Nhân giống lan dendronbium anosmum, dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô nhiên cứu các loại giá thể trồng lan dendrobium mini thích hợp và cho hiệu quả cao

Lan Dendrobỉum anosmum...20 3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trường gieo hạt thích họp cho hạt lan Dendrobium anosmum...20 3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TNTN

Bộ MỒN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NHÂN GIÓNG LAN Dendrobium anosmum, Dendrobium

minỉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ NGHIÊN

CỨU CÁC LOẠI GIÁ THẺ TRÒNG LAN

Dendrobium mini THÍCH HỢP

VÀ CHO HIỆU QUẢ CAO

Chù nhiệm đề tài: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN

NHÂN GIỐNG LAN Dendrobium anosmum, Dendrobium

mini BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ NGHIÊN

CỨU CÁC LOẠI GIÁ THẺ TRỒNG LAN

Dendrobium mini THÍCH HƠP

VÀ CHO HIỆU QUẢ CAO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TNTN

Bộ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NHÂN GIÓNG LAN Dendrobium anosmum, Dendrobium

mini BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ NGHIÊN

CỨU CÁC LOẠI GIÁ THẺ TRÒNG LAN

Dendrobium mini THÍCH HƠP

VÀ CHO HIỆU QUẢ CAO

Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN

Cộng tác viên: TRỊNH HOÀI vũ

LÒI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Ke hoạch vàtài vụ, và đặc biệt là Ban chủ Nhiệm Khoa Nông nghiệp & TNTN Truờng Đại học AnGiang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này

Rất biết ơn Thầy Võ Tòng Xuân, Thầy Võ Tòng Anh, Thầy Truông Bá Thảo, ThầyNguyễn Hữu Thanh đă nhiệt tình động viên và ủng hộ tôi thực hiện đề tài Cùng vớiNguyễn Thị Thúy Diễm, Trịnh Hoài Vũ và các đồng nghiệp trong bộ môn đã nhiệt góp sứccùng tôi nghiên cứu thực hiện đề tài này

Cô Mai Dung, cô Đặng Phương Trâm là những người Thầy đã chỉ dẫn cho tôi tronghai lĩnh vực trồng lan và cấy mô

Rất cám ơn Thầy Chương cùng các cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện để tôihoàn thành các thí nghiệm

Các em sinh viên lóp DH3SH, DH4SH và DH5SH1 đã góp sức cùng tôi thực hiện

đề tài

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

1

PHẦN TÓM TẮT

Đe tài nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Nông Nghiệp & TNTN, Trường Đại học

An Giang từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 02 năm 2008 Đề tài thực hiện với hai qui trình

vi nhân giống lan Dendrobỉum anosmum và Dendrobium mini, và thử nghiệm ra cây Dendrobỉum mini trên nhiều loại giá thể khác nhau Với tổng cộng là 6 thí nghiệm gồm 5

thí nghiệm trong phòng và 1 thí nghiệm ngoài vườn

Qui trình vi nhân giống lan Dendrobỉum anosmum

- Trái lan Dendrobium anosmum sau khi được tự thụ 4 tháng, khử trùng và gieo cấy

hạt vào môi trường thích hợp Sau 3 tháng gieo cấy thì tất cả các hạt đều nẩy mầm tốt, tỉ lệđạt được là > 85% trên môi trường MS + 1 mg/1 NAA và môi trường MS + 1 mg/1 BA +0,2 mg/1 NAA

- Sang giai đoạn nhân nhanh: Chồi lan Dendrobium anosmum phát triển và nhẩy

chồi rất tốt trên môi trường MS + 2mg/l BA, ở thời gian 3 tháng sau khi cấy đạt 3,17chồi,

chồi cao 20,6 ram Môi trường MS không bổ sung BA cho kết quả nhân chồi rất thấp Đồngthời khi sử dụng BA ở nồng độ cao (10mg/l) vào môi trường nhân chồi cũng cho kết quảtạo chồi thấp (1,5 chồi), xuất hiện chồi dị dạng, cây phát triển yếu

- Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: Chồi lan Dendrobium anosmum tạo rễ tốt nhất trên

môi trường MS + 1 mg/1 NAA Sau 3,5 tháng tạo được cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn đểđưa ra ngoài vườn

Như vậy, sau thời gian 9,5 tháng thì từ hạt lan gieo cấy đă cho ra được cây lan conhoàn chỉnh có thể đưa ra ngoài vườn trồng

Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium mỉni

- Giai đoạn nhân chồi: Chồi lan Dendrobium mini phát triển và nhẩy chồi rất tốt trên

môi trường có bổ sung 1 mg/1 BA Xét về tính kinh tế thì môi trường MS/2 + lmg/1 BA chohiệu quả cao hơn trong việc nhân nhanh chồi lan Dendrobium mini Sau 2 tháng nhân chồi

thì đã 3,8 chồi, chồi cao l,26cm

- Sự tạo rễ lan Dendrobium mini: môi trường MS/2 + 0,2 mg/1 NAA cho kết quả ra

rễ tốt và lại có tính kinh tế hơn so với các môi trường MS Sau 2 tháng, chồi lan tạo rễ tốtthành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm

- Thử nghiệm ra cây trên nhiều loại giá thể khác nhau thì thấy rằng đối với lan

Dendrobỉum mỉni trong giai đoạn đầu nuôi trồng (từ cây mới ra mô đến khi cây được 7,5

tháng tuổi) thì giá thể thích họp nhất cho cây là dớn và dừa miếng

Như vậy, sau 4 tháng nuôi cấy đã cho ra được cây lan con Dendrobỉum mini hoàn

chỉnh có thể đưa ra ngoài vườn trồng Cây con thuần dưỡng 1 tháng trong vườn ươm vớichế độ chăm sóc đặc biệt Sau đó đưa ra vườn trồng

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Phần tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách bảng vi

Danh sách hình vii

Danh mục các chữ viết tắt viii

CHƯƠNG I MỎ ĐÀU 1

I MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1

1 Mục tiêu 1

2 Nội dung 2

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VỊ NGHIÊN CỨU 2

1 Đối tuợng 2

2 Phạm vi 2

III Cơ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

1 Cơ sở lý thuyết 3

1.1 Giới thiệu về giống lan Dendrobium 3

1.1.1 Phân loại và phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Lan Giả hạc {Dendrobium anosmum) 5

1.1.4 Lan Dendrobium mini 7

1.2 Giá thể trồng lan 7

1.3 Lan rừng Việt Nam 9

1.4 Hi ện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam và trên thế giới 10

1.5 Th ành tựu nuôi cấy mô ở Việt Nam và trên thế giới 11

1.5.1 Trên thế giới 11

1.5.2 Việt Nam 11

1.6 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật 11

1.7 Những khó khăn và lợi ích trong nhân giống in vitro 12

1.7.1 Khó khăn 12

iii

1.8 Các yếu tố liên quan đến phương pháp vi nhân giống 14

1.8.1 Qui trình vi nhân giống 14

1.8.2 Cá c thành phần trong môi trường nuôi cấy mô thực vật 16

2 Mô tả các phương pháp nghiên cứu liên quan đã được thực hiện 18

IV PHƯƠNG PHÁP TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19

1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 19

2 Phương tiện nghiên cứu 19

3 Phương pháp nghiên cứu 20

3 1 Lan Dendrobỉum anosmum 20

3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trường gieo hạt thích họp cho hạt lan Dendrobium anosmum 20

3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BA (6 Benzyl -aminopurine) lên sự nhân chồi lan Dendrobium anosmum 22

3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng NAA (Naphthalene acetic acid) lên sự tạo rễ cho lan Dendrobium anosmum 23

3.2 Lan Dendrobỉum mini 23

3.2.1 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy mô thích họp cho việc nhân chồi lan Dendrobỉum mini 23

3.2.2 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA với hai loại môi trường cơ bản là MS và MS/2 lên sự tạo rễ từ chồi lan 24

3.2.3 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm ra cây lan Dendrobium mỉni trên các loại giá thể khác nhau 25

CHƯƠNG II KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ PHÂN TÍCH KÉT QUẢ 27

I Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) 27

1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trường gieo hạt thích họp cho hạt lan Dendrobium anosmum 27

2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BA (6 Benzyl -aminopurine) lên sự nhân nhanh chồi lan Dendrobium anosmum 28

3 Thí nghiệm 3: Khảo sát một số môi trường tạo rễ giống Dendrobium anosmum 7 32

II Lan Dendrobỉum mini 36

1 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy mô thích họp cho việc nhân chồi của Lan Dendrobỉum mini 36

2 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA với hai loại môi trường cơ bản là MS và MS/2 lên sự tạo rễ từ chồi lan Dendrobỉum minỉ 39

3 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm ra cây lan Dendrobium mini trên các loại giá thể khác nhau

7 40

KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 45

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ CHƯƠNG 50

V

DANH SÁCH BẢNG

1.1 Các loại lan rừng có trữ lượng nhiều hoa đẹp được thị trường nước

1.2 Ký hiệu các nghiệm thức theo môi trường cấy hạt lan 221.3 Ký hiệu các nghiệm thức theo môi trường cấy chồi lan Dendrobium

1.4 Ký hiệu các nghiệm thức thí nghiệm nhân chồi lan Dendrobỉum mini 241.5 Các nghiệm thức thí nghiệm tạo rễ lan Dendrobỉum mỉni 241.6 Các giá thể chọn làm thí nghiệm trồng lan 252.1 Kết quả gieo hạt lan Dendrobỉum anosmum 272.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự nhân chồi lan Dendrobium

2.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự nhân chồi lan Giả hạc Dendrobium

2.4 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự nhân chồi lan Giả hạc Dendrobium

2.5 Mầu lan Giả hạc tạo rễ ở thời điểm 30 NSKC 332.6 Mầu lan Giả hạc tạo rễ ở thời điểm 60 NSKC 332.7 Mầu lan Giả hạc tạo rễ ở thời điểm 105 NSKC 342.8 Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi lan Dendrobium mini 30 NSKC 362.9 Ảnh hưởng của BA lên quá trình nhân nhanh chồi lan Dendrobium mini

DANH SÁCH HÌNH

1.1 Hoa lan Dendrobium anosmum 6

1.3 Sự tạo thành chồi ngang (a) và chồi bất định (b) 131.4 Các bước cơ bản của vi nhân giống 141.5 Hiệu quả của sự tương tác NAA và BA trên cây Bowỉea volubilis 181.6 Hoa lan Dendrobium anosmum và trái lan được thụ 201.7 Qui trình khử trái và gieo hạt lan Dendrobium anosmum 211.8 Chuẩn bị vật liệu trồng và bố trí thí nghiệm 262.1 Số lượng chồi lan Giả hạc Dendrobỉum anosmum tạo trên môi trường có

BA ở thơi điểm 70, 80, 90 NSKC 312.2 Lan Giả hạc ra hoa trong keo nuôi cấy 322.3 Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum từ hạt 352.4 Qui trình nhân giống lan Dendrobium mini 432.5 Một số hiện tượng trong quá trình sinh trưởng củalan Dendrobium mini 44

vii

BA 6 - Benzyl - AminopurineHLCC Hoa lan cây cảnh

MS Murashige & SkoogNAA 1- Naphhalene Acetic AcidNSKC Ngày sau khi cấy

NSKG Ngày sau khi gieo

NSKT Ngày sau khi trồng

NT Nghiệm thức

TpHCM Thành phổ Hồ Chí Minh

CHƯƠNG I

MỞ ĐÀU

Nói đến hoa lan thì ai cũng nghĩ ngay đến một loài hoa vương giả, thanh cao vìhoa lan không chỉ rất đẹp mà giá trị lại rất cao Ngày nay, nhờ kỹ thuật nhân giống hiệnđại bằng phương pháp nuôi cấy mô hồ trợ cho phương pháp nhân giống cổ truyền theokiểu tách chiết, nên đă nhân được số lượng lớn lan giống cung cấp cho thị trường hoalan, vì thế giá thành của cây lan cũng tương đối dễ chịu hơn Cũng từ đó thú chơi lantrong dân ta ngày càng phát triển thông qua các Hội thi hoa lan ngày càng đa dạng vàphong phú hơn Hơn thế nữa, Hoa lan đã dần dần chiếm vị trí cao trong các bàn tiệc, hộinghị, lễ, đám cưới, bằng cách trang trí giỏ hoa, lẵng hoa, bình hoa, và hoa cài áo,trang điểm cô dâu Do đó Hoa lan đang được xem là một loại hoa trang trí quan trọng và

có giá trị kinh tế cao, là mặt hàng xuất khẩu chiến lược của nhiều quốc gia

Chẳng hạn chỉ với loại hoa chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đã xuất khẩu đạt

doanh thu gần 600 triệu USD mỗi năm Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ,năm 2000, tổng sản lượng lan bán ra thị trường đạt xấp xỉ 100.000.000 USD, trong đó

Phaỉaenopsis chiếm 75% (Griesbach, R.J 2002) Bên cạnh đó, ở các nước phát triển

như: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, Hồng Kông, đều nhập khẩu rất nhiều phong lan.Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuất khẩu phong lan (HuỳnhVăn Thới, 2005)

Với kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật, thì ngoài các ưuđiểm là khả năng nhân giống nhanh với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn, có thểnhân được từ nhiều bộ phận khác nhau của thực vật, tạo ra cây giống sạch bệnh Xa hơnnữa, thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô sẽ tạo ra nguồn vật liệu lai tạo ra cây giống mới cóđược các đặc tính ưu việc chỉ với thời gian ngắn Ưu điểm nữa của nuôi cấy mô là giúpcho việc nẩy mầm của hạt lan Vì hạt lan có đặc tính là chỉ có phôi mà không có (hoặc

có quá ít) phôi nhũ và kích thước hạt quá nhỏ khó nẩy mầm ngoài tự nhiên Nên ngoàiphương pháp nhân giống cổ truyền là tách chiết với tốc độ nhân giống rất chậm, người

ta phải sử dụng kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm Ngoài ra, nhân giống bằng hạt cũngđược áp dụng cho công tác lai tạo giống mới, đặc biệt là hoa Lan

Tuy nhiên, một yếu tố không kém phần quan trọng quyết định đến sự thành côngcủa qui trình nhân giống bằng nuôi cấy mô là việc đưa cây mô ra vườn ươm với tỷ lệsống cao Do đó, đề tài “Nhân giống lan Dendrobim anosmum và Dendrobỉum minỉ bằng phương pháp nuôi cấy mô Nghiên cửu các loại ệiá thể trồng lan Dendrobỉum mỉnỉ thích họp và cho hiệu quả cao” được thực hiện nhăm nhân nhanh hai loài lan này

và nghiên cứu qui trình ra cây lan mô cho tỷ lệ sống cao để cung cấp cây giống cho thịtrường hoa lan trong và ngoài tỉnh

1 Mục tiêu:

- Đưa ra qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum bằng phương pháp

nuôi cấy hạt lan giúp cho việc nhân nhanh và bảo tồn loài hoa quí hiếm này của nước ta

- Đưa ra qui trình vi nhân giống lan Dendrobium mini nhằm nhân nhanh loài hoa

lan này để cung cấp cây giống cho thị trường hoa lan trong và ngoài tỉnh

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng (NAA và BA) trên cácmẫu cấy

- Nghiên cứu qui trình ra cây của cây lan cấy mô nhằm giúp gia tăng tỉ lệ câysống sau khi đưa ra ngoài.

2 Nội dung

Nghiên cứu môi trường gieo hạt thích họp cho hạt lan, môi trường nhân nhanh

và tạo cây hoàn chỉnh lan Dendrobỉum anosmum (Giả hạc).

Nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích họp cho việc nhân nhanh và tạo cây hoànchỉnh cho lan Dendrobium mỉni.

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố bên trong và bên ngoài, giá thể trồng ảnhhưởng đến sự sống và phát triển của của lan con Dendrobỉum mỉni từ phòng thí nghiệm

ra ngoài vườn

1 Đối tượng

1.1 Lan Denbrobỉum anosmum thuộc giống Dendrobium, là loài lan rừng

của Việt Nam còn có tên Giả hạc Đây là đối tượng quý hiếm và đặc biệt chỉ có ở ViệtNam, Lào, Thái Lan, Philippines, New Guinea, Bomeo, Indonesia, Malaya and SriLanka Đặc điểm của giống là sai hoa, hoa to, đẹp và có hương thơm nên rất được ưachuộng Hiện nay giống lan này đang rất được ưa chuộng trong và ngoài nước, trong khiviệc nhân giống bằng tách chiết thông thường không kịp đáp ứng nhu cầu

Cây lan giống (cây mẹ) được mua về từ Đà Lạt và trồng tại vườn lan của TrườngĐại học An Giang Sau đó thụ phấn tạo trái lan Khi trái được 4 tháng thì cắt đem vàophòng thí nghiệm khử trùng và cấy vào môi trường nuôi cấy

1.2 Lan Dendrobỉum mỉni, theo hướng dẫn của Công ty Long Đỉnh thì

đây là một giống mới được lai tạo từ Thái Lan và mới được du nhập vào nước ta Đặcđiểm của loài này là cây chỉ cao 1 5 - 2 0 cm, số hoa trên cành 6-12 hoa, thời gian hoatàn 2,5 - 3 tháng, Thời gian từ cây seedling đến ra hoa khoảng 4-5 tháng nếu nuôi tốt

Do đặc điểm cây nhỏ gọn lại siêng hoa, thời gian ra hoa nhanh nên rất phù họp chotrang trí nội thất, đám tiệc, Nên cần nhân nhanh và rộng giống lan Dendrobium mini

để cung cấp cho thị trường hoa tươi

2 Phạm vi nghiên cún

Trong thế giới các loài hoa, hoa lan được coi là loài hoa vương giả, nữ hoàngcủa các loài hoa Bởi vì hoa lan không những đẹp về màu sắc mà còn đẹp cả về hìnhdáng Cái đẹp của hoa lan thể hiện từ những đường nét của cánh hoa, cấu trúc đặc biệtquyến rũ của môi lan, cho đến những điểm xuyến ngộ nghĩnh trên các lá lan, hay cấutrúc đa dạng của thân lan Nhiều loài hoa lan, nhất là các loài lan rừng Việt Nam, cóhương thơm rất nồng nàn và quyến rũ như Giáng hương, Giả hạc, Ngọc điếm,

Việt Nam là một quốc gia được quốc tế công nhận là có trữ lượng lan rừng rấtlớn và có nhiều loài có giá trị cao, được nhiều người yêu thích Một trong những loài đó

đó điển hình là loài lan Giả hạc Nhưng do nhà nước ta chưa có chính sách bảo tồn triệt

để nên lượng lan rừng Việt Nam hiện bị thất thoát ra nước ngoài rất nhiều và trở nênkhan hiếm tại thị trường trong nước Việc nhân giống theo phương pháp truyền thống làtách chiết không thể đáp ứng đủ với nhu cầu thị trường Do đó, ngày nay các nghiên cứu

về nhân giống lan bằng phương pháp cấy mô rất được các nhà khoa học quan tâm đầu

tư, vì chỉ có nuôi cấy mô mới có thể nhân ra lượng lớn cây giống cung cấp cho thịtrường trong thời gian ngắn

Loài lan Denbrobium anosmum hiện đang rất được các nghệ nhân Việt Nam và

thế giới ưa chuộng Do loài lan này có hoa rất to, đẹp, lại có hương rất thơm Hiện thịtrường trong nước một cây lan giả hạc với một đơn vị nhỏ cũng phải giá cả trăm ngàn,nếu là đơn vị lớn thì hàng trăm đến triệu đồng Do giá trị cao nên hiện Đài Loan đã laitạo ra loài Giả hạc Hawaii và đang được rất nhiều nước ưa chuộng, ngay cả Việt Namcũng đã nhập cây giống của loài này Như vậy đế thấy việc bảo tồn, lai tạo và nhângiống loài lan này là rất cần thiết

Tuy nhiên, hiện nay vấn đề làm cho các phòng cấy mô trong nước không pháttriển mạnh được, một trong các nguyên nhân là việc không tiêu thụ được cây cấy mô Vìngười dân khó biết để tìm mua Phần khác họ không biết cách ra cây nên tỉ lệ thất thoát

ra đưa cây mô ra vườn là rất cao, do đó họ rất e ngại khi mua cây con từ các chai mô

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này cũng nhằm để nghiên cứu qui trình vinhân giống hai loài lan này nhằm cung ứng nhu cầu cây giống cho thị trường Mặt khácthông qua đề tài nghiên cứu qui trình ra cây con cấy mô nhằm gia tăng tỉ lệ cây mô sốngsau khi đưa ra ngoài Sau đó có thể triển khai hướng dẫn kỹ thuật cho các nghệ nhântrồng lan

III. CO SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

1 Cở sở lý thuyết

1.1 Giới thiệu về giống lan Dendrobium

1.1.1 Phân loại và phân bố Thuộc lóp một lá mầm: Monocotyledones

+ Dạng đứng (Dendrobium phaỉaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và rất

siêng ra hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia,

+ Dạng thòng ỤDendrobium mobile) chịu khí hậu mát mẽ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long

tu, Phi điệp vàng,

Với 1.600 loài khác nhau đòi hỏi nhiều cách chăm sóc khác nhau, nguyên do là

vì chúng du nhập từ nhiều địa danh khác nhau: Nhật Bản, Triều Tiên và Newzealand,đặc biệt là Guinea là nơi sản sinh ra nhiều loài Dendrobium nhất (Thiên Ân, 2002)

Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông được phân biệtbằng thân (giả hành), lá và hoa (Nguyễn Công Nghiệp, 2004).

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) thì không có một hình dạng chung nhất vềhoa và dạng cây do số lượng quá lớn, phân bố rộng rãi Riêng giống lan Dendrobiumđều có bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái

Rễ: Cây có hệ rễ khí sinh, có một lóp hút ẩm dày bao quanh gồm những lóp tế

bào chết chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc Vì vậy rễ hút được nướcmưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ lửng trong không khí, hơi sương và hơi nước,giúp cây hút dinh dưõưg và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không

bị gió cuốn Một số loài có thân lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễchứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang họp(Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Rễ của lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễcây sẽ bị mục nát và cây bị chết (Dương Công Kiên, 2006)

Rễ lan Dendrobium cũng giống như rễ lan Vũ nữ, Cattleya thuộc loại rễ bán gió.Nhóm này thường có rễ nhỏ nhưng rất nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể, vào thân cây

để hút dưỡng chất dính vào giá thể như nước, cho nên khi trồng vào chậu, phải để giáthể nhiều hơn, gần như toàn bộ rễ đều bám vào giá thể, vào thành chậu, chỉ có một số ít

rễ chìa ra ngoài Đối với lan rễ bán gió phải trồng với giá thể nhỏ hơn và nhiều hơn, để

bộ rễ bám dày đặc hút nhiều dưỡng chất v.v (Huỳnh Văn Thới, 2005)

Giá thể của lan Dendrobium có cấu tạo tương tự như các loài thuộc giốngCattleya, nghĩa là chậu phải thật thông thoáng và không úng nước Tuy nhiên do bảnnăng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các loài thuộc giốngDendrobium có thể dùng giá thể hơi ẩm hơn Cattleya chút ít nhưng không được làmthối căn hành Vì thế một số loài lan Dendrobium có thể phát triển trên các giá thể là xơdừa hay cả quả dừa, dùng như một cái chậu chứa sẵn giá thể Cũng có thể trồng lanDendrobium với căn hành cách đáy chậu khoảng 3 cm, rồi rải thật thoáng xung quanhcăn hành một số rễ lục bình giặt sạch Với cách trồng này thì kích thước chậu và câyphải thật tương xứng Tuy nhiên giá thể than và gạch vẫn tỏ ra hiệu quả nhất (NguyễnCông Nghiệp, 2004)

Thân: Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) thì Dendrobium thuộc nhóm đa thân

(còn gọi là nhóm họp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằmsâu trong đất gọi là thân rễ

Một số Dendrobium lá chỉ có ở các mầm non, là loài chống tàn chúng vàng úa

và rụng vào mùa thu, thân phì to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng(Trần Văn Bảo, 1999)

Giả hành: Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa

dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiệnkhô hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra, giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thểquang họp được (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hìnhtrụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ (Dương Công Kiên, 2006)

Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiên vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hànhkhông có màu xanh nhưng phía trên có mang lá (Dương Công Kiên, 2006).

Lá: Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng một cuốn

hay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng (NguyễnCông Nghiệp, 2004)

Lá có hình kim, trụ có rănh hay phiến mỏng Dạng lá mềm mại mọng nước nạc,dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tuỳ thuộc vào vị trí sống của cây Phiến lá trãirộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hìnhchừ V Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn những bẹ không phát triển haygiảm hẳn thành vảy (Dương Công Kiên, 2006)

Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceaenói chung đôi khi trút lá vào mùa khô hạn Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặpmưa thì cho chồi mới (Trần Văn Bảo, 1999)

Hoa: Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) thì Dendrobium thuộc nhóm phụ ra

hoa ở nách lá Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cảtrên ngọn cây Sự biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết látrước khi ra hoa Thời gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu tết (Nguyễn Công Nghiệp,2004)

Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì cho hoa thành chùm, phát hoa dài vàthời gian ra hoa trung bình 1-2 tháng (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Trái: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc quả nang, khi hạt chín, các nang bung ra

chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc Ở một số loài, khi chín quả không nứt ra nênhạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát (Dương Công Kiên, 2006)

Hạt: Những hạt giống không chứa các chất dinh dưỡng do gió gieo vãi, để được

nẩy mầm cần có nấm cộng sinh hỗ trợ các chất cần thiết, đặc biệt ở đầu các giai đoạnphát triển (Trần Văn Huân và Văn Tích Lượm, 2004)

Theo Dương Công Kiên (2006), thì quả chứa 10.000 - 100.000 hạt đôi khi đến 3triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phôi hạt chưa phân hoá Sau 3-5 tháng hạt chín vàphát tán nhờ gió

1.1.3 Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)

Dendrobỉum anosmum xuất xứ từ các nước như Philippin, Malaysia., Lào, Việt

Nam Lindley đặt tên cho lan Giả hạc từ năm 1845 Lan Giả hạc có nhiều trên dăyTrường Sơn từ Nam ra Bắc (Nguyễn Thiện Tịch, Hội HLCC - Tp HCM được trích bởiTrần Văn Bảo, 1999)

Dendrobỉum anosmum là một giống lan thường mọc ở các quốc gia thuộc vùng

Đông Nam Á Châu nhưng nay phổ thông trên khắp thế giới bởi vì khá dễ trồng, nhiềuhoa và hương thơm ngào ngạt (Bùi Bảo Lộc, 2008)

www.theorchiddoctor.com www myriadgardens com

Hình 1.1 Hoa lan Dendrobium anosmum

Lan còn có tên là Dendrobỉum superbum và người Hawaii gọi là Dendrobium

honohono có nghĩa là lá mọc đối cách Người Việt chúng ta thường gọi là Dã Hạc, Giảhạc, Lưỡng điểm hạc, Phi diệp Lan thường mọc trên các cành cây ở cao độ khoảng1000-1300 m tại các rừng cây thuộc Đô Lương, Vinh, Krong Pha, Đà Lạt, Bảo lộc, ĐắcLắc, Sông Bé, Lộc Ninh v.v (Bùi Bảo Lộc, 2008)

Thân dài tới 1,20 m buông rũ xuống Lá mọc đối cách dài 8 12 cm, rộng từ 4

-7 cm Hoa to tới 10 cm mọc từ 1- 3 chiếc ở các đốt đã rụng lá, nở vào mùa Xuân

Dendrobỉum anosmum có hai màu sắc chính: tím hồng và trắng Tuy nhiên có khá nhiều

biến dạng hồng nhạt, hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím, nhưng rất dễ nhầm lẫn với

Dendrobỉum parỉshii thân ngắn chỉ chừng 30-40 cm và hoa tím sẫm hơn nhiều Hoa có

hương thơm ngào ngạt và lâu tàn ( 3 - 4 tuần lễ) Nhiều hoa trên phát hoa, một cây nếumạnh khỏe có thể ra tới 50 - 70 hoa (Bùi Bảo Lộc, 2008)

Sau khi hoa tàn, những đốt gần trên ngọn hoặc ở gần dưới gốc thường nẩy sinh

ra những cây con (keiki) Vài tháng sau, khi các cây con mọc rễ dài chừng 3-4 cm cóthể tách ra trồng riêng Năm đầu cây này còn nhỏ và ngắn chừng 3 0 - 4 0 cm và không rahoa, nhưng sẽ ra hoa vào năm tới Khi đó dưới gốc sẽ ra tới 3 - 4 mầm non, những mầmcây này mọc mạnh và lớn hơn rất nhiều có thể đạt tới 1- 1,20 m nếu nuôi trồng đúngcách (Bùi Bảo Lộc, 2008)

Ngoài ra ta cũng có thể nhân giống loài lan này theo phương pháp truyền thống:cắt thân cây già thành từng đoạn dài 15 - 20 cm, đặt lên khay có rong rêu hoặc mùn cây

ẩm ướt, vài tháng sau cây con sẽ mọc ra từ các đốt (những đốt vừa ra hoa sẽ không mọccây non) Khi cây non cao chừng 4 - 5 cm hay rễ dài khoảng 3 - 4 cm đem trồng trongchậu hay trên vỏ cây như đã nói ở trên (Bùi Bảo Lộc, 2008)

Người ta trồng Dendrobium anosmum với nhiều vật liệu khác nhau như: mảnh

cây dương sỉ, cành cây, mảnh gỗ hay trong chậu với vỏ thông, vỏ dừa v.v nhưng tốthơn cả là trồng trong chậu gỗ và treo lên bởi vì cây cần thoáng gió và thoáng gốc (BùiBảo Lộc, 2008)

1.1.4 Lan Dendrobium mỉni

Neu như Lan Giả hạc là một loài thuộc nhóm lan rừng Việt Nam có giá trị cao,thân thòng, thì lan Dendrobium mỉni lại là một loài lai tạo, thân đứng Loài lan này được

lai tạo từ Thái Lan và được du nhập vào nước ta Đặc điểm của loài lan này là cây dạngbụi, lùn (chỉ cao 1 5 - 2 0 cm), nhưng rất siêng hoa, hoa nở quanh năm Cây nhỏ nhưngnhảy chồi rất mạnh, nhảy chồi ngay cả trên các thân già hay cây suy yếu Hoa có kíchthước không lớn chỉ khoảng 4 X 5 cm nhưng hoa rất đẹp, số hoa trên cành nhiều từ 6 -

13 hoa, hoa rất bền lâu tàn (1,5 — 2 tháng) Thông thường trên một giả hành có tới 3 - 4phát (cành) hoa, nếu cây tốt có thể lên đến 5 phát hoa

Hình 1.2 Hoa lan Dendrobium minỉ

1.2 Giá thể trồng lan (compost)

Trồng Phong lan ta phải sử dụng đến giá thế Giá thế là những chất liệu dùng đếcải thiện độ ẩm là chính, còn cung cấp chất dinh dưỡng cho lan chỉ là việc phụ, khôngđáng kể

Với một số loài Lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinh trưởng tốt, nhưngnếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hon.

Giá thể của lan gồm những thứ dễ kiếm, nhiều khi không cần mất tiền mua, vì cósẳn chung quanh ta Những chất liệu này không phải nước nào cũng dùng như nhau vàchúng được chọn tùy theo điều kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan và qui mô sản xuất

Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) và Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2006), thì có cácloại giá thể trồng lan và đặc tính của từng loại như sau:

cái, ngón chân cái là vừa Đặc tính của than gỗ là hút nước và giữ ẩm được lâu Nênchọn loại than xốp, với than chắc quá như than đước không nên dùng vì khả năng giữ

ẩm kém Than không mục như gỗ, cũng không có mầm bệnh nên giới nghệ nhân trồnglan không ai chê thứ giá thể quí giá này

b Xơ dừa: Dừa là thổ sản của nước mình nên xơ dừa gần như không cần phải

mua, mà mua cũng với giá rẻ Khi cần dùng đến quanh năm lúc nào cũng có Xơ dừalàm giá thể để trồng lan chính là vở của trái dừa khô Xơ dừa được tách ra thành từngmảng lớn, tuỳ theo nhu cầu mà nhà vườn để nguyên miếng, hoặc xé ra, chặt khúc ra đểsắp xếp trồng lan trên vạt tre hoặc cho vào chậu Xơ dừa rút ẩm rất tốt, tốt hơn cả than

gỗ, nhưng khuyết điểm là mau mục và là nơi đeo bám lý tưởng của rêu và cỏ dại

Trong xơ dừa có chất tanin là chất chát, vì vậy trước khi dùng ta nên ngâm nướcnhiều ngày, sau đó vớt ra phơi khô, rồi cẩn thận hon nên phun thuốc trừ sâu bệnh,

c Gạch: Gạch là chất hút nước tốt, giữ ẩm cao Gạch được nung chín xốp vừa

nhẹ vừa hút nước nhiều Khi dùng làm giá thể, gạch được đập vụn ra từng thanh nhỏbằng ngón tay cái Khuyết điểm của gạch là dễ mọc rêu và nặng, vì vậy ít ai trồngLan với giá thể là gạch không thôi, mà trộn lẫn với vài giá thể khác như than gỗ hay vỏcây hoặc xơ dừa, mỗi thứ một ít

d Vỏ cày: Trong các loại cây như vú sữa, sao, me, thông, thì vỏ thông là loại

vỏ cây được ưa chuộng nhất vì trong vỏ thông có chất resin là chất sát khuẩn cao, lâumục, không đóng rêu, ít có mầm bệnh nên trồng lan rất tốt

Vỏ thông được lấy từ cây thông 2 lá {Pinus merkussĩ) hoặc cây thông 3 lá (Pỉnus khasya) có nhiều ở Bảo Lộc và Đà Lạt.

Cây lan được trồng bằng vỏ cây thời gian đầu phát triển tốt Sau 1 năm vỏ bị phânhuỷ thành mùn, gây úng nước, thối rễ và cũng là môi trường thích hợp cho sự xuất hiệnmột số loài côn trùng cắn phá rễ Vì vậy khi trồng bằng vỏ cây, cây lan phải được thaychậu thường xuyên

e Dởn: dớn là chất liệu làm giá thể trồng lan mới được sử dụng gần đây thôi.

Dớn là chất trồng được lấy từ thân và rễ của cây Dương xỉ Giống cây thảo này đượcmọc nhiều ở cao nguyên Đà Lạt Ưu điểm của dớn là giữ ẩm tốt

Có hai loại dớn: dớn sợi và dớn vụn

- Thứ được ưa chuộng nhất là dớn sợi do thân rễ cây dương xỉ già tạo nên Dớnsợi thích hợp cho việc trồng Lan xứ nóng vì nó có độ thông thoáng

- Dớn vụn: Là loại thứ cấp của dớn do các phần vỏ, lá, rễ của dớn sau khi khaithác sợi bị nát vụn ra Loại này sử dụng trồng lan rất tốt ở vùng lạnh vì độ hút ẩm cao,thiếu thoáng khí nên nhiệt độ trong chậu cao hơn bên ngoài Tuy nhiên ở vùng nhiệt đớiĐồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) không nên dùng loại dớn này, vì nhiệt độ cao và

Bảng 1.1 Các loại lan rừng có trữ lượng nhiều hoa đẹp được thị

trường nước ngoài ưa chuộng

1Hồng lan Đà Lạt Cymbidium ỉnsỉgne

2Hoàng lan Đà Lạt Cymbidium ỉrỉdioỉdes

3Hồng hoàng Đà Lạt c.ỉnsignex c.ỉridioides

4Bạc lan Đà Lạt c.eburnum var erythrostylum

5Tuyết ngọc Coelogyne mooreana

6Kim hài Paphipedỉum viỉỉosum

7Vân hài Paphipedium callosum

8Huyết nhung Renanthera imschootiana

9Mỹ dung dạ hương Vanda denisoniana

11Long tu Dendrobium primulinum

12Kim điệp Dendrobỉum capillies

13Thuỷ tiên trắng Dendrobỉum j'armeri

14Thuỷ tiên vàng Dendrobium chrysotoxum

15 Thuỷ tiên mỡ gà Dendrobium densịỷỉorum

16 Thuỷ tiên tím Dendrobỉum amabỉle

17 Thuỷ tiên cam Dendrobỉum thhyrsịỷlorum

18 Nhất điểm hồng Dendrobỉum draconis

19 Lụa vàng Dendrobỉum heterocarpum

20 Hoàng phi hạc Dendrobium sỉgnatum

21 Ý thảo Dendrobium gratỉossỉmum

22 Tóc tiên Holeolossum subulifolỉum

23 Hạc đỉnh Phaius tankervilliae

24 Hoả hoàng Ascocentrum minỉatum

25 Ngọc điểm Rhynchostylỉs gỉgantea

26 Đuôi cáo Aerides multịỷỉora

27 Đại ý thảo Dendrobium aphyllum

28 Lan quế Aerides odorata

29 Long nhãn kim điệp Dendrobium ỷìmbrỉatum

30 Long châu Papỉlionanthe pedunculatta

31 Huyết nhung giún Renanthera coccinea

32 Bò cạp tía Arachnis annamensis

33 Bạch vĩ hồ Rhynchostylis retusa

34 Cẩm báo Hygrochilus parishiỉ

35 Uyên ương Chrỉstensonia vietnammica

(Nguồn: Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Một số loài lan rừng Việt Nam rất quý, đuợc nước ngoài biết đến và đặt muavới số lượng lớn nhưng ta chưa gây trồng mà chủ yếu khai thác trong tự nhiên nênkhông đáp ứng được nhu cầu của khách hàng, đồng thời lại vi phạm các điều khoản củaHiệp ước CITES Ví dụ như loài Tuyết ngọc Coelogyne mooreana Sander ex Rolfe,

Thanh đạm Coelogyne cristata Lindl., Thanh lan Cymbidium cyperi/olium Wall ex

Lindl (một trong những loài lan đẹp nhất thế giới), Mạc lan Cymbidỉum ensỉfolỉum (L.)

Sw., Giả hạc Dendrobium anosmum Lindl., Vân hài Paphyopedilum callosum

(Reichenb.f.) Stein, Hài đỏ Paphyopedỉlum delenatỉi Guillaume, Kim hài Paphyopedỉlum vỉllosum (Lindl.) Stein, Lá gấm Ludỉsỉa dỉscolor (Ker-Gawl.) A Rich

(Nông Văn Duy, Nguyễn Thị Lang và ctv, 2001)

1.4 Hiện trạng canh tác hoa lan ỏ’ Việt Nam và trên Thế giói

Thị trường phong lan ngày nay đã trở thành một mặt hàng lớn trên quốc tế, thurất nhiều ngoại tệ Ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, HồngKông, đều nhập khẩu rất nhiều phong lan, Thái Lan là nước xuất khấu phong lan

nhiều nhất Đông Nam Á Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuấtkhẩu phong lan (Huỳnh Văn Thới, 2005).

Theo điểm tin trên tạp chí Hoa cảnh số 10/2008, thì số loại hoa xuất khẩu điNhật Bản từ 12 - 19/9/2008: Hoa cúc 0,21 USD/cành, kim ngạch 65.622 USD; Hoa lan1,50 USD/cành, kim ngạch 8.595 USD; Hoa Hồng 0,15 USD/cành, kim ngạch 6.882USD (Minh Tú, 2008) Cũng theo bản tin thì ngoài thị truờng lớn là Nhật Bản, TrungQuốc cũng là thị trường lớn tiêu thụ hoa tươi Việt Nam nhất là hoa Hồng, cẩm chướng,

Ly ly, Lan, Trung bình thị trường Trung Quốc tiêu thụ gần 576.000 USD hoa tươicủa Việt Nam/năm (Minh Tú, 2008) Ngoài ra, Việt Nam còn có thị trường xuất khẩuhoa sang các nước như Đài Loan, Hàn Quốc, Singapore, Tuy nhiên ta lại không có đủlượng hoa để xuất cho họ, nhất là hoa lan

1.5 Thành tựu nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam

1.5.1 Trên thế giói

Nuôi cấy mô trên thế giới đã có từ rất lâu đời và đến nay đã có các thành tựu rấtđáng kể như: vào năm 1978, Melchers lai tạo thành công cây lai giữa Khoai tây và Càchua bằng dung hợp tế bào chất; năm 1990, Vasil và cộng sự tái sinh cây lúa mì hoànchỉnh từ nuôi cấy tế bào trần Vasil và cộng sự (1991) báo cáo về tạo cây lúa mì chuyểngen bằng súng bắn gen vào các phôi non; hay như năm 1994, cây cà chua Favr-savrchuyển gen được chấp nhận cho buôn bán ở Hoa Kỳ,

1.5.2 Ở Việt Nam

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiếntranh kết thúc (1975) Phòng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đầu tiên được xây dựng tạiviện sinh học, Viện khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Bước đầu chỉnghiên cứu sự phát triển của túi phấn, mô sẹo và protoplast, nhưng sự thành công thì chỉ

có ở 2 cây là lúa và khoai tây Tiến đến những năm 80 trở lại đây thì nuôi cấy mô pháttriển khá mạnh mẽ và kết quả khích lệ đã đạt được ở các giống: chuối, dứa, mía, hồng,cúc, phong lan, (Nguyễn Đức Thành, 2000) Như kỹ thuật tạo cây lan Cymbidiumgiống sạch bệnh bằng xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của Nguyễn Văn Uyển

và ctv (1984) Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhângiống lan Hồ điệp của Cung Hoàng Phi Phượng và ctv, trích trong Hội nghị khoa học -Công nghệ sinh học thực vật trong công tác và chọn tạo giống hoa của Dương Tấn Nhựt(2007) Tiến xa hơn là tạo ra giống lan mới bằng kỹ thuật gây đột biến nhân tạo hoa lancắt cành Dendrobium bằng tia gamma của Lê văn Hòa và ctv, trích trong Hội nghị khoahọc - Công nghệ sinh học thực vật trong công tác và chọn tạo giống hoa của Dương TấnNhựt (2007) Chuyển gen phát sáng GFP (Green Flourescent Protein) vào cây Lỉlium oriental hybrid “siberia” nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của Nguyễn Thị Lý

Anh và ctv, trích trong Hội nghị khoa học - Công nghệ sinh học thực vật trong công tác

và chọn tạo giống hoa của Dương Tấn Nhựt (2007)

1.6 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp này có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinhhọc cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống

* về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiếusâu sắc về bản chất của sự sống Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trướchết là mô phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hoá gọi là

mô sẹo (callus) và từ mô sẹo thì có thế kích thích tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh Bằng

* về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phụctráng và nhân nhanh các giống cây trồng quí, có giá trị kinh tế cao Hiện nay phươngpháp này đã trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn giống cây trồng Ngoài

ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn chúng ta có thể tạo được sinh khối lớn

có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình (Nguyễn ĐứcLượng, 2002)

1.7 Những khó khăn và lọi ích trong nhân giống ỉn vitro

1.7.1 Khó khăn

Tuy nhân giống in vitro đạt được những thành tựu to lớn nhưng cạnh đó đã gặp

không ít khó khăn, theo Nguyễn Văn Uyển và ctv (1984) thì có một số khó khăn sau:

- Nhân giống trên môi trường agar thì giá thành sản xuất vẫn còn cao và thờigian nhân giống dài

- Khi sản xuất ở qui mô công nghiệp thì chi phí cho năng lượng và nhân côngvẫn còn ở mức cao

- Đôi khi xảy ra biến dị soma trong quá trình nuôi cấy, đặc biệt là tái sinh thôngqua mô sẹo

- Giới hạn sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống do cây con tạo ra thườngđồng nhất về mặt di truyền

- Quá trình nhân giống phức tạp

Tính bất định về mặt di truyền

Nhân giống in vitro là tạo quần thể đồng nhất với số lựợng lớn Tuy nhiên trong

một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra biến dị soma, mà tế bào mô sẹo thì cónhiều biến dị hơn so với đỉnh chồi Những nhân tố thường gây ra biến dị soma là:

+ Kiểu di truyền: các loài cây khác nhau thì tạo ra các biến dị khác nhau, nóichung cây càng có mức độ bội thể cao thì càng dễ biến dị

+ Số lần cấy truyền: số lần cấy truyền càng nhiều thì độ biến dị càng cao.Amstrong và Phillips (1988) khi nuôi cấy dài hạn thường gây ra biến dị nhiễm sắc thể

Ngoài ra, khi cấy truyền nhiều lần, môi trường phát triển các chồi ngang có thểchuỵển sang tạo ra các bất định (adventitious shoots) Ket quả là có thể tạo ra các biến

dị tế bào soma Vì vậy cây con tạo ra không đồng nhất Đối với mục đích vi nhân giống,

sự tạo chồi ngang là kỹ thuật thích hợp đang được sử dụng Theo nguyên tắc, cách nàytạo ra đúng kiểu cây (Debergh, 2006)

Hình 1.3 Sự tạo thành chồi ngang (a) và chồi bất định (b) (Debergh, 2006)

1.7.2 Những lợi ích

Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống in vỉtro có những ưu điểm sau:

- Tạo các cây con đồng nhất và giống cây mẹ

- So với kiểu nhân giống thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôicấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trongmột thời gian ngắn

- Không chiếm nhiều diện tích

- Có thể cung cấp cây giống bất cứ thời điểm nào vì chủ động được, do không bịảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh

- Có thể tạo ra các cây con sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng kết hợp xử lý nhiệt và vi ghép trong ống nghiệm

- Có thể tạo và nhân được các giống mới bằng kỹ thuật cứu phôi, chuyển gen

- Một số cây quí có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất và việc trao đổi giốngđược dễ dàng

Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy mô còn giúp cho việc nhân giống hữu tính các đốitượng quí mà với kỹ thuật nhân giống thông thường khó thực hiện được (như trườnghợp gieo hạt lan) Bởi vì như chúng ta biết, trái lan có tới hàng triệu hạt Tuy nhiên hạtlan không chứa albumin và có một phôi chưa phân hoá vì thế sự nẩy mầm của hạt rấtkhó khăn trong điều kiện tự nhiên, tỉ lệ nẩy mầm rất thấp (khoảng 1 phần triệu) Do đó

để nhân giống lan bằng hạt có 3 phương pháp: nẩy mầm cộng sinh nấm, nẩy mầmkhông cộng sinh và hiện nay người ta dùng phương pháp gieo hạt hoàn toàn mới đó làphương pháp gieo hạt xanh (sau khi thụ tinh trái lan sẽ được đem vào phòng thí nghiệmkhử trùng và mổ trái trong điều kiện vô trùng, vỏ quả được tách ra bằng một dụng cụ đăkhử trùng và gieo hạt trực tiếp lên môi trường cấy) Ngày nay đã có nhiều công thứcmôi trường gieo hạt cho từng loại lan (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Có nhiều loại môi trường gieo hạt Lan đã được khuyến cáo Môi trường phổbiến nhất là môi trường Knudson c (1946)

Thành phần của môi trường Knudson c (1946)

1.8 Các yếu tố liên quan đến phưong pháp vi nhân giống

Vi nhân giống là một phương pháp nhân giống hiện đại hay nhân giống vô tínhtrong phòng thí nghiệm

Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu gen đượctuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật ỉn vitro Vi nhân giống thông thường là phương

pháp nhân nhanh và giảm giá thành Hình 1.3 trình bày một sơ đồ tổng quát quy trình vinhân giống

cấv vỉ nhãn ulống _^.lụorề Câv lớn

của cây

•o

đạ! đuoc nliicu chổi

(lựi đu ọc cảy COII ra re

Ex vitro (mỏitrirõmg bôn ngoái)

Hình 1.4 Các bưó’c CO’ bản của vi nhân giống (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

1.8.1 Qui trình vi nhân giống

Qui trình vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành 4giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn có một chức năng riêng Sự thành công của côngviệc vi nhân giống tuỳ thuộc vào tất cả các giai đoạn (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

In vivo Giai đoạn 0: Sự chuẩn bị của cây mẹ

In vitro Giai đoạn 1: Bắt đầu tiệt trùng

Giai đoạn 2: Nhân Giai đoạn 3a: Kéo dài Giai đoạn 3b: Tạo rễ và tiền thuần dưỡng

In vivo Giai đoạn 4: Thuần dưỡng

Giai đoạn 0 (chuẩn bị của cây mẹ): là chọn cây mẹ hoàn toàn sạch bệnh, tốt

nhất là chọn cây mẹ trong nhà kính Mầu thì lấy vào giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất(Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Giai đoạn này còn được hiểu là cải thiện điều kiện vệ sinh của cây mẹ Phươngpháp tưới nhỏ giọt của cây mẹ cho phép cải thiện tình trạng sinh lý của cây mẹ, để mẫucấy tuân thủ theo qui trình cấy Tình trạng sinh lý của cây mẹ cũng như nguồn dùng làmmẫu cấy có thể được cải thiện bởi một số kỹ thuật như ghép nhiều tầng (Nguyễn BảoToàn, 2004)

Giai đoạn 1: Mục đích là thực hiện thao tác cấy Nó là một sự kết họp giữa một

phương pháp tiệt trùng đầy đủ và một tỉ lệ sống cao của mẫu cấy và không bị nhiễm.Thông thường khó đạt thành công 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu

Khử trùng mẫu cấy thường được sử dụng các chất diệt nấm bệnh, sản phẩmdùng đế khử trùng tốt nhất là các sản phẩm rẻ tiền, không độc với mẫu cũng như đối vớingười thao tác và hiệu quả loại các vi sinh vật trong một phạm vi rộng (Nguyễn BảoToàn, 2004)

Giai đoạn 2: Quá trình kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh sinh

trưởng, chồi chính, chồi bên Có nhiều kiểu tăng tốc độ nhân như cấy mắt Trong kỹthuật này có hai kiếu tạo chồi, một kiểu tạo chồi từ một mẫu cấy chỉ có một mắt hoặcmẫu cấy có nhiều mắt Cả hai điều tạo ra số chồi nhiều và hệ số nhân tuỳ thuộc vào cácđoạn chồi mới tạo thành Phương pháp nhân giống này thường được ứng dụng trênnhững cây không có mầm bệnh (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

Phương pháp khác để gia tăng số chồi ở giai đoạn 2 là cấy đỉnh sinh trưởng(meristem culture) hoặc cấy đỉnh chồi (shoot tip culture) Đỉnh sinh trưởng hoặc chồi cóthế được lấy từ chồi chính hoặc chồi ngang Theo cách cấy này hai kiếu dạng chồi cóthể được tạo thành là chồi dài và cụm chồi Ở chồi dài, các chồi phát triển lóng dài vàcác chồi ngang cũng dài Vì vậy, cây con được tạo ra từ chồi này có dạng bình thường.Trong khi đó cụm chồi tạo ra nhiều chồi nhưng lóng ngắn nên cây con được tạo ra cóthể là cây con hoặc cụm cây con (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

Ở giai đoạn 2, việc gia tăng số chồi phụ thuộc nhiều vào việc sử dụng cytokinin

Sử dụng hàm lượng cytokinin cao có thế gây ra một số vấn đề trong các cây được nhân

giống như sự thừa nước, tạo thành bụi rậm, biến dị vô tính, các vấn đề về rễ và chậm rahoa (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).

Giai đoạn 3: Được chia thành hai giai đoạn là giai đoạn kéo dài (3a), kích thích

tạo rễ và tiền thuần dưỡng (3b) Giai đoạn (3a) Kéo dài: Trong nhiều trường họp sự kéodài là một yêu cầu cho sự tạo rễ đầy đủ Môi trường kéo dài thường không chứacytokinin hoặc một cytokinin yếu hơn cytokinin đã được sử dụng trong giai đoạn 2;Giai đoạn (3b) Kích thích rễ và tiền thuần dưỡng: Auxin thường được sử dụng để kíchthích tạo rễ Tạo rễ tốt nhất thường đạt được trên môi trường với hàm lượng khoángthấp (ví dụ môi trường Knop Vì) (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).

Giai đoạn 4: Nhằm làm giảm tối thiểu sự chết cây con, khi chuyển từ in vỉtro

sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng Trong giai đoạn này các yếu tố cần được quantâm là tình trạng cây con khi chuyển ra môi trường trồng, và các yếu tố về môi trườngnhư nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

1.8.2 Các thành phần trong môi trường nuôi cấy mô thực vật a/ Khoáng đa lưọiig: Đạm (N), Lân (L), Kali (K), Magie (Mg), Calci (Ca), sắt

(Fe) Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trongđiều kiện tự nhiên (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

b/ Khoáng vi lưọng: Nhu cầu vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật là lĩnh vục

rất ít được nghiên cứu Tuy nhiên nó được chứng minh là không thể thiếu đối với sựphát triển của mô và tế bào Tuy nhiên có những trường họp, một số khoáng vi lượng làkhông cần thiết Các nguyên tố vi lượng thường dùng trong nuôi cấy mô là manganese,boron, kẽm, đồng, cobalt, idodine, molypdenum (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

c/ Carbon và nguồn năng lưọng: Nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng

họp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải là do quátrình quang họp cung cấp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạngđường Hai dạng đường thường gặp trong nuôi cấy in vitro là glucose và sucrose Cácnguồn carbohydrate khác cũng được thử nghiệm nhưng hiệu quả kém hơn glucose vàsucrose (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

d/ Vitamin: Thực vật tổng họp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát

triển của chúng để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Các vitamin thườngđược sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamine (Bl), acid nicotinic (PP),pyridoxine (B6), và myo-inositol (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

e/ Các họp chất hữu CO’ bổ sung không xác định: Các chất bổ sung này là

protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nướccam, nước cà chua Nhưng hiện nay người ta thường dùng dịch chuối và proteinhydrolysate hon (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Chất có hoạt tính trong nước dừa được chứng minh là myo-inositol và một sốcác acid amin khác, lượng nước dừa (lấy từ trái dừa già) dùng trong môi trường thườngkhá lớn từ 15 - 20% thể tích môi trường (Nguyễn Văn Uyển và ctv, 1984)

Trong dịch chuối xiêm chín hoàn toàn thì có sự chuyển hoá tinh bột thành đườnggần như hoàn toàn, ngoài ra còn có các chất Ca, Fe, p và các vitamin B, C Vì vậy dịchchuối xiêm chín là nguồn cung cấp đường, khoáng, vitamin cho môi trường nuôi cấy(Nguyễn Tấn Đàm, 1990)

f Các chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật: Theo Đặng Phương Trâm (2005),

thì chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật được chú ý vào năm 1928 khi Went phát hiệnvai trò của Auxin lên khả năng phát triển tế bào của lúa mạch, đã mở đầu cho việc pháthiện, ứng dụng chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật vào nuôi cấy mô

Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật là cách gọi chung cho những hợp chất hữu

cơ có tác dụng kích thích hay ngăn cản đến sự phát triển sinh lý của thực vật, ở mộtnồng độ rất thấp (Mai Trần Ngọc Tiếng và ctv, 1991 trích theo Đặng Phương Trâm,

2005 Các chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật có tác dụng điều tiết các quá trình sinhtrưởng và phát triển của cây từ lúc tế bào trứng thụ tinh, phát triển thành phôi cho tớikhi cây ra hoa, kết quả là hình thành cơ quan sinh sản, dự trữ và kết thúc chu kỳ sốngcủa mình (Vũ Văn Vụ, 1999 trích theo Đặng Phương Trâm, 2005) Trong nhân giống in vitro ta thường sử dụng hai chất điều hòa sinh trưởng đó là Auxin và Cytokinin.

Auxin: Trong môi trường nuôi cấy thì Auxin được kết hợp chặt chẽ với các

thành phần dinh dưỡng để kích thích tạo mô sẹo, huyền phù tế bào và phát sinh hìnhthái, đặc biệt là khi sử dụng kết hợp với Cytokinin (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Trongquá trình phát sinh hình thái, sự di chuyển của Auxin có vai trò trong việc thiết lập tínhhữu cực của cơ quan thực vật và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh cơ quan (BùiTrang Việt, 2001)

Các Auxin được dùng phổ biến:

+ 2,4-D (2,4- Dichlorophenoxyacetic)

+ IAA (indole 3- aceticacid)

+ IBA (indole 3- butyric acid)

+ NAA (1-naphhalene acetic acid)

Trong đó 2,4-D là một dạng Auxin mạnh rất cần thiết trong sự biệt hoá để tạo

mô sẹo, tuỳ theo mục đích mà 2,4-D được sử dụng riêng lẽ hay kết hợp với các Auxinkhác (Nguyễn Văn Uyển và ctv, 1984)

Cytokinin: Trong nuôi cấy mô thực vật Cytokinin có tác dụng làm phân chia tế

bào, nó ảnh hưởng rõ rệt lên sự phát sinh chồi, kích thích phân chia chồi và định hướngphân hoá tế bào Khi trong môi trường có chứa nồng độ Cytokinin thích hợp thì cácmầm bên của đỉnh chồi sẽ phát triển thành chồi (Đặng Phương Trâm, 2005)

Nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin thấp thì sẽ kích thích thành lập chồi, ngược lại thì sẽhình thành rễ, còn nếu ở một mức độ cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển mô sẹo Vìvậy chúng ta có thể sử dụng Cytokinin kết hợp với Auxin theo một tỷ lệ nào đó để thuđược các sản phẩm như mong muốn (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Các Cytokinin phổ biến dùng để phân hóa chồi thân mầm và chồi rễ mầm:

+ BAP (6 - benzyl - aminopurine)

+ Zea (zeatin)

+ Kinetine

Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỉ lệ Auxin và Cytokinin

có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của nuôi cấy mô in vitro

cũng như trên cây nguyên vẹn Nếu Auxin cao hơn Cytokinin thì kích thích sự tạo rễcòn ngược lại thì kích thích sự tạo chồi (Vũ Văn Vụ, 2001 trích theo Nguyễn ĐứcThành, 2000)

Thí nghiệm vê hiệu quả của sự tương tác NAA và BA trên cây Bowiea volubilỉs

2 Mô tả các phưong pháp nghiên cún liên quan đã đưọc thực hiện

Có rất nhiều các nơi thực hiện kỹ thuật gieo cấy hạt lan như Công ty Long Đỉnh(Tp Hồ Chí Minh), Công ty Tân Xuân, hay như trong sách Nuôi cấy Mô - tập 3 củaDương Công Kiên (2006), sách Kỹ Thuật Nuôi Trồng Hoa Lan của Nguyễn Thiện Tịch(2006), nhưng chỉ là qui trình gieo cấy do các tác giả thực hiện mà ít có thí nghiệm để

so sánh

Tuy nhiên, sau khi gieo hạt lên chồi rồi thì đây là nguồn vật liệu được các côngtrình nghiên cứu tiếp theo sử dụng rất phổ biến (Dương Công Kiên, 2006) như:

- Gandewijaja (1980), sử dụng chồi đỉnh dài từ 1- 1,5 mm của cây con gieo hạt

in vỉtro sẽ tạo cụm chồi và tạo rễ Áp dụng cho giống Dendrobỉum phalaenosỉs (Dương

Công Kiên, 2006)

- Vij và Pathak (1989), dùng chồi bên lấy từ giả hành của cây gieo hạt ỉn vỉtro

được 40 tuân tuôi Sau một thời gian quan sát thây có sự tạo chôi và tạo thành cây từchồi bên Cây con được tái sinh từ chồi bên có tính tế bào ổn định (Dương Công Kiên,2006)

Thòi gian Địa điểm Công việc

Tháng 2/2006

tháng 7/2007 - Phòng Nuôi cấy mô thuộcKhoa Nông nghiệp & TNTN

-Trường Đại học An Giang

Nhân giống lan Dendrobium anosmum

Tháng 2/2006

tháng 2/2007 - Phòng Nuôi cấy mô thuộcKhoa Nông nghiệp & TNTN

-Trường Đại Học An Giang

Nhân giống lan Dendrobium mini

Tháng 2/2007

tháng 2/2008

- Vườn lan Khoa Nông nghiệp

& TNTN - Trường Đại học

An Giang

Thử nghiệm ra cây lan

Dendrobium mini trên các loại

giá thế khác nhau

2 Phương tiện nghiên cửu

a Dụng cụ

- Ống đong, ống hút, đũa thủy tinh, kẹp dài 25 - 30 cm, kéo cắt mẫu cấy

- Dao cắt mẫu cấy (loại số 10)

- Bình nuôi cấy - chai thuỷ tinh chịu nhiệt hàng Việt Nam

- Đèn cồn, bình tia, bình xịt đựng cồn, giấy thanh trùng.

- Cốc thủy tinh chia vạch: 50ml, lOOml, 200ml, lOOOml

- Đường saccharose và Agar

d Phòng nuôi mẫu: phòng kín có kệ để các mẫu cấy; hệ thống đèn neon chiếu

sáng cho mẫu cấy 16/24 giờ; phòng được gắn máy lạnh nuôi mẫu cấy ở nhiệt độ 26

-28°c

3 Phưoiig pháp nghiên cún

3.1 Lan Dendrobium anosmum

3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trưòng gieo hạt thích họp

cho hạt lan Dendrobium anosmum

Vật liệu: Trái lan Dendrobium anosmum được thụ phấn từ cây lan giống tại

Vườn lan Khoa Nông nghiệp & TNTN Trường Đại Học An Giang

Hình 1.6 Hoa và trái lan lan Dendrobium anosmum đưọ’c thụ 4 tháng

Qui trình khử trùng và gieo hạt: Trái lan được thụ phấn khoảng 3-5 tháng

chín sẽ được cắt đem lên phòng Nuôi cấy mô khử trùng bằng xà phòng 5 phút —» rữadưới vòi nước chảy 15 phút —» ngâm cồn 70° trong 1 phút (trong tủ cấy vô trùng) —»rữa 3 lần với nước cất 2 lần (trong tủ cấy) —» sau đó ngâm trong clorox 15 phút (trong tủcấy) —» rữa 5 lần với nước cất 2 lần (trong tủ cấy) —» Gắp trái ra và xẻ lấy hạt cấy vàomôi trường đã được chuẩn bị sẵn (Qui trình khử trái và gieo hạt theo như hình 1.7)

Hình 1.7 Qui trình khử trái và gieo hạt lan Dendrobium anosmum

(2.2a: ngâm trái lan trong dung dịch clorox; 2.2b,c,d,e: gắp trái ra và xẻ lấy hạt cấy vàomôi trường đã được chuẩn bị sẵn; 2.2f: Hạt lan sau khi gieo được một tháng)

Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát và ghi nhận ảnh hưởng của chất điều hòa sinh

trưởng lên sự nẩy mầm của hạt lan thông qua các chỉ tiêu: ngày xuất hiện màu xanh;ngày hạt nẩy chồi; tỷ lệ nẩy chồi

Thòi gian lấy chỉ tiêu: 30, 45, 60, 75, 90 ngày sau khi cấy.

3.1.2 Thí nghiệm 2: Kháo sát ảnh hưồng của chất điều hoà sinh

trưỏng BA (6 - Benzyl - aminopurỉne) lên sự nhân chồi lan Dendrobium anosmum

Vật liệu: Chọn chai có hạt lên mầm tốt ở thí nghiệm 1 cấy sang môi trường

nhân chồi đã chuẩn bị sẵn Chồi có chiều cao khoảng 10 mm

Môi trưòng nhân chồi sử dụng là môi trường cơ bản MS, với chất kích thích tố

Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát và ghi nhận ảnh hưởng của chất điều hòa sinh

trưởng BA lên sự nhân chồi lan thông qua các chỉ tiêu:

- Chiều cao chồi (mm): lấy trung bình chiều cao của các chồi mới tạo thành

- Số lá: trung bình của tổng số lá trên các chồi mới tạo thành

Thòi gian lấy chỉ tiêu: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ngày sau khi cấy.

Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được tính bằng Microsoft Excel, và xử lý

thống kê bằng phần mềm MSTATC

3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh

trưởng NAA (Naphthalene acetic acid) lên sự tạo rễ cho lan Dendrobium anosmum

Vật liệu: Chọn những chồi có chiều cao khoảng 1,5 cm và số lá 4 - 5 đạt tiêu

chuấn cấy sang môi trường tạo rễ đã chuẩn bị sẵn

Môi trường tạo rễ sử dụng là môi trường MS với các kích thích tố NAA ở nồng

- Số lượng rễ trên chồi

- Chiều dài rễ trung bình (cm)

- Số chồi mới tạo thành

- Chiều chồi chính (cm)

Thòi gian lấy chỉ tiêu: 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 ngày sau khi cấy.

Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được tính bằng Microsoft Excel, và xử lý

thống kê bằng phần mềm MSTATC

3.2 Lan Dendrobỉum mitti

3.2.1 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy mô thích họp

cho việc nhân chồi lan Dendrobium mini

Vật liệu: Lan Dendrobium mini (dòng Dl) được đặt mua từ Công ty TNHH

Long Đỉnh dưới dạng chai mô

Chai mô sau khi đem về sẽ được khử trùng cồn và đặt trong phòng nuôi cấy môkhoảng 5-7 ngày cho ổn định, sau đó được bố trí cấy mẫu vào môi trường nuôi cấythích họp để nhân nhanh chồi

Chọn những chồi có chiều cao trung bình 1,0 cm bố trí cấy mẫu vào môi trườngnhân chồi đã được chuẩn bị sắn

Môi trường nuôi cấy: Môi trường co bản MS và MS/2, với các nồng độ BA

thay đổi từ 0 - 2 (mg.ĩ)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy theo thể thức

hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 lần lặp lại, mỗi lần là 1 keo thủy tinh, mỗi keo được cấy vào

2 chồi con