Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm (10 TCN)

Bệnh tích - Xuất huyết tràn lan ở các cơ quan nội tạng - Gia cầm phù thũng dưới da vùng đầu, cổ và ngực - Miệng chứa nhiều dịch - Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhày - Đường tiêu

Céng hoµ x∙ héi chñ nghÜa viÖt nam

Bé n«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n

10 tcn tiªu chuÈn ngµnh

Quy tr×nh chÈn ®o¸n bÖnh cóm gia cÇm

Hµ néi - 2005

Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm

I Phạm vi áp dụng

Quy trình này được áp dụng để chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm tại các phòng xét nghiệm chẩn đoán bệnh động vật

II Khái niệm

Bệnh cúm gia cầm do virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra cho các loài gia cầm và chim hoang dã Bệnh có nhiều dạng khác nhau: có dạng tỷ lệ chết rất cao,

có dạng không có triệu chứng

Virus Cúm type A có thể gây nhiễm cho gia cầm, lợn, ngựa và các loài khác kể cả con người Virus cúm type A có 16 subtype kháng nguyên H (Haemaglutinin) và 9 subtype kháng nguyên N (Neuraminidase) Sự kết hợp của 2 loại kháng nguyên bề mặt này tạo nên nhiều chủng virus cúm khác nhau

III Lấy mẫu và bảo quản

Bệnh phẩm phát hiện virus là dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản (swab), các phủ tạng (Não, phổi, khí quản, lách,ruột )

Bệnh phẩm phát hiện kháng thể là huyết thanh gia cầm nghi nhiễm cúm hoặc huyết thanh gia cầm sau khi tiêm vắc xin

Chi tiết về cách lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm xem phần phụ lục

IV Máy móc – Dụng cụ – Hoá chất – Nguyên liệu

- Nồi đun cách thuỷ (water bath)

- Buồng cấy vô trùng (BSC-Bio-safety cabinet)

- Máy hút chân không

- Máy ly tâm lạnh (ống 15 ml)

- Máy trộn ống nghiệm (vortex mixer)

- Máy ly tâm ống nhỏ (microcentrifuge)

* Máy móc thực hiện phản ứng huyết thanh học

- Máy lắc đĩa (orbital shaker)

- Cốc có mỏ

- ống nghiệm

- Lọ chắt huyết thanh

- ống eppendorf 1,5 ml (Rnase/Dnase free)

- Máng trộn chất phản ứng (reagent trough)

- Pipet thuỷ tinh: 1, 5 và 10 ml

- Micropipet đơn: 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 àl

- Micropipet nhiều đầu (8-12): 5-50, 50-300 àl

- Đầu típ các cỡ 10, 20, 100, 200 và 1000àl sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc)

- Cối chày sứ

- Cát sạch để nghiền bệnh phẩm

- Dao, kéo, panh kẹp

- Găng tay cao su không bột hoặc găng nitrile

- Đĩa 96 giếng đáy chữ V

* Hoá chất thông thường

- Nước cất hoặc nước khử ion

* Hoá chất cho PCR

- Cồn Ethanol 70%, cồn Ethanol tuyệt đối

- Trizolđ LS reagent hoặc Trizolđ reagent

- Chloroform

- Isopropanol

4 Nguyên liệu

4.1 Nguyên liệu cho phân lập và phản ứng HA, HI

- Trứng gà có phôi 9- 10 ngày tuổi, khoẻ mạnh

- Kháng huyết thanh chuẩn H1-H16 (ví dụ kháng huyết thanh H5N1 A/Chicken/scot/59)

- Kháng nguyên chuẩn H1-H16 (ví dụ kháng nguyên H5N1 Weybridge – UK)

- Men xử lý huyết thanh RDE (Receptor Destroying Enzyme)

- Hồng cầu gà 0,5%

- Kháng sinh

4.2 Nguyªn liÖu cho RT-PCR

- KÝt chiÕt t¸ch RNA cña virus (Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoÆc #74106 250 prep)

- KÝt RT-PCR OneStep Qiagen (hoÆc kit Invitrogen Superscript One-step RT-PCR)

Ph©n lËp virus

(-) (+)

RT-PCR (RRT-PCR) KiÓm tra l©m

sµng

1 Kiểm tra một số đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng – bệnh tích

1.1 Một số đặc điểm dịch tễ hoc

Bệnh Cúm gia cầm có tính lây truyền rất nhanh và mạnh

Chim hoang dã được coi là nguồn truyền lây mầm bệnh Chim mắc bệnh truyền virus qua nước dãi, dịch nước mũi và phân

Chim và gia cầm mẫn cảm có thể bị nhiễm bệnh khi tiếp xúc trực tiếp với chim mắc bệnh hoặc gián tiếp qua các bề mặt nhiễm bẩn

Ngoài ra một số loài khác cũng có thể bị mắc bệnh: người, lợn, ngựa

1.2 Triệu chứng

- Gia cầm bị xù lông, ủ rũ, bỏ ăn, giảm đẻ

- Đầu, mặt sưng, phù quanh mắt Mào, tích sưng, xuất huyết

- Mắt bị viêm kết mạc và có thể xuất huyết

- Chân giữa vùng bàn và khuỷu bị xuất huyết

- Có triệu chứng hô hấp

- Con vật mắc bệnh thường chết trong vòng 24-48 giờ sau khi xuất hiện các triệu chứng đầu tiên

1.3 Bệnh tích

- Xuất huyết tràn lan ở các cơ quan nội tạng

- Gia cầm phù thũng dưới da vùng đầu, cổ và ngực

- Miệng chứa nhiều dịch

- Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhày

- Đường tiêu hoá xuất huyết

- Gà đẻ buồng trứng xuất huyết

+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc 10X (xem phụ lục), lắc đều

+ Để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng

Mẫu đã sẵn sàng để tiêm truyền

- Chọn trứng có phôi 9-10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3 trứng/bệnh phẩm

- Lau trứng bằng cồn 70% và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi

- Dùng syringe 1 ml lắp kim và hút dịch bệnh phẩm (đã xử lý ở trên) tiêm vào xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng

- Gắn vết tiêm bằng keo dán

- ấp trứng tiếp 2-3 ngày ở nhiệt độ 370C

- Theo dõi sau khi tiêm, soi trứng ngày 2 lần Những trứng chết được cất vào tủ lạnh

40C để kiểm tra

c Thu hoạch nước trứng sau khi phân lập:

- Trứng chết hoặc sống được cất vào tủ lạnh 40C qua đêm hoặc ít nhất 4 giờ trước khi thu hoạch

- Cho 25 àl dịch niệu mô vào giếng thứ 1

- Pha loãng kháng nguyên bằng cách chuyển 25 àl dịch niệu mô từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự đến giếng 11 thì bỏ đi 50 àl

- Nhỏ thêm 25 àl PBS vào các giếng

- Nhỏ 25 àl hồng cầu gà 1% (v/v) vào tất cả các giếng trên

- Lắc đĩa bằng máy hoặc bằng tay

- ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng, thời gian khoảng 40 phút

* Đọc kết quả:

Hiệu giá HA của virus được tính ở độ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn hiện tượng ngưng kết hồng cầu

Ví dụ: Nếu ở độ pha loãng 1/128 còn có ngưng kết thì hiệu giá HA là 1/128

- Nếu HA(+) dương tính, chứng tỏ có virus Tiếp tục giám định bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn của một số subtype H virus Cúm A và kháng huyết thanh chuẩn Newcastle để xác định loại virus phân lập

- Nếu HA(-) âm tính mà phôi chết, có bệnh tích phôi, lấy nước trứng tiêm truyền lần

2

- Nếu HA(-) âm tính, phôi phát triển bình thường, có thể tiêm lại hoặc không

Bảo quản virus phân lập được ở – 700C

b Giám định virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu - HI

- Pha kháng nguyên 4HA/25 àl: Lấy độ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu chia cho 4

Ví dụ: Hiệu giá HA của dịch niệu mô là 1/128

Đơn vị 8 HA = 128: 4 = 32

Như vậy sẽ trộn 1 phần dịch nước trứng với 31 phần PBS để đạt được dung dịch kháng nguyên 8HA

- Chuẩn độ kháng nguyên 8 HA:

Sau khi pha, kháng nguyên 4HA phải được chuẩn độ lại

Tiến hành: Như phản ứng HA

Kháng nguyên loãng: Nếu ngưng kết đến giếng thứ 1 tức là thiếu kháng nguyên, có thể thêm một lượng kháng nguyên (bằng với lượng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngưng kết đến giếng thứ 2

- Tiến hành phản ứng HI: Trên 1 đĩa có thể tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng

huyết thanh của các subtype khác nhau

+ Nhỏ 25 àl PBS vào các giếng của đĩa 96 giếng

+ Nhỏ tiếp 25 àl kháng huyết thanh vào giếng đầu tiên

+ Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 àl kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 àl cuối cùng

+ Nhỏ 25 àl kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 - 11 Thêm 25

àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12)

+ Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút

+ Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu vào tất cả các giếng của đĩa, lắcđều

+ Để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút Đọc kết quả

2.1.3 Phương pháp RT-PCR

a Chiết tách RNA

Có thể chiết tách RNA bằng bộ kít hoặc phương pháp chiết tách Trizol

Các mẫu swab nên chiết tách bằng kít, khi sử dụng nên theo hướng dẫn của nhà sản xuất (có thể sử dụng bộ kít Qiagenđ Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #74106

250 prep)

Chiết tách bằng Trizol:

• Cho 0,75 ml Trizolđ LS reagent (hoặc 1 ml Trizolđ reagent) + 0,25 ml dịch bệnh phẩm(0,1 ml dịch bệnh phẩm nếu dùng Trizolđ reagent) vào ống 1,5 ml Lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 5 phút

• Thêm 0.2 ml chloroform vào mỗi ống Lắc mạnh trong 15 giây và để ở nhiệt độ phòng 5 phút

• Ly tâm ống ở tốc độ 12.000 g trong 15 phút ở 4°C

• Chuyển phần nước (khoảng 500 àl) sang ống microtube mới

• Thêm 0.5 ml Isopropanol và lắc đều Để 5-10 phút ở nhiệt độ phòng

• Ly tâm ống ở tốc độ 10.000 g trong 5 phút ở 4°C Bỏ dung dịch trong ống đi

• Rửa RNA đóng ở đáy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tâm với tốc độ 10.000

10) Giữ ở 40C Quy trình nhân gien này áp dụng cho primer H5 (F 936 và R 1299) và N1 (F6 và R595), đối với các cặp primer khác quy trình có thể thay đổi cho phù hợp

c Chạy điện di:

- Chuẩn bị thạch agarose 1,5% pha trong dung dịch TAE hoặc TBE có Ethidium Bromide (10 àg/àl)

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có l−ợc)

- Thạch khô, rút lược ra và cho mẫu vào các giếng (5 àl sản phẩm PCR + 2àl dung dịch loading buffer)

- Sử dụng Marker trọng lượng phân tử (thang 100 bp)

- Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm đi kèm (mẫu

2.2.1 Phản ứng HI phát hiện kháng thể subtype H5 (hoặc các subtype khác )

Huyết thanh kiểm tra: Huyết thanh gà không cần xử lý bằng RDE, huyết thanh vịt, ngan có thể xử lý bằng RDE để chống hiện tượng ức chế ngưng kết không đặc hiệu và xử lý hồng cầu để chống hiện tượng ngưng kết hồng cầu giả (các phương pháp xử lý huyết thanh xem phần phụ lục)

a Chuẩn bị kháng nguyên:

- Chuẩn độ kháng nguyên – Xác định hiệu giá HA (phản ứng ngưng kết hồng cầu

HA) xem phần 2.1.2.a

- Pha kháng nguyên chuẩn 8HA/50 àl: Xem phần 2.1.2.b

Chú ý: Trước khi pha cần tính lượng kháng nguyên dùng cho phản ứng:

1 mẫu huyết thanh kiểm tra cần 175 àl kháng nguyên Tính lượng kháng nguyên cần dùng cho số mẫu huyết thanh cộng thêm 1ml để đảm bảo lượng kháng nguyên dùng cho phản ứng

Ví dụ: 30 mẫu huyết thanh kiểm tra: 5,25ml (5.250 àl)+ 1ml(thêm) = 6,25ml

- Chuẩn độ kháng nguyên 8HA trước khi tiến hành phản ứng HI (phụ lục II.3.3)

b Phản ứng HI:

- Nhỏ 25 àl PBS vào các giếng của đĩa 96 giếng

- Nhỏ tiếp 25 àl kháng huyết thanh vào giếng đầu tiên

- Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 àl kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 àl cuối cùng

- Nhỏ 25 àl kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 - 11 Thêm 25

àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12)

- Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút

- Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu vào tất cả các giếng của đĩa, lắcđều

- Để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút Đọc kết quả

Đọc kết quả:

Phản ứng (+) dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy

Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu Huyết thanh được coi là dương tính khi có hiệu giá huyết thanh ≥ 1/16 Huyết thanh đối chứng âm tính phải có hiệu giá ≤ 1/4

Chú ý: Khi kiểm tra huyết thanh các loài khác không phải là gà nên có 1 giếng chỉ

có huyết thanh và hồng cầu để kiểm tra hiện tượng ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu Nếu phát hiện thấy có ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu xảy ra với mẫu huyết thanh nào cần xử lý lại mẫu huyết thanh đó và kiểm tra lại bằng phản ứng HI

2.2.2 Phản ứng ELISA

Hiện nay trên thị trường có nhiều bộ kít ELISA thương mại Các bộ kit này chỉ phát hiện được kháng thể gia cầm với kháng nguyên Nucleocapsid, tức là chỉ phát hiện được kháng thể cúm A mà không phân biệt được subtype của kháng thể có trong huyết thanh Khi sử dụng kít ELISA nên áp dụng theo quy trình kèm theo

- Nếu kết quả RT-PCR (RRT-PCR) dương tính, kết luận dương tính virus cúm

- Nếu gia cầm chưa tiêm phòng, phát hiện có kháng thể cúm, kết luận gia cầm đã nhiễm virus cúm

- Nếu kết quả phân lập âm tính, RT-PCR (RRT-PCR) âm tính, kết luận âm tính virus cúm

Phụ lục

I Lấy và Bảo quản bệnh phẩm

1 Lấy mẫu:

- Dịch ngoáy họng, khí quản: Đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thu lấy

dịch nhày, sau đó từ từ rút ra rồi đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que vừa với

chiều dài của ống, đóng kín nắp

- Dịch ngoáy ổ nhớp: Cho que ngoáy sâu vào hậu môn gia cầm, ngoáy quanh thành

hậu môn, đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản như trên

- Mẫu phân: Dùng tăm bông ngoáy trực tiếp vào phân tươi ở chuồng gà, rồi cho vào

ống chứa dịch bảo quản

- Mẫu tổ chức: Lấy kéo cắt phần tổ chức cần lấy cho vào túi nilon hay hộp nhựa

sạch, bảo quản lạnh Mẫu tổ chức nhỏ có thể cho vào dung dịch bảo quản

- Mẫu huyết thanh: Lấy 3-5 ml máu gia cầm vào ống nghiệm, để nghiêng, chờ máu

đông chắt lấy huyết thanh

Bệnh phẩm sau khi cho vào dung dịch vận chuyển có thể bảo quản ở 40C từ 1-2

ngày, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở nhiệt độ -200C

Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 40C trong vòng 1 tuần, nếu bảo quản lâu hơn

nên giữ ở nhiệt độ -200C

Mẫu được chuyển tới phòng xét nghiệm trong điều kiện lạnh (phích đá), càng sớm

càng tốt, có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo

2 Môi trường bảo quản bệnh phẩm

Bệnh phẩm là dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản được bảo quản trong dung dịch vận

chuyển Có thể sử dụng môi trường 199 hoặc môi trường glycerol có bổ sung kháng sinh,

bảo quản ở 40C từ 1-2 ngày, nếu lâu nên giữ ở nhiệt độ -200C

- Môi trường 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò)

+ Hấp vô trùng (1210C/15) phút, bổ sung kháng sinh (như trên) và trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1

Ngoài ra có thể sử dụng các môi trường bảo quản khác như: Muối đệm Hank, môi trường M.E.M, PBS, Tryptose Phosphate broth, Veal Infusion Broth, Sucrose-phosphate buffer Các dung dịch này có thể được bổ sung bovine serum albumin (BSA), gelatin 0,5-1%, các chất kháng sinh, kháng nấm

II Chuẩn bị các dung dịch và xử lý huyết thanh

2 Dung dịch nước muối sinh lý 0,85%:

8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất

Hấp vô trùng, bảo quản 40C không quá 3 tuần

3 Dung dịch hồng cầu gà 0,5%:

- Máu gà trống khoẻ mạnh đã trưởng thành, không có kháng thể cúm và newcastle

- Dùng bơm tiêm 5 – 10 ml hút sẵn 1ml (10 % thể tích) dung dịch chống đông (Natri Citrat 4%, Alserver…) rồi lấy máu gà cho máu vào ống nghiệm

- Ly tâm 1000 – 1500 vòng/phút, trong 15 phút, đổ bỏ huyết tương, cho thêm nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc đều Ly tâm như trên 3 – 4 lần để rửa hồng cầu Sau lần ly tâm cuối hút bỏ nước ở trên

- Pha hồng cầu thành huyễn dịch 0,5% bằng cách pha 0,5 ml hồng cầu với 99,5 ml nước muối sinh lý

- Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 – 80 C Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong 4-5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết loại bỏ không dùng)

4 Chuẩn độ ngược kiểm tra kháng nguyên 4 HA

1 Nếu là 1, thêm 7 lượng kháng nguyên (KN) chưa pha loãng nữa (ví dụ nếu đã sử dụng 0,1ml KN trước đó, thì thêm 0,7ml KN nữa

2 Nếu là 1 1/2, thêm 5 lượng KN chưa pha loãng nữa

3 Nếu là 2, thêm 3 lượng KN chưa pha loãng nữa

4 Nếu là 2 1/2, thêm 2 lượng KN chưa pha loãng nữa

5 Nếu là 3, thêm 1 lượng tương đương KN chưa pha loãng nữa

6 Nếu là 3 1/2, thêm 1/2 lượng KN chưa pha loãng nữa

7 Nếu là 4, đạt tiêu chuẩn

5 Kháng huyết thanh chuẩn:

- Kháng huyết thanh chuẩn chế trên các loài như thỏ, dê, cừu cần được xử lý bằng RDE (Receptor Destroying Enzyme) trước khi xét nghiệm

- Kháng huyết thanh chế trên gà không cần xử lý bằng RDE Tuy nhiên, nếu phản ứng cho kết quả không rõ ràng, kháng huyết thanh có thể xử lý RDE để khẳng định kết quả dương tính

- Hoàn nguyên kháng huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ -200C

a Xử lý kháng huyết thanh vô hoạt yếu tố ức chế không đặc hiệu:

Trộn 3 phần RDE với 1 phần kháng huyết thanh (vd: 0,9 ml RDE+0,3 ml huyết thanh)

ủ ở nhiệt độ 370C trong nồi đun cách thuỷ (water bath) qua đêm

Sau ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 560C/30 phút để vô hoạt RDE còn dư

Kháng huyết thanh đã xử lý để nguội cho thêm 6 phần nước muối sinh lý (0,3 ml

HT + 1,8mlSL), độ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh sẽ là 1/10

b Xử lý huyết thanh chống hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu giả

Hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu giả có thể xử lý bằng cách hấp phụ huyết thanh kiểm tra với hồng cầu gà Thêm 25 àl hồng cầu đặc vào 500 àl huyết thanh, lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 800 g trong vòng 2-5 phút Thu lây huyết thanh đã hấp phụ

III Công thức một số cặp mồi (primer)

H5-219f GAG TGA AGC GTC TCA TTT TG

1

H5-515r GAT CTT CTT GGT TGG TAT TAT GTA GCT CC 296

IVA-D150-H5f GGA ATG CCC CAA ATA TGT GAA ATC

2

AI N1-f6 AGC AGG AGA TTA AAA TGA ATC CAA

3

NP1200f CAG RTA CTG GGC HAT AAG RAC

4

M52C CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG

5

H5F 936 GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC

6