Nghiên cứu biểu hiện và xác định đặc tính của omegaconotoxin

Đó là các conotoxin có bản chất là peptide được tách chiết từ bầu độc của ốc cối, có tác động khóa chọn lọc lên các kênh ion hay các thụ thể trên tế bào thần kinh nên được ứng dụng trong

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÙI THỊ HUYỀN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC

Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS TS Phan Văn Chi

Viện Công nghệ sinh học

Vào hồi …… ngày …… tháng ……năm 2015

Có thể tìm hiểu luận án tại:

§ Thư viện Quốc gia Việt Nam

§ Viện Công nghệ sinh học

§ Trang web của Bộ GDĐT

MỞ ĐẦU

Đau do thần kinh là một rối loạn đặc trưng bởi những tổn thương hệ thần kinh từ các bệnh mạn tính như ung thư, đái tháo đường, HIV hoặc do phẫu thuật, chấn thương Theo thống kê mới nhất của Viện Hàn lâm Y học về Đau của Mỹ (AAPM -American Academy of Pain Medicine), năm 2015 trên thế giới

có khoảng 1,5 tỷ người bị đau mạn tính, trong đó 4,5% là bệnh nhân đau thần kinh và tỷ lệ mắc bệnh tăng theo tuổi, tính riêng ở Châu Âu số người phải chịu đựng các cơn đau do thần kinh chiếm khoảng 5% dân số Trên thực tế, bệnh đau thần kinh không thể trị dứt điểm mà chỉ có thể cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân bằng cách sử dụng các loại thuốc giảm đau Cho đến nay, việc điều trị giảm đau truyền thống với các thuốc chống viêm không steroid hoặc sử dụng nhóm opioid có tác dụng mạnh như Morphine vẫn chưa thực sự hiệu quả Việc tìm kiếm các phân tử đích mới trong phát triển thuốc giảm đau vẫn đang

là nỗ lực của các nhà khoa học trong nhiều năm qua Một thế hệ chất giảm đau

mới có nguồn gốc từ nọc các loài ốc cối biển (Conus) đã và đang được đầu tư

nghiên cứu và phát triển mạnh trong thời gian gần đây Đó là các conotoxin (có bản chất là peptide) được tách chiết từ bầu độc của ốc cối, có tác động khóa chọn lọc lên các kênh ion hay các thụ thể trên tế bào thần kinh nên được ứng dụng trong việc tạo thuốc giảm đau, bảo vệ tế bào thần kinh Trong đó, omega

conotoxin MVIIA là độc tố tách chiết từ loài ốc cối Conus magus, có tác dụng

khóa chọn lọc kênh Ca2+ type N trên tế bào thần kinh, gây ức chế quá trình truyền tín hiệu thần kinh qua các khe synapse, có hiệu lực giảm đau tốt hơn Morphine nhưng không gây nghiện Đặc biệt omega conotoxin MVIIA với tên thương mại là Prialt hay Ziconotide đã được Cơ quan Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (United States Food and Drug Administration - FDA) cấp phép sử dụng

từ tháng 4 năm 2004 và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (Europe Medicines Agency - EMA) cấp phép sử dụng từ tháng 2 năm 2005 như một loại thuốc giảm đau mới Bên cạnh đó, nhiều đặc tính khác của MVIIA cũng đang được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng trong các pha khác nhau như tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vùng đồi thị trong các mô hình gây đột quị não

Việc tách chiết trực tiếp các conotoxin có hoạt tính dược lý từ bầu độc của ốc cối thường có hiệu suất thấp, độ tinh sạch không cao do sự đa dạng về thành phần protein trong nọc (khoảng 1000 loại) và hàm lượng của mỗi loại lại rất

thấp Cho đến nay, conotoxin thường được tổng hợp bằng con đường hoá Tuy nhiên, phương pháp tổng hợp hóa học bị hạn chế bởi cách thức tổng hợp thường qua nhiều khâu, giá thành sản xuất cao đồng thời việc tạo thành các cầu nối disulfide gặp khó khăn Vì vậy conotoxin đang được chú trọng nghiên cứu, tạo ra bằng công nghệ ADN tái tổ hợp

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu về conotoxin tự nhiên và tái tổ hợp vẫn còn hạn chế và mới bắt đầu được triển khai tại Phòng Hóa sinh Protein, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chính vì vậy,

chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu biểu hiện và xác định đặc tính của

omega conotoxin” với mục tiêu và nội dung như sau:

Mục tiêu

Tạo ra omega conotoxin tái tổ hợp (ω-CTX, viết tắt là CTX) có khả năng ứng dụng trong y dược học dưới dạng hoạt chất giảm đau

Nội dung nghiên cứu

1 Tạo phân tử CTX tái tổ hợp gồm: (i) Thiết kế và tạo dòng gen mã hóa cho CTX; (ii) Nghiên cứu biểu hiện CTX dạng dung hợp với thioredoxin (Trx-

CTX) ở E coli; (iii) Tinh sạch Trx-CTX và CTX tái tổ hợp; (iv) Xác định CTX

tái tổ hợp đã được tạo ra bằng phương pháp khối phổ; (v) Xây dựng quy trình lên men 4 lít/mẻ thu nhận, tinh sạch và bảo quản CTX tái tổ hợp

2 Thử nghiệm hoạt tính giảm đau của CTX trên chuột nhắt trắng bằng mô hình hóa chất sử dụng Formalin

Những đóng góp mới của luận án

1 Đã tạo được dòng và xác định được trình tự gen mã hoá cho CTX với kích

thước 75 bp tương đồng 100% với trình tự nucleotide vùng peptide trưởng

thành của conotoxin từ ốc cối biển Conus magus (ConcoSever, N01765)

2 Đã thiết kế và biểu hiện được CTX dưới dạng dung hợp với Trx ở E coli; đã

tinh sạch được CTX tái tổ hợp dạng Trx-CTX với hiệu suất 60 mg/L, hiệu suất thu hồi từ dịch chiết tế bào đạt 12% và độ sạch là 96,6%; đã tinh sạch được peptide CTX từ Trx-CTX với hiệu suất thu hồi đạt 9% và độ sạch là 97,5%; đã xác định được peptide CTX có khối lượng phân tử là 2,769 kDa bằng phương pháp khối phổ

3 Trên mô hình gây đau thực nghiệm bằng Formalin ở chuột nhắt trắng, CTX tái tổ hợp được khẳng định có hoạt tính giảm đau tương đương với Lidocain nhưng với liều lượng nhỏ hơn 142 lần

Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 102 trang được chia thành các phần: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 22 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp 18 trang; Chương 3: Kết quả 30 trang; Chương 4: Thảo luận 9 trang; Kết luận và kiến nghị: 1 trang; Các công trình công bố của tác giả 2 trang; Tài liệu tham khảo 17 trang; Tóm tắt luận án bằng tiếng anh 6 trang; Phụ lục 5 trang Luận án có 20 bảng số liệu, 35 hình và 150 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh

NỘI DUNG LUẬN ÁN

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Độc tố thần kinh (neurotoxin)

Độc tố thần kinh (hay còn gọi là neurotoxin) là các chất độc có khả năng làm tổn thương và phá huỷ các mô cũng như tế bào thần kinh Độc tố thần kinh ức chế sự kiểm soát nồng độ ion của tế bào thần kinh qua màng tế bào hoặc ức chế

sự trao đổi thông tin giữa các tế bào thần kinh qua synapse

1.2 Conotoxin

1.2.1 Cấu trúc và phân loại

Conotoxin là độc tố thần kinh nằm ở phần bầu độc của các loài ốc cối biển

(Conus), có bản chất là các peptide/protein gồm 8-35 amino acid và giàu các cầu

nối disulfide để cố định hình dạng phân tử làm tăng khả năng bám của conotoxin với đích đặc hiệu Conotoxin được chia thành 5 loại gồm α-, δ-, κ-, µ- và ω- conotoxin dựa vào sự sắp xếp của các gốc cysteine trong phân tử với đích tác dụng chủ yếu là các kênh ion như Ca2+, Na+, K+ hay các thụ thể như acetylcholine, NMDA…

1.2.2 Tác dụng dược lý của conotoxin

Conotoxin đang được coi như các thuốc dẫn đầu trong điều trị giảm đau thần kinh và các bệnh lý thần kinh, có tác dụng đặc hiệu trên các tổn thương thần kinh như bệnh Alzheimer, Parkinson và chứng đa xơ cứng (multiple sclerosis) Bên

cạnh đó các conotoxin còn có triển vọng trong các nghiên cứu về các hội chứng rối loạn co giật, đột quị, nhồi máu cơ tim, bảo vệ hệ tim mạch Trong phần tổng quan tài liệu chúng tôi chủ yếu đề cập đến tác dụng giảm đau và bảo vệ thần kinh của conotoxin liên quan đến nội dung nghiên cứu

1.3 Omega conotoxin MVIIA (CTX)

1.3.1 Cấu trúc của CTX

CTX được tách chiết từ bầu độc của ốc cối biển Conus magus, phân tử gồm

25 amino acid, trong đó có 6 gốc cysteine tạo thành ba cầu nối disulfide giữa các

vị trí 1-16, 8-20 và 15-25

1.3.2 Tác dụng dược lý của CTX

CTX khóa chọn lọc các kênh Ca2+ type N, phân bố chủ yếu ở trong các tế bào thần kinh tiền synapse Khi CTX được truyền trực tiếp vào tuỷ sống, nó sẽ liên kết với quai P trong tiểu phần đơn vị α1 ức chế mở kênh Ca2+, ngăn cản dòng Ca2+ nhập bào đi vào trong tế bào thần kinh tiền synapse kéo theo ức chế

sự giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitters) trong cúc synape

Từ đó tín hiệu thần kinh không được truyền qua khe synape, các dẫn truyền thần kinh liên tục giữa các neuron thần kinh kế cận bị gián đoạn Dựa trên cơ sở này

mà CTX có ứng dụng làm chất giảm đau và bảo vệ tế bào thần kinh trong mô hình gây đột quị

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hóa chất

Các chủng vi sinh: Chủng E coli DH5α (Invitrogen, Mỹ), chủng E coli BL21

(DE3) (Novagen, Mỹ)

Plasmid: Vector tác dòng pBT được cải biến từ vector pUC18 (do phòng Công

nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp) và vector biểu hiện pET32c(+) (Novagen, Mỹ)

Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng dòng Swiss do Viện Vệ sinh Dịch tễ

Trung ương và Học viện Quân Y, Bộ Quốc phòng cung cấp

Các hóa chất và thiết bị máy móc: Invitrogen, Novagen, Merck, New England

Biolab Qiagen, Sigma…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Luận án sử dụng ba nhóm phương pháp nghiên cứu chính

2.2.1 Nhóm phương pháp tạo dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định CTX tái

tổ hợp

• Nhân gen mã hoá cho CTX bằng kỹ thuật PCR

• Tách dòng gen mã hoá cho CTX vào vector tách dòng và vector biểu hiện

• Xác định trình tự gen mã hoá cho CTX

• Biểu hiện và tối ưu hoá các điều kiện biểu hiện CTX ở E coli

• Tinh sạch Trx-CTX tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực Ni-NTA và sắc ký lọc gel Sephacryl S100

• Tinh sạch peptide CTX bằng enterokinase và cột siêu lọc VIVASPIN 500

• Xác định khối lượng phân tử CTX bằng khối phổ

2.2.2 Nhóm phương pháp xác định đặc tính của CTX tái tổ hợp

• Thử nghiệm hoạt tính giảm đau của peptide CTX trên mô hình chuột thực nghiệm bằng phương pháp Formalin

2.2.3 Nhóm phương pháp xử lý số liệu bằng tin sinh học

• Blast, DNAclub, BioEdit, ConcoSever, ImageJ, Alalyst QS, thống kê sinh học…

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ

3.1 THIẾT KẾ TẠO GEN MÃ HOÁ CHO CTX

Từ kết quả khảo sát hệ protein nọc của các loài ốc cối thu thập được ở vùng biển Nha Trang, Việt Nam, hơn 40 loại conotoxin đã nhận dạng được bằng hệ thống khối phổ LC-MS/MS Một số conotoxin có tiềm năng ứng dụng trong y dược như omega conotoxin MVIIA cũng được tìm thấy từ nguồn ốc cối của Việt

Nam (Lê Thị Bích Thảo et al., 2011) Kết hợp với các thông tin về trình tự

peptide và nucleotide của omega conotoxin MVIIA được tìm kiếm trên ConoServer (Hình 3.2) Chúng tôi tiến hành nghiên cứu thiết kế, biểu hiện và thử nghiệm hoạt tính giảm đau của omega conotoxin MVIIA tái tổ hợp (CTX tái tổ

hợp) Sơ đồ nghiên cứu trên Hình 3.1 Do kích thước gen mã hóa cho CTX khá nhỏ, gồm 75 nucleotide mã hóa cho 25 amino acid nên gen ctx được tổng hợp

trực tiếp bằng 2 mồi bổ sung với nhau ctx1 với ctx 2 và ctx3 với ctx4 theo nguyên tắc bổ sung A-T, G-C Trong đó mỗi mồi dài khoảng từ 45 - 55 bp, ctx1

chứa điểm cắt của enzyme giới hạn NcoI và ctx4 chứa điểm cắt của EcoRI để

thuận lợi cho mục đích biểu hiện trong hệ vector pET32c+

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 3.2 Kết quả tìm kiếm trình tự gen mã hoá cho CTX trên ConoServer

(Nguồn: www.conoserver.org)

Quá trình tạo dòng gen mã hóa peptide CTX được thực hiện như sau: Trước khi thực hiện phản ứng PCR, các đoạn mồi được phosphoryl hóa bởi T4 PNK Hỗn hợp 1 (ctx1, ctx2) và hỗn hợp 2 (ctx3, ctx4) được trộn đều với nhau, sau đó được biến tính ở 95oC trong 3 phút trước khi giảm dần xuống 45oC ở nhiệt độ phòng, tạo điều kiện thuận lợi cho các đoạn mồi bắt cặp bổ sung với nhau Phản ứng nối hai đoạn DNA sợi đôi mới được hình thành được thực hiện bởi enzyme

T4 ligase ở 14oC để tạo phân tử ctx (Hình 3.3)

Hình 3.3 Sơ đồ mô tả chuỗi phản ứng tạo gen mã hóa cho peptide CTX và trình tự các cặp

mồi đã thiết kế

3.2 TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA CHO CTX

3.2.1 Kết quả nhân gen mã hóa cho CTX bằng kỹ thuật PCR

Sản phẩm của phản ứng nối ghép được pha loãng 200 lần và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi ctx1 và ctx4 Gen mã hóa cho protein CTX được nhân lên bằng kỹ thuật PCR có kích thước 75 bp Cặp mồi để nhân đoạn gen này được thiết kế và tổng hợp gồm: Mồi xuôi với trình tự nhận biết của

enzyme giới hạn NcoI mang mã khởi đầu dịch mã ở E coli nối với đoạn trình tự nucleotide của một nửa gen ctx Mồi ngược là trình tự nucleotide nửa gen ctx còn lại nối tiếp với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI mang mã kết thúc

Hình 3.4 Kết quả nhân gen mã hóa cho CTX

M: Thang DNA chuẩn 100 bp

Đường chạy (ĐC) số 1: Sản phẩm gen mã

hóa cho CTX

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,7% được thể hiện trên Hình 3.4 cho thấy, đường chạy số 1 cho một băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 100 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (gồm đoạn gen và mồi) Sản phẩm PCR sau đó được sử dụng trực tiếp để đưa vào vector tách dòng pBT đã mở vòng Tổ hợp gen mới (plasmid tái tổ hợp) được tạo thành được biến nạp vào tế bào tách dòng DH5α để chọn ra dòng plasmid có khả năng mang gen mã hoá cho CTX (CTXpBT)

3.2.2 Tách dòng gen mã hóa cho CTX

DNA plamid được tách chiết từ các khuẩn lạc đã chọn tiếp tục được kiểm tra song song bằng hai phương pháp gồm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng

enzyme giới hạn BamHI và PCR trực tiếp từ khuẩn lạc bằng cặp mồi ctx1 và ctx4 để chọn ra dòng mang gen ctx Sản phẩm thu được từ 2 phương pháp này

được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,7% (Hình 3.5 và 3.6)

Kết quả trên Hình 3.5 cho thấy tại các đường chạy 4, 5, 6 và 8, mẫu DNA

plasmid sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn BamHI đã xuất hiện 2 băng: băng

thứ nhất có kích thước khoảng 2700 bp chính là vector pBT nguyên gốc đã được

mở vòng thành dạng mạch thẳng; băng thứ hai có kích thước tương đương với kích thước của sản phẩm PCR so với thang DNA chuẩn, khoảng 100 bp Trong khi đó tại đường chạy số 2, 3 và 7 chỉ có một băng duy nhất tương ứng với vector pBT ở đường chạy số 1 Như vậy các dòng 4, 5, 6 và 8 là các plasmid tái

tổ hợp có khả năng mang gen mã hóa cho CTX

Hình 3.5 Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt plasmid

tái tổ hợp bởi BamHI

M: thang DNA chuẩn 100 bp; ĐC 1: vector pBT

nguyên thể; ĐC 2, 3 và 7: các plasmid không có tổ

hợp gen mới chèn vào; ĐC 4, 5, 6 và 8: các

plasmid có khả năng mang gen mới chèn vào

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR

chọn lọc khuẩn lạc trên gel agarose 1,7%

M: thang DNA chuẩn; ĐC 1 - 4: sản phẩm PCR

từ các dòng tế bào chọn kiểm tra; ĐC 5: Sản phẩm PCR mục 3.1.1

Kết quả kiểm tra song song bốn dòng plasmid này bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu (ctx1 và ctx4) với đối chứng dương là sản phẩm PCR trong Hình 3.4 được thể hiện trên Hình 3.6 cũng cho kết quả tương tự, thu được một băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 100 bp so với thang DNA chuẩn Như vậy 4 dòng tế bào 4, 5, 6 và 8 trong Hình 3.5 có khả

năng chứa gen mã hóa cho CTX

3.2.3 Kết quả xác định trình tự gen mã hóa cho CTX

Hai trong bốn dòng tế bào có khả năng mang gen mã hóa cho CTX được tiến hành kiểm tra xác định trình tự gen trên Hệ thống ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer Mồi M13F và M13R được sử dụng để đọc kiểm tra từ 2 đầu của đoạn gen Mỗi dòng plasmid được tiến hành đọc 3 lần để đảm bảo độ chính xác theo nguyên tắc thống kê Kết quả xác định trình tự của cả 2 dòng plasmid là giống hệt nhau sau khi xử lý bằng các phần mềm tin sinh Clutal X và BioEdit (Hình 3.8) Kết quả trên Hình 3.8 đã cho thấy gen được tạo dòng có kích thước 75 bp, có

độ tương đồng 100% so với trình tự nucleotide vùng peptide trưởng thành của

ctx được tìm thấy trên ConoServer với số đăng ký N01765 Đồng thời đoạn

nucleotide này mã hóa cho 25 amino acid cũng có độ tương đồng 100% với trình

tự của peptide CTX với số đăng ký trên Các kết quả trên khẳng định gen mã hóa cho CTX đã được dòng hóa vào vector pBT

N01756 CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC

CTX CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

Hình 3.8 Phổ trình tự nucleotide đoạn gen ctx mã hóa cho ω-conotoxin MVIIA và so sánh trình tự

amino acid của CTX với trình N01765 trên ConoSever

3.3 BIỂU HIỆN CTX TÁI TỔ HỢP

3.3.1 Thiết kế vector biểu hiện CTXpET32c

Gen mã hóa cho CTX sau khi đã được tách dòng vào vector pBT và xác định đúng trình tự thiết kế được chuyển vào vector pET32c (+) để biểu hiện Vector tách dòng CTXpBT và vector pET32c cùng đồng thời được xử lý với hai enzyme

giới hạn là NcoI và EcoRI để tạo đầu dính tương hợp giữa đoạn gen cần chèn và

vector (Hình 3.9)

Hình 3.9 (A) Điện di sản phẩm cắt

bởi NcoI và EcoRI (B) Điện di sản

phẩm sau khi thôi gel

M: thang DNA chuẩn; ĐC 1: pET32c+

đã mở vòng; ĐC 2: Sản phẩm PCR;

ĐC 3: CTXpBT sau khi xử lý bởi NcoI

và EcoRI; ĐC 4: ctx sau khi thôi gel;

ĐC 5: pET32c+ mở vòng sau khi thôi

gel

Kết quả trên Hình 3.9 A là sản phẩm sau khi xử lý bằng 2 enzyme giới hạn

NcoI và EcoRI cho thấy, đường chạy (ĐC) số 1 có một băng DNA duy nhất có

kích thước 5,9 Kb, đây là vector pET32c+ đã mở vòng ĐC số 3 xuất hiện 2 băng: băng trên có kích thước 2,7 Kb là vector pBT bị cắt văng ra và băng thấp hơn có kích thước khoảng 100 bp tương đương với sản phẩm PCR ở đường chạy

số 2 là gen mã hóa cho CTX

Sử dụng kít QIAGEN để tách vector pET32c+ và gen đích như đã mô tả ở phần phương pháp Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel (Hình 3.9 B) cho thấy, các băng DNA thôi ra đạt độ tinh sạch cần thiết để thực hiện các thí nghiệm

tiếp theo Gen mã hóa cho CTX và vector pET32c+ được nối ghép với nhau nhờ

enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm gắn kết được biến nạp vào chủng E coli DH5α để chọn dòng những vector pET32c (+) có chứa gen ctx Vector tái tổ hợp này được ký hiệu là CTXpET32c và sau đó được biến nạp vào chủng E coli

BL21(DE3) để biểu hiện

3.3.2 Biểu hiện CTX tái tổ hợp

Tế bào E coli BL21(DE3) chứa tổ hợp gen mới CTXpET32c được nuôi cấy

trên môi trường LB đặc sau đó được chuyển sang môi trường LB lỏng đều được

bổ sung kháng sinh ampicillin đến nồng độ cuối cùng 100 µg/ml Dịch tế bào sau khi cấy chuyển với tỷ lệ 1%, nuôi lắc ở 37oC đến khi OD600 đạt từ 0,6 - 0,8 thì được cảm ứng bởi IPTG đến nồng độ cuối cùng 0,5 mM Sinh khối tế bào được thu ở các thời điểm 0h (trước khi cảm ứng) và 3h (sau khi cảm ứng) để tiến hành điện di kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp mới

Hình 3.10 Biểu hiện protein dung hợp Trx-CTX trên gel polyacrylamide 12,6%

M: thang protein chuẩn SM0431; ĐC 0h:

protein tổng số tại thời điểm 0 giờ (trước khi cảm

ứng); ĐC 3h: protein tổng số tại thời điểm 3 giờ

(sau cảm ứng)