Tóm tắt luận văn nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ chủng Bacillus subtilis và ứng dụng khử protein nang mực trong quá trình sản xuất chitin

Chitin và chitosan hiện nay được ứng dụng trong nhiều các lĩnh vực như nông nghiệp, xử lý nước thải và y dược… Quá trình sản xuất chitin cần trải qua hai quá trình khử khoáng và protein. Hiện nay, quá trình khử protein trong nguyên liệu chủ yếu sử dụng bazơ mạnh là NaOH để khử, phương pháp này có nhược điểm gây ô nhiễm môi trường vì vậy cần có biện pháp thay thế. Biện pháp thay thế hiện nay đã và đang nghiên cứu là sử dụng phương pháp sinh học, trong đó sử dụng enzyme protease được sử dụng. Bằng phương pháp sinh học sẽ giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường. Enzyme protease thu từ nguồn là thực vật, động vật và vi sinh vật, trong đó vi sinh vật là nguồn thu enzyme nhanh và ổn định. Trong các visinh vật sinh enzyme protease thì Bacillus subtilis là một trong những chủng sinh protease mạnh và an toàn.

CẤU TRÚC LUẬN VĂN CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU (4 trang)

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU (22 trang)

CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (18 trang )

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN (13 trang)

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ (1 trang)

TÀI LIỆU THAM KHẢO (2 trang)

PHỤ LỤC (2 trang)

Luận văn được trình bày trong 68 trang, trong luận văn có sử dụng 12 bảng và

10 biểu đồ để trình bày kết quả nghiên cứu.Luận văn sử dụng 15 tài liệu tham khảo, trong đó có 10 tài liệu tiếng Việt và 5 tài liệu tham khảo từ internet

NỘI DUNG LUẬN VĂN CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Chitin và chitosan hiện nay được ứng dụng trong nhiều các lĩnh vực như nông nghiệp, xử lý nước thải và y dược… Quá trình sản xuất chitin cần trải qua hai quá trình khử khoáng và protein Hiện nay, quá trình khử protein trong nguyên liệu chủ yếu sử dụng bazơ mạnh là NaOH để khử, phương pháp này có nhược điểm gây ô nhiễm môi trường vì vậy cần có biện pháp thay thế Biện pháp thay thế hiện nay đã

và đang nghiên cứu là sử dụng phương pháp sinh học, trong đó sử dụng enzyme protease được sử dụng Bằng phương pháp sinh học sẽ giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường Enzyme protease thu từ nguồn là thực vật, động vật và vi sinh vật, trong đó vi sinh vật là nguồn thu enzyme nhanh và ổn định Trong các visinh

vật sinh enzyme protease thì Bacillus subtilis là một trong những chủng sinh

protease mạnh và an toàn Từ đó em tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu thu

nhận enzyme protease từ chủng Bacillus subtilis và ứng dụng khử protein nang

mực trong quá trình sản xuất chitin”.

1.2 Mục tiêu đề tài

- Xác định điều kiện nuôi Bacillus subtilis C7 để thu enzyme protease cao.

- Xác định điều kiện khử protein trong nang mực trong quá trình sản xuất

chitin

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Kiểm tra tính thuần của các chủng Bacillus subtilis C7

- Xác định điều kiện nuôi cấy Bacillus subtilis C7 để sinh enzyme protease cao

nhất

- Thử nghiệm thay thế NaOH bằng enzyme protease để khử protein nang mực

trong quá trình sản xuất chitin

1.4 Ý nghĩa đề tài

- Ý nghĩa khoa học: từ chủng Bacillus subtilis C7 thương mại, xác định các

điều kiện thích hợp nuôi cấy chủng Bacillus subtilis C7 có hoạt tính enzyme

protease cao Từ đó thu nhận enzyme protease để khử protein trong nang mực nhằm thay thế NaOH để giảm thiểu chi phí sản xuất chitin Biết và hiểu rõ các thao tác kỹ thuật trong quá trình làm đề tài

- Ý nghĩa thực tiễn: Thu nhận chế phẩm enzyme từ chủng Bacillus subtilis

C7 và tiến hành thay thế NaOH trong sản xuất chitin nhằm giảm giá thành và giảm

thiểu ô nhiễm môi trường

CHƯƠNG 2 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về enzyme

2.2 Tổng quan về enzyme protease

2.3 Tổng quan về Bacillus subtilis

2.4 Tổng quan về chitin

2.5 Tổng quan về phế liệu nang mực

CHƯƠNG 3 NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƯỢNG

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu và đối tượng

- Đối tượng nghiên cứu: chủng Bacillus subtilis C7 ( cung cấp bởi viện CNSH Trường Đại học Nha Trang)

- Vật liệu : Nang mực khô ( Kiên Giang)

- Môi trường sử dụng

- Môi trường kiểm tra tính thuần chủng Bacillus subtilis TSA (Trypticase soya

agar Tryptone 1,5%, Peptone 0,3%, NaCl 0,5%, Agar 1,5%, nước cất vừa đủ

- Môi trường khảo sát điều kiện nuôi cấy : TSB ( Trypticase soya Broth

Tryptone 1,7%, Peptone 0,3%, NaCl 0,5%, KH2PO4 0,25%, Glucose 0,25%, Nước

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu vi sinh

3.2.3 Bố trí thí nghiệm

3.2.3.1 Kiểm tra tính thuần khiết

3.2.3.2 Khảo sát môi trường nuôi cấy

3.2.3.3 Khảo sát nồng độ glucose vào môi trường nuôi cấy

3.2.3.4 Khảo sát bổ sung peptone vào môi trường nuôi cấy

3.2.3.5 Khảo sát bổ sung khoáng vào môi trường nuôi cấy

3.2.3.6 Khảo sát thời gian nuôi cấy

3.2.3.7 Khảo sát pH nuôi cấy

3.2.3.8 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

3.2.3.9 Khảo sát nhiệt độ hoạt động của enzyme protease

từ Bacillus sutilis C7

3.2.3.10 Khảo sát pH hoạt động thích hợp enzyme protease từ

Bacillus sutilis C7

3.2.3.11 Khảo sát tỷ lệ và thời gian thủy phân protein Nang mực

bằng enzyme protease chủng Bacillus subtilis C7

3.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

- Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Anson

- Xác định đạm acid amin theo phương pháp chuẩn độ Formol

- Phương pháp định lượng protein phản ứng Biuret

Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS

(viết tắt của Statistical Package for the Social Sciences)

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 4.1 Kiểm tra tính thuần khiết

tra khuẩn lạc Trên môi trường TSA khuẩn lạc đồng nhất, không tạp nhiễm vi sinh

vật khác Nhuộm gram Bacillus subtilis bắt màu gram + không có sự xuất hiện vi

khuẩn tạp nhiễm Kết luận ống giống thuần khiết Tiến hành thí nghiệm tiếp theo

4.2 Khảo sát môi trường nuôi cấy

4.2.1 Khảo sát loại môi trường nuôi cấy

Tiến hành cấy chủng Bacillus subtilis C7 vào 3 môi trường TSB, TSB +

Casein 0,25%, TSB + (CaCl2, MgSO4, KH2PO4 0,25%) Thu enzyme và xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp Anson Kết quả thể hiện qua sơ đồ hình 4.2.1

0 10 20 30 40 50 60 70

61

Môi trường nuôi cấy

Hình 4.2.1 Hoạt độ enzyme ở các môi trường

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy 3 loại môi trường có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme và hoạt độ enzyme Enzyme protease có hoạt độ cao nhất ở môi trường TSB + Khoáng 0,25% Ở môi trường TSB và môi trường TSB + Casein 0,5% , hoạt độ enzyme protease thấp hơn môi trường TSB + Khoáng 0,25% Theo

nhiều nghiên cứu, các ion Ca2+, Mg2+, K+ có ảnh hưởng tới hoạt độ enzyme protease Khi bổ sung các ion khoáng vào môi trường làm tăng hoạt độ enzyme protease Môi trường TSB + Casein 0,5%, nguyên nhân hoạt độ enzyme không cao

có thể do nồng độ casein cao tạo áp suất thẩm thấu lớn gay ức chế sinh sinh trưởng của vi khuẩn dẫn đến hoạt độ enzyme thu được thấp

Vì vậy ta chọn môi trường TSB + Khoáng (CaCl2, MgSO4, KH2PO4 0,25% ) để khảo sát các yếu tố tiếp theo

4.2.2 Khảo sát nồng độ peptone bổ sung

Tiến hành cấy chủng Bacillus subtilis C7 vào môi trường có bổ sung peptone

nồng độ từ 0,25% - 1,5% Thu enzyme và xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp Anson Kết quả thể hiện qua sơ đồ hình 4.2.2

52 54 56 58 60 62 64 66

60.47

65.18

59.45

60.98

57.29

58.82

Nồng độ Peptone(%)

Hình 4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ peptone đến hoạt độ

enzyme protease chủng Bacillus subtilis C7

Từ nghiên cứu cho thấy, nồng độ peptone bổ sung ít có ảnh hưởng đến

hoạt độ enzyme protease của chủng Bacillus subtilis C7 Ở nồng độ 0,5% hoạt

peptone lên hoạt độ enzyme giảm, thấp nhất ở nồng độ 1,25% hoạt độ 57,29 

cứu sau

4.2.3 Khảo sát nồng độ glucose bổ sung

Tiến hành cấy chủng Bacillus subtilis C7 vào môi trường có bổ sung glucose

nồng độ từ 0,25% - 2% Thu enzyme và xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp Anson Kết quả thể hiện qua sơ đồ hình 4.2.3

0 10

20

30

40

50

60

70

80

61

74

49

44

Nồng độ Glucose (%)

Hình 4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose đến hoạt độ

enzyme protease chủng Bacillus subtilis C7

Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ glucose bổ sung vảo môi trường

nuôi cấy có ảnh hưởng tới sự phát triển của Bacillus subtilis C7 và hoạt độ

enzyme protease Hoạt độ của enzyme tăng khi tăng nồng độ glucose từ 0,25% -0,75%, khi tiếp tục tăng nồng độ glucose đến 1,25% thì hoạt độ enzyme giảm Ở

tiếp tục tăng nồng độ glucose, hoạt độ enzyme giảm nhanh xuống thấp nhất ở

quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu làm giảm khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn và ảnh hưởng tới hoạt độ enzyme Ở nồng độ thấp, glucose

không đủ đáp ứng nhu cầu của vi khuẩn nên hoạt tính enzyme thu được thấp hơn Vậy ta chọn nồng độ glucose 1,5% để thực hiện các nghiên cứu sau

4.2.4 Khảo sát nồng độ khoáng bổ sung

Tiến hành bổ sung môi trường ba loại khoáng, nuôi cấy thu enzyme ở nhiệt độ phòng, pH =7, thời gian 24 giờ, chế độ lắc 160 vòng/ phút Sau thời gian nuôi cấy, thu dịch môi trường và xác định hoạt độ enzyme Kết quả được thể hiện trong Hình 4.2.4

0.0 10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

65.5 62.5

56.1

76.5

0.25% 0,50% 0,75%

Khoáng bổ sung

Hình 4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của khoáng đến hoạt độ

enzyme protease chủng Bacillus subtilis C7

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung khoáng vào môi trường nuôi cấy có

ảnh hưởng tới hoạt độ enzyme thu được Khi tăng CaCl2 từ 0,25 – 0,75% thì hoạt

MgSO4 thì hoạt độ enzyme không có sự khác biệt giữa mức 0,25 và 0,75%, ở mức 0,5% hoạt độ enzyme thu được thấp hơn hai nồng độ còn lại Khi bổ sung KH2PO4

là nguồn cung cấp kali và cũng là chất đệm giúp ổn định pH môi trường nuôi cấy

Từ các kết quả trên, ta chọn nồng độ CaCl2 bổ sung là 0,75%, MgSO4 là 0,25%, KH2PO4 là 0,5% để thu được enzyme có hoạt tính cao nhất và tiến hành các thí nghiệm sau

4.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy

4.3.1 Khảo sát thời gian nuôi cấy

Ta tiến hành nuôi cấy với các điều kiện đã chọn ở trên, nuôi cấy lắc 160 vòng/phút Tiến hành đo hoạt độ enzyme ở các mức thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ Kết quả được thể hiện qua Hình 4.3.1

0 10

20

30

40

50

60

70

50

60.34

Thời gian nuôi cấy(giờ)

Hình 4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới hoạt độ

enzyme protease chủng Bacillus subtilis C7

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng tới hoạt độ enzyme protease thu được Ở mức thời gian 24 – 48 giờ dinh dưỡng còn nhiều, vi khuẩn sinh trưởng mạnh tang sinh khối Khi tang thời gian nuôi cấy, dinh dưỡng moi trường giảm dần và vi khuẩn sinh trưởng chậm và enzyme thu được hoạt độ thấp hơn Vì vậy ta chọn mức thời gian nuôi cấy là 48 giờ để tiến hảnh nghiên cứu sau

4.3.2 Khảo sát pH môi trường nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy trên môi trường đã điều chỉnh pH từ 6 – 9 theo phương pháp nuôi cấy chìm Dịch nuôi cấy sau 24 giờ đem xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp Anson Kết quả được thể hiện trong hình 4.3.2 :

0 10

20

30

40

50

60

70

62

50

pH môi trường

Hình 4.3.2 1 Khảo sát ảnh hưởng của pH nuôi cấy tới hoạt độ enzyme

protease chủng Bacillus subtilis C7 Kết quả nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis C7 có pH sinh trưởng tương đối

rộng từ 6 -9 Khi thay đổi pH hoạt độ enzyme không thay đổi nhiều Hoạt độ enzyme protease đạt giá trị cao nhất tại pH 7,5 , ở giá trị pH 6 – 7 hoạt độ enzyme thay đổi không nhiều Khi pH tăng lên , hoạt độ enzyme có xu hướng giảm dần và

các thí nghiệm sau

4.3.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

Ta tiến hành nuôi cấy ở các điều kiện đã nghiên cứu ở trên, thời gian 24 giờ, chế độ, ở nhiệt độ phòng Kết quả nghiên cứu thể hiện trong Hình 4.3.3

30 37 40 45 50 0

10

20

30

40

50

60

70

52

66

Nhiệt độ nuôi cấy(oC)

Hình 4.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt độ

enzyme protease chủng Bacillus subtilis C7 Từ kết quả nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis C7 sinh trưởng và phát triển

phát triển vi khuẩn do đó làm giảm hoạt độ enzyme thu được Hoạt độ enzyme đạt

chủng Bacillus subtilis C7 để thu được enzyme có hoạt tính cao.

4.4 Khảo sát điều kiện thủy phân

4.4 Khảo sát điều kiện thủy phân protein nang mực

4.4.1 Khảo sát nhiệt độ hoạt động của enzyme protease

Sau khi nuôi cấy, ta thu dịch enzyme và tiến hành khảo sát nhiệt độ hoạt độ

hoạt động tối ưu cho en zyme protease của chủng Bacillus subtilis C7 Chọn

nhiệt độ thích hợp cho enzyme protease hoạt động tốt nhất

30 35 40 45 50 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

6

8

6

Nhiệt độ thủy phân(oC

Hình 4.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt độ

enzyme protease chủng Bacillus subtilis C7

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt động của

chủng Bacillus subtilis C7 hoạt động tốt nhất.

4.4.2 Khảo sát pH Hoạt động của enzyme protease

pH là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới sự hoạt động của enzyme Ta tiến hành thu enzyme protease, đem thủy phân với cơ chất casein ở pH từ 6 - 10 và xác định lượng acid amin bằng chuẩn độ formol Kết quả biểu hiện qua sơ đồ hìn 4.4.2

6 7 8 9 10 0.0

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

6.3

9.5

6.6

pH

Hình 4.4.2 Khảo sát pH hoạt động của enzyme protease của chủng

Bacillus subtilis C7

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, pH có ảnh hưởng đến độ hoạt động của

enzyme protease của Bacillus subtilis C7 Ở pH =7 lượng nitơ giải phóng nhiếu nhất 9,47μg, chứng tỏ ở pH = 7 enzyme protease của g, chứng tỏ ở pH = 7 enzyme protease của Bacillus subtilis C7 hoạt động

mạnh nhất Khi tăng giá trị pH lên 8,9,10 thì hoạt độ cua enzyme giảm dần và thấp

nhất ở pH 9 và 10 Vì vậy ta chọn pH = 7 để enzyme protease của Bacillus subtilis C7 hoạt động tốt nhất.

4.4.3 Khảo sát tỷ lệ enzyme và thời gian thủy phân

Tiến hành khảo sát bốn tỷ lệ enzyme và bốn mức thời gian, xác định lượng protwin còn lại trong mẫu nang mực,chọn chế độ thủy phân thích hợp Kết quả thể hiện qua hình 4.4.3

18 24 28 42 0

2

4

6

8

10

12

tỷ lệ E/S 10/1 tỷ lệ E/S 20/1 tỷ lệ E/S 30/1 tỷ lệ E/S 40/1

Thời gian thủy phân(giờ)

Hình 4.4.3 Khảo sát thời gian và tỷ lệ enzyme để thủy phân

protein nang mực bằng enzyme protease từ Bacillus subtilis C7

0

10

20

30

40

50

60

70

37

61

40

51

50

65 52

10/ 1 20/ 1 30/ 1 40/ 1

Thời gian khử

Hình 4.4.4 Hiệu suất khử protein nang mực bằng enzyme protease

chủng Bacillus subtilis C7

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy khi tăng thời gian khử protein nang mực thì lượng protein còn lại giảm dần theo các mức thời gian và hiệu suất khử protein tăng Tuy nhiên ở các mức từ 24 – 42 giờ thì lượng giảm không đáng kể

Khi tang tỷ lệ enzyme, khả năng khử protein tăng theo và hiệu suất tăng theo Ở mức thời gian 24 giờ, khả năng khử protein đạt cao nhất ở mức 40/1 nhưng không có khác biệt nhiều so với mức 30/1 Khi kéo dài thời gian thủy phân thì lượng protein giảm không đáng kể vì vậy ta chọn thời gian thủy phân 24 giờ và tỷ lệ enzyme/ nang mực là 30/1 để khư protein nang mực

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

Sau thời gian nghiên cứu để tài bước đầu đạt được những kết quả sau:

- Xác định điều kiện nuôi thu enzyme protease từ Bacillus subtilis C7

Nồng độ peptone bổ sung nồng độ 0,5%

Nồng độ glucose bổ sung nồng độ 1,5%

Khoáng bổ sung là CaCl2 0,75%, MgSO4 0,25%, KH2PO4 0,5%

Thời gian nuôi cấy là 48 giờ

 pH nuôi cấy là 7,5

- Xác định điều kiện hoạt động của enzyme protease từ Bacillus subtilis C7

Độ pH thủy phân là 7

Tỷ lệ khử enzyme/nang mực là 30/1 và thời gian thủy phân là 24h

5.2 Kiến nghị

- Tăng thời gian khảo sát nuôi cấy lên 48 giờ

- Tinh sạch chế phẩm enzyme protease

- Kết hợp phương pháp sinh học và hóa học trong khử protein nang mực

- Tiến hành sản xuất chitin từ nang mực bằng phương pháp sinh học