Nghiên cứu xác định vitamin c trong thuốc, thực phàm chức năng, hoa quả và nước giải khát bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó phađộng là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chiadưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lê

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

THÁI ĐẠI QUÂN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH VITAMIN c TRONG THUÓC, THựC PHẨM CHỨC NĂNG, HOA QUẢ VÀ NƯỚC GIẢI KHÁT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.

LUDN VDN THÓC Sũ HÚA HDC

VINH - 2013

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

THÁI ĐẠI QUÂN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH VITAMIN c TRONG THUỐC, TllỤc PHẢM CHỨC NĂNG, HOA QUẢ VÀ NƯỚC GIẢI KHÁT BẰNG

PHƯONG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH

MÃ SÓ: 60.44.29

Người hướng dẫn khoa học:

TS ĐINH THỊ TRƯÒNG GIANG

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TÁT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC sơ ĐỒ

LỜI CẢM ƠN

MỞ DẦU 1

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về vitamin 3

1.1.1 Khải niệm 3

1.1.2 Đặc đỉêm chung và phân loại 3

1.1.2.1 Đặc điểm chung 3

1.1.2.2 Phân loại 4

1.2 Vitamin c (Acid ascorbic) 5

1.2.1 Lược sử 5

1.2.3 Phân loại vitamin c 6

1.2.4 Cẩu tạo của vitamin c 6

1.2.5 Nguồn gốc 7

1.2.5.1 Ng uồn gốc từ thực vật 7

1.2.5.2 Nguồn goc từ động vật 9

1.2.6 Vai trò của vitamin c trong cơ thế song 10

1.2 7 Nhu cầu về Vitamin c 10

1.2.7.1 Thiếu vitamin c 12

1.2 7.2 Thừa vitamin c 13

1.3 Giới thiệu các đối tượng nghiên cúu 14

1.3.2 Quýt 14

1.3.3 Thuốc IIAPACOL KIDS 75

1.3.4 Thuốc AMPHA BC COMLEX 17

1.3.5 Thực phẩm chức năng: RUTIN-C 18

1.3.6 Thực phàm chức năng: Nam dược giải rượu 19

1.3 7 Nước giải khát (Faith) nước khoáng chanh muối 21

1.4 Phuơng pháp sac ký lỏng hiệu năng cao HPLC 21

1.4.1 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 21

1.4.1.1 Cơ sở lý thuyết 21

1.4.1.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 22

1.4.1.3 Phăn loại sắc ký và ứng dụng 23

1.4.1.4 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 24

1.4.1.4.1 Thời gian lưu: Retention time (tỵ) 24

1.4.1.4.2 Hệ số dung lượng K 25 1.4.1.4.3 Độ chọn lọc a 25

1.4.1.4.4 Số đĩa lý thuyết N 25

1.4.1.4.5 Độ phân giải R (Resolution) 26

1.4.1.4.6 Hệ so không đoi xứng T 26

1.4.2 Hệ thống HPLC 27

1.4.2.1 Bình đựng dung môi 27

1.4 2 Hệ thống HPLC 28

1.4.2.1 Bình đựng dung môi 28

1.4.2.2 Bộ khử khí (Degasse) 28

1.4.2.3 Bơm (Pump) 28

1.4.2.4 Bộ phận tiêm mẫu (injection) 28

1.4.2.5 Cột sắc lcý 29

1.4.2.6 Đầu dò (Detector) 29

1.4.2.7 Bộ phận ghi tín hiệu 30

1.4.2.8 In kết quả 30

1.4.2.9 Ch ọn điều kiện sắc ký 30

1.4.2.9.1 Lự a chọn pha tĩnh 31

1.4.2.9.2 Lựa chọn pha động 32

1.4.3 Tiến hành đo sắc kỷ 33

1.4.3.1 Chuăn bị dụng cụ và mảy móc 33

1.4.3.2 Chuẩn bị dung môi pha động 34

1.4.3.3 Cách đoHPLC 35

1.5 Đinh lượng bang phương pháp(HPLC) 35

1.5.1 Các bước định lượng bằng phương pháp IIPLC 35

1.5.1.1 Lẩy mẫu thử 36

1.5.1.2 Tiến hành đo sắc ký 36

1.5.1.3 Đo tín hiệu detector 36

1.5.2 Các phương pháp định lượng 37

1.5.2.1 Phương pháp chuân ngoại (Extemais Standard) 37

1.5.2.2 Phương pháp chuẩn nội (Intemais Standard) 39

1.5.2.3 Ph ưong pháp thêm chuẩn 41

1.5.2.4 Kỹ thuât đường chuẩn thêm chuân 42

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 43

2.1 Trang thiết bị và hóa chất 43

2.2 Phương pháp lay mẫu và bảo quản mẫu 44

2.3 Nguyên tac xử lý mẫu 44

2.4 Cá c sơ đồ xử lý mẫu xác định vitamin c 46

2.5 Ch uan bị dung dịch chuấn cho phép đo HPLC 48

2.8.2 Khảo sát độ lặp lại 50

2.8.3 Xác định hiệu suất thu hồi 50

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Xác đinh khoảng tuyến tính và đường chuan của Vitamin c 51

3.2 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tích 54

3.2.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 54

3.2.2 Giới hạn định lượng LOO 54

3.3 Xác đinh hàm lượng vitamin c theo hai cách sau 55

3.3.1 Tính hàm lượng vitamin c từ dịch lọc mâu cam sành, quýt theo đường chuân 55

3.3.2 Tính hàm lượng vitamin c trong các mẫu thuốc, thực pham chức năng theo chuẩn thử song song 56

3.4 Đánh giá phương pháp 59

3.4.1 Xá c định độ lặp lại của phương pháp 59

3.4.2 Xác định hiệu suất thu hồi 62

3.5 Các sắc đồ của phép đo HPLC 64

KÉT LUẬN 71

TẢI LIỆU THAM KHẢO 72

(High Períormance Liquid Chromatography)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại Vitamin hòa tan trong chất béo và vitamin hòa tan trong

nước

Bảng 3.2 Giá trị LOD và LOQ

HPLC và giá trị ghi trên bao bì

sành và Quýt phương pháp đường chuẩn và phương pháp chuân thử song

song

Bảng 3.6 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu

Cam sành và mẫu Quýt

Bảng 3.7 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên

Bảng 3.8 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng

Hình 1.1 Hình ảnh không gian của cấu trúc vi tam in c

Hình 1.2 Cam sành.

Hình 1.3 Qu>1.

Hình 1.4 Thuốc hapacol kids

Hình 1.5 Thuốc ampha bc comlex

Hình 1.6 Thực phẩm chức năng rutin c

Hình 1.7 Thực phâm chức năng nam dược giải rượu Hình 1.8 Nước giải khát chanh muối.

Hình 1.9 Đồ thị phương pháp chuẩn ngoại

Hình 1.10 Phương pháp đường chuẩn sử dụng nội chuẩn Hình 1.11 Đồ thị kỹ thuât thêm đường chuẩn

Hình 3.8 Sắc đồ mẫu Chuẩn 1

Hình 3.9 Sắc đồ mẫu Chuẩn 2

Hình 3.10 Sắc đồ mâu Trăng

Hình 3.11 Sắc đồ mẫu Cam sành

viii Hình 3.12 Sắc đồ mẫu Quýt

Hình 3.13 Sắc đồ mẫu AMPHA BC COMLEX (TI

Hình 3.14 Sắc đồ mẫu AMPHA BC COMLEX (T2)

Hình 3.15 Sắc đồ mẫu Hapacol kids (Tl)

Hình 3.16 Sắc đồ mẫu Hapacol kids (T2)

Hình 3.17 Sắc đồ mẫu TPCN Rutin-C (Tl)

Hình 3.18 Sắc đồ mẫu TPCN Rutin-C (T2)

Hình 3.19 Sắc đồ mẫu TPCN Nam dược giải rượu (Tl) Hình 3.20 sắc đồ mẫu TPCN Nam dược giải rượu (T2) Hình 3.21 Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 1.1 Hình 3.22 Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 1.2 Hình 3.23 Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 2.1 Hình 3.24 Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 2.2 Hình 3.25 Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 3.1 Hình 3.26 Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 3.2

DANH MỤC CÁC sơ ĐÒ

LỜI CẢM ƠN

Đe hoàn thành luân văn này, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- Cô giáo TS Đinh Thị Trường Giang người đã trực tiếp hướng dẫn vàtạo mọi điều kiện cho tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn

- Chị ThS Bùi Thị Hòa và ThS Dương Thị Hằng với các anh chị kỹthuật viên của viện thực phẩm chức năng trung tâm kiểm nghiệm và họp chuẩn,

đã tận tình hưỡng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện tốt luận văn

- Thầy giáo PGS.TS: Nguyễn Khắc Nghĩa và Thấy giáo TS NguyễnTrung Dũng đã dành nhiều thời gian đọc và viết nhận xét cho luận văn

- Thầy cô trong Hội đồng chấm luận văn cao học và Ban chủ nhiệmKhoa Hóa học trường Đại Học Vinh đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợinhất cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Và xin cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã độngviên giúp đỡ tôi hoàn thành luận này

Vinh, tháng 10 năm 2013

Người thực hiện

Thái Đại Quân

MỞ ĐẦUVitamin là một nhóm chất hữu cơ có phân tử lượng lớn và các tính chấtvật lý, hoá học rất khác nhau Tác dụng của chúng trên các cơ thể sinh vậtcũng rất khác nhau nhưng đều cần thiết cho sự sống của sinh vật, nhất là đốivới người và động vật So với nhu cầu về các chất dinh dưỡng cơ bản nhưprotein, lipit, gluxit thì nhu cầu về vitamin rất thấp

Vitamin được cung cấp vào cơ thể con người để đáp ứng nhu cầu dinhdưỡng giúp cơ thê khỏe mạnh Trong nhiều thế kỉ, do thiếu một số vitamingây nên các bệnh mù lòa (thiếu vitamin A), bệnh beri-beri (thiếu vitamin Bl),bệnh scobut (thiếu vitamin C), thiếu axit folic trong thời kì thai nghén gâykhuyết tật ống thần kinh ở thai nhi Theo thống kê, chỉ riêng ở Mỹ, có tới 7/10người phải “cầu cứu” tới vitamin, còn 3 người thì sử dụng chúng một cách cóđịnh hướng và thường xuyên Từ những năm 70, chính phủ Mỹ đã cho phép

sử dụng các phụ gia thực phẩm có chứa vitamin liều cao Kết quả là, hàngnăm ở Mỹ, người ta tiêu tốn khoảng 4 tỉ đô la cho các loại vitamin Nhiềungười còn cho rằng vitamin là thần dược chữa ung thư và kéo dài tuổi thọ

Hiện nay, khoa học đang tiến hành những nghiên cứu thực nghiệm trênquy mô rộng lớn về vitamin Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm của Mỹcũng đưa ra một lời khuyên là, đa dạng hóa ăn uống là biện pháp tốt nhất đểđáp ứng nhu cần vitamin của cơ thể Sử dụng bổ sung các loại vitamin và cácchất khoáng cần phải có mức độ Liều lượng sử dụng nhiều hay ít là vấn đề cótính riêng biệt, tùy thuộc vào lối sống, khấu phần ăn uống, tình trạng sức khỏecủa từng người và vô số những nhân tố khác

hoại huyết, ảnh hưởng tiêu cực đến sự tự vệ của cơ thể với các bệnh nhiễm

trong thực phẩm là điều rất cần thiết

Tuy nhiên đây là hợp chất hữu cơ thuộc đối tượng khó phân tích, hơnnữa trong mẫu phân tích tồn tại nhiều chất hữu cơ và vô cơ ở các dạng khác

nhau, gây cản trở cho quá trình định lượng Do đó để cần phải lựa chọn

phương pháp phân tích hữu hiệu nhất

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tôi đã lựa chon đề tài:

“Nghiên cứu xác định vitamin c trong thuốc, thực phàm chức năng, hoa quả và nước giải khát bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”

Trong luận văn này, chúng tôi triển khai các nhiệm vụ sau

- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) củaphương pháp phân tích

- Khảo sát độ lặp

- Xác định hiệu suất thu hồi

- Phân tích, xử lý số liệu

- Kết quả thực nghiệm

Đối tượng nghiên cứu

Mau các loại quả, thuốc và sản phẩm chức năng được thu thập từ các cửahàng bán hoa quả, nước giải khát và các đại lý bán thuốc trong thành phố Vinhtỉnh Nghệ An Mỗi mẫu được lấy lkg đựng vào túi mlông sạch Bao gồm:

Quả: Cam sành, Quýt

Thuốc: Hapacol kids, Ampha BC complex

Nước giải khát: Nước khoáng chanh muối

Phương pháp nghiên cứu

Các kết quả nghiên cứu đã được tiến hành bằng thực nghiệm Phươngpháp thực nghiệm được sử dụng là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(High Períormance Liquid Chromatography) viết tắt (HPLC)

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Khái niệm

Vitamin là hợp chất hữu cơ, phần lớn có phân tử tương đối lớn Bảnchất hóa học, lý học của các vitamin rất khác nhau Nhóm chất hữu cơ này cómột đặc điém chung là đặc biệt cần thiết chơ mọi hoạt động sinh sống bìnhthường của các cơ thế sinh vật dị dưỡng

Vitamin là những chất mà cơ thể con người không thể tự tổng hợpđược, Phần lớn phải đưa từ ngoài vào bằng con đường ăn uống Mặc dù lượngvitamin có thể sử dụng ít nhưng khi thiếu một loại vitamin nào đó sẽ dẫn đếnnhững rối loạn về hoạt động sinh lý bình thường của cơ thể Vitamin còn cầnthiết cho cơ thể tự dưỡng như thực vật (là những đối tượng có khả năng tựtổng hợp nên hầu hết các vitamin) Còn một số bộ phận cây xanh không cókhả năng tổng hợp vitamin, vì thế cần cung cấp thêm cho chúng đé đảm cho

sự sinh trưởng và phát triển

1.1.2 Đặc điếm chung và phân loại

1.1.2.1 Đặc đi êm chung

- Mặc dù có cấu trúc, vai trò và cách thức hoạt động khác nhau nhưng tất

cả các vitamin đều có những đặc tính cơ bản:

- Vitamin không trực tiếp sinh năng lượng như protein, lipit hay gluxit

Mà chỉ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất và sử dụng năng lượng

- Không thế thay thế lẫn nhau: thiếu một loại vitamin này không thê thaythế được bằng một loại khác

- Vitamin ảnh hưởng tói hoạt động và quá trình phát triển của tổ chức, làchất xúc tác, bằng cách hoạt hoá quá trình oxi hoá thức ăn và chuyển hoá Thamgia vào thành phần cấu tạo coenzym, quyết định hoạt tính đặc thù của chúng

- Vitamin A và caroten - Vitamin Bi (Titamin)

- Vitamin Q

- Vitamin B12 (Xiancobalamin)

- Vitamin p p (Acid nicotinic)

- Vitamin p ( BioAavonoit)

hành trình trên biển dài ngày Đã có những giai đoạn lịch sử mà bệnh scurvylan tràn rộng khắp như một bệnh dịch Từ năm 1556 đến 1857, đã có 114 dịchscurvy được báo cáo suốt trong các tháng mùa đông, lúc mà không thể cungcấp đầy đủ nguồn rau xanh Các chiến binh trên các cuộc hải trình dài ngàycòn bị ảnh hưởng nặng nề hơn.

Một số nhà thám hiểm, như Jacques Cartier năm 1856, đã nhận thấy rằng

ăn một số loại thức ăn nào đó có thể làm giảm được tình trạng bệnh Ông đãcùng thủy thủ đoàn ăn loại cây lá kim vân sam một số thủy thủ đoàn khác ăncam, chanh, chanh lá cam Năm 1742, Jame Lind, một bác sĩ người Anh, đãviết một bài thảo luận chính thức đầu tiên về khả năng gây bệnh scurvy dothiếu hụt dinh dưỡng Theo kinh nghiệm của Lind, ông cho biết các bệnhnhân scurvy có thế phục hồi sau khi cho dùng nước cam Mặc dù có một sốnhà thám hiểm đã ủng hộ những khám phá của Lind - như thủy thủ đoàn củathuyền trưởng Jame Cook đã hoàn toàn tránh được scurvy trong 3 cuộc hànhtrình dài ngày trên biển từ 1768 đến 1779 Thủy quân Anh quốc vẫn chưa chấpnhận việc sử dụng nước cam chanh cho các thủy thủ mãi đến năm 1804, tức

62 năm sau những khám phá của Lind Xu hướng ngày nay người ta chấpnhận chế độ dinh dưỡng toàn diện nhờ nhiều khám phá mới về vai trò quan

Szent-Gyorgyi phân lập năm 1928 Gần 70 năm sau, các nhà nghiên cứu đã khám phá

mức độ giới hạn dưới cũng khá phổ biến, đặc biệt là ở người già

1.2.2 Danh pháp vitamin c

- Tên theo IƯPAC: 2-oxo-L-threo-hexono-l,4- lactone-2,3-enediol hay(R)-3,4-đihyđroxy-5-((S)- l,2-dihydroxyethyl)furan-2(5H)-one

- Tên gọi khác : L-ascorbate

- Công thức phân tử: CôHgOô

- Khối lượng phân tử: 176.13 g/mol

+ Nó chỉ tồn tại ở dạng L trong các sản phẩm thiên nhiên

hoại huyết

+ 15 chất đồng phân không có hoạt tính

1.2.4.Cấu tạo của vitamin c

Công thức cấu tạo

CH OH

1.2.5 Nguồn gốc

1.2.5.1 Nguồn gốc từ thực vật

thực vật (tìm thấy nhiều nhất trong trái cây), là 1 vitamin hoà tan được trong

đất, khí hậu nơi mà thực vật đó phát triển, thời gian dài hay ngắn từ lúc thựcvật đó được hái lên khỏi mặt đất, điều kiện dự trữ, và phương pháp chế biến

Bảng sau đây đưa ra giá trị xấp xỉ (gần đúng) sự phong phú về lượng

thực vật (mg/100g) thực vật (mg / 100g)

Nguồn Hàm lượng

1.2.6 Vai trò của vitamin c trong cơ thế sổng

- Chống oxy hóa

hóa của cơ thể Các chất chống oxy hóa (vitamin E, beta-caroten, Vitamin C)

có thể chuyển các tác nhân gây oxy hóa thành những chất vô hại và thải ra

khỏi cơ thể, giúp phục hồi Vitamin E trở lại dạng có khả năng chống oxy hóa

- Tạo collagnen

Collagen là thành phần protein chính của mô liên kết, xương, răng, sụn,

tổng hợp collagen Lúc đó, sẹo sẽ khó lành, vỡ mao mạch, khiếm khuyết trongquá trình hình thành xương và răng

- Phòng chống bệnh tim mạch

với mạch máu nuôi tim Giúp chuyển cholesterol thành acid mật, bằng cáchgiảm tình trạng cholesterol trong máu Loại vitamin này còn giúp hạn chếtăng huyết áp, chống tạo cục máu đông để giảm thuyên tắc mạch

- Tăng cường hệ miễn dịch

Hỗ trợ sản xuất interĩeron là loại protein do tế bào cơ thể tạo ra để chốnglại tác nhân gây bệnh, là thành phần đạm quan trọng của hệ miễn dịch, cầnthiết cho các tế bào miễn dịch đó là tế bào T và bạch cầu Từ đó làm mạnhchức năng của hệ miễn dịch, làm tăng phản ímg dị ứng

- Tống hợp chất dẫn truyền thần kinh

1.2 7 Nhu cầu về Vitamin c

mg/ngày, đặc biệt đối với người hút thuốc cần cung cấp thêm 35 mg/ngày vì

khói thuốc gây ra

Lượng vi ta min c cân thiêt theo độ tuôi

Vitamin c có vai trò rất quan trọng đối với con nguời, đặc biệt là đốivới thai phụ và phụ nữ cho cho con bú, tuy nhiên việc lạm dụng hay thiếu hụt

1.2.7.1 Thiếu vitamin c

nhanh hay chậm tùy theo mức độ thiếu hụt, trước khi bị bệnh Scorbut do thiếu

Giai đoạn 1: mệt mỏi, căng thẳng thần kinh, buồn ngủ, đau nhức cơ khớp.Giai đoạn 2: chảy máu nướu răng, dưới da, da niêm

Giai đoạn 3: biến dạng xương khóp, vết thương không lành, hư răng, bội

nhiễm

Trẻ em trong giai đoạn phát triên nhanh từ 6 - 2 4 tháng tuối cũng dễ bị

biếng ăn, giảm sức đề kháng, thiếu máu tiến triển

tím khi va chạm nhẹ), chảy máu cam, chảy máu lợi, vết thương chậm lành(bệnh Scorbut)

Cách khắc phục tình trạng thiếu vitamin C: ăn các thực phẩm có chứa

khỏe được cải thiện rõ rệt

1.2.7.2 Thừa vitamin c

trên 1000 mg/ngày, bạn sẽ bị rối loạn tiêu hóa, gây tiêu chảy, rát dạ dày, cóhiện tượng thừa sắt, giảm độ bền hồng cầu, giảm khả năng diệt khuân củabạch cầu, viêm bàng quang, viêm đường tiết niệu do axit ascorbic

ức chế bài tiết insulin, tăng huyết áp, tổn thương thận do tăng tổng hợpcorticoid và catecholamin

cho xương chậm phát triển, dễ biến dạng Thai phụ dùng thừa có thể gây dịtật bấm sinh ở trẻ

có 243 mg muối ăn được hình thành sau phản ứng sủi bợt Không nên dùng

nó cho người suy thận, người kiêng ăn muối (tăng huyết áp)

500 mg, không được dùng cho người bị bệnh sỏi thận

các men chuyển hóa ở thai nhi do hiện tượng dội ngược và gây ra bệnh lý

gây ra các tai biến do tiêm thuốc như nhiễm trùng

một lượng lớn dài ngày (quá lg/ngày) sẽ dẫn đến viêm loét dạ dày, tiêu chảy,sỏi thận

“mất đi sự cân bằng vốn có của cơ thể” làm “tăng sự tích tụ” những phân tửkép có hại, sự tích tụ này có một vai trò nhất định trong các căn bệnh như ungthư, thấp khớp, xơ vữa động mạch Còn cần phải thu thập thêm chứng cứnhưng đây là điều cảnh báo đáng quan tâm

đặc biệt là với trẻ em và phụ nữ mang thai Những trường hợp cần thiết dùngliều cao phải do thầy thuốc chỉ định và chỉ dùng trong thời gian ngắn Vitamin

có những tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khỏe

1.3 Giới thiệu các đối tượng nghiên cứu

1.3.1 Cam sành

Hình 1.2 Cam sành

Là một giống cây ăn quả thuộc chi Cam chanh có hình dạng nhuquả cam, có nguồn gốc từ Việt Nam Quả cam sành rất dễ nhận ra nhờ lớp vỏdày, sần sùi giống bề mặt mảnh sành, và thường có màu lục nhạt (khi chín cósắc cam), các múi thịt có màu cam

Cam sành được gắn nhiều tên khoa học khác nhau như Citrus nobilis,Citrus reticưlata, hay Citrus sinensis, trên thực tế nó là giống lai tự nhiên

1.3.2 Quýt

Hình 1.3 Quýt

Quýt có giá trị dinh dưỡng phong phú, trong 100 g thực phẩm hấp thụ,hàm lượng protein của quýt gấp 9 lần lê, hàm lượng canxi gấp 5 lần lê, hàmlượng photpho gấp 5.5 lần lê, vitamin BI gấp 8 lần, vitamin B2 gấp 3 lần,vitamin c cũng gấp 10 lần so với lê

Các thành phần dinh dưỡng trong quýt chống lại sự phá vỡ acid urictrong máu Các loại acid hữu cơ và vitamin trong quýt điều hòa chức năngtrao đổi chất trong cơ thế đặc biệt là người già mắc bệnh tim

Vỏ quýt chứa vitamin D có thể duy trì tính dẻo của huyết quản mao mạch,

hiệu quả trị liệu ỗối với ngýời mắc bệnh máu xấu Cho nên ngýời xõ címg mạch

Quýt chứa thành phần chống oxy hóa, có thể tăng cao khả năng miễn

dich, chống sự phát triển của u bướu Ngoài ra, quýt còn có tác dụng chống lạitia bức xạ của máy tính, trong quýt chứa nhiều vitamin A và beta carotin, có

thẻ bảo vệ da cho những người thường sử dụng máy tính

1.33 Thuốc IIAPACOL KIDS

Hình 1.4 Thuốc hapacoỉ kids CÔNG THỨC:

Paracetamol 150 mg

Tá dược vừa đủ 1 gói

(Manitol, acid citric khan, natri hydrocarbonat, đường trắng, đường

aspartam, kollidon 30, màu đỏ amaranth, bột hương cam)

DẠNG BÀO CHÉ: Thuốc bột sủi bọt.

TÍNH CHẢT: Paracetamol là thuốc giảm đau - hạ sốt hữu hiệu Thuốc

tác động lên trung tâm điều nhiệt ở vùng dưới đồi gây hạ nhiệt, tăng toả nhiệt

do giãn mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên làm giảm thân nhiệt ở người

bị sốt, nhưng hiếm khi làm giảm thân nhiệt bình thường và giảm đau bằngcách nâng ngưỡng chịu đau lên

hoá các chất cần thiết cho quá trình phát triển của cơ thể và giữ vai trò quantrọng trong tăng cường chức năng miễn dịch, tăng khả năng đề kháng vớinhiễm khuẩn của cơ thế

chế dưới dạng bột sủi bọt, hòa tan trong nước trước khi uống, thích hợp dùng

hạ sốt - giảm đau - tăng cường miễn dịch cho trẻ em trên 1 tuổi Thuốc đượchấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua hệ tiêu hóa

CHÍ ĐỊNH: Hạ sốt, giảm đau, tăng cường sức đề kháng cho trẻ trongcác trường hợp: cảm, cúm, đau đầu, đau cơ - xương, bong gân, đau khớp,nhiễm khuẩn, nhiễm siêu vi, sau khi tiêm chủng, sau phẫu thuật cắt amiđan,nhổ răng, mọc răng, nhức răng,

LIỀU DÙNG VÀ CÁCH DÙNG: Hòa tan thuốc vào lượng nước (thíchhợp cho bé) đến khi sủi hết bợt Cách mỗi 6 giờ uống một lần, không quá 5lần/ ngày Liều uống tương ứng với thành phần Paracetamol, trung bình từ 10

- Rutin có tác dụng làm tăng sự bền vững của hồng cầu, làm giãn cơ trơn,chống co thắt.

Chỉ định:

Giúp tăng sức bền của thành mạch máu, phục hồi tính đàn hồi của maomạch Hạ huyết áp, hạ cholesterol trong máu, phòng ngừa bệnh xơ vữa độngmạch Hỗ trợ trong điều trị huyết áp cao, chảy máu cam xuất huyết

Người đang bị xuất huyết hoặc có nguy cơ xuất huyết, người huyết ápcao Người dễ bị chảy máu do tính bền của thành mạch kém như Chảy máucam, trĩ ra máu, xuất huyết dưới da

Tác dụng:

Say rượu là nguyên nhân gây ra các bệnh cơ thể và tâm thần trầm trọng

và lâu dài khác (xơ gan, nhồi máu cơ tim, mất trí nhớ, ) Sau khi hấp thu vào

cơ thể, rượu đi vào từng tế bào và chuyển hoá thành Acetaldehyd

Acetaldehyd là một chất rất độc gây nên hầu hết các loại bệnh có nguyên

nhân từ rượu và cũng là một chất gây nghiên rượu

Nam dược giải rượu là một thực phẩm chức năng có tác dụng:

- Tăng cường chuyển hoá rượu bằng cách làm chậm quá trình chuyên

hoá thành Acetaldehyd

- Thúc đẩy quá trình chuyên hoá Acetaldehyd thành acid acetic, rồi tạo

- Do đó, sản phẩm có tác dụng ngăn chặn những tác hại do rượu gây rađối với các cơ quan trong cơ thê con người, giảm bớt tỷ lệ nghiện do rượu

Công dụng:

- Làm giảm triệu chứng “say”: Nhức đầu, khó chịu trong người, đầy

bụng, buồn nôn

- Ngăn chặn những tác hại do rượu gây nên cho cơ thể

Cách sử dụng: uống 2-3 viên trước khi uống rượu 30 phút - 1 tiếng

Hạn dùng: 36 tháng kể từ ngày sản xuất.

Quy cách đóng gói: Vỉ 6 viên X 0,5g Hộp nhỏ 1 vỉ (3g) Hộp lớn 5 hộp

nhỏ (15g)

1.3 7 Nước giải khát (Faừh) nước khoáng chanh muối

Hình 1.8 Nước khoáng chanh muối.

1.4 Phương pháp sac ký lỏng hiêu năng cao HPLC

1.4.1 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.1.1 Cơ sở ụ thuyết

HPLC là chữ viết tắt cúa 04 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Perlbrmance Liquid Chromatography),trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure LiquidChromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-19Ố8 trên cơ sở phát triển và cảitiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay, phương pháp HPLC ngàycàng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triên nhanh chóng của ngànhchế tạo máy phân tích Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiếmnghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiếm nghiệm thuốc Và nó hiện làcông cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính

và định lượng

Ưu điểm của HPLC:

Điều kiện phân tích khá dễ dàng

Dễ dàng thu hồi chất phân tích vói độ tinh khiết cao

Độ lặp lại cao

Thường không phân hủy mẫu

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó phađộng là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chiadưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay mộtchất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay phânloại theo kích cỡ (Rây phân tử)

Trong luận văn này chúng tôi sử dụng Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC) HITACHI L-5000 detectorDAD

1.4.1.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ phathuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổiion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếupha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử Cùng với pha tĩnh đê rửagiải chất phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động Như vậy, nếu

cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tácF1,F2 và F3

Tống của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏicột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (Fl) và ngược lại

Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực Fl, F2, F3 Trong đó F1

và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hương không lớn Ở đây F1

là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chấtphân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khácnhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khácnhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột

1.4.1.3 Phân loại sắc ký và ứng dụng

Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của phatĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động đê kéochất tan ra khỏi cột

Theo cơ chế chia tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động họccủa chất hấp phụ của sắc ký, người ta phân ra các loại sau đây:

- Sắc ký hấp phụ (NP-HPLC và RP-HPLC)

- Sắc ký phân bố - sắc ký chiết (LLC)

- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC)

- Sắc ký rây phân tử - sắc ký gel (IG-HPLC)

Nhimg thực tế hiên nay, chúng ta hiện chỉ đang ímg dụng sắc ký' hấp phụvào phân tích mẫu sắc ký hấp phụ là quá trình sắc ký' dựa trên sự hấp phụ mạnhyếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ)

của pha động đế kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách một hỗn họp phụ thuộc vào

tính chất động học của chất hấp phụ Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:

Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động

không phân cực

Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha

động phân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành công đê tách các hỗn

hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,

phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ nhiệt giảm đau

Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP)

1.4.1.4 Các đại ỉưọng đặc trung của sắc kỷ đồ

Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thànhsắc ký' đồ Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyếtđược đưa ra đế đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượngthường dùng trong thực tế và cách thay đối các đại lượng này có lợi cho quátrình phân tích sắc ký

1.4.1.4.1 Thời gian Um: Retention time (tỵ)

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột

cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau có thờigian lưu khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy, thời gianlưu là đại lượng đẻ phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

Bản chất sắc ký của pha tĩnh

Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của phađộng.Trong một phép phân tích nếu Rt nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu Rtquá lớn thỉ peak bị dán và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rấtdài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độchính xác của phép phân tích kém Đe thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vàocác yếu tố trên

1.4.1.4.2 Hệ so dung lượng K

- Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đótrong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trongpha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điẻm cân bằng

Thường được tính theo công thức sau:

- Hệ số dung lượng k phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặctính của pha tĩnh và pha động

Trong đó: tR là thời gian lưu của chất phân tích

1.4.1.4.5 Độ phân giải R (Resoỉution)

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhautrên một điều kiện sắc ký’ đã cho

Trong thực tế nếu các Peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để 2 Peaktách là R =1 Trong phép định lượng R=l,5 là phù hợp

Neu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích Peak sẽkhông chính xác

Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độnhạy sẽ kém Đẻ khắc phục ta có thể thay đối hệ pha động hay dùng chươngtrình Gradient dung môi Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chươngtrình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổiđường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các Peak

ta phân tích

Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi màchủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng cácyêu cầu trong quá trình phân tích

1.4.1.4.6 Hệ so không đoi xứng T

- Hệ số đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ

thu được T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa pic tại diêm 1/10 hoặc1/20 chiều cao của pic

27

a

Pic dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được, vì vậy phảiquan tâm ỗen hệ số không ỗối xứng T, khi T < 2,5 thì phép định lượng đượcchấp nhận, nếu T > 2,5 thì diêm cuối của pic rất khó xác định Vì vậy cầnthay đổi các điều kiện sắc kí đê làm cho pic cân đối xứng hơn theo cách sau:

+ Làm giảm thể tích chiết, tức là đoạn nối từ cột đến Detecter

+ Thay đối thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên

+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tíchhoặc giảm thể tích

1.4.2 Hệ thống HPLC

Gồm các bộ phận cơ bản sau: Degasse, Pump, Tiêm mẫu, Column,Detector

Trong đó: có bình chứa dung môi pha động, bộ phận khử khí, bơm cao

áp, bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample), cột sắc ký (Pha tĩnh) (đểngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt), detector (nhận tín hiệu), hệ thốngmáy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu, điều khiển hệ thốngHPLC và in dữ liệu

1.4.2.1 Bình đựng dung môi

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp,cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo

tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đường là 100%

Tuy nhiên, theo kinh nghiêm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dungmôi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 2 và 3 đường đê cho hệpha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn, đêquá trình rửa giải ổn định hơn

Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải gradiendung môi theo thời gian và công tác xây dụng tiêu chuấn

Lưu ý:

Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và

có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích

Tất cả các hóa chất dùng đế pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng

là hóa chất tinh khiết phân tích, nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký haynhiễu đường nền, tạo ra các Peak tạp trong quá trình phân tích

1.4.2.2 Bộ khử khỉ (.Degasse)

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bợt nhỏ còn sót lại trongdung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích, dung môi pha độngcòn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra

Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm chothời gian lưu của Peak thay đối

Trong trường hợp bợt quá nhiều, bộ khử khí không thế loại trừ hết đượcthì có thể Pump sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên vàmáy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

1.4.2.3 Bơm (Pump)

Mục đích đẻ bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký.Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến -500 at(lat =0.98 Bar) và purnp phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar)

Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412Bar Tốc độ dòng: 0.1-9.999 ml/phút

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm

có 2 pistone để thay phiên nhau đấy dung môi liên tục

1.4.2.4 Bộ phận tiêm mâu (injection)

Dùng để đưa mẫu vào cột phân tích Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột:Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động(Autosample)

1.4.2.5 Cột sắc ký

Có rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường Chúngđược chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột phađảo RP C18 (ODS), cột pha thường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhómchất Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn các hợp chất thông thường

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệunăng cao

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột

khoảng 10 - 30cm, đường kính trong 1-1 Omm

Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đãđược Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài rangười ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm Oxit, polyme xốp, chất traođổi ion

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ caohoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Ovencolumn)

1.4.2.6 Đầu dò (Detector)

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệughi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất củacác chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phảithoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích