phân lập chủng vi khuẩn LACTIC và khảo sát khả năng sinh tổng hợp BACTERIOCIN

trình bày phân lập chủng vi khuẩn LACTIC và khảo sát khả năng sinh tổng hợp BACTERIOCIN

Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp

NỘI DUNG

 Vi khuẩn lactic

 Các vi khuẩn G+, chịu acid, không hình thành bào tử, hình que hoặc hình cầu.

 Nhu cầu dinh dưỡng phức tạp (amino acid,

carbonhydrate, khoáng, vitamin )

 Sản phẩm chuyển hóa: acid lactic, diacetyl, ethanol, CO2, bacteriocin…

 Được sử dụng rất nhiều trong thực phẩm

Tổng quan

 Ứng dụng: chất kháng sinh, chất phụ gia thực phẩm

Và trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu phân lập các

Tổng quan

o L.G Stoyanova et al (2005) phân lập được Lc lactis từ sữa tươi tách béo tự lên men

o Phân lập từ kim chi của Sang Hee Park et al., 2003

o Nghiên cứu trên giá đỗ của M Nomura et al., 2007

o Phân lập từ thức uống, rau quả lên men truyền thống

2006

o Phân lập từ thức uống lên men truyền thống Uganda –

o L Aquilanti et al., 2006 phân lập từ fromage Canestrato

Pugliese

Mục tiêu nghiên cứu

 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp bacteriocin

từ các nguồn tự nhiên ( sữa tươi lên men, rau quả muối

chua, kim chi và giá đỗ ).

 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng phân lập được.

Nguyên liệu

 Chủng vi sinh vật

 Chủng vi khuẩn lactic phân lập

 Môi trường phân lập và nuôi cấy

 MRS

 TSA

 Nguồn phân lập

o Sữa tươi tự lên men

o Rau quả muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá, kim chi)

o Giá đỗ

Chọn nguồn phân lập

(sữa, rau quả muối chua, giá đỗ)

Tách loại từng loài vi sinh vật thuần khiết

bằng phương pháp dàn đều và cấy ria trên môi trường MRS

Phân biệt bằng đặc tính chủng vi khuẩn

(hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram)

Phương pháp: Khảo sát

Dịch nuôi cấy

(2 lần)

Thử hoạt tính bacteriocin

(pp Agar Well Diffusion)

Đo quang

(O.D 600 nm )

Kết quả phân lập: Từ nguồn sữa tươi tự lên men

 Có 3 loại khuẩn lạc

- (1a) lớn, trắng đục, bóng

mịn

- (1b) hơi lớn, trắng hơi

trong, bóng mịn

- (1c) nhỏ, màu trắng đục,

bề mặt nhám, mép xung

quanh có răng cưa

- (1a) Tế bào lớn, tròn, đơn hoặc kết đôi, có nhân

- (1b) Tế bào nhỏ, tròn, đơn, đôi hoặc kết chuỗi ngắn

- (1c) Tế bào nhỏ, hình tròn, xếp thành chuỗi dài, không chuyển động

Kết quả phân lập: Từ nguồn rau quả muối chua

Có 4 loại khuẩn lạc

- (2a) trắng, đục, kích

thước nhỏ.

- (2b) trắng, trong, kích

thước hơi lớn.

- (2c) màu trắng đục, kích

thước lớn.

- (2d) ( kim chi ) trắng,

trong, bề mặt hơi mờ, rất

nhỏ.

Quan sát hình thái

- (2a) Tế bào nhỏ, tròn, kết chuỗi ngắn

- (2b) Tế bào nhỏ, que dài

- (2c) Tế bào lớn, tròn, riêng rẽ hoặc kết đôi, có nhân.

- (2d) Tế bào nhỏ, tròn, riêng rẽ hoặc kết chuỗi ngắn

Kết quả phân lập: Từ nguồn giá đỗ

 Chỉ có 1 loại khuẩn lạc

(3a)

trắng sữa, nhỏ, bề mặt

bóng mịn, mép không có

răng cưa

Tế bào nhỏ, tròn, xếp riêng rẽ hay thành từng đôi

Kết quả

Chủng phân

lập

Kết quả

Kết quả khảo sát:

-500 0 500 1000 1500 2000 2500

Kết quả khảo sát:

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng

và sinh tổng hợp bacteriocin

Ở 25oC (pH ban đầu = 6.0)

-500 0 500 1000 1500 2000 2500

Ở 37oC (pH ban đầu = 6.0)

0 500 1000 1500 2000 2500

Kết quả khảo sát:

Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường

đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin

pHban đầu = 5.0 (ở nhiệt độ 30oC)

-500

0 500

pHban đầu = 7.0 (ở nhiệt độ 30oC)

-500

0 500

 ở 30oC

Công thức Nisin

Cơ chế kháng khuẩn

Cơ chế sinh tổng hợp 1

Cơ chế sinh tổng hợp 2

Phân loại Bacteriocin

Bacteriocin

Bacteriocin từ LAB Bacteriocin vi khuẩn G - Bacteriocin từ Archaea:

halocin và sulfolobicin

Nhóm II Các peptide nhỏ (<

10 kDa), bền nhiệt, có chứa ít nhất một cầu nối disulfur

Nhóm III Các protein lớn (>30 kDa), dễ biến đổi bởi nhiệt độ

Nhóm I

Các peptide nhỏ có

chứa các amino acid

không phổ biến

Sản phẩm chuyển hóa của LAB

1.Carbon dioxide Ngăn cản sự khử nhóm carboxyl,

giảm tính thấm của màng

2 Diacetyl Phản ứng với protein gắn arginine

3 Hydrogen peroxide/

Lactoperoxidase

Oxy hoá các protein cơ bản

4 Acid lactic Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua

màng, làm thấp pH nội bào Nó gây trở ngại quá trình chuyển hoá như oxi hoá khử phosphor

5 Bacteriocin Ảnh hưởng đến màng, tổng hợp

Bacteriocin và chủng VSV

(Da)

Đặc tính

Laticin 3714 Lc lactis 2847 Bền nhiệt ở 1000C ở pH 5 hay 900C

ở pH 7 trong 10ph Nhạy cảm với trypsin, –chymotrypsin, proteinase α–chymotrypsin, proteinase

K, và pronase E, kháng pepsin Plantaricin

C

Lactobacillus plantarum 3500-4000 Ổn định ở nhiệt độ thấp, bền nhiệt ở 1000C trong 60ph hay 1210C trong

10ph Nhạy cảm với pronase, trypsin, và –chymotrypsin, kháng α–chymotrypsin, proteinase lại pepsin, proteinase K, –amylase, α–chymotrypsin, proteinase và lipase

Bacteriocin và chủng VSV

4416 Ổn định ở pH 2 sau khi lưu trữ 2

tháng tại 40C Bền nhiệt tại 1000C trong 120ph tại pH 2–3 Nhạy cảm với –chymotrypsin, –α–chymotrypsin, proteinase β–

chymotrypsin, protease type I, XIV, XXIII, và trypsin, kháng catalase, lipase và lyzozyme

varians 2658 Ổn định ở pH từ 2 đến 10, bền nhiệt 1150C trong 20ph, nhạy cảm với

pronase E, proteinase K, ficin, kháng catalase

Các yếu tố ảnh hưởng Môi trường nuôi cấy

Nguồn C, N, khoáng, chất

tăng độ nhớt cho môi

trường (agar, dextran,

glycerol, hay tinh bột)

Điều kiện nuôi cấy

(nhiệt độ, thời gian, oxy,

Tinh sạch bacteriocin

Cô đặc

Dịch thô

Tiền xử lý Dịch nuôi cấy

Lắng tủa phân đoạn với

acid, muối, ethanol, hoặc

các hỗn hợp khác nhau

Phá vỡ tế bào, ly tâm/ trích

ly bằng acid hay nước nóng

Tinh chế

dựa vào kích cỡ

(sắc ký lọc gel, lọc qua máy siêu lọc, ly tâm) Dựa vào điện tích (sắc ký trao đổi ion, điện chuyển)

Bacteriocin

 Trong bảo vệ sức khoẻ con người

 Trong bảo quản thực phẩm

Phụ gia thực phẩm: giảm khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn (để cải thiện hiệu quả thanh trùng ngay ở chế độ thanh trùng ôn hoà hơn) và kìm hãm, ngăn ngừa quá trình thối rữa (trong trường hợp nếu còn bào tử sót)

nisin-nitrite

Ứng dụng bacteriocin

Môi trường nuôi cấy

 H.J Choi, C.I Cheigh, 2000 : Nghiên cứu sự sinh tổng hợp

Nisin của chủng Lc lactis phân lập từ kim chi

 L G Stoyanova, T D Sul’timova, 2006 Nghiên cứu phân

lập và định danh Lc lactis phân lập từ sữa

 R Yang and B.Ray, 1994 Nghiên cứu về các yếu tố ảnh

hưởng lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic

 Svetoslav D Todorov and Leon M T Dicks, 2004 nghiên

cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp

bacteriocin của chủng Lc Lactis phân lập từ sữa lên men

Phương pháp Agar Well Diffusion

Incubator 30 0 C

24 h

Petri dish