, khoảng 1/300 kích thước của bột gỗ Sử dụng các chất gây

đột biến đổi hóa học để thay đổi các mức độ tác động của enzyme, chủng A xylinum được

phân lập để làm giảm lượng chất phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, bao gồm gluconic acidvới việc điều chỉnh pH thấp hơn Rõ rằng hơn, chủng vi sinh vật được phân lập để sản xuấtcellulose khi khuấy đảo Trước đây, khuấy đảo một dịch lên men để cung cấp oxy, và sự traođổi chất, tổng hợ cellulose không ngừng Tuy nhiên, sản phẩm tạo ra từ phương pháp này là

một dịch huyền phù sệt, nhớt, tên thương mại là Cellulon (Black et al., 1990).

c) ICI

ICI (Imperial Chemical Industry) bao gồm 4 bước và sản xuất một chất sệt giống với

hệ thống Weyerhauser Bước đầu tiên là bước tích lũy Khi đó vi khuẩn được phép phát triểntrong một thiết bị phản ứng có khuấy đảo đến khi nguồn carbon được tiêu thụ hết Sau đó bổsung nguồn carbon với tốc độ phù hợp cho sự tổng hợp cellulose Bước cuối cùng là loại đicác huyền phù từ thiết bị phản ứng và sau đó tách các tế bào vi sinh vật ra khỏi sản phẩm

(Serafica et al.,1998).

d) Gengiflex®, Biofill® và BASYC®

Chủng A xylinum thích hợp được đưa vào một thiết bị, trong đó tạo điều kiện tối ưu

cho chúng phát triển Các điều kiện tối ưu cho sự sản xuất cellulose sau đó được áp dụng chodịch lên men Tất cả các quy trình đều được phát triển trên môi trường cơ bản của Schramm

và Hestrin (1954)

Gengiflex® được áp dụng trong công nghiệp nha khoa, cụ thể là được áp dụng để giúp

hồi phục lại mô bao quanh răng (Novaes et al., 1997).

Biofill®, được sử dụng như là một dải băng, có thể được ứng dụng băng các vếtthương trong trường hợp bị phỏng hay bị loét Biofill® được sử dụng như da nhân tạo cho conngười Mặt hạn chế lớn nhất của sản phẩm là bị giới hạn bởi tính co giãn khi ứng dụng để làmcác vết băng tai những vùng có cường độ vận động cao Ngược lại, ưu điểm của nó là giúp hồiphục nhanh chóng vết thương, và khả năng chống nhiễm trùng tốt Cellulose trong suốt chophép kiểm tra, theo dõi vết thương dẽ dàng trong khi Biofill® sẽ tách ra khi vết thương hồiphục Với việc rút ngắn thời gian và chi phí điều trị, Biofill® được đánh giá rất cao (Fontana

et al, 1990).

Một nhóm các nhà hóa học, sinh vật học và giải phẫu học đã phát triển một sản phẩmgọi là BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose) BASYC® là một sản phẩm dạng ống dùngthay cho các mạch máu Các ống có đường kính trong khoảng 1mm và dài 5mm, được sửdụng thay thế cho mạch máu Công dụng khác của loại sản phẩm này là bề mặt trong của ống

BASYC® nhẵn và trơn hơn các vật liệu tổng hợp khác khi sử dụng cùng mục đích (Klemm et al, 2001).

e) Thiết bị thu nhận cellulose liên tục

Thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm Sử dụng một dụng cụ có độ sâu khônglớn để lượng môi trường cần thiết là tối thiểu, các sợi cellulose được thu bởi một trục quayliên tục với tốc độ 35 mmh-1 Sau một thời gian thu nhận cellulose thì đem cellulose đi xử lý

Ưu điểm lớn nhất của dạng thiết bị này là cellulose có thể được thu nhân liên tục và môi

trường mới được bổ sung sau mỗi 12 giờ (Sakairi et al., 1997).

f) Thiết bị phản ứng có sục khí tuần hoàn và khuấy đảo

Trong môi trường tĩnh, thời gian nhân đôi số lượng tế bào là từ 8 – 10 giờ, trong khitrong điều kiện có lắc đảo, thời gian này là 4 – 6 giờ (Canon và Anderson, 1991) Bằng cáchtăng khuấy đảo và cung cấp oxy cho môi trường nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng tế bào cũng tănglên Do đó, khả năng sản xuất với tỷ lệ lớn là có thể, thiết bị lên men có khuấy đảo và có sụckhí được nghiên cứu và mong muốn tạo ra cellulose dạng II Độ nhớt cao của môi trường vàsức cản mạnh là trở ngại của phương pháp Với phương pháp này thì sợi cellulose tạo ra có

cấu trúc không bình thường (Kouda et al., 1997).

1.2.3.3 Aûnh hưởng của áp suất oxy đến quá trình tổng hợp cellulose vi khuẩn

Sự hình thành cellulose diễn ra tại vị trí mặt phân cách giữa khơng khí và lớp màngcellulose chứ khơng phải tại mặt phân cách giữa mơi trường và cellulose Do đĩ oxy là nhân

tố quan trọng cho quá trình tổng hợp cellulose (Borzano & Desouza et al., 1995).

Watanabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy ảnh hưởng đến cả sự hìnhthành cellulose cũng như sức sản xuất màng Cellulose tăng trưởng dưới áp suất oxy thấp cĩ

sự phân nhánh nhiều hơn so với cellulose tăng trưởng trong điều kiện áp suất cao hơn Điềunày cĩ thể ảnh hưởng trực tiếp đến tính dai của lớp màng Hơn nữa, với áp suất oxy là 10%tính sản xuất cellulose cao hơn 25% mà khơng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào Sựtổng hợp cellulose tại áp suất 10% và 15% cao hơn so với điều kiện áp suất khí quyển Tuynhiên, hàm lượng oxy cao trên 50% lại hạn chế khả năng tổng hợp cellulose của vi sinh vật

(Yamanaka & Watanabe et al., 1995).

1.2.3.4 Aûnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sản phẩm cellulose vi khuẩn

ưu là 5 - 7 Masaoka et al (1993) thì thấy rằng khoảng này là 4 - 6 Qua các kết quả nghiên

cứu đĩ cho chúng ta kết luận rằng pH thấp hơn 7 là thích hợp cho sự tổng hợp cellulose và sự

phát triển của tế bào vi sinh vật A xylinum.

A xylinum đồng thời tổng hợp cả cellulose và cellulase Cellulase ít được tổng hợp ở

pH thấp (pH < 5) và được tổng hợp nhiều hơn ở pH cao Độ bền cơ học của tấm cellulose

nuơi cấy tại pH 4 cao hơn độ bền của tấm cellulose nuơi ở pH 6 (Toda et al., 1997).

2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Sự tổng hợp cellulose phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ Nhiệt độ từ 25 - 300C là thíchhợp cho sự tổng hợp cellulose (Canon & Anderson, 1991) Hầu hết các nghiên cứu đều sửdụng khoảng nhiệt độ từ 25 - 300C

Sự thay đổi nhiệt độ khơng những chỉ thay đổi hiệu suất tổng hợp cellulose mà cịnthay đổi cả cấu trúc của cellulose, đặc biệt là khả năng giữ nước và mức độ polymer hĩa

cellulose được sản xuất ở 300C có mức độ polymer hóa thấp hơn và khả năng giữ nước cao

hơn so với cellulose được sản xuất ở nhiệt độ thấp hơn (Geyer et al., 1994).

Nhiệt độ cao (khoảng 1000C trong 3 giờ) không gây ảnh hưởng cho cấu trúc cellulosenhưng nhiệt độ thấp (-20 0C) sẽ làm tăng tính mềm dẻo của cellulose vi khuẩn (Zou et al.,

2006)

1.2.3.5 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về quá trình tổng hợp cellulose của chủng A xylinum là môi trường do Hestrin và Schramm (1954) thiết lập, có nguồn nitơ là dịch chiết

nấm men và peptone với tỉ lệ tương ứng là 5:3 Từ khi thành phần môi trường này được đưa

ra, nó đã trở thành môi trường cơ bản cho hầu hết các nghiên cứu về sản xuất cellulose vikhuẩn Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã có sự thay đổi thành phần môi trường liên quanđến phần trăm của nitơ từ các nguồn khác nhau như dịch chiết nấm men, CSL (corn steepliquor), peptone, trypton, cao thịt, proteopeptone…Tất cả các nguồn nitơ này đều được ứngdụng, trong đó CSL là nguồn nitơ được cho là có hiệu quả nhất, tác động tăng trưởng tế bào

và tốc độ tạo cellulose cao so với các nguồn nitơ khác và đây cũng là nguồn nitơ có giá thành

tương đối rẻ (Klemm et al., 2001; Jonas et al., 1998; Toda et al., 1997).

Một vài amino acid bắt buộc phải có là methionine và glutamate Masaoka et al (1993)

đã chứng minh methionine có tác dụng quan trọng đến sự tăng trưởng tế bào và tăng hiệu suấttạo cellulose so với môi trường không có amino acid này

Các vitamin pyridoxine, nicotinic acid, p-aminobezoic acid và biotin được xác định làcần thiết cho sự tăng trưởng và tổng hợp cellulose, trong khi pantothanate và riboflavin cho

kết quả ngược lại (Yang et al., 1998).

2 Ảnh hưởng của nguồn carbon.

Rất nhiều cơ chất được sử dụng làm nguồn carbon cho sự hình thành cellulose bởi vi

khuẩn A xylinum Các chủng vi khuẩn khác nhau tổng hợp cellulose với những lượng khác

nhau đối với các cơ chất khác nhau

Glucose được xem là nguồn carbon tốt nhất cho A xylinum IFO 13693 tổng hợp

cellulose, lượng cellulose có thể đạt được lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau 2 - 4 ngày lên men