Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym

Bảng 19: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông...57 Bảng 20: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA 2 CHẾ PHẨM THUỐC

CHỨA ENZYM

Chủ nhiệm đề tài: TS ĐOÀN CAO SƠN

Cơ quan chủ trì đề tài:

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Năm 2010

MỤC LỤC

PHẦN A TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI 1

1 Mục đích nghiên cứu 1

2 Phương pháp đã được sử dụng để nghiên cứu 1

3 Kết quả nghiên cứu 2

4 Kết luận rút ra từ nghiên cứu 3

5.Về cải tiến kỹ thuật 5

6 Những đóng góp khác 5

7 Tiến độ thực hiện 6

PHẦN B NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ 7

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 7

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 7

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 9

2 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 9

2.1 Enzym bromelain 9

2.1.1 Cấu trúc và tính chất của enzym bromelain 9

2.1.2 Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học 10

2.1.3 Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym bromelain 13

2.2 Enzym Trypsin 13

2.2.1 Cấu trúc và tính chất của enzym trypsin 13

2.2.2 Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học 14

2.2.3 Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym trypsin 18

2.3 Enzym streptokinase 18

2.3.1 Cấu trúc và tính chất của enzym streptokinase 18

2.3.2 Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học của enzym streptokinase 19 2.3.3 Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym streptokinase 22

2.4 Enzym Streptodornase 23

2.4.1 Cấu trúc và tính chất của enzym streptodornase 23

2.4.2 Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học của enzym streptodornase 24

2.4.3 Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym streptodornase 25

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Hóa chất, chất chuẩn, mẫu nghiên cứu 26

3.1.1 Chất chuẩn 26

3.1.2 Dung môi, hóa chất: 26

3.1.3 Mẫu dùng để nghiên cứu xây dựng và thẩm định các quy trình 27

3.2 Thiết bị và dụng cụ 27

3.3 Phương pháp 28

3.3.1 Bromelain 28

3.3.2 Trypsin 28

3.3.3 Streptokinase 29

3.3.4 Streptodornase 29

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

4.1 Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm thuốc chứa bromelain và trypsin 30

4.1.1 Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của bromelain và trypsin 30

4.1.2 Thẩm định phươn g pháp xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm thuốc chứa bromelain và trypsin 34

4.2 Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm thuốc chứa streptokinase và streptodornase 43

4.2.1 Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của streptokinase và streptodornase 43

4.2.2 Thẩm định phương pháp đã xây dựng để xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm thuốc chứa streptokinase và streptodornase 50

4.3 Áp dụng các quy trình đã xây dựng để kiểm tra chất lượng của một số chế phẩm trên thị trường 67

4.3.1 Kiểm tra chất lượng một số chế phẩm chứa bromelain và trypsin 67

4.3.2 Kiểm tra chất lượng một số chế phẩm chứa Streptokinase và Streptodornase 68

4.4 Bàn luận về ý nghĩa thực tiễn của đề tài 69

5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70

5.1 Kết luận 70

5.2 Kiến nghị 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của L-cystein đến khả năng xác định hoạt tính của

bromelain 32

Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Tyrosin 34

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Bromelain 35

Bảng 4: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Bromelain 36

Bảng 5: Khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Bromelain 37

Bảng 6: Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp định lượng Bromelain 38

Bảng 7: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Trypsin 39

Bảng 8: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Trypsin trên viên Brolasin 40

Bảng 9: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Trypsin trên viên Kimoral-S41 Bảng 10: Khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Trypsin 41

Bảng 11: Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp định lượng Trypsin 42

Bảng 12: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose 50

Bảng 13: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose 51

Bảng 14: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose 52

Bảng 15: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose 53

Bảng 16: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Streptokinase bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose 54

Bảng 17: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông 55

Bảng 18: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông 56

Bảng 19: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Streptokinase bằng

phương pháp đo thời gian ly giải khối đông 57 Bảng 20: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Streptokinase bằng

phương pháp đo thời gian ly giải khối đông 58 Bảng 21: Kết quả định lượng Streptokinase của 1 số chế phẩm trên thị trường 59 Bảng 22: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptodornase 60 Bảng 23: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát

độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase 61 Bảng 24: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase 62 Bảng 25: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát

độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase 63 Bảng 26: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase 64 Bảng 27: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 1 trong thử nghiệm khảo

sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase 65 Bảng 28: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 2 trong thử nghiệm khảo

sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase 66 Bảng 29: Hàm lượng bromelain và trypsin trong một số chế phẩm 67 Bảng 30: Hàm lượng streptokinase và streptodornase trong một số chế phẩm 68

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ trong định lượng

Tyrosin 34Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ trong định lượng

Bromelain 35Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và chênh lệch độ hấp thụ trong

định lượng Trypsin 40Hình 4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit của nồng độ và logarit của đường

kính vòng ly giải 51Hình 5: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit của nồng độ và logarit của đường

kính vòng ly giải 52Hình 6: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit của nồng độ và logarit của đường

kính vòng ly giải 53Hình 7: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit nồng độ và logarit thời gian ly giải

khối đông trong định lượng streptokinase 55Hình 8: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit nồng độ và logarit thời gian ly giải

khối đông trong định lượng Streptokinase 56Hình 9: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và hệ số giảm độ nhớt trong

định lượng streptodornase 60Hình 10: Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn độ giảm độ nhớt theo thời gian của dung

dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase 61Hình 11: Đường tuyến tính biểu diễn giảm độ nhớt theo thời gian của dung dịch

chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase 63Hình 12: Đường tuyến tính biểu diễn giảm độ nhớt theo thời gian của dung dịch chuẩn

2 trong thử nghiệm khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase 66

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PHẦN A TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI

1 Mục đích nghiên cứu:

- Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của các enzym: Bromelain, Trypsin, Streptokinase và Streptodornase trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzym Bromelain, Trypsin và chế phẩm hỗn hợp Streptokinase, Streptodornase

- Áp dụng phương pháp xác đinh hoạt tính của các enzym Bromelain, Trypsin, Streptokinase và Streptodornase để kiểm tra chất lượng một số thuốc lưu hành trên thị trường và thẩm định, xét duyệt tiêu chuẩn

2 Phương pháp đã được sử dụng để nghiên cứu:

Đề tài Khoa học - Công nghệ “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hoạt

tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym” là nghiên cứu đầu tiên được thực hiện một

cách có hệ thống để thiết lập các quy trình xác định hoạt tính của 4 enzym trong các chế phẩm chứa hỗn hợp các enzym Những kết quả nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa thực tiễn cao Các quy trình xác định hoạt tính được thiết lập trong đề tài này đã được thẩm định chu đáo để chứng minh về sự phù hợp, độ tin cậy khi áp dụng xác định hoạt tính từng thành phần enzyme trong chế phẩm thuốc chứa hỗn hợp 2 enzym, góp phần nâng cao khả năng kỹ thuật của hệ thống kiểm nghiệm giám sát chất lượng thuốc

Các phương pháp định lượng được xây dựng hướng tới phù hợp về mặt kỹ thuật với điều kiện trang thiết bị hiện tại của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương và các

cơ sở thuộc hệ thống kiểm nghiệm thuốc nói chung Trong một số trường hợp, do chưa có phương pháp phù hợp, sau quá trình khảo sát sơ bộ, nhóm nghiên cứu đã phải tiến hành cải tiến các điều kiện phân tích cho phù hợp với đối tượng mẫu thuốc cần kiểm tra cũng như điều kiện trang thiết bị hiện có

Cụ thể, trong số 4 phương pháp xác định hoạt tính của 4 enzym thì chỉ có 2 phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym là Streptokinase (BP và CP) và Trypsin (USP) là có sẵn trong các dược điển ở chuyên luận thuộc về các nguyên liệu Còn phương pháp xác định hoạt tính của Bromelain chưa có trong dược điển

và Streptodornase chỉ có trong chuyên luận Streptokinase nguyên liệu và giới hạn

Streptodornase, vì vậy nhóm nghiên cứu đã thực hiện các bước sau:

1- Tham khảo các tài liệu để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Bromelain trong chế phẩm chứa hỗn hợp Bromelain và Trypsin

2- Tham khảo tài liệu USP để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Trypsin trong chế phẩm chứa hỗn hợp Bromelain và Trypsin

3- Tham khảo tài liệu BP 2003 và CP 2005 và các nguồn tài liệu khác để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Streptokinase trong chế phẩm chứa hỗn hợp Streptokinase và Streptodornase

4- Tham khảo các tài liệu hiện có để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Streptodornase trong chế phẩm chứa hỗn hợp Streptokinase và Streptodornase

5- Áp dụng 2 phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym Bromelain và Trypsin đã xây dựng để kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này có trên thị trường

6- Áp dụng 2 phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym Streptokinase và Streptodornase đã xây dựng để kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này có trên thị trường

3 Kết quả nghiên cứu:

- Đã thiết lập được 4 quy trình xác định hoạt tính của 4 enzym để định lượng

hoạt tính của các enzym trong 2 chế phẩm hỗn hợp là chế phẩm chứa hỗn hợp gồm

2 enzym Bromelain và Trypsin và chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym Streptokinase

và Streptodornase đạt các yêu cầu:

• Khoảng tuyến tính và hệ số tương quan

• Độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu

• Phù hợp với điều kiện trang thiết bị, hóa chất của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

- Đã thiết lập báo cáo kết quả xác định hoạt tính của enzym Bromelain và

Trypsin của 09 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này

- Đã thiết lập báo cáo kết quả xác định hoạt tính của enzym Streptokinase và

Streptodornase của 09 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này

.- Đã hoàn thiện được nội dung 4 bài báo khoa học, trong đó:

1/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Bromelain trong chế phẩm hỗn hợp chứa Bromelain và trypsin (Đã được đăng tạp chí Kiểm nghiệm số 2/2010) 2/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính enzym Streptokinase trong chế phẩm hỗn hợp chứa Streptokinase và Streptodornase bằng phương pháp đo vòng ly giải (Đã được đăng tạp chí Kiểm nghiệm số 3/2010)

2 bài báo còn lại đã được chuẩn bị hoàn tất về nội dung, nhóm nghiên cứu sẽ gửi đăng vào tháng 10/2010, cụ thể gồm các bài báo sau đây:

3/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Trypsin trong chế phẩm hỗn hợp chứa Bromelain và trypsin

4/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase trong chế phẩm hỗn hợp chứa Streptokinase và Streptodornase

4 Kết luận rút ra từ nghiên cứu:

- 4 quy trình định lượng xác định hoạt tính của 4 enzym Bromelain, Trypsin, Streptokinase và Streptodornase trong 2 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym đã được xây dựng, thẩm định dựa trên đối tượng nghiên cứu là các sản phẩm đang lưu hành trên thị trường Việt Nam Những quy trình này đã được chứng minh tính khả thi trong điều kiện cơ sở vật chất của nước ta, trên đúng đối tượng áp dụng là các chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym, do đó đây là những giải pháp kỹ thuật có ý nghĩa ứng dụng thực tiễn cao trong kiểm tra giám sát chất lượng thuốc chứa các hoạt chất enzym tại Việt Nam

- Trong quá trình thực hiện đề tài, qua những kết quả thực nghiệm, chúng tôi có một số nhận xét về tính mới sau:

a) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzyme Bromelain trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Bromelain và trypsin:

- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp với phương pháp quang phổ UV-VIS

- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym trypsin đến phương pháp xác định hoạt tính của bromelain trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này Kết quả trypsin không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của bromelain

b) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Trypsin trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Bromelain và trypsin:

- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp với phương pháp đo quang động học

- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym bromelain đến phương pháp xác định hoạt tính của trypsin trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này Kết quả bromelain không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của trypsin

c) Xây dựng phương p háp xác định hoạt tính của enzyme Streptokinase trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Streptokinase và streptodornase:

- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp với phương pháp đo thời gian ly giải khối đông và phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose

- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym streptodornase đến phương pháp xác định hoạt tính của streptokinase trong chế phẩm hỗn hợp chứa hỗn hợp 2 enzyme này Kết quả streptodornase không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của streptokinase

d) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzyme Streptodornase trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Streptokinase và streptodornase:

- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp với phương pháp đo thời gian giảm độ nhớt của dung dịch cơ chất AND

- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym streptokinase đến phương pháp xác định hoạt tính của streptodornase trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzyme này Kết quả streptokinase không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của streptodornase trên cơ chất ADN

5.Về cải tiến kỹ thuật:

- Cách xác định điểm dừng của phản ứng tiêu fibrin thực nghiệm (trong phương pháp xác định hoạt tính Streptokinase):

Theo dược diển Anh 2003: phương pháp xác định điểm dừng quan sát bằng mắt,

sử dụng đồng hồ bấm giây Trên thực tế điểm dừng rất khó quan sát

Theo dược diển Mỹ (chuyên luận ly giải fibrin của Alteplase bằng cách xác định bọt khí) thì cũng rất khó giam giữ bọt khí đồng đều trong các ống nghiệm, hơn nữa trong quá trình tạo bọt khí có ảnh hưởng lớn đến sự tạo fibrin nên kết quả không ổn định

Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã cải tiến cách xác định điểm ly giải hoàn toàn fibrin bằng quan sát sự rơi cận đáy của viên bi chuẩn cho phép xác định chính xác điểm dừng có độ đúng cao và dễ quan sát

- Phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase: Sử dụng nhớt kế Oswald với mao quản thích hợp thay vì thiết bị xác định độ nhớt bằng điện cực Platin có gắn bơm chân không Vì thiết bị này chưa có tại Việt Nam và rất đắt tiền, còn nhớt kế Oswald hiện có tại Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương

6 Những đóng góp khác:

a) Góp phần đánh giá chất lượng thuốc:

Các thuốc có bản chất là enzym rất đễ bị thay đổi về mặt chất lượng Hơn nữa các phương pháp xác định hoạt tính các enzym rất đa dạng, cách biểu thị hoạt tính enzyme tùy thuộc vào từng cơ sở sản xuất (có thể xác định theo IU hoặc mg hoặc các đơn vị khác theo qui định) Vì vậy để xây dựng được một phương pháp xác định hoạt tính của mỗi enzym sẽ góp phần nâng cao năng lực đánh giá chất lượng của nhóm hoạt chất "khó tính" này, đặc biệt là trên đối tượng chế phẩm phối hợp các enzym hiện đang lưu hành trên thị trường

b) Đào tạo:

- Qua quá trình thực hiện đề tài, năng lực kiểm nghiệm, đặc biệt là kiểm nghiệm enzym của các cán bộ tham gia nghiên cứu được cập nhật và nâng cao Góp phần đào tạo các cán bộ thử việc

- Trong quá trình thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu đã kết hợp chặt chẽ với trường Đại học Dược Hà Nội để gắn kết công tác nghiên cứu với đào tạo nhân lực cho ngành Dược Trong khuôn khổ đề tài, các kết quả nghiên cứu thu được đã đăng

ký luận án tốt nghiệp thạc sĩ dược học

Lý do phải kéo dài…

b Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đề ra:

• Thực hiện đầy đủ các mục tiêu đề ra

• Thực hiện các mục tiêu đề ra nhưng không hoàn chỉnh

• Chỉ thực hiện được một số mục tiêu đề ra

• Những mục tiêu không thực hiện được (ghi rõ)

c Các sản phẩn tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương:

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương

• Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng chất lượng có sản phẩm chưa đạt

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả các sản phẩm đều chưa đạt

chất lượng

• Tạo ra được một số sản phẩm đạt chất lượng

• Những sản phẩm chưa thực hiện được (ghi rõ)

d Đánh giá việc sử dụng kinh phí:

Tổng kinh phí thực hiện để tài: 450 triệu đồng

Trong đó Kinh phí sự nghiệp khoa học: 450 triệu đồng

Kinh phí từ nguồn khác: 0 triệu đồng

Trang thiết bị đã được đầu tư từ nguồn kinh phí của đề tài (chi phí những trang thiết

bị có giá trị trên 3000 USD): Không

Toàn bộ kinh phí đã được thanh quyết toán

Chưa thanh quyết toán xong: Không

PHẦN B NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Enzym là chất xúc tác sinh học, có vai trò quan trọng trong hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống Trong khoảng 20 năm trở lại đây, enzym đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực như trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y tế chăn nuôi, Hiện nay ước tính mỗi năm

có khoảng 300 000 tấn enzym được sản xuất với giá trị thương mại khoảng 1 tỷ USD, trong số đó chủ yếu là các enzym thủy phân, chiếm tới 75%

Trong lĩnh vực y tế, các thuốc có bản chất là enzym cũng đã và đang được nghiên cứu đầy đủ hơn về cấu trúc, cơ chế tác dụng, và những ứng dụng lâm sàng Một số thuốc enzym như các thuốc có chứa trypsin, chymotrypsin, bromelain, Papain, amylase, Streptokinase, Serratiopeptidase được sử dụng như là thuốc hỗ trợ trong điều trị một số bệnh liên quan và đã chứng minh được hiệu quả điều trị của chúng như trong điều trị kháng viêm, chống phù nề trong ngọai khoa, trong điều trị nhồi máu cơ tim, viêm tắc mạnh do huyết khối, hỗ trợ trong điều trị ung thư, sử dụng phối hợp nhằm làm tăng hiệu quả kháng khuẩn của thuốc kháng sinh Chính nhờ các hiệu quả điều trị như vậy, nhiều chế phẩm thuốc chứa enzym đã được cấp

số đăng ký cho phép lưu hành tại Việt nam

Trước đây trên thị trường Việt Nam chỉ có các chế phẩm sử dụng đơn thành phần streptokinase trong điều trị và chuyên luận streptokinase đã được đưa vào Dược thư quốc gia Hiện nay, để tăng hiệu quả điều trị, các chế phẩm thuốc chứa đồng thời 2 enzym streptokinase và streptodornase đã được nhập vào nước ta trong những năm gần đây để điều trị chống viêm nói chung và đặc biệt trong hỗ trợ điều trị nhồi máu cơ tim, viêm tắc huyết khối Chế phẩm hỗn hợp trypsin và bromelain được sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa, hỗ trợ điều trị ung thư

Về phương pháp kiểm nghiệm các enzym này, trong các dược điển mới chỉ

có Dược điển Anh quy định chuyên luận nguyên liệu Streptokinase, chưa có chuyên luận của streptodornase nguyên liệu và các dạng chế phẩm, đặc biệt là chế phẩm phối hợp gồm streptokinase và streptodornase

Đối với enzym bromelain và trypsin, trong Dược điển Anh và Dược điển Mỹ mới có chuyên luận nguyên liệu Trypsin, chưa có chuyên luận về chế phẩm

Các tiêu chuẩn chất lượng của các chế phẩm hiện có trên thị trường vẫn chưa được thẩm định, đánh giá một cách đầy đủ Đặc biệt là tiêu chuẩn của chế phẩm hỗn hợp Streptokinase và streptodornase do các nhà sản xuất cung cấp vẫn chưa thực hiện được với điều kiện của các cơ sở kiểm nghiệm trong nước do không có trang thiết bị chuyên dụng

Từ các lý do trên, việc đánh giá chất lượng của các chế phẩm này hiện nay vẫn còn hạn chế, và thực tế là chưa kiểm tra chất lượng các chế phẩm hỗn hợp Streptokinase và streptodornase Trong khi đó enzym được coi là loại thuốc sinh học, có bản chất protein nên rất dễ bị giảm hoạt tính trong các điều kiện bảo quản không tốt hoặc bị thoái biến theo thời gian nên không có tác dụng điều trị

Để thực hiện nhiệm vụ này đòi hỏi phải có sự đầu tư nghiên cứu để xây dựng các phương pháp xác định họat tính của các chế phẩm enzym nhằm áp dụng cho công tác kiểm tra chất lượng thuốc trong điều kiện hiện có của hệ thống kiểm nghiệm

Trong thời gian gần đây, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương đã tiến hành nghiên cứu và xây dựng được một số phương pháp, quy trình kiểm tra chất lượng của một số dạng chế phẩm enzym Tuy nhiên, do điều kiện kinh phí hạn hẹp, việc nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở một số chế phẩm enzym đơn thành phẩn và đơn giản

Chính vì vậy, việc nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp

xác định hoạt tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym” là thực sự cần thiết và

hữu ích nhằm nâng cao năng lực kiểm tra, giám sát chất lượng đối với các sản phẩm thuốc có nguồn gốc sinh học với điều kiện trang thiết bị hiện có của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và các Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm trên toàn

quốc, đồng thời hỗ trợ cho các phòng kiểm nghiệm của các công ty sản xuất thuốc trong nuớc trong việc kiểm tra chất lượng các dạng thành phẩm này, góp phần kiểm soát chất lượng thuốc trên thị trường

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được thực hiện theo 3 mục tiêu chính sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hoạt tính của chế phẩm kết hợp 2 enzym bromelain và trypsin

2 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hoạt tính của chế phẩm kết hợp 2 enzym streptokinase và streptodornase

3 Áp dụng các phương pháp để kiểm tra chất lượng một số chế phẩm tương

tự lưu hành trên thị trường

2 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

2.1 Enzym bromelain

2.1.1 Cấu trúc và tính chất của enzym bromelain

Enzym bromelain lần đầu tiên được phát hiện bởi nhà hóa học người Venezuela Viente Marcane vào năm 1891 từ nước ép của quả dứa [18] Năm 1982, Chitenden, cộng tác với Joslin và Meara đã đi sâu nghiên cứu đầy đủ hơn và gọi dịch chiết xuất đó là Bromelain Sau đó, thuật ngữ Bromelain được dùng để chỉ các enzym protease từ các thân và quả của họ dứa Bromeliaseae Bromelain được chỉ định là thuốc hỗ trợ điều trị một số bệnh vào năm 1957 Những nghiên cứu về Bromelain lần đầu tiên được tiến hành ở Hawai, nhưng hiện nay, các nước châu Á, châu

Âu và Châu Mỹ la tinh quan tâm đến nghiên cứu Bromelain nhiều hơn, đặc biệt là ở Đức, Bromelain được sử dụng rộng rãi, đứng thứ 13 trong số các thảo dược

Năm 1964 Murachi và cộng sự đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzym Bromelain, kết quả như sau [1]:

Trọng lượng phân tử: 33200 - 33500 Dalton

Bromelain là enzym thuộc nhóm enzyme thiol (Cystein) protease, có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein thành các đoạn nhỏ Thành phần hóa học của Bromelain là một glycoprotein Mỗi phân tử có chứa 1 chuỗi oligosaccharid (glycan) gồm 3 manose, 2 glucosamin, 1 xylose và 1 fructose Tùy theo phương pháp thu nhận mà thành phần acid amin thay đổi khác nhau, trong khoảng 121 - 144 acid amin Hơn nữa, Bromelain trong các bộ phận khác nhau của cây dứa cũng có thành phần hóa học khác nhau như polypeptid của Bromelain thân

có acid amin (đầu -NH2) là valin hoặc glycine, còn Bromelain quả lại có acid amin (đầu -NH2) là alanine [11]

Hoạt tính của Bromelain biểu thị khác nhau trên những cơ chất khác nhau

So với protease thực vật khác như papain cho thấy: khả năng phân giải hemoglobin của Bromelain mạnh gấp 4 lần so với papain, nhưng nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của 2 enzym này tương đương nhau, còn đối với cơ chất tổng hợp thì hoạt tính của bromelain lại kém hơn Bromelain có khả năng thủy phân protein, peptid, amid

và các ester của amid và peptid [1]

2.1.2 Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học

Cơ chế tác động của enzym bromelain đã được làm sáng tỏ: các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm -SH của cystein và nhóm imidazol trong hoạt động thủy phân của bromelain Nhóm -SH tham gia tạo thành acyl-thioester trong gốc carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết bị cắt) Nhóm Imidazol làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận, giữ vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain Cụ thể, khi dùng casein hoặc hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên, trước tiên bromelain kết hợp với protein và thủy phân chúng để tạo thành các oligopeptid và acid amin Tiếp theo nhóm -SH của enzym khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazol sẽ khử ester để giải phóng enzym (Hình 1)

Hình 1: Sơ đồ cơ chế xúc tác của enzym Bromelain

Cũng giống như các loại chất sinh học khác, Bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH, ion kim loại Ở điều kiện bảo quản 40C, hoạt tính sinh học của Bromelain không bị giảm trong khoảng 6 tháng, nhưng nếu ở 550C, pH 6,0 thì hoạt tính có thể bị giảm tới 50% trong vòng 20 phút Biên độ pH của Bromelain khá rộng từ 3-10, nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-9 Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của Bromelain là do thường gắn vào trung tâm hoạt động của enzym Bromelain bị ức chế bởi các ion hoặc những hợp chất có

ái lực mạnh hơn nhóm -SH như iodoacetat, methyl bromid, clo acetophenol, Hg 2+,

H2O2 Trong khi đó, một số ion kim loại như Zn2+, Fe2+, Ag+, lại làm ổn định cấu trúc phân tử của Bromelain

Hiện nay, bromelain được sản xuất bằng cách tinh chế từ hỗn hợp chiết xuất trực tiếp từ cây dứa và thành phẩm tạo ra ở dạng viên nang hoặc viên nén, được dùng trong điều trị Ngoài tác dụng tham gia vào quá trình đồng hóa protein trong thức ăn, Bromelain còn có nhiều tác dụng khác ở ngoài đường tiêu hóa Trên thực

tế, Bromelain được biết đến như là một thuốc kháng viêm tự nhiên và được ứng dụng ngày càng nhiều trong điều trị như là một thuốc hỗ trợ:

Trong phẫu thuật hoặc tổn thương:

Bromelain hỗ trợ làm giảm sưng, các vết thâm tím, viêm hoặc đau sau phẫu thuật hoặc thương tổn, đặc biệt trường hợp bị bỏng, bromelain giúp mau chóng lành vết thương

Trong điều trị viêm xoang:

Bromelain được khuyến cáo như là thuốc điều trị hỗ trợ cho viêm xoang, làm giảm sự xung huyết, gây dễ thở và ức chế ho, làm giảm các triệu chứng viêm xoang

Nó là 1 trong những thuốc hỗ trợ điều trị thịnh hành ở Đức, được Hội đồng Điều trị của Đức chỉ định trong điều trị viêm sưng ở mũi và xoang mũi do phẫu thuật hoặc

do tổn thương từ năm 1993 [5]

Trong tiêu hóa :

Bromelain là thuốc hỗ trợ giúp tiêu hóa tự nhiên là do có khả năng tiêu hủy protein, được dùng trong các trường hợp có các hội chứng sưng, sinh hơi và hội chứng dạ dày bị kích thích Bromelain được sử dụng ở dạng đơn thành phần hoặc phối hợp với các enzym khác như với Lipase (enzym tiêu hủy chất béo), với amylase (enzym tiêu hủy tinh bột) hoặc với trypsin (enzym tiêu hủy protein) Tuy nhiên hiện nay các nghiên cứu về tính an toàn và hiệu quả của Bromelain trong điều trị các bệnh về đường tiêu hóa vẫn đang được tiếp tục

Trong điều trị viêm xương khớp:

Bromelain có tác dụng trợ giúp làm giảm đau khi bị viêm khớp xương, nhưng chưa được nghiên cứu lâm sàng trên phạm vi lớn để đánh giá tính hiệu quả Trong điều trị ung thư:

Bromelain và nhóm enzym protease cũng được dùng như là thuốc hỗ trợ điều trị ung thư trong 1 số nghiên cứu lâm sàng trên trên bệnh nhân ung thư: Bromelain tác dụng như một yếu tố điều hòa miễn dịch bằng cách làm tăng khả năng gây độc

tế bào của các tế bào đơn nhân để kháng lại các tế bào ung thư của bệnh nhân và bằng cách kích thích tổng hợp các cytokin như yếu tố gây hoại tử khối u (Tumor

necrosis factor-a), interleukin -1β, interleukin-6 và Interleukin-8 Một số nghiên cứu trên động vật thí nghiệm đã thu được kết quả khả quan về hiệu quả ngăn ngừa các

tế bào ung thư di căn khi phối hợp bromelain với dược chất nghiên cứu có hoạt tính diệt tế bào ung thư [18]

2.1.3 Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym bromelain

Hoạt tính của enzym Bromelain được xác định dựa trên khả năng thủy phân các cơ chất khác nhau, cụ thể như sau:

Thủy phân cơ chất là casein: tạo ra sản phẩm là tyrosin Định lượng tyrosin bằng phương pháp quang phổ UV-VIS Hoạt tính được xác định theo lượng tyrosin:

1 đơn vị bromelain là lượng enzym có khả năng thủy phân casein để giải phóng 1 mcg tyrosin trong 1 phút trong điều kiện nhất định [3, 4]

Thủy phân cơ chất là gelatin: tạo ra sản phẩm là acid amin Định lượng acid amin bằng phương pháp chuẩn độ acid kiềm [7]

Thủy phân cơ chất Nα- carbobenzoxy-L-lysin p-nitrophenyl ester: tạo ra sản phẩm p-nitrophenol, làm thay đổi giá trị độ hấp thụ quang của dung dịch theo thời gian Hoạt tính của bromelain được xác định dựa theo lượng p-nitrophenol tạo thành

Thủy phân các protein có trong hỗn dịch sữa làm đông vón hỗn dịch sữa Hoạt tính của bromelain được xác định bằng cách so sánh thời gian đông vón sữa với chất chuẩn đã biết hoạt tính

2.2 Enzym Trypsin

2.2.1 Cấu trúc và tính chất của enzym trypsin

Enzym trypsin có mặt trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật có xương sống, có khả năng thủy phân protein Trypsin được sản xuất tại tuyến tụy dưới dạng tiền enzym là trypsinogen với trọng lượng phân tử là 34 Kdalton, sau khi cắt chuỗi gồm 6 acid amin ở đầu N tạo thành trypsin hoạt động có trọng lượng phân tử 23,8 KDalton Phân tử trypsin là 1 chuỗi peptid đơn có khoảng 223 acid amin [26]

Khi tuyến tụy bị kích thích bởi cholecystokinin sẽ tiết trypsinogen vào ruột non Tại đó, enzym peptidase trong ruột (Enteropeptidase) sẽ hoạt hóa chúng để tạo thành trypsin Tuyến tụy tổng hợp 3 dạng đồng phân của trypsinogen là trypsinogen-1 (cation trypsinogen), trypsinogen-2 (anion trypsinogen), và trypsinogen-3 (mesotrypsinogen) Trypsinogen-1 và trypsinogen-2 là hai dạng chính chịu trách nhiệm tiêu hóa protein với tỷ lệ 2:1, trong khi mesotrypsin chỉ chiếm 5% trong tổng số dịch tiết của tuyến tụy, không bị các chất ức chế trypsin tác động Mesotrypsin là một protease biệt hóa , có vai trò đặc biệt trong việc phá hủy các chất ức chế trypsin, nên có ích trong việc tiêu hóa các thực phẩm giầu chất ức chế trypsin như đậu tương Bản thân trypsin hình thành cũng lại tự động hoạt hóa trypsinogen Do đó chỉ cần một lượng nhỏ enzym Enteropeptidase đủ để khởi động quá trình hoạt hóa [15]

2.2.2 Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học

Trong cơ thể tự nhiên, trypsin được tiết vào tá tràng, nó xúc tác quá trình thủy phân các peptid bằng cách cắt các liên kết peptid thành các acid amin cấu thành sau khi các protein thức ăn đã được tiêu hóa một phần bởi enzym pepsin trong

dạ dày Cơ chế xúc tác của enzym tương tự như các enzym serin protease khác: Trypsin cắt chuỗi peptid tại vị trí có acid amin lysin hoặc arginin ở phía gốc carboxyl

Trypsin là enzym thuộc nhóm serin protease Nhóm serin protease gồm những enzym có chứa nhóm -OH của gốc serin trong trung tâm hoạt động, có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này gồm 2 nhóm nhỏ là chymotrypsin và subtilisin Nhóm subtilisin gồm 2 loại enzyme vi khuẩn là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN Các serin protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng [21]

Trypsin có chứa trung tâm hoạt động gồm bộ ba các acid amin là histadin-57, aspartat-102 và serin-195 Bộ ba acid amin này nằm sát gần nhau và đóng vai trò cần thiết trong hoạt tính phân hủy protein của các enzym protease do hình thành 1

“rơ le” tích điện để tạo ra vị trí hoạt động là serin ái nhân bằng cách thay đổi mật độ

điện tử của serin Gốc acid amin aspartat (Asp 189) định vị trong trung tâm xúc tác của trypsin làm ổn định gốc lysin và gốc arginin tích điện dương, do vậy nó có vai trò trong tính đặc hiệu của enzym, có nghĩa là trypsin cắt protein ở đầu C tại vị trí acid amin lysin và arginin Toàn bộ các phản ứng được tóm tắt qua 5 bước như sau [ 22]: Bước 1: Cơ chất polypeptid gắn lên bề mặt của enzym sao cho liên kết bị cắt nằm vào vị trí hoạt động của enzym bằng cách nguyên tử carbon của gốc carbonyl định

vị gần với gốc serin ái nhân

Bước 2: Gốc – OH của serin tấn công vào nguyên tử carbon và nitơ của gốc histidin nhận –H từ -OH của serin và cặp điện tử từ liên kết đôi –C=O di chuyển về phía nguyên tử oxy

Bước 3: Liên kết giữa Nitơ và carbon của mạch peptid bị bẻ gãy Các điện tử hóa trị của liên kết này di chuyển để tấn công vào nguyên tử -H của histidin làm gãy mối liên kết Các điện tử đã chuyển dịch về phía nguyên tử oxy trong gốc carbonyl trước đó lại di chuyển ngược lại để tái tạo lại liên kết hình thành sản phẩm trung gian acyl-enzym

Bước 4: Lúc này, phân tử nước tham gia vào phản ứng Nước thế chỗ cho đầu –N của mạch peptid bị cắt và tấn công vào nguyên tử carbon của gốc carbonyl Một lần nữa, các điện tử của liên kết đôi –C=O di chuyển về phía nguyên tử oxy làm cho nó tích điện âm, hình thành liên kết giữa oxy của nước với nguyên tử carbon, đồng thời nitơ của Histidin nhận proton từ nước

Bước 5: Trong phản ứng cuối cùng này, liên kết hình thành trong bước 1 giữa nguyên tử carbon của gốc carbonyl và serin lại di chuyển để tấn công vào nguyên tử –H mà histidin vừa nhận được Lúc này nguyên tử carbon tái tạo lại liên kết đôi với nguyên tử oxy Kết quả mạch peptit ở đầu –C bị tách ra (Hình 2)

Hình 2: Sơ đồ cơ chế xúc tác của enzym trypsin

Do vị trí cắt của enzym nằm phía trong của chuỗi polypeptid nên trypsin được phân loại là enzym peptidase nội phân tử (endopeptidase)

Trypsin có cấu trúc phân tử tương tự như của enzym chymotrypsin, tuy nhiên chúng khác nhau ở loại cơ chất cần phân giải: trypsin cắt protein tại vị trí lysin và arginin, còn chymotrypsin lại cắt tại các gốc kỵ nước như tryptophan, tyrosin và phenylalanin

Hoạt tính của trypsin không bị ảnh hưởng bởi chất ức chế tosyl phenylalanin chloromethyl keton (TPCK), là khác so với chymotrypsin Trong cơ thể, sự thiếu hụt trypsin có thể gây những bất thường: ví dụ như bệnh u xơ có tính di truyền trên nhiễm sắc thể là do thiếu hụt vận chuyển của trypsin và các enzym tiêu hóa khác từ tuyến tụy dẫn đến hiện tượng tắc phân ở trẻ sơ sinh

Trypsin có pH tối ưu ở khoảng 8,0 – 9,0 và nhiệt độ tổi ưu khoảng 370C Trypsin cần được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (-200C đến - 800C) để tránh sự tự phân hủy Quá trình tự phân hủy có thể được ngăn ngừa bằng cách bảo quản trypsin ở pH

3 hoặc bằng cách sử dụng trypsin đã được methyl hóa Khi pH được điều chỉnh lại 8 thì hoạt tính của trypsin được phục hồi Trypsin dễ tan trong nước, không hòa tan trong Triclomethan, ethanol, glycerin Ion Ca2+ đóng vai trò bảo vệ và hoạt hóa trypsin Trypsin bị ức chế bởi các thành phần có chứa phosphat hữu cơ như diisopropylfluorophosphat và các chất ức chế tự nhiên có trong tuyến tụy Hạt đậu tương, lòng trắng trứng cũng có các chất ức chế tự nhiên đối với trypsin

Ứng dụng của enzym trypsin:

Trypsin có mặt với số lượng lớn trong tuyến tụy và có thể tinh chế tương đối dễ dàng Chính vì vậy trypsin được sử dụng rộng rãi như là thuốc hỗ trợ điều trị giống như Bromelain: giúp cho sự lưu thông thể dịch ở vị trí viêm cũng như ức chế quá trình viêm để thúc đẩy nhanh chóng sự phục hồi của mô và làm giảm các triệu chứng liên quan đến tình trạng viêm

Trypsin được ứng dụng nhiều trong quá trình sản xuất bằng công nghệ sinh học như: các sản phẩm được sản xuất trên tế bào, các kháng huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu Trong nuôi cấy tế bào, trypsin được dùng để tách các tế bào bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy và thu được hỗn dịch tế bào

Trong nghiên cứu sinh học, trypsin được dùng trong các thử nghiệm trên các phân tử protein để thủy phân protein thành các mạch peptid cho việc phân tích khối phổ do trypsin có tính đặc hiệu cao, chỉ thủy phân liên kết peptid tại gốc carbonyl của acid amin là Arginin và Lysin

Trypsin có thể được sử dụng trong công nghệ sản xuất sữa, thực phẩm cho trẻ nhỏ, do trypsin có khả năng phân cắt các phân tử protein trong sữa giúp trẻ tiêu hóa dễ dàng hơn

2.2.3 Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym trypsin

Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất để xác định hoạt tính của trypsin là trên cơ chế thủy phân cơ chất N-benzoyl-L-arginin ethyl ester như sau:

Trypsin N-benzoyl-L-arginin ethyl ester N-benzoyl-L-arginin + Ethanol

Trên cơ sở sản phẩm tạo thành có hai cách để xác định hoạt tính của trypsin:

- Theo Dược điển Mỹ, giá trị hấp thụ của dụng dịch theo thời gian và hoạt tính của Trypsin được xác định bằng cách quy đổi từ sự biến thiên giá trị của độ hấp thụ [3,28]

- Theo Dược điển Anh, lượng N-benzoyl-L-arginin tạo thành làm thay đổi

pH của hỗn hợp phản ứng Hoạt tính enzym trypsin được tính toán bằng cách so sánh với chất chuẩn đã biết hoạt tính, dựa trên thể tích dung dịch natri hydroxyd cần thiết để duy trì pH tại giá trị 8,0 [27]

2.3 Enzym streptokinase

2.3.1 Cấu trúc và tính chất của enzym streptokinase

Streptokinase được phát hiện vào năm 1933, do Bác sỹ William Smith Tilett người Mỹ một cách hoàn toàn tình cờ trong một thử nghiệm: Ông lấy huyết tương người từ máu có chứa chất chống đông oxalat để loại bỏ Ca++ nên không bị đông Sau đó ông bổ sung Ca++ vào ống chứng, liên cầu khuẩn và canxi vào các ống thử với hy vọng là các vi khuẩn sẽ hấp phụ fibrinogen trong huyết tương để ngăn ngừa hình thành cục đông Nhưng ông đã thất vọng khi tất cả các ống nghiệm, kể cả ống nghiệm chỉ chứa liên cầu khuẩn cũng bị đông Sau một thời gian tìm hiểu nguyên nhân không thành công của thử nghiệm trước khi loại bỏ các ống nghiệm, tình cờ ông quan sát thấy có dung dịch lỏng xuất hiện trong các ống thử có chứa liên cầu khuẩn Điều này đưa ông đến kết luận rằng các liên cầu khuẩn đã tổng hợp một yếu

tố ly giải fibrin nên làm tan các cục đông Ông gọi yếu tố ly giải fibrin này là fibrinolysin Ông cũng đã đưa ra kết luận về tính đặc hiệu cao của yếu tố này là chỉ làm ly giải khối đông của người mà không ly giải cục máu đông của các động vật khác [19]

Vào cuối năm 1933, Garner và Tillett đã phân lập thành công fibrinolysin từ liên cầu khuẩn ở dạng bền vững và chứng minh được bản chất protein của enzym này Đến năm 1945, Christensen và Macleod sử dụng thuật ngữ Streptokinase thay thế cho fibrinolysin [19]

Việc sử dụng và nghiên cứu thuốc làm tan huyết khối để điều trị các trường hợp có khối huyết và /hoặc các rối loạn huyết khối tắc mạch bắt đầu từ năm 1933 về tác dụng phân hủy fibrin của các chất từ cầu khuẩn tan huyết beta Tuy nhiên do nguy cơ chảy máu và số liệu về hiệu quả không đầy đủ của thuốc trong thời gian đó nên việc dùng thuốc làm tan huyết khối bị hạn chế Dẫn liệu đầu tiên sử dụng trị liệu làm tan huyết khối để điều trị nhồi máu cơ tim bắt đầu vào năm 1958 khi Fletcher sử dụng trị liệu streptokinase liều cao, kéo dài và được coi là thuốc thần kỳ (“magic drug”) Nhưng phải đến những năm 1980 các thuốc làm tan huyết khối trong đó có streptokinase được công nhận trong trị liệu làm tan huyết khối và thực

tế đã cứu sống hàng nghìn người mỗi năm đặc biệt trong nhồi máu cơ tim cấp Phân tử Streptokinase là một mạch polypeptid đơn, có trọng lượng phân tử khoảng 47 KDa gồm 415 acid amin được sản xuất bởi phần lớn các Streptococcus thuộc nhóm A, C và G Trong phân tử có chứa acid amin cystin, không chứa cystein

và không hình thành liên kết disulphid, tổng số gồm 69 gốc carbocyl, 61 gốc bazơ với 170 (41%) gốc kị nước [20]

2.3.2 Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học của enzym streptokinase

Streptokinase thuộc nhóm thuốc làm tan huyết khối Bình thường, trong cơ thể luôn tồn tại một hệ thống tiêu hủy fibrin là một hệ enzym nội sinh hòa tan huyết khối trong lòng mạch thông qua plasmin làm tiêu fibrin Hoạt tính hủy fibrin được duy trì bình thường trong cân bằng nội mô bởi một số chất ức chế tuần hoàn Khi sử dụng thuốc tan huyết ngoại sinh streptokinase, SK kết hợp với plasminogen theo tỷ

lệ đồng phân tử để tạo thành phức hợp SK-plasminogen Phức hợp này biến đổi plasminogen không liên kết khác bằng cách cắt liên kết arginin-valin ở vị trí 560 của plasminogen để tạo thành plasmin Plasmin là một enzym có khả năng phân hủy fibrin mạnh do đó làm tan cục máu đông [10]:

Cơ chế hoạt động cụ thể của Streptokinase như sau: Phân tử streptokinase được phân chia thành 3 vùng ký hiệu là α, β và γ Vùng α là chuỗi peptid có các acid amin từ 1 đến 150, vùng β có các acid amin từ 151 đến 287 và vùng γ có các acid amin từ 288 đến 414 Mỗi vùng đều gắn với plasminogen nhưng không thể hoạt hóa nó 1 cách độc lập Kết quả plasmin được tạo thành trong máu làm tiêu hủy các sợi tơ huyết trong cục máu đông, do đó làm tan cục máu Khi được hoạt hóa, plasminogen bị cắt tại kiên kết Arg 561 - Val 562 Sau đó gốc amin của Val 562 tạo cầu muối với Asp 740, làm thay đổi cấu trúc phân tử để hình thành enzym hoạt hóa plasmin Khi SK có mặt, nó gắn vào plasminogen thành phức hợp (SK.Plgn) và biến đổi cơ chất Plgn thành Pm Chuỗi acid amin 1-59 của SK đóng vai trò điều tiết khả năng trình diện vị trí hoạt động của nó trong việc gắn với Plgn theo cơ chế không thủy phân protein Phức hợp tạo thành sắp xếp lại cấu trúc phân tử tạo thành phức hợp hoạt hóa nhưng liên kết Arg 561-Val 562 vẫn được giữ nguyên Do đó phải có một gốc acid amin khác thay thế cho gốc amin tự do của Val 562 và cung cấp gốc acid amin liên kết với Asp 740 trong phức hợp hoạt hóa Có 2 gốc thay thế

là Ile 1 của streptokinase và Lys 698 của Plgn Một nghiên cứu chỉ ra rằng việc loại

bỏ Ile 1 của Streptokinase làm ức chế khả năng trình diện trung tâm hoạt động của

nó đối với plasminogen, điều này khẳng định giả thuyết là việc hình thành cầu muối giữa Ile 1 của SK và Asp 740 của Plgn là cần thiết để tạo thành phức hợp SK.Plgn theo cơ chế không ly giải protein Ngược lại, các đột biến Lys 698 cũng làm giảm hằng số phân ly của phức hợp từ 15 đến 50 lần Có nghiên cứu cho rằng Lys 698 tham gia vào hình thành phức hợp SK.Plgn ban đầu [24]

Trong cơ thể ngoài enzym streptokinase, còn có những yếu tố khác [2] có thể hoạt hóa plasminogen là:

- Yếu tố hoạt hóa plasminogen của mô (Tissue plasminogen activator- tPA)

- Yếu tố XII hoạt hóa

- Các enzym của lysosom từ mô tổn thương

- Urokinase

Không giống với các yếu tố hoạt hóa plasminogen từ mô của người, Streptokinase không bị điều hòa bởi các yếu tố ức chế có trong plasma bình thường (là α2-anti-plasmin và α2- macroglobulin) và một tác dụng không mong muốn thứ phát và tiềm tàng của streptokinase là gây cảm ứng việc đáp ứng của chất trợ đông thông qua việc tăng giải phóng thrombin Mặc dù đáp ứng chất trợ đông xảy ra với tất cả các thuốc tan huyết khối nhưng streptokinase biểu hiện rõ hơn cả

Do sản lượng của streptokinase được sản xuất theo con đường cũ là nuôi cấy chủng streptococcus nhóm C thấp, kèm theo khả năng gây bệnh của bản thân chủng

vi khuẩn, nên hiện nay xu hướng sản xuất streptokinase tái tổ hợp đang được chú ý Các nhà khoa học đã thành công trong việc cấy ghép gen Streptokinase của chủng Streptococcus eqIUsimilis H46A vào E.coli và đã bào chế dưới dạng thuốc tiêm dùng trong các trường hợp cấp cứu nhồi máu cơ tim

Ứng dụng trên lâm sàng của streptokinase:

Chính vì tác dụng đặc biệt nên streptokinase được xếp vào nhóm thuốc làm tan huyết khối cùng với các thuốc khác như alteplase (tPA - thuốc hoạt hóa

plasminogen từ mô), Urokinase (UK, có nguồn gốc từ chất chiết tế bào thận người), phức chất streptokinase-plasminogen anisoylat hóa (APSAC) và tenecteplase (là một dạng biến đổi của tPA), được chỉ định dùng theo đường tiêm tĩnh mạch càng sớm càng tốt khi có cơn đau thắt ngực để làm ly giải khối đông trong động mạch vành, làm giảm tổn thương cơ tim Do Streptokinase là sản phẩm từ vi khuẩn, nên

cơ thể có thể tạo đáp ứng miễn dịch với chúng Do đó, Streptokinase được khuyến cáo không nên dùng lại sau 4 ngày kể từ lần tiêm đầu tiên vì thuốc không có hiệu quả như ban đầu hoặc gây dị ứng Vì lý do này, Streptokinase chỉ dùng cho người bị lên cơn đau tim lần đầu Những lần đau tim tiếp theo được điều trị với Thuốc hoạt hóa plasminogen từ mô (tPA)

Streptokinase còn được sử dụng để ngăn ngừa hiện tượng dính sau mổ, là biến chứng chung của phẫu thuật, đặc biệt phẫu thuật vùng bụng (cắt ruột thừa, cắt

tử cung, sỏi mật ), trong các trường hợp cấp tính khác như tắc động mạch cấp ở chân tay, nghẽn mạch phổi phế quản nặng, viêm mủ màng phổi, đọng máu màng phổi, ở khớp xương, hạch viêm có mủ [9]

2.3.3 Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym streptokinase

Hoạt tính của Streptokinase được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau có so sánh với streptokinase chuẩn đã biết hoạt tính như:

Thử nghiệm ly giải fibrin dựa theo phương pháp của Christensen phụ thuộc vào mối quan hệ tuyến tính Log/log giữa nồng độ streptokinase và thời gian ly giải khối đông [25]

Thử nghiệm ly giải fibrin dựa trên phương pháp đo quang sản phẩm thủy phân là peptid tan trong urea và acid tricloacetic giải phóng từ cục máu đông tạo thành

Thử nghiệm ly giải fibrin dựa trên phương pháp đo vòng ly giải bởi plasmin hoạt hóa do streptokinase trên thạch đĩa agarose do sự tiêu hủy của fibrin người thành các phân đoạn hòa tan [29]

Thử nghiệm ly giải casein: dựa trên phương pháp đo quang các sản phẩm thủy phân là peptid tan từ casein bởi plasmin hoạt hóa theo độ pha loãng khác nhau của streptokinase từ một lượng dư plasminogen trong khoảng thời gian nhất định [6]

Thử nghiệm phân giải cơ chất màu S-2251: Đây là phương pháp có tính đặc hiệu và dễ tái hiện Phản ứng enzym gồm 2 bước diễn ra trong cùng 1 khâu ủ là bước hoạt hóa plasminogen và tiếp theo là bước thủy phân cơ chất màu có ký hiệu S-2251 (với công thức hóa học là H-D-Val-Leu-Lys-pNA.2HCl) Có sự tương quan tuyến tính giữa lượng chất màu tạo thành và hoạt tính hoạt hóa của streptokinase trong khoảng giá trị hấp thụ quang ở bước sóng 405 nm là từ 0,05 đến 1,2 trong 30 phút ủ [6]

2.4 Enzym Streptodornase

2.4.1 Cấu trúc và tính chất của enzym streptodornase

Enzym streptodornase là cách viết tắt của enzym deoxyribonuclease từ vi

khuẩn tan huyết Streptococcus sp (Streptococcus deoxyribonuclease) Khi nghiên

cứu về chủng Streptococcus eqIUsimilis nhóm C, hai nhà khoa học người Anh là Ian C Locke và Brian G Carpenter đã phân tích canh thang thu được sau khi nuôi cấy chủng cho thấy có khoảng 40 loại protein khác nhau, trong đó có 2 thành phần

có hoạt tính điều trị chiếm tới 25-30% về hàm lượng: Thành phần thứ nhất được xác định là Streptokinase, là yếu tố hoạt hóa plasminogen và thành phần thứ hai là streptodornase Hai thành phần có hoạt tính này có thể tách biệt, tuy nhiên khi ở dạng phối hợp chúng lại tương tác hỗ trợ nhau trong quá trình làm sạch vết thương

có mủ [ 8]

Trong khi các đặc điểm trong cấu trúc và cơ chế hoạt động của streptokinase

đã được hiểu biết đầy đủ thì các đặc tính của streptodornase còn ít được biết đến Mặc dù vậy, hiệu quả của hoạt tính DNase đã biểu hiện và được ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng Streptodornase có bản chất là protein với trọng lượng phân tử 38,2 KDa, có pI là 4,6, khoảng pH thích hợp cho hoạt tính của enzym được xác định trong khoảng từ 5,0 đến 9,0 và hoạt tính biểu thị mạnh nhất là ở pH 7,8 Trong một nghiên cứu thuốc Varidase, kết quả cho thấy khi sản phẩm ở dạng đông khô, và dung môi để pha tiêm sau khi hoàn nguyên thuốc cho pH ở 7,4, nhưng nếu dung môi được pha chế để có pH ở 7,8 thì thuốc có hoạt tính cao hơn trên thực tế điều trị vết thương đến 18% và do đó vết thương mau được làm sạch hơn

Streptodornase cũng chịu sự tác động của nhiệt độ Kết quả nghiên cứu tính

ổn định nhiệt của streptodornase cho thấy ở nhiệt độ nhỏ hơn 400C, enzym có hoạt tính ổn định, nhưng khi ủ trước ở 50-600C hoạt tính của enzym bị giảm hoạt động ở dải nhiệt độ rộng, từ 10-600C Trong nghiên cứu tác động của nhiệt độ cao hơn 600C, nhận thấy rằng hoạt tính của enzym giảm đi rõ rệt do hình thành dạng bán biến tính bền vững (không phục hồi) của phân tử streptodornase [13]

2.4.2 Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học của enzym streptodornase

Cũng giống như các enzym thuộc nhóm deoxyribonuclease, Streptodornase có đặc điểm chung trong cơ chế hoạt động là xúc tác phản ứng thủy phân liên kết phosphodiester trong mạch AND Và cũng tùy theo vị trí cắt của en zym trên cơ chất AND có thể có loại enzym có khả năng xúc tác cắt liên kết phosphodiester ở bất kỳ vị trí nào của phân tử AND, hoặc chỉ ở một vị trí đặc hiệu nhất định (như vị trí liên kết phosphodiester của nucloetid nằm ở đầu phân tử AND hoặc ở bên trong phân tử…)

Nghiên cứu sâu về Streptodornase cho thấy enzym có tính đặc hiệu cơ chất:

có hoạt tính tiêu hủy các phân tử ADN tự nhiên, nhưng không tiêu hủy ARN và hoạt tính này biểu hiện trên phân tử ADN mạch kép mạnh hơn so với mạch đơn khoảng 2,5 lần Sự khác biệt trong hoạt tính streptodornase đối với ADN mạch kép

so với ADN mạch đơn có thể là do yếu tố cấu trúc như sự quay tự do của mạch đơn tạo nên sự cản trở không gian để gắn với Streptodornase hoặc là do sự nhận biết vị trí riêng biệt của streptodornase trên cấu trúc nhánh kép của phân tử ADN Cho đến nay ngoài hoạt tính đặc hiệu trên ADN mạch kép, hoạt tính của Streptodornase trên các cơ chất khác vẫn còn chưa được biết đến [13]

Hiện nay Streptodornase được chủ yếu bào chế ở dạng phối hợp với enzym streptokinase (thường theo tỷ lệ 1:4) có tác dụng hỗ trợ nhau trong quá trình làm sạch vết thương có mủ: Streptokinase hoạt hóa plasminogen để hình thành plasmin làm tiêu hủy bẻ gãy các sợi fibrin, kết quả làm tan nhanh chóng cả cục máu đông và các phần cấu trúc fibrin trong dịch vết thương Còn Streptodornase làm phân giải các nucleoprotein ngoại tế bào ở trong vết thương có mủ Sự có mặt của các

nucleoprotein ngoại tế bào thu hút các bạch cầu đến vị trí bị tổn thương và kết thành cục (khối cứng) Hiện tượng này kết hợp cùng với cục máu đông làm cho việc dẫn lưu vết thương kém đi Sự phân rã của các ADN ngoại bào do streptodornase làm loãng mủ, các bạch cầu được di chuyển tự do, do đó làm tăng cường thực bào Kết quả làm lành vết thương Ngoài ra Streptodornase còn được bào chế ở dạng xịt cho những người bị xơ hóa các bao khớp, làm tiêu dịch nhày ở phổi

2.4.3 Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym streptodornase

Hiện nay, hoạt tính của Streptodornase trên phân tử ADN được xác định chủ yếu bằng các phương pháp sau:

Phương pháp đo quang động học: Thử nghiệm này dựa trên sự thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm xảy ra do tiêu hủy ADN mạch kép thành các oligonucleotide mạch đơn Dung dịch cơ chất là AND tự nhiên chiết được từ tuyến tụy của bê được chuẩn bị với nồng độ khoảng 0,04 mg/ml và có chứa các ion Ca++ ,

Mg++ để đảm bảo hoạt tính tối ưu của streptodornase Trong quá trình thử nghiệm, cuvette phải được khuấy liên tục bằng thanh khuấy loại nhỏ đặt ở đáy, và nhiệt độ của buồng cuvette phải được duy trì ổn định Độ hấp thụ quang có giá trị tăng dần trong khoảng thời gian 2,5 phút Hoạt tính của streptodornase được tính theo slope của đường tuyến tính biểu thị sự phụ thuộc gữa các giá trị hấp thụ đo được với thời gian so sánh với chất chuẩn [13]

Phương pháp đo độ nhớt: dưới tác động của enzym streptodornase, độ nhớt của dung dịch cơ chất AND tự nhiện bị giảm do bị thủy phân Do đó hoạt tính sẽ được so sánh dựa trên cơ sở của quan hệ tuyến tính giũa nồng độ của enzym và độ nhớt tương quan của hỗn dịch enzym-cơ chất sau khoảng thời gian nhất định [6]

Phương pháp đo xanh methyl (phương pháp Kurnick): dựa trên nguyên tắc xanh methyl tách khỏi phức hợp AND/Mg/xanh methyl khi ở nồng độ thấp Hoạt tính tương quan của mẫu thử so với mẫu chuẩn được xác định bằng cách so sánh độ giảm của giá trị hấp thụ quang ở buớc sóng 640 nm của dung dịch AND/Mg/methyl-green sau khi bị streptodornase tiêu hủy ở khoảng thời gian chuẩn và sau khi để qua đêm, tránh ánh sáng [6]

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Hóa chất, chất chuẩn, mẫu nghiên cứu

3.1.2 Dung môi, hóa chất:

- Casein (Hammerstein type)

- Natri monohydrophosphat P.A

- Acid hydrocloric P.A

- Acid tricloroacetic P.A

- Natri acetate P.A

- Acid acetic P.A

- L-Cystein HCl.H2O

- Natri hydroxyd

- Kali dihydrophosphat P.A

- N- Benzoyl L – Arginine ethyl ester hydrochloride (loại cơ chất dùng cho

định lượng enzyme)

- Thrombin người (Sigma-Aldrich)

- Plasminogen người (Sigma-Aldrich)

- Fibrinogen (Sigma-Aldrich)

- Peptone - TS (Sigma-Aldrich)

- Deoxyribonucleate – TS (Sigma-Aldrich)

- Magnesi sulfat P.A

3.1.3 Mẫu dùng để nghiên cứu xây dựng và thẩm định các quy trình

- Viên bao phim tan trong ruột Brolasin Tablet, số lô BRJT9E01, hạn dùng: 05/03/2012, sản xuất bởi Samik Pharm.Co.Ltd (Bromelain: 20000IU, Trypsin 2500 IU)

- Viên bao phim Kimoral-S, số lô: 801E, hạn dùng: 15/05/2010, sản xuất bởi OZA Pharm, Australia (Bromelain: 20000IU, Trypsin 2500 IU)

- Viên nén HCtonase, số lô M06, hạn dùng: 20/10/2010, sản xuất bởi Korean Drug Co.Ltd (Streptokinase 10 000IU, Streptodornase 2500 IU)

- Viên bao phim tan trong ruột SERRONASE (Streptokinase 10000IU, Streptodornase 2500IU), lô 9203, hạn dùng: 04/08/2011 sản xuất bởi Reyon Pharm Co.,Ltd

3.2 Thiết bị và dụng cụ: Các thiết bị đã được hiệu chuẩn theo ISO/IEC

- Cân phân tích Sartorius CP 224S, độ chính xác 0,1mg

- Máy quang phổ UV- VIS 2450S Shimadzu

- Bể điều nhiệt Labec

- Máy đo pH Hanna Instrument

- Nhớt kế OSTWALD, mao quản số - No 22972, k = 0,0120

- Máy lắc siêu âm

- Bếp điện

- Thước kẹp Balme MITUTOYO

- Bi thủy tinh chuẩn (d = 2,00±0,05 mm, m = 33±1 mg)

3.3 Phương pháp:

Các enzyme nghiên cứu được định lượng theo phương pháp như sau:

3.3.1 Bromelain: Phương pháp đo quang điểm cuối [3,11]:

Hoạt tính của bromelain được xác định dựa trên nguyên tắc thủy phân cơ chất là casein và tạo ra sản phẩm là tyrosin Định lượng tyrosin bằng phương pháp quang phổ UV-VIS

Hoạt tính được xác định theo lượng tyrosin (BTU, bromelain tyrosine unit):

1 đơn vị bromelain là lượng enzym có khả năng thủy phân casein để giải phóng 1 mcg tyrosin trong 1 phút trong điều kiện nhất định

- Xây dựng quy trình xác định hoạt tính: Qua tham khảo tài liệu, xác định được phương pháp chuẩn bị các dung dịch thuốc thử và cơ chất casein Xác định được pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân cơ chất là nhiệt độ 37oC và pH 7,0 Trong phản ứng enzym-cơ chất của bromelain, tác nhân xúc tác rất quan trọng là L-cystein được thêm vào dung dịch pha mẫu Trong quá trình khảo sát, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của nồng độ của L-cystein đến hiệu suất của phản ứng

- Thẩm định quy trình xác định hoạt tính: Thẩm định trên các tiêu chí độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp

3.3.2 Trypsin: Phương pháp đo quang động học dựa trên cơ chế thủy phân cơ chất

N-benzoyl-L-arginin ethyl ester như sau [27,28]:

Trypsin N-benzoyl-L-arginin ethyl ester N-benzoyl-L-arginin + Ethanol

Trên cơ sở sản phẩm tạo thành để xác định hoạt tính của trypsin, giá trị hấp thụ của dung dịch biến đổi theo thời gian và hoạt tính của Trypsin được xác định bằng cách quy đổi từ sự biến thiên giá trị của độ hấp thụ [28]

- Xây dựng quy trình xác định hoạt tính: Qua tham khảo tài liệu, xác định được phương pháp chuẩn bị các dung dịch thuốc thử và cơ chất N-benzoyl L-arginin ethyl ester hydroclorid Xác định được pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân cơ chất là nhiệt độ 25oC và pH 7,6 Đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng

253 nm

- Thẩm định quy trình xác định hoạt tính: Thẩm định trên các tiêu chí độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp

3.3.3 Streptokinase: Hoạt tính của Streptokinase được xác định bằng cách so sánh

khả năng hoạt hóa plasminogen thành plasmin của mẫu nghiên cứu với mẫu chuẩn, tính theo đơn vị quốc tế Sự hình thành plasmin được xác định qua thời gian ly giải fibrin trong điều kiện thử nghiệm

Thử nghiệm ly giải fibrin dựa theo phương pháp của Christensen phụ thuộc vào mối quan hệ tuyến tính Log/log giữa nồng độ streptokinase và thời gian ly giải khối đông [25, 30]

Thử nghiệm ly giải fibrin dựa trên phương pháp đo vòng ly giải bởi plasmin hoạt hóa do streptokinase trên thạch đĩa agarose do sự tiêu hủy của fibrin người thành các phân đoạn hòa tan [29]

- Xây dựng quy trình xác định hoạt tính: Qua tham khảo tài liệu, chuẩn bị các dung dịch thuốc thử, dung dịch cơ chất Xây dựng quá trình ly giải fibrin với nhiệt

độ tối ưu cho quá trình thủy phân cơ chất là nhiệt độ 37oC, lựa chọn phương pháp xác định điểm dừng thích hợp, khả thi

- Thẩm định quy trình xác định hoạt tính: Thẩm định trên các tiêu chí độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp

3.3.4 Streptodornase: Phương pháp đo độ nhớt: dưới tác động của enzym

streptodornase, độ nhớt của dung dịch cơ chất ADN tự nhiên bị giảm do bị thủy phân Do đó hoạt tính sẽ được so sánh dựa trên cơ sở của quan hệ tuyến tính giữa nồng độ của enzym và độ nhớt tương quan của hỗn dịch enzym-cơ chất sau khoảng thời gian nhất định [6, 31]

- Xây dựng quy trình xác định hoạt tính: Qua tham khảo tài liệu [31,32,33], chuẩn bị các dung dịch thuốc thử, dung dịch cơ chất Xây dựng quá trình thủy phân ADN với nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân cơ chất là nhiệt độ 30oC, lựa chọn mao quản thích hợp trong phương pháp xác định độ nhớt bằng nhớt kế Oswald

- Thẩm định quy trình xác định hoạt tính: Thẩm định trên các tiêu chí độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Sau khi nghiên cứu khảo sát chúng tôi đã xây dựng được các quy trình định lượng cho bốn enzym nghiên cứu với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm và tiến hành thẩm định các quy trình đã xây dựng theo quy định của FDA và ASEAN về khoảng tuyến tính, độ đặc hiệu độ đúng và độ lặp lại Kết quả thu được như sau:

4.1 Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm thuốc chứa bromelain và trypsin

4.1.1 Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của bromelain và trypsin

4.1.1.1 Quy trình xác định hoạt tính của bromelain

a) Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử

- Dung dịch A: Hòa tan khoảng 1,775g Na2HPO4 với nước cất vừa đủ 250ml

- Dung dịch cơ chất Casein: Hòa tan một lượng casein (Hammerstein casein type) khoảng 0,6g (đã được làm khô trong 3 giờ ở 60oC dưới áp suất giảm 5mmHg) trong cốc có mỏ và cho thêm 80 ml dung dịch A Hòa tan trong bình cách thủy với nhiệt độ khoảng 50-60oC trong khoảng 15 phút Sau đó làm nguội về nhiệt độ phòng Điều chỉnh pH của dung dịch về 7,0 bằng dung dịch HCl 0,1N (cho từ từ dung dịch HCl 0,1N và khuấy đều, tránh làm kết tủa protein) Thêm nước cất vừa

đủ 100ml

- Dung dịch kết lắng: Hòa tan khoảng 9g acid tricloroacetic (CCl3COOH); 14,95g Natri acetate (CH3COONa.3H2O) và 9,9g acid acetic (CH3COOH) vào trong nước cất vừa đủ 500ml

- Dung dịch pha mẫu: (Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng)

Hòa tan khoảng từ 5g đến 20g L-cystein hydroclorid (L-Cystein HCl.H2O) và 4,4g EDTA vào khoảng 1800ml nước cất Điều chỉnh pH dung dịch về 4,5 bằng dung dịch NaOH 0,1N Sau đó thêm nước vừa đủ 2000ml

- Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ L-cystein, pha các dung dịch pha mẫu như sau:

+ Dung dịch pha mẫu 1 (dd 1): Hòa tan khoảng 4,4g EDTA vào khoảng 1800ml nước cất Điều chỉnh pH dung dịch về 4,5 bằng dung dịch NaOH 0,1N Sau đó thêm nước vừa đủ 2000ml (không có L-cystein)

+ Dung dịch 2 (dd 2): Hòa tan khoảng 5,3g L-Cystein HCl.H2O và 4,4g EDTA vào khoảng 1800ml nước cất Điều chỉnh pH dung dịch về 4,5 bằng dung dịch NaOH 0,1N Sau đó thêm nước vừa đủ 2000ml

+ Dung dịch 3 (dd 3): Hòa tan khoảng 10,6g L-Cystein HCl.H2O và 4,4g EDTA vào khoảng 1800ml nước cất Điều chỉnh pH dung dịch về 4,5 bằng dung dịch NaOH 0,1N Sau đó thêm nước vừa đủ 2000ml

+ Dung dịch pha mẫu 4 (dd 4): Hòa tan khoảng 21,2g L - Cystein HCl.H2O và 4,4g EDTA vào khoảng 1800ml nước cất Điều chỉnh pH dung dịch về 4,5 bằng dung dịch NaOH 0,1N Sau đó thêm nước vừa đủ 2000ml

b) Chuẩn bị dung dịch chuẩn Tyrosin:

Cân chính xác khoảng 50mg chuẩn Tyrosine hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 250ml Hút 5ml dung dịch trên, pha loãng thành 20ml bằng dung dịch HCl 0,2N

c) Chuẩn bị dung dịch thử:

Cân xác định khối lượng trung bình của 20 viên (bóc vỏ bao phim nếu cần)

và nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng

5000 đơn vị Bromelain vào bình định mức dung tích 100ml Thêm 70ml dung dịch hòa tan enzym; lắc siêu âm 15 phút để hòa tan, thu dược dung dịch chứa khoảng 50 IU/ml Thêm dung dịch hòa tan enzym vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc, lấy dịch lọc (bỏ khoảng 20ml dịch lọc đầu) làm dung dịch thử

d) Tiến hành:

- Giai đoạn Bromelain thủy phân cơ chất casein: trong 2 ống nghiệm riêng biệt: Ống dung dịch thử: Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử, để trong cách thủy 37 ± 0,5oC trong 5 phút Thêm chính xác 5ml dung dịch cơ chất casein, lắc đều

và để trong cách thủy ở 37 ± 0,5oC trong chính xác 10 phút Sau đó thêm chính xác 5ml dung dịch kết lắng, lắc đều và để trong cách thủy trong chính xác 30 phút Để nguội về nhiệt độ phòng, lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 2 ml dịch lọc đầu hoặc ly tâm lấy dịch nổi

Ống dung dịch đối chứng: Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử, để trong cách thủy 37 ± 0,5oC trong 5 phút Thêm chính xác 5ml dung dịch kết lắng, lắc đều

và để trong cách thủy ở 37 ± 0,5oC trong chính xác 10 phút Sau đó thêm chính xác

5ml dung dịch casein, lắc đều và để trong cách thủy trong chính xác 30 phút Để nguội về nhiệt độ phòng, lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 2 ml dịch lọc đầu hoặc ly tâm lấy dịch nổi

Mỗi mẫu thử, tiến hành trên 3 ống dung dịch thử và 3 ống đối chứng tương ứng

- Định lượng sản phẩm thủy phân:

Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn, dung dịch thử và dung dịch đối chứng ở bước sóng 275nm, cốc đo dày 1cm, mẫu trắng là nước cất Độ hấp thụ của các ống lần lượt là AC, AT, ADC

Định nghĩa đơn vị Bromelain: Trong phép thử này, 1 đơn vị Bromelain là lượng

Bromelain tương ứng có khả năng giải phóng được 1 µg tyrosin trong 1 phút từ dung dịch casein

e) Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ L-cystein:

- Pha các dung dịch chuẩn bromelain có nồng độ khoảng 50 IU/ml trong các dung dịch pha mẫu, thu được các dung dịch chuẩn 1, 2, 3 và 4 Xác định hoạt tính của các dung dịch chuẩn này theo mục d Kết quả được ghi theo bảng 1

Bảng 1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của L-cystein đến khả năng xác định hoạt tính

Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy sự có mặt của L- Cystein có ảnh hưởng đến

khả năng phản ứng của Bromelain

- Ở dung dịch pha mẫu không có L-cystein, phản ứng thủy phân cơ chất không xảy ra, do vậy không xác định được hoạt tính của bromelain

- Nồng độ cystein cho khả năng hoạt động của bromelain tốt nhất (cho độ đúng và độ lặp lại đạt yêu cầu) ở nồng độ là khoảng 10,6g trong 2000ml, khi

tăng nồng độ L - Cystein lên cũng không tăng được khả năng phản ứng mà ngược lại lượng L – cystein quá thừa có thể gây ức chế phản ứng thủy phân

cơ chất

4.1.1.2 Quy trình xác định hoạt tính của trypsin

a) Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử:

- Dung dịch đệm phosphat 0,067M – pH 7,6 (Theo DĐVN III)

Hòa tan khoảng 4,54g KH2PO4 với nước cất vừa đủ 500ml (Dung dịch A) Hòa tan khoảng 4,73g Na2HPO4 với nước cất vừa đủ 500ml (Dung dịch B) Lấy 13ml dung dịch A trộn đều với 87ml dung dịch B Điều chỉnh pH dung dịch đến 7,6 (nếu cần) bằng một trong 2 dung dịch A hoặc dung dịch B

- Dung dịch cơ chất: Hòa tan khoảng 85,7 mg N- Benzoyl L – Arginine ethyl

ester hydrochloride (loại cơ chất dung cho định lượng enzyme) hòa tan trong nước vừa

đủ 100ml Pha loãng chính xác 10,0 ml dung dịch này bằng dung dịch đệm phosphat 0,067M - pH 7,6 thành 100,0 ml Điều chỉnh độ hấp thụ của dung dịch cơ chất về khoảng 0,575 – 0,585 bằng dung dịch đệm phosphat 0,067M – pH 7,6 hoặc dung dịch

cơ chất Sử dụng dung dịch cơ chất trong vòng 2 giờ

- Dung dịch acid HCl 0,001N

b) Chuẩn bị dung dịch thử:

Cân xác định khối lượng trung bình của 20 viên (bóc vỏ bao phim nếu cần)

và nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 2500 đơn vị trypsin vào bình định mức dung tích 50ml Thêm khoảng 35ml dung dịch HCl 0,001N lắc nhẹ nhàng để hòa tan hoặc lắc siêu âm 15 phút để hòa tan Quá trình hòa tan được thực hiện ở khoảng 5 -100C Để dung dịch về nhiệt độ phòng, thêm dung dịch HCl 0,001N vừa đủ đến vạch lắc đều Lọc qua giấy lọc Whatman số

5, lấy dịch lọc (bỏ khoảng 20ml dịch lọc đầu) làm dung dịch thử

Dung dịch mẫu thử được sử dụng trong vòng 2 giờ

c) Tiến hành:

- Cho chính xác 0,2ml dung dịch mẫu thử vào cóng đo sau đó thêm chính xác 3ml dung dịch cơ chất, lắc đều cho vào buồng đo có ổn nhiệt ở 25 ± 0,10 C Đo độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 253 nm trong vòng 5 phút