NGHIÊN cửu xác ĐỊNH hàm LƯỢNG một só KIM LOẠI và VITAMIN bl, b6 BÀNG PHƯƠNG PHÁP háp THỤ NGUYÊN tử và sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG nấm LINH CHI NUÔI TRÒNG ở THỪA THIÊN HUÉ

PHẠM THỊ THANH THÚYNGHIÊN CỬU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SÓ KIM LOẠI VÀ VITAMIN Bl, B6 BÀNG PHƯƠNG PHÁP HÁP THỤ NGUYÊN TỬ VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG NẤM LINH CHI NUÔI TRÒNG Ở THỪA TH

PHẠM THỊ THANH THÚY

NGHIÊN CỬU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SÓ KIM LOẠI

VÀ VITAMIN Bl, B6 BÀNG PHƯƠNG PHÁP HÁP THỤ NGUYÊN TỬ VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG NẤM LINH CHI NUÔI TRÒNG Ở THỪA THIÊN HUÉ

LUẬN VĂN THẠC sĩ HÓA HỌC

VINH-2013

PHẠM THỊ THANH THÚY

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SÓ KIM LOẠI

VÀ VITAMIN Bl, B6 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẤP THỤ NGUYÊN TƯ VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÃNG CAO TRONG NÁM LINH CHI NUÔI TRÒNG Ở THỪA THIÊN HUÉ

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH

MÃ SÓ: 60.44.29

LUẶN VĂN THẠC sĩ HÓA HỌC

Người hưởng dẫn khoa học:

PGS TS: Nguyễn Khắc Nghĩa

Luận vãn dược thực hiện tại Sở Y tế Thừa Thiên Huế - Trung tâm kiêm định thuốc, mỹ phâm, thực phâm; phòng thí nghiệm chuyên đề Hóa phân tích, Khoa Hóa trường Đại học Vinh.

Tôi xin bày tỏ lòng biết on chân thành và sâu sắc nhất đến PGS TS

Nguyên Khăc Nghĩa đã giao đề tài, tận tình hướng dân, tạo điều kiện trong suốt

quá trình làm luận vãn.

Tôi chân thành cảm on sự giúp đỡ rất tận tình của các thầy, cô:

PGS TS Ngô Anh dã giúp đỡ định danh mẫu vật.

PGS TS Trân Đình Thăng đã giúp đỡ trong việc tìm kiếm tài liệu.

PGS TS Nguyễn Hoa Du và TS Đinh Thị Trường Giang đã đọc và góp

nhiều ỷ kiến quý báu cho luận vãn.

Nhân dịp này, tôi xin cảm on đến Ban chủ nhiệm khoa Sau Đại học, ban chủ nhiệm khoa Hỏa cùng các thầy cô giảo và các cản bộ phòng thí nghiệm khoa Hóa học đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn.

Dù cỏ nhiều cổ gang, song do năng lực còn hạn chế nên trong luận văn của tôi chắc chắn không thê tránh khỏi thiếu sót Tôi rất mong nhận được ỷ kiến đỏng góp của các thầy cô và các bạn đê luận văn được hoàn chỉnh hon.

Vinh, tháng 10 năm 2013

Phạm Thị Thanh Thúy

AAS Atomic Absorption Spectrometry Phép đo quang phổ hấp thụ

nguyên tử

F-AAS Flamc -Atomic Absorption

Spectrometry

Phcp đo quang phổ hấp thụnguyên tử bằng ngọn lửa

GF - AAS Graphit-Atomic Absorption

spectrometry

Phép đo quang phổ hấp thụnguyên tử không ngọn lửa

HPLC High performance liquid

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN 3 1.1 G IỚI THIỆU VÈ NẮM LINH CHI 3 1.1.1 G iới thiệu về nấm Linh chi 3

1.1.2 Phân loại: Nấm Linh chi có vị trí phân loại rộng rãi hiện nay 4

1.1.3 Chu trình sống của nấm Linh chi 4

1.1.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi 5

1.1.5 Thành phần hóa học 5

1.1.6 Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi 6

1.2 GIỚI THIÊU CÁC KIM LOẠI: Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn VÀ VAI TRÒ SINH HỌC CỦA CÁC KIM LOẠI 7 1.2.1 Giới thiệu về kim loại Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn 7

1.2.1.1 N guyên tố đồng (Cu) 7

1.2.1.2 N guyên tố chì (Pb) 8

1.2.1.3 Nguyên tố coban (Co) 8

1.2.1.4 Nguyên tố cadimi (Cd) 9

1.2.1.5 Nguyên tố canxi (Ca) 9

1.2.1.6 Nguyên tố kẽm (Zn) 10

1.2.2 Vai trò sinh học của Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn 10

1.2.2.1 Vai trò sinh học của Cu 10

1.2.2.2 Vai trò sinh học của Pb 11

1.2.2.3 Vai trò sinh học của Co 11

1.3.1 Phương pháp xử lý mẫu ướt (bằng axit đặc oxi hóa mạnh) 13

1.3.2 Phương pháp xử lý mẫu khô (vô cơ hóa khô) 14

1.3.3 Phương pháp xử lý mẫu khô ướt kết hợp 14

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KIM LOẠI 15 1.4.1 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 15

1.4.1.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp 15

1.4.1.2 Trang bị của phép đo 17

1.4.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo AAS 18

1.4.1.4 Ph ương pháp định lượng trong phép đo AAS 19

1.4.1.5 Ưu nhược điểm của phương pháp 20

1.4.2 Mộ t số phương pháp xác định kim loại vét khác 21

1.4.2.1 Phương pháp điện hóa 21

1.4.2.2 Phương pháp quang phổ khác 22

1.5 GIỚI THIỆU VITAMIN BI, B6 23 1.5.1 Vitamin BI 24

1.5.1.1 Tính chất vật lý 24

1.5.1.2 Tính chất hóa học 25

1.5.2 Vitamin B6 25

1.5.2.1 Tính chất vật lý 26

1.5.2.2 Tính chất hóa học của vitamin B6 26

1.5.3 Vai trò và nhu cầu của vitamin Bl, B6 đối với cơ thể 27

1.6 MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HỎN HỢP VITAMIN Bl, B6 28 1.6.1 Ph ương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 28

1.6.1.1 Cá c đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký 28

1.6.1.6 Cá

ch tính kết quả 34

1.6.2 Phương pháp phổ đạo hàm 35

CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT THỤC NGHIỆM 37 2.1 L ÁY MẪU 37

2.2 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẢƯ XÁC ĐỊNH KIM LOẠI VÀ VITAMIN 38

2.2.1 Trang thiết bị, hóa chất, xử lý mẫu nấm xác định các kim loại 38

2.2.1.1 Trang thiết bị và hóa chất 38

2.2.1.2 Xử lý mẫu nấm 39

2.2.1.3 Ph ương pháp định lượng 39

2.2.2 Trang thiết bị, hóa chất, xử lý mẫu nấm xác định vitamin Bl, B6 39

2.2.2.1 Trang thiết bị và hóa chất 39

2.2.2.2 Điều kiện tiến hành và chuẩn bị hóa chất chuẩn 40

2.2.2.3 Xử lý mẫu xác định vitamin 41

2.2.2.4 Phương pháp định lượng 41

CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ THỤC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 42 A Ket quả thực nghiệm và thảo luận xác định kim loại bằng phương pháp AAS ’ 42

3.1 LựA CHỌN CÁC ĐIÈƯ KIỆN ĐO PHỎ 42 3.1.1 Vạch đo phổ 42

3.1.2 Khe đo 43

3.1.3 Cường độ đèn catot rỗng (HCL) 43

3.1.4 Loại khí đốt và tốc độ dẫn khí trong phcp đo F-AAS 44

3.4 KHẢO SÁT HIỆU SUÁT THƯ HÒI CỦA PHÉP ĐO AAS 47

3.5.1 Khảo sát xác định khoảng tuyến tính 48

3.5.2 Xây dựng phương trình đường chuấn, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của Cu, Pb, Co, Cd, Ca và Zn 52

3.6 LựA CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ QƯY TRÌNH xử LÝ MẪƯ 57 3.7 TỎNG KÉT CÁC ĐIÈƯ KIỆN ĐO PHÒ F-AAS CỦA Ca, Zn VÀ GF-AAS CỦA Cu, Pb, Cd, Co * 58

3.8 THựC NGHIỆM ĐO PHÒ VÀ KẾT QƯẢ TÍNH TOÁN 59 3.8.1 Phương pháp xử lý kết quả phân tích theo phương pháp đường chuẩn 59

3.8.2 Kết quả xác định hàm lượng Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn trong các mẫu nấm 59 3.9 KIẺM TRA QƯÁ TRÌNH xử LÝ MẪU 64 B Kêt quả thực nghiệm và thảo luận xác định vitamin Bl, B6 băng phương pháp IIPLC 71

3.10 CÁC ĐIÈƯ KIỆN ĐO HPLC 71 3.10.1 Lựa chọn cột tách 71

3.10.2 Lựa chọn thể tích tiêm mẫu 71

3.10.3 Tống kết các điều kiện hệ thống HPLC xác định vitamin 71

3.11 KHẢO SÁT THỜI GIAN LUƯ VÀ DIỆN TÍCH PIC CỦA CHẢT CHƯẢN CỦA VITAMIN Bl, B6 ’ 72

3.12 T HựC NGHIỆM ĐO MẪU VÀ TÍNH TOÁN KẾT QUẢ 73 3.12.1 Ket quả đo thời gian lưu và diện tích pic Bl, B6 trong 4 mẫu nấm 73

3.12.2 Hàm lượng vitamin BI trong bốn mẫu nấm 76

KÉT LUẬN 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

MỞ ĐẦU

Đé có thé khẳng định tác dụng chỉ định và chống chỉ định của các đơnthuốc trị bệnh, thực phẩm chức năng bồi bố sức khỏe của người bệnh có nấmLinh chi là thành phần chính, thì cần phải xác định cấu tạo và thành phần hóahọc của nấm

Trong các sách, tạp chí, từ điển y học đang được lưu hành và cả trên mạnginternet các thông tin đề cập đến cấu tạo và thành phần của nấm Linh chi vẫn cònrất hạn ché

Qua khảo sát sơ bộ, chúng tôi biết được có hàng chục kim loại trong thànhphần hóa học và khá nhiều loại vitamin có trong nấm Linh chi Đế góp thêmthông tin về nấm Linh chi, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu xác địnhthành phần một số kim loại và một số vitamin nhóm B trong nấm Linh chi đượcnuôi trồng ở Thừa Thiên Huế Ket quả phân phân tích này so sánh với các số liệuphân tích về nấm Linh chi Hàn Quốc đang được bán ở trên thị trường tại thànhphố Huế

Để xác định hàm lượng vết một số kim loại và vitamin trong thực vật thìphương pháp hấp thụ nguyên tử và sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp tỏ

ra có nhiều ưu việt hơn cả

Xuất phát từ tình hình thực tế và góp phần vào công tác đảm bảo chất

lượng nấm dùng để làm dược liệu, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định

hàm lượng một so kim loại và vitamin BI Ị B6 bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử (AAS) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong nấm Linh chi nuôi trồng ở Thừa thiên Huế ' làm luận văn tốt nghiệp của mình.

Thực hiện đề tài này chúng tôi giải quyết những nhiệm vụ sau:

♦> Nghiên cứu xác định kim loại bằng phương pháp phồ hấp thụ nguyên tử(AAS).

Khảo sát các điều kiện để đo phố AAS của Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo xác định các kim loại trên.Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn cho phép đo phả

Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đánh giá sai số và độ lặp

Xác định các điều kiện tối ưu để đo sắc đồ HPLC của Bl, B6

Xác định hàm lượng vitamin Bl, B6 theo phương pháp ngoại chuẩn

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VÈ NẤM LINH CHI

1.1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi

Linh chi có nhiều tên gọi khác nhau như Bất Lão Thảo, Vạn Niên Thảo,Trần Tiên Thảo, Chi Linh, Nấm Lim Mỗi tên gọi của Linh chi gắn liền vớimột giá trị dược liệu của nó Tên gọi Linh chi bắt nguồn từ Trung Quốc, haytiếng Nhật là Reishi hoặc Mannentake, tên gọi Latinh: Ganodcrma lucidum [7]

Linh chi (Ganoderma) là các loại gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có hàngtrăm loài khác nhau cùng họ nấm gỗ (Ganodemataceae) Có 2 nhóm lớn là cổLinh chi và Linh chi

+ Cổ Linh chi: là các loài nấm gỗ không cuống (hoặc cuống rất ngắn) có

nhiều tầng Mũ nấm hình quạt, màu từ nâu xám đến đen sẫm, mặt trên xù xì thôráp Nấm rất cứng (như gỗ lim nên gọi là nấm lim) Tên khoa học: Ganodermaapplanatum (Pers) Past [20]

+ Lình chi: là các loài nấm gỗ mọc hoang ở những vùng núi cao và lạnh ở

các vùng Tứ Xuyên, Quảng Đông (Trung Quốc), nấm có cuống, cuống nấm cómàu (mỗi loài có một màu riêng như nâu, đỏ, vàng, đỏ cam ) Thụ tầng màutrắng ngà hoặc màu vàng Mũ nấm có nhiều hình dạng, phố biến là hình thận,hình tròn, mặt trên bóng Nấm hơi cứng và dai Tên khoa học: Ganodermalucidum

Linh chi có tới 2000 loại và phố biến nhất là Ganoderma lucidum vàGanoderma zaponicum

ơ Việt Nam, loài nấm Linh chi Ganoderma lucidum mới được nuôi trồngthành công trong phòng thí nghiệm (1978) Năm 1994 loài nấm lim - một chủngLinh chi đỏ đặc sắc của các rừng Lim Bắc Việt đã được Phạm Quang Thụ đưavào nuôi trồng chủ động [20]

Đến hiện nay, việc nuôi trồng nấm Linh chi đỏ đã được phố biến tại cáctrang trại, đặc biệt là các vùng ven thành phố Huế

1.1.2 Phân loại: Nấm Linh chi có vị trí phân loại rộng rãi hiện nay [19]

Ngành: MaycotaLớp: BasidiomycetesBộ: PolyporalesHọ: GanodermataceaeGiống: GanodermaLoài: Ganoderma lucidum

1.1.3 Chu trình sống của nấm Linh chi [19]

Chu trình sống của nấm Linh chi cũng bắt đầu từ các đảm bào tử Bào tửnảy mầm hình thành hệ sợi sơ cấp Hệ sợi thứ cấp tích lũy đầy đủ dinh dưỡng

hình thành quả thể hoàn chỉnh mang đảm bào tử mới

Hình 1.1: Chu trình sống của nấm Linh Chi 1.1.4 Nhũng yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát

triển của nấm Linh chi.

Nhiệt độ: giai đoạn nuôi sợi, nấm Linh chi sinh trưởng và phát triển tốt ởnhiệt độ 20-E30°C, giai đoạn hình thành quả thể nhiệt độ thích hợp 22-ỉ-28°C

Độ ẩm: độ ẩm của giá thể khoảng 60-^65% Độ ấm không khí của nhànuôi 80-^95%

Ánh sáng: giai đoạn nuôi sợi, nấm không cần ánh sáng, giai đoạn hìnhthành quả thổ cần ánh sáng tán xạ, cường độ phải cân đối về mọi phía

Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phối, thông

mũi, an thần, chữa ho

Hắc chi

(Huyền chi) Đen

Vị ngọt, tính bình, không độc, trị bí tiểu, íchthận khí

Tứ chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức xương

khớp, gân cốt

Qua phân tích về các mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi,người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh như: bệnh tim mạch, hôhấp, tăng khả năng miễn dịch, trị bệnh gan, có hiệu quả trong chống ung thư, khả

năng kháng HIV , ngoài ra các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khảnăng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay do nhiễm

xạ Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tốn thương và không gây hiệu ứng phụnào cho cơ thể [19]

Cao Linh chi đỏ Viên Linh chi Trà Linh chi hộp

Hình 1.2: Các chế phẩm từ nấm linh chi 1.2 GIỚI THIỆU CÁC KIM LOẠI: Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn VÀ VAI TRÒ SINH HỌC CỦA CÁC KIM LOẠI

1.2.1 Giói thiệu về kim loại Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn [16]

1.2.1.1 Nguyên tố đồng (Cu) [16]

Đồng là nguyên tố hóa học có kí hiệu Cu và số hiệu nguyên tử 29, thuộcchu kỳ 4, nhóm IB Khối lượng nguyên tử là 63,546 đ.vC Đồng là nguyên tốphố biến chiếm khoảng 0,003% tổng số nguyên tử

Đồng là kim loại mềm dẻo, dễ uốn, màu đỏ, có hóa trị I và II, dẫn điện rấttốt Được dùng làm dây dẫn điện, trong xây dựng, công nghiệp mạ kim và làthành phần của nhiều hợp kim

Trong tự nhiên Cu tồn tại dưới dạng khoáng vật: cuprit (Cu20), covelin(CuS), đôi khi cũng tồn tại dưới dạng đơn chất

Trong không khí, đồng bị oxi hóa tạo CuO ở bề mặt, sau đó gặp H20, C02

tạo thành bazơ màu xanh: Cu(0H)2.CuC03 (rỉ đồng)

Phản ứng với phi kim, không tan trong dung dịch HC1, H2SO4 loãng, chỉtan trong dung dịch có tính oxi hóa mạnh.

1.2.1.2 Nguyên tố chì (Pb) [16]

Chì có ký hiệu hóa học là Pb, thuộc nhóm chính nhóm IVB, chu kỳ 6, sốthứ tự là 82 trong bảng tuần hoàn Chì có màu xanh khi mới cắt, nhưng bắt đầuxỉn màu thành xám khi tiếp xúc với không khí Chì là kim loại mềm, nặng, độchại và có thể tạo hình

Chì là kim loại được sử dụng khá phố biến: dùng trong xây dựng, ắc quychì, đạn và là một phần của nhiều hợp kim

ơ điều kiện thường, chì bị oxi hóa thành lớp oxit màu xám xanh bao bọctrên bề mặt bảo vệ cho chì không bị oxi hóa nữa Khi đun nóng, Pb tác dụngđược với Ơ2, s, halogen Chì tan tốt trong dung dịch HNO3, chỉ tương tác trên bềmặt với dung dịch HC1 loãng và H2SO4 80% Vì bị bao phủ bởi lớp muối khó tan(PbCl2, PbS04) Tuy nhiên với dung dịch axit đậm đặc hơn chì có thể tan được,

vì muối khó tan của lớp bảo vệ đã chuyển thành hợp chất tan (H2PbCl4)

Ion Pb(II) có thể tạo nhiều phức với hợp chất hữu cơ như amonipyrilodynDithiocacbamat, đién hình là với đithizon ở pH 8,5 - 9,5 tạo phức màu đỏ gạch

1.2.1.3 Nguyên tố coban (Co) [16]

Coban (Co) thuộc phân nhóm phụ nhóm VTIIB, số thứ tự 27 trong bảngtuần hoàn Coban là nguyên tố ít phố biến, trữ lượng trong vỏ Quả Đất là 0,001%tổng số nguyên tố Coban là kim loại có ánh kim, có màu trắng xám, cứng vàdòn Những hợp kim coban có từ tính, bền nhiệt và bền hóa học

Coban có vai trò sinh học rất lớn, vitamin B12 là phức chất của coban.Ngoài ra coban còn là nguyên tố vi lượng trong thực vật

Coban là kim loại có hoạt tính hóa học trung bình Ở điều kiện thườngkhông có hơi ẩm, Co không tác dụng ngay với các nguyên tố không kim loại như

02, s, Cl2 vì có màng oxit bảo vệ Nhưng khi đun nóng phản ứng xảy ra mãnhliệt, nhất là khi kim loại ở trạng thái chia nhỏ Co bền với F2 ở nhiệt độ cao, Cotác dụng với s khi đun nhẹ tạo thành những hợp chất không hợp thức, Co tácdụng với trực tiếp với co tạo thành cacbonyl kim loại.

Co bền với dung dịch kiềm vì oxit của chúng không thc hiện tính lưỡngtính Đối với không khí và nước, coban tinh khiết bền Phức của Co(II): ion Co2+

tạo nhiều phức bền, phức chất bát diện và có số phối trí 6

Trong dung dịch nước, coban (II) [Co(NH3)6]2 dễ tác dụng với oxi không khí

tạo thành coban (III) [Co(NH3)ố]3+

dễ dàng tác dụng với axit không phải là chất oxi hóa, giải phóng khí hidro

Đa số các muối của cadimi đều không màu, các muối suníầt và nitrat của

Cd đều tan chỉ có muối suníua, cacbonat của chúng ít tan trong nước Ngoài ra

Cd (II) còn tạo phức mạnh với rất nhiều thuốc thử hữu cơ cũng như vô cơ và cómàu đặc trưng như phức đithizon tạo ra cadimi-đithizonnat có màu tím, vớiEDTA, Cd2 tạo phức bền với lgp = 16,6 Các phức của Cd2+ với halogenua,SCN", CN’ NH3 đều là các phức tan

1.2.1.5 Nguyên tố canxi (Ca) [ 16]

Canxi là nguyên tố thuộc nhóm IIA, chu kì 4 bảng tuần hoàn các nguyên

tố hoá học, số thứ tự 20, nguyên tử khối 40,08 đ.vC Là kim loại kiềm thổ, màu

trắng bạc Rất hoạt động hoá học: ở nhiệt độ thường, dễ bị oxi hoá trong khôngkhí, tác dụng với tất cả các nguyên tố phi kim, tác dụng mạnh với nước.

Ca được dùng làm chất khử đế điều chế nhiều kim loại urani, thori,vanađi, crom, kẽm, berili và một số kim loại khác từ hợp chất của chúng, khử oxitrong thép Hợp chất của Ca được dùng trong xây dựng (vôi, xi măng), một sốchế phẩm được dùng trong y học

Theo lượng phân bố trong vỏ Trái Đất, Ca chiếm vị trí thứ năm trong tống

số các nguyên tố Các khoáng vật chính: thạch cao, íluorit, Điều chế bằng cáchđiện phân canxi clorua nóng chảy, dùng nhôm khử canxi oxit ở nhiệt độ cao vàtrong chân không cao

Kẽm là kim loại tương đối hoạt động, song ở nhiệt độ thường kẽm bền vớinước và có màng oxit bảo vệ Khi tác dụng với HC1 và H2SO4 loãng sẽ giảiphóng khí H2 và tạo thành muối tương ứng

1.2.2 Vai trò sinh học của Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn

1.2.2.1 Vai trò sinh học của Cu

Đồng là một thành phần thiết yếu của cơ thể do thức ăn đưa vào hằng ngày

từ 0,033 - 0,05 mg/kg thế trọng Với liều lượng này người ta không thấy có tíchlũy đồng trong cơ thể người bình thường

Đồng có nhiều vai trò sinh lý, nó tham gia vào quá trình tạo hồng cầu và làthành phần của nhiều enzym Đồng thời tham gia tạo sắc tố hô hấp hemoglobin

Các nghiên cứu khoa học cho thấy khi nồng độ Cu cao hơn mức cho phép, một

số người có dấu hiệu mắc bệnh do đồng lắng đọng trong gan, thận, não Ngượclại, khi nồng độ quá thấp, cơ thế phát triển không bình thường đặc biệt với trẻ

em Đồng không gây độc do tích lũy, nhưng nếu ăn phải một lượng lớn muốiđồng thì bị ngộ độc cấp tính Theo WHO-2008, hàm lượng đồng tối đa trongnước là 2mg/l còn đối với Việt Nam là 0,lmg/l

1.2.2.2 Vai trò sinh học của Pb

Chì thâm nhập qua đường tiêu hóa do ăn uống những rau, quả, thực phẩm,nguồn nước bị nhiễm chì, qua đường hô hấp Chì là một thành phần không cầnthiết trong khẩu phần ăn Trung bình liều lượng chì do thức ăn, thức uống cungcấp cho khẩu phần ăn hàng ngày là 0,0033 - 0,005 mg/kg the trọng

Liều lượng tối đa chì có thể chấp nhận hàng ngày cho người do thức ăncung cấp, được tạm thời quy định là 0,005mg/kg thể trọng Chỉ cần mỗi ngày cơthể hấp thụ từ lmg trở lên, sau một vài năm sẽ có những triệu chứng như: hơi thởthối, sưng lợi và viền đen ở lợi, da vàng, đau bụng dữ dội, táo bón, đau xươngkhớp, bại liệt chi trên, mạch yếu, nước tiểu ít, trong nước tiếu có chứa poephyrin,phụ nữ dễ sẩy thai

1.2.2.3 Vai trò sinh học của Co [29]

Coban có chức năng là kích thích sự tạo máu ở tủy xương Neu thiếu

coban sẽ dẫn tới thiếu vitamin B12 và dẫn đến thiếu máu ác tính, chán ăn, suy

nhược cơ thể

1.2.2.4 Vai trò sinh học của Cd

Cadimi là một nguyên tố rất độc Cadimi thường tìm thấy trong cáckhoáng vật có chứa kẽm, còn trong khí quyén và nước Cd xâm nhập qua nguồn

tự nhiên (như bụi núi lửa, bụi đại dương ) và nguồn nhân tạo như công nghiệpluyện kim, lọc dầu

Cadimi xâm nhập vào cơ thể con người thông qua chủ yếu là thức ăn thựcvật, bằng nước có chứa nhiều Cd Hít hơi bụi Cd thường xuyên có thể làm hạiphổi, trong phổi Cd sẽ thấm vào máu và được phân bố đi khắp nơi Phần lớn Cdxâm nhập vào cơ thể người được giữ lại ở thận và được đào thải, còn một phần ít(khoảng 1%) được giữ trong thận, do Cd liên kết với protein tạo thànhmetallotionein có ở thận [10] Khi lượng Cd được tích trữ lớn, nó có thể thế Zn2+

trong các enzvm quan trọng và gây rối loạn tiêu hóa và các chứng bệnh rối loạnchức năng thận, thiếu máu, tăng huyết áp, phá hủy tủy sống, gây ung thư

1.2.2.5 Vai trò sinh học của Ca [27]

Canxi vẫn là một khoáng chất quan trọng cho cơ thể Nếu không có đủcanxi, xương sẽ trở nên yếu đi Thiếu canxi cũng gây ra cao huyết áp, béo phì,cholesterol cao và bệnh còi xương

Canxi trong máu, trong tố chức phần mềm tuy chỉ chiếm 1% trọng lượng

cơ thé nhưng vô cùng quan trọng đối với hệ miễn dịch, hệ thần kinh

Tuy nhicn, việc tiêu thụ hàm lượng canxi vượt quá mức cho phép có thểgây kích thích niêm mạc dạ dày, có thể dẫn tới táo bón và đau dạ dày nói chung.Ngoài ra bị sỏi thận cũng là một trong những bệnh liên quan đến việc dư thừacanxi trong cơ thể

1.2.2.6 Vai trò sinh học của Zn [4]

Kẽm là yếu tố vi lượng cần thiết cho mọi hình thái của sự sống Kẽm cóchức năng xúc tác, kích thích hoạt động của khoảng 100 enzym, các enzym nàytham gia vào các quá trình chủ yếu sau: sinh trưởng, hô hấp, thị giác, sử dụngglucid, bảo vệ hệ miễn dịch và sinh sản

Kẽm còn đóng vai trò làm giảm độc tính của các kim loại độc như: nhôm,asen, cadimi và góp phần vào quá trình giảm lão hóa Vì vậy kẽm còn đượcmệnh danh là “ngọn lửa sinh mạng”

Kẽm là một trong những nguyên tố vi lượng cần thiết cho thực vật, độngvật và con người Hàm lượng kẽm được giới hạn trong thức ăn từ 5-10ppmkhông gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.

Mặt dù kẽm là vi chất cần thiết cho cơ thế, tuy nhiên nếu hàm lượng kẽmvượt quá mức cần thiết sẽ có hại Kẽm có khả năng gây ung thư đột biến, gâyngộ độc hệ thần kinh, sự nhạy cảm, sự sinh sản, gây độc đến hệ miễn nhiễm Hấp thụ quá nhiều kẽm làm ngăn chặn sự hấp thụ đồng và sắt Còn sự thiếu hụtkẽm sẽ gây ra các triệu chứng như bệnh hệt dương, teo tinh hoàn, mù màu, viêm

da, bệnh về gan

1.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU XÁC ĐỊNH KIM LOẠI [12]

Để xác định hàm lượng Cu, Pb, Cd, Co, Ca, Zn trong mẫu nấm, trước hếtphải tiến hành xử lý mẫu nhằm chuyển các nguyên tố cần xác định có trong mẫu

từ trạng thái ban đầu (dạng rắn) về dạng dung dịch Hiện nay có nhiều kỹ thuật

xử lý mẫu phân tích bằng axit như: kỹ thuật xử lý mẫu ướt, xử lý mẫu khô haykhô ướt kết hợp

1.3.1 Phương pháp xử lý mẫu ướt (bàng axit đặc oxi hóa mạnh)

Nguyên tắc: Dùng axit mạnh và đặc nóng hay axit có tính oxy hoá mạnh

hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO + H2S04), hay 3 axit (HNO + H2S04 + Hciop, hoặc

là 1 axit đặc và một chất oxy hoá mạnh (H^so + KMnO ), v.v để phân huỷ mẫutrong điều kiện đun nóng trong bình Kendan, trong ống nghiệm, trong cốc haytrong lò vi sóng Lượng axit cần dùng đế phân huỷ mẫu thường gấp 10 - 15 lầnlượng mẫu, tuỳ thuộc mỗi loại mẫu và cấu trúc vật lý hoá học của nó

ưu điểm và nhược điểm của phương pháp: Hầu như không bị mất các

chất phân tích, nhất là trong lò vi sóng, thời gian phân huỷ mẫu rất dài Trongđiều kiện thường, tốn nhiều axit đặc tinh khiết cao, nhất là trong các hệ hở, dễ bị

nhiễm bẩn khi xử lý trong hệ hở, do môi trường hay axit dùng, phải đuổi axit dưlâu nên dễ bị nhiễm bẩn, bụi vào mẫu, v.v.

1.3.2 Phương pháp xử lý mẫu khô (vô cơ hóa khô)

Nguyên tắc: Kỹ thuật xử lý khô là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò

nung ở một nhiệt độ thích hợp (450-750 C) Sau khi nung, mẫu bã còn lại đượchoà tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay dung dịch axit phù hợp đế chuyểncác chất cần phân tích trong tro mẫu vào dạng dung dịch, đế sau đó xác định nótheo một phương pháp đã chọn Khi nung các chất hữu cơ của mẫu sẽ bị đốtcháy thành co và nước

ưu nhược điểm của phương pháp: Thao tác và cách làm đơn giản, không

phải dùng nhiều axit đặc tinh khiết cao đắt tiền, xử lý được triệt để, nhất là cácmẫu nền hữu cơ, đốt cháy hết các chất hữu cơ, vì thế làm dung dịch mẫu thuđược sạch, nhưng có nhược điểm là có thể mất một số chất dễ bay hơi, ví dụ như

Cd, Pb, Zn, Sn, Sb, v.v nếu không có chất phụ gia và chất bảo vệ

1.3.3 Phương pháp xử lý mẫu khô ướt kết hợp

Nguyên tăc: Mau được phân huỷ trong chén hay cốc nung Trước tiên

người ta thực hiện xử lý ướt sơ bộ bằng một lượng nhỏ axit và chất phụ gia, đểphá vỡ sơ bộ cấu trúc ban đầu của các hợp chất mẫu và tạo điều kiện giữ một sốnguyên tố có thể bay hơi khi nung Sau đó mẫu nung ở nhiệt độ thích hợp Vì thếlượng axit dùng đé xử lý thường chỉ bằng 1/4 hay 1/5 lượng cần dùng cho xử lýướt Sau đó nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ triệt để hơn xử lý ướt, đồngthời lại hạn chế được sự mất của một số kim loại khi nung Do đó đã tận dụngđược ưu điểm của cả hai kỹ thuật xử lý ướt và xử lý khô, nhất là giảm bớt đượccác hoá chất khi xử lý ướt, sau đó hoà tan tro mẫu sẽ thu được dung dịch mẫutrong, vì không còn chất hữu cơ và sạch hơn tro hoá ướt bình thường

ưu nhược điếm của phương pháp: Hạn chế được sự mất của một số chất

phân tích dễ bay hơi, sự tro hoá triệt đế, sau khi hoà tan tro còn lại có dung dịchmẫu trong, không phải dùng nhiều axit tinh khiết cao tốn kém, thời gian xử lýnhanh hon tro hoá ướt, không phải đuối axit dư lâu, nên hạn chế được sự nhiễmbẩn, phù hợp cho nhiều loại mẫu khác nhau đế xác định kim loại, v.v

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KIM LOẠI

Để xác định Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn, có không ít những phương pháp phân tích:

Phương pháp hóa học: Nhóm các phương pháp này dùng để xác định hàm

lượng lớn (đa dạng) của các chất, thông thường lớn hơn 0,05%, tức là nồng độmiligam Các thiết bị và dụng cụ của phương pháp này đơn giản, không đắt tiền.Gồm các phương pháp: phương pháp phân tích khối lượng, phương pháp phântích thế tích, phương pháp oxi hóa-khử, phương pháp complexon 112,221

Phương pháp phân tích công cụ: gồm điện hóa, phổ phân tử UV-VIS, sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phố phát xạ nguyên tử, phố hấp thụ nguyên tửngọn lửa (F-AAS) và không ngọn lửa (GF-AAS) đây là các phương pháp đếxác định các kim loại ở hàm lượng vết, có độ chọn lọc, độ nhạy và độ chính xáccao, cho kết quả tốt Nhưng trong điều kiện luận văn này chúng tôi chỉ đi sâunghiên cứu xác định 6 kim loại trên bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS

1.4.1 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) [13,17]

Phương pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phố hấp thụ nguyên tử của mộtnguyên tố được gọi là phép đo phố hấp thụ nguyên tử (phcp đo AAS)

1.4.1.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp

Nguyên tăc: Đo sự hấp thụ năng lượng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự

do ở trong trạng thái hơi (khí) khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của

nguyên tố đó trong môi trường hấp thụ

Do đó, muốn thực hiện phcp đo AAS cần phải có các quá trình sau:

1 Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyến mẫu phân tích

từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử

tự do Đó chính là quá trình hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu

2 Chiếu chùm tia bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơinguyên tử tự do vừa được tạo ra ở trên Các nguyên tử của nguyên tố cần xácđịnh trong đám hơi sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phố hấp thụcủa nó

3 Tiếp đó, nhờ một hệ thống máy quang phổ người ta thu toàn bộ chùmsáng, phân ly và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần phân tích đổ đocường độ của nó Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ Trong một giới hạnnồng độ xác định, tín hiệu này phụ thuộc tuyên tính vào nồng độ của nguyên tốcần xác định trong mẫu theo phương trình:

Ax=K.Cb

Trong đó: Ax‘ cường độ hấp thụ

K: hằng số thực nghiệmC: nồng độ nguyên tố trong mẫub: hằng số bản chất, phụ thuộc vào nồng độ (0<b<l)Phương trình trên là cơ sở định lượng cho phép đo AAS tùy thuộc vào kỹthuật nguyên tử hóa mẫu mà người ta phân biệt phố hấp thụ nguyên tử ngọn lửa(T-AAS) cho độ nhạy cỡ 0,1 ppm Phổ hấp thụ không ngọn lửa (GP-AAS) có độnhạy cao hơn kỹ thuật ngọn lửa 50-1000 lần, cỡ 0,1 - 1 ppb)

• Phép đo phổ P-AAS

Kỹ thuật F-AAS dùng năng lượng nhiệt của ngọn lửa đèn khí để hóa hơi

và nguyên tử hóa mẫu phân tích Do đó mọi quá trình xảy ra trong quá trìnhnguyên tử hóa mẫu phụ thuộc vào đặc trưng và tính chất của ngọn lửa đèn khínhưng chủ yếu là nhiệt độ ngọn lửa Đây là yếu tố quyết định hiệu suất nguyên

tử hóa mẫu phân tích, mọi yéu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ ngọn lửa đèn khí đềuảnh hưởng đến kết quả của phép phân tích.

1.4.1.2 Trang bị của phép đo

Dựa vào nguyên tắc của phép đo, ta có thế mô tả hệ thống trang bị củathiết bị đo phổ AAS theo sơ đồ như sau:

Phần 1 Nguồn phát chùm tia bức xạ cộng hưởng của nguyên tố cần phân

tích Đó có thể là đèn catốt rỗng (Hollow Cathode Lamp-HCL), hay đèn phóng

điện không điện cực (Electrodeless Discharge Lamp-EDL), hoặc nguồn phát bức

xạ liên tục đã được biến điệu

Phần 2 Hệ thống nguyên tử hoá mẫu Hệ thống này được chế tạo theo ba

loại kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu Đó là:

+ Kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu bằng ngọn lửa đòn khí (F-AAS)

+ Kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu không ngọn lửa (GF-AAS)

+ Kỹ thuật hoá hơi lạnh

Phần 3 Bộ phận đơn sắc (hệ quang học) có nhiệm vụ thu, phân ly và chọn

tia sáng (vạch phố) cần đo hướng vào nhân quang điện để phát hiện và đo tínhiệu hấp thụ AAS của vạch phố

Phần 4 Bộ phận khuyếch đại và chỉ thị tín hiệu AAS Phần chỉ thị tín hiệu

có thé là: điện kế chỉ tín hiệu AAS; bộ tự ghi các pic hấp thụ; bộ chỉ thị hiện số;hoặc máy tính (Computer) với màn hình video, để hiện thị, lưu trữ, xử lý số liệu

và điều khiến toàn bộ hệ thống máy đo

1.4.1.3 Các yếu to ảnh hưởng đến phép đo AAS

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích trong phép đo AAS rất đadạng và phức tạp tùy thuộc vào thành phần của mẫu và nẻn mẫu Nhìn chung cóthể chia thành 6 nhóm sau:

Nhóm 1: Các thông số của hệ máy đo phố.

Nhóm 2: Các điều kiện nguyên tử hóa mẫu.

Quá trình nguyên tử hóa mẫu là một quá trình quan trọng của phép đoquang phố hấp thụ nguyên tử Các chất nền sẵn có trong mẫu hay do thêm vào cóthể dẫn đến các ảnh hưởng sau:

+ Làm giảm cường độ vạch phố, do tạo thành các hợp chất khó bay h

ơi và khó nguyên tử hoá và giảm độ nhạy

+ Làm tăng cường độ vạch phổ, do sự tạo thành các hợp chất dễ bayhơi và dễ nguyên tử hóa và do sự hạn chế ảnh hưởng của sự lon hóa và sự kíchthích phát xạ của nguyên tố phân tích

+ Sự tăng cường độ vạch phố khi nguyên tố cần phân tích còn tồn tạitrong mẫu nền là các hợp chất dễ hóa hơi

+ Sự giảm cường độ vạch phố khi nguyên tố phân tích tồn tại trongnền của mẫu là các hợp chất khó bay hơi Lúc này nguyên tố kìm hãm sự hóa hơicủa nguyên tố cần phân tích Các chất nền này thường là các chất bền nhiệt.

Nhóm 3: Các ảnh hưởng về phổ như: Sự hấp thụ nền, sự chen lấn của vạch

phổ và sự hấp thụ của các hạt rắn

Nhóm 4: Kỹ thuật và phương pháp được chọn đế xử lý mẫu.

Nhóm 5: Các yếu tố vật lý như: độ nhớt, sức căng bề mặt của dung dịch

mẫu có ảnh hưởng nhiều đến phép đo nhất là khi mẫu phân tích có nồng độ lớn

Nhóm 6: Các yếu tố hóa học như: nồng độ axit và loại axit trong dung dịch

mẫu, ảnh hưởng của các cation và anion khác trong dung dịch, ảnh hưởng củacác thành phần nền và ảnh hưởng của dung môi hữu cơ

Vì vậy, đé kết quả chính xác và tin cậy đòi hỏi người phân tích phải biết

xử lý hóa học, tách loại, làm giàu, che tránh các yếu tố ảnh hưởng về mặt hóa

học cũng như về pho hấp thụ trong mỗi trường hợp

1.4.1.4 Phương pháp định lượng trong phép đo AAS [13]

Đe xác định nồng độ (hàm lượng) của một nguyên tố trong mẫu phân tíchtheo phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, người ta thưÒTLg thực hiện theo các phươngpháp sau đây:

a Phương pháp đường chuân

Nguyên tắc: phương pháp này dựa vào phương trình cơ bản của phép đo

A=K.C và một dãy mẫu đầu đế dựng một đường chuẩn và sau đó nhờ vào đườngchuẩn này và giá trị Ax để xác định nồng độ cx của nguyên tố cần phân tích trongmẫu đo phổ, rồi từ đó tính được nồng độ của nó trong mẫu phân tích

b Phương pháp thêm tiêu chuân

Nguyên tắc Phương pháp này người ta dùng ngay mẫu phân tích làm nền

đc chuẩn bị một dãy mẫu đầu, bằng cách lấy một lượng mẫu phân tích nhất định

và gia thêm vào đó những lượng nhất định của nguyên tố cần xác định theo từngbậc nồng độ (theo cấp số cộng).

c Phương pháp đồ thị không đôi

Nguyên tắc: Muốn xác định một nguyên tố nào đó, trước hét người ta

dựng một đường chuấn như phương pháp đường chuẩn, đường chuẩn này đượcgọi là đường chuẩn cố định và đường này được dùng lâu dài Như vậy muốn xácđịnh nồng độ cx chưa biết, ta phải chuyển các giá trị axi tương ứng về các giá trị

Ax0 của đường chuẩn cố định để xác định cx

d Phương pháp một mẫu chuẩn

Trong trường hợp đơn giản, chúng ta không pha một dãy mẫu chuẩn đếdựng đồ thị chuẩn, mà có thế tính ngay giá trị cx nhờ một mẫu chuẩn Ci của chấtphân tích Nghĩa là chúng ta có:

Do đó đem (a) chia cho (b) chúng ta có: cx = (Ax/A0).Ci

Như vậy khi đo được giá tri Ax và Ao ta có tỷ số của chúng, và chỉ việc

nhân nó với giá trị Ci là chúng ta có nồng độ cx phải tìm

Nhưng cần nhớ rằng, giá trị nồng độ chuẩn Co và cả nồng độ chất phântích nằm trong vùng tuyên tính của phcp đo xác định chất đó chúng ta đã biết rõtrước, thì mới có kết quả đúng đắn

1.4.1.5 Ưu nhược điểm của phương pháp [13]

Ưu điểm Đây là phcp đo có độ nhạy và độ chọn lọc cao Gần 60 nguyên

tố hóa học có thể xác định bằng phương pháp này với độ nhạy từ 1.10’4 -1.10‘5%.Đặc biệt, néu sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa thì có thể đạt tới

độ nhạy n,10"7%

Một ưu điếm lớn của phép đo là trong nhiều trường hợp không phải làmgiàu nguyên tố cần xác định trước khi phân tích Do đó tốn ít mẫu, ít thời giancũng như hóa chất tinh khiết để làm giàu mẫu Tránh được sự nhiễm bẩn khi xử

lý mẫu qua các giai đoạn phức tạp Đặc biệt là phương pháp này cho phép phântích hàng loạt mẫu với thời gian ngắn, kết quả phân tích ổn định, sai số nhỏ,được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đế xác định lượng vết kim loại

Nhược điểm: hệ thống máy AAS đắt tiền, độ nhạy của phương pháp cao

nên sự nhiễm bẩn ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phân tích hàm lượng vết vì vậydụng cụ hóa chất phải có độ tinh khiết cao Ngoài ra nhược điểm lớn nhất củaphương pháp này là chỉ cho biết thành phần nguyên tố của chất trong mẫu phântích mà không chỉ ra trạng thái hên kết của nguyên tử đó trong mẫu

1.4.2 Một số phương pháp xác định kim loại vết khác

1.4.2.1 Ph ương ph áp điện h óa

a Phương pháp cực pho [8,14]

Nguyên tắc: Người ta thay đổi liên tục và tuyến tính điện áp đặt vào 2 cực

đé khử các ion kim loại, do mỗi kim loại có thế khử khác nhau Thông qua chiềucao của đường cong Von -Ampe có thế định lượng được ion kim loại trong dungdịch ghi cực pho Vì dòng giới hạn Igh ở các điều kiện xác định tỉ lệ thuận vớinồng độ ion trong dung dịch ghi cực phố theo phương trình: I=K.C

Ưu điếm Phương pháp này cho phép xác định chất vô cơ, chất hữu cơ với

nồng độ 10'5 -H0‘ốM tùy thuộc vào cường độ và độ lặp lại của dòng dư Sai sốcủa phương pháp thường là 2-K3% với nồng độ 10~3 -H0'4M, là 5% với nồng độ10’5M (Ở điều kiện nhiệt độ không đồi)

Nhược điểm Phương pháp này có những hạn chế như ảnh hưởng của

dòng tụ điện, dòng cực đại, của oxi hòa tan, bề mặt điện cực

Nhằm loại trừ ảnh hưởng trên đồng thời tăng độ nhạy, hiện nay đã có cácphương pháp cực phổ hiện đại: cực phổ xung vi phân, cực phồ sóng vuông chúng cho phép xác định lượng vết của nhiều nguyên tố.

b Phương pháp } T on-Ampe hòa tan

về bản chất, phương pháp Von-Ampc hòa tan cũng giống như phươngpháp cực pho là dựa trên việc đo cường độ dòng để xác định nồng độ các chấttrong dung dịch

Nguyên tắc: gồm hai bước

Bước 1: Điện phân làm giàu chất cần phân tích trên bề mặt điện cực làm

việc, trong khoảng thời gian xác định, tại thế điện cực xác định

Bước 2: Hòa tan kết tủa đã được làm giàu bằng cách phân cực ngược điện

cực làm việc, đo và ghi dòng hòa tan Trên đường Von-Ampc hòa tan cho piccủa nguyên tố cần phân tích Chiều cao pic tỉ lệ thuận với nồng độ

Ưu điểm: Xác định được những chất không bị khử trên điện cực với độ

Nguyên tắc: Dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch

phức tạo thành giữa ion cần xác định với một thuốc thử hữu cơ hoặc vô cơ trongmôi trường thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng Phương pháp định lượngtheo phương trình cơ bản: A=K.C

Trong đó: A là độ hấp thụ quang của chất; K là hằng số thực nghiệm; c lànồng độ của chất phân tích

ưu điếm: Phương pháp trắc quang phân tử nói chung đặc biệt là chiết trắc

quang phức màu chelat đaligan có độ nhạy, độ ốn định, độ chính xác cao, xácđịnh nồng độ của chất ở khoảng 10'5 -M0"7M

Nhược điểm: Không chọn lọc, một thuốc thử có thể tạo nhiều phức với

Nguyên tắc: Ở điều kiện bình thường, nguyên tử không thu hay phát xạ

năng lượng, nhưng nếu bị kích thích thì các electron sẽ nhận năng lượng chuyểnlên trạng thái có năng lượng cao hơn Trạng thái này không bền, chúng có xuhướng giải phóng năng lượng đế trở về trạng thái bền vững dưới dạng các bức

xạ Các bức xạ này gọi là phố phát xạ nguyên tử Một số nguồn năng lượngthường dùng để kích thích phổ AES như: ngọn lửa đèn khí, hồ quang điện, tialửa điện

Ưu điểm: Phương pháp AES có độ nhạy cao thường (thường từ n.10"3 đếnn.l0"4%) ít tốn mẫu, có thể phân tích đồng thời nhiều nguyên tố trong cùng mộtmẫu, phân tích được lượng vết kim loại trong nước, thực phẩm, lương thực

Nhược điếm: Phương pháp này chỉ cho biết thành phần nguyên tố trong

mẫu mà không chỉ ra được trạng thái liên kết của nó trong mẫu

1.5 GIỚI THIỆU VITAMIN BI, B6 [31]

Tên gọi "vitamin" có từ năm 1912 do nhà khoa học Ba Lan Funk với ýnghĩa đó là những "amin sống" Chúng được chia thành 2 nhóm lớn

- Các vitamin tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin c, vitamin

pp, vitamin p, chủ yếu tham gia vào các quá trình liên quan tới sự giải phóngnăng lượng như quá trình oxi hoá khử, quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ

- Các vitamin tan trong dầu: Vitamin A, D, E, K tham gia vào các phảnứng tạo nên các chất có chức năng cấu trúc các mô, các cơ quan

Vitamin nhóm B là hợp chất rất quan trọng trong tế bào sống như là thànhphần cần thiết cho sự phát triền

1.5.1.1 Tỉnh chất vật lý

Vitamin BI là những tinh thể trắng hình kim hay ở dạng vẩy, có mùi đặctrưng Khi tiếp xúc với không khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm (khoảng4% nước)

pkai =2.7, pka2 = 4.8Vitamin B6 hay còn gọi là pyridoxin có tên khoa học là 3- hydroxy-4, 5dihydroxymcthyl 1-2- methylpyridin,

Cấu trúc hóa học: của 3 dạng vitamin B6

CTPT C 8HI 2 CINO 3 C 8 H 9 NO 3.HCI C 8 H 12 N 2 O 2.HCI

1.5.2.2 Tính chất hóa học của vitamin B6

Tất cả 3 chất trên đều có tính bazơ do nhân pyridin gây ra tác dụng với cácaxit tạo thành muối Chế phẩm dược dùng là pyridoxin hydroclohidrat dễ tan

trong nước, tạo muối, kết tủa với axit silicovonữamic, axitphotphovonữamic, dễhòa tan trong các dung dịch kiềm.

Vitamin B6 dễ bị oxy hóa, tác nhân xúc tác quá trình này là ánh sáng tia tửngoại, vitamin B6 tác dụng với Fe(ni) cho muối phức màu đỏ.Vitamin B6 ởdạng dẫn xuất photphat như pyridoxan photphat tham gia nhóm ngoại(coenzyme) của nhiều men như: transaminase, decacboxylase, dehydrodesylíuarase tham gia trong các quá trình chuyển hóa axit amin, lipid, glucid,chuyển protein sang glucid

1.5.3 Vai trò và nhu cầu của vitamin Bl, B6 đối với cơ thể [26]

♦♦♦ Vitamin B1

Vitamin BI chữa một số biếu hiện thần kinh, viêm dây thần kinh (do rượu,rối loạn tiêu hoá, nhiễm độc do nhiễm khuẩn ) do đau thấp khớp, zona Nhữngbệnh về tim và tiêu hoá, gan, đi lỏng, xơ gan, thoái hoá mỡ, trong những trườnghợp nhiễm khuẩn được điều trị bằng kháng sinh, salicylat, sulfamid

Nhu cầu về vitamin Bi phụ thuộc vào các điều kiện khác nhau như trạngthái sinh lý của cơ thể, chế độ thức ăn, làm việc Trung bình người cần từ 1 - 3

mg vitamin BI trong 24h

♦♦♦ Vi tam in B6

- Thiêu hụt vitamin B6 có the dẫn đến thiếu máu nguyên bào sắt, viêm dâythần kinh ngoại vi, viêm da, tăng bã nhờn, khô nứt môi Vitamin B6 dùng điều trịnhiễm độc isoniazid hoặc cycloserin

- Nhu cầu về vitamin B6 tùy thuộc vào lượng protein tiêu thụ của mỗi

người, trung bình từ 15mg trên mỗi gam protein

1.6 MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HỎN HỢP VITAMIN Bl, B6

[21,23,31]

Hiện nay có nhiều phương pháp đế nghiên cứu xác định hàm lượng hỗnhợp vitamin như: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, xác định hỗn họpvitamin bằng phương pháp phố đạo hàm bậc [31], phương pháp trắc quang

Tuy nhiên, để chọn phương pháp vừa đảm bảo độ chính xác, tính kinh tế

và tính khả thi phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm, thì trong luận văn này

chúng tôi xin chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao vì nó có nhiều ưu

điểm như: phân tích đồng thời nhiều hợp chất, không cần làm bay hơi mẫu, độ

nhạy, độ phân giải cao, nhanh chóng, dễ dàng kết nối với khối phổ

1.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [11]

Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao: Là một phương pháp tách hóa lý

dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc vàkhông đồng thời tan vào nhau, một pha động và một pha tĩnh

- Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định

- Pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn được phân chia dưới dạng tiếu phânhoặc một chất lỏng phủ lên chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đốibằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ

1.6.1.1 Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký

♦♦♦ Thời gian lưu và thể tích thế lưu: Thời gian lưu của một chất là

thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đcn khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng

độ cực đại và cho pic trên sắc ký đồ

Nếu gọi tR là thời gian lưu trữ của một chất thì: t’R= tR - to

Trong đó: t’R là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh)

to là thời gian chét (thời gian không lưu giữ)

Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất làhằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào bảnchất, cấu tạo và tính chất của chất đó Vì vậy thời gian lưu là đại lượng tính cácchất.

Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đối thì thời gian lưu cóthể thay thế bằng thể tích lưu Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cộttrong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu

mi+mmi

Hình 1.2: sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trưng

♦♦♦ Hệ số phân bố: Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất

tan giữa pha động và pha tĩnh Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng

phân bố với hê số phân bố đươc tính theo công thức: K = —

Trong đó: Cs, CM là nồng độ chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ởthời điểm cân bằng

♦♦♦ Thừa số dung lượng: Thừa số dung lượng là đại lượng biểu thị khả

năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ sốgiữa lượng chất tan trong hai pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thờiđiểm cân bằng:

♦♦♦ Hệ so chọn lọc: Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có các giá trị

k’ khác nhau, hệ số chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký

K B _ _ tRE — ^0 _ t^RB

KA k'A tRA — t0

Ở đây quy ước chất B lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy oc luôn lớn hơn

1, oc càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ Thường phân tích trong

điều kiện trong khoảng 1,5 đen 2

♦♦♦ Sô đĩa lý thuyêt và chiêu cao đĩa lý thuyêt

Hiệu lực cột thường được biểu thị qua hai thông số: số đĩa lý thuyết (N)hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H) Cột sắc ký coi như có N tầng thuyết, ở mỗi tầng

sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến trạng thái cân bằng mới Mỗi tầngđược giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H Đĩa lý thuyết được địnhnghĩa như một khu vực của hệ số phân tách mà trong đó thiết lập một cân bằngnhiệt động học giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong phađộng

Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức: N = 16 X ^ hoặc 5,54 X

Trong đó W: Chiều rộng pic ở đáy pic

Wi/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức: H =

-Trong đó L: chiều cao của cột sắc ký

Với một điều kiện sắc ký nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa

lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích

❖ Độ phân giải (R s ): Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của

các chất ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai piccạnh nhau được tính theo 1 trong 3 công thức sau:

Rs = hoặc Ị.18x(t^-tBA) hoặc ọc^Ị x _kpg_ x VN

W A +W E W.;ự2(A)+Wi/2(B) K 1+k'E 4

*♦♦ Hệ so đoi xủng (T): Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó

được tính theo công thức: T = —

Trong đó: wx: là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

A: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến chânđường cong phía trước, ở tại 1/20 chiều cao pic

*♦♦ Phương trình Van-Deemter: Phương trình Van-Deemter mô tả ảnh

hưởng của tốc độ dòng pha động và các thông số động học khác đến hiệu lực củacột sắc ký:

B

H = A H -b C x u

u