Nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 2 aryl 3 1,2,4triazol 4 ylthiazolidin 4 on

Trong những năm gần đây, triazol và các dẫn chất là một dãy chất hữu cơ đã được nghiên cứu một cách có hệ thống về mặt hóa học cũng như tác dụng sinh học.. Trong số các dẫn chất triazol

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ XUÂN HOÀNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH :CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với PGS TS Đinh Thị Thanh Hải và TS Văn Thị Mỹ Huệ, những người thầy đã tận tụy hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cám ơn PGS TS Nguyễn Quang Đạt, các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên thuộc bộ môn Hoá hữu cơ - Trường Đại học Dược Hà Nội

đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập, thực nghiệm tại bộ môn

Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu và Nhà trường đã đồng ý, hỗ trợ để tôi tham

dự khóa học Trong quá trình thực hiện luận văn tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của cá nhân, đơn vị trong và ngoài trường, tôi xin chân thành cám ơn: ThS Đào Thị Nhung, khoa Hoá - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội; các cán bộ phòng phân tích cấu trúc, khối phổ và phổ hồng ngoại, Phòng Hóa học ứng dụng - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các cán bộ Khoa Dược Lý - Viện Dược Liệu - Bộ Y tế

Cuối cùng tôi xin chân thành cám ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Hà Nội, tháng 10 năm 2015

Học viên

Ngô Xuân Hoàng

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT 2-ARYL-3-[1,2,4] TRIAZOL-4-YLTHIAZOLIDIN-4-ON 3

1.1.1 Tác dụng kháng tế bào ung thư 3

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn 7

1.1.3 Tác dụng kháng nấm 10

1.1.4 Tác dụng kháng virus và các tác dụng khác 14

1.2 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT AZOMETHIN CỦA 4-AMINO-4H-[1,2,4]TRIAZOL VÀ 2-ARYL-3-[1,2,4]- TRIAZOL-4-YL- THIAZOLIDIN-4-ON 15

1.2.1 Phương pháp tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol 15

1.2.2 Phương pháp tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol 16

1.2.3 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất 2-aryl-3-[1,2,4]triazol-4-ylthiazolidin-4-on từ các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol 20

1.3 TỔNG QUAN VỀ VI SÓNG VÀ CÁC ỨNG DỤNG TRONG TỔNG HỢP HỮU CƠ … 23

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 27

2.1.1 Hóa chất 27

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 28

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Tổng hợp hóa học 28

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.3.1 Tổng hợp các chất dự kiến 29

2.3.2 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư 29

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 34

3.1.1 Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol 34

3.1.2 Tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol 37

3.1.3 Tổng hợp các dẫn chất 2-aryl-3-[1,2,4]triazol-4-ylthiazolidin-4-on từ các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol 44

3.2 THÔNG SỐ HÓA LÝ VÀ SỐ LIỆU PHỔ 51

3.2.1 Thông số hóa lý của các chất tổng hợp được 51

3.2.2 Số liệu phổ của các chất tổng hợp được 52

3.3 THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ 56

Chương 4 BÀN LUẬN 4.1 VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC 58

4.1.1 Về phản ứng tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol 58

4.1.2 Về phản ứng tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol…… 59

4.1.3 Về phản ứng đóng vòng tạo các dẫn chất 2-aryl-3-[1,2,4]triazol-4-ylthiazolidin-4-on 60

4.2 VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 62

4.2.1 Về phổ hồng ngoại (IR) 62

4.2.2 Về phổ khối lượng (MS) 63

4.2.3 Về phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (13C-NMR) 63

4.3 VỀ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 KẾT LUẬN

2 KIẾN NGHỊ

67

67 TÀI LIỆU THAM KHẢO

H - NMR : Proton nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ proton)

HPLC : High performance liquid chromatography

Hela : Tế bào ung thư tử cung

Hep-2 : Tế bào ung thư gan người

IR : Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

PTL : Phân tử lượng

LU : Tế bào ung thư phổi người

MeOH : Methanol

MIC : Minimal Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế tối thiểu)

MS : Mass spectrometry (Phổ khối lượng)

OVCAR-8 : Tế bào ung thư buồng trứng

SKLM : Sắc ký lớp mỏng

tonc : Nhiệt độ nóng chảy

WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1: Một số thuốc điều trị ung thư có nhân triazol 4

2 Bảng 1.2: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số

dẫn chất 1,2,4-triazol trên các dòng tế bào ung thư HT29, K293,

MDA231

6

3 Bảng 1.3: Một số kháng sinh điều trị nấm chứa nhân 1,2,4-triazol 11

4 Bảng 2.1: Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 27

5 Bảng 3.1: Bảng các chất được tổng hợp theo sơ đồ tổng quát 37

6 Bảng 3.2: Hiệu suất và hằng số vật lý các chất tổng hợp được 49

7 Bảng 3.3: Kết quả đo t0nc và sắc ký lớp mỏng 51

8 Bảng 3.4: Số liệu phổ IR của các chất tổng hợp được 52

9 Bảng 3.5: Số liệu phổ khối lượng của các chất 2-16 53

14 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của hằng số thế Hammett của các nhóm

thế trong hợp phần aldehyd thơm tới hiệu suất của phản ứng

ngưng tụ tạo sản phẩm azomethin

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

1 Sơ đồ 1.1: Sơ đồ quy trình tổng hợp Anastrozol 4

2 Sơ đồ 1.2: Sơ đồ quy trình tổng hợp Letrozol 5

3 Sơ đồ 1.3: Sơ đồ quy trình tổng hợp Fluconazol 12

4 Sơ đồ 1.4: Sơ đồ quy trình tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol

theo Horning E C

16

5 Sơ đồ 1.5: Sơ đồ quy trình tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol

theo Rubtsov M V và Baichikov A G

16

6 Sơ đồ 1.6: Sơ đồ quy trình tổng hợp furazonal 19

7 Sơ đồ 1.7: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất của

2,3-diaryl-1,3-thiazolidin-4-on

20

8 Sơ đồ 1.8: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất của

thiazolidin-4-on theo Turgut Z và cộng sự

21

9 Sơ đồ 1.9: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất của

thiazolidin-4-on theo Patel H S và Patel K B

21

10 Sơ đồ 1.10: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất của

thiazolidin-4-on theo Kumar P S và cộng sự

21

11 Sơ đồ 1.11: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất của

thiazolidin-4-on theo Shah P M và cộng sự

22

12 Sơ đồ 1.12: Các giai đoạn trong phản ứng tổng hợp các dẫn chất đóng vòng thiazolidin-4-on

23

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời đại ngày nay, nền công nghệ khoa học kỹ thuật ngày càng tiên tiến, hiện đại thì cuộc sống của con người cũng ngày càng phát triển Nhưng đi đôi với điều đó là sự ô nhiễm môi trường toàn cầu ảnh hưởng tới khí hậu trái đất và môi trường sống của nhân loại Ô nhiễm môi trường sống và môi trường làm việc là một trong những nguyên nhân gây ra bệnh ung thư, một trong các căn bệnh nguy hiểm của thời đại Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO) mỗi năm có khoảng 14 triệu người mắc mới bệnh ung thư và 8 triệu người bị tử vong liên quan đến căn bệnh này [60] Các nhà khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu phát triển thuốc mới trên toàn cầu đang nỗ lực nghiên cứu tổng hợp ra nhiều dược chất đáp ứng nhu cầu chữa trị căn bệnh này

Ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam, số người bị ung thư gia tăng nhanh chóng do sự ô nhiễm nặng nề môi trường sống, môi trường làm việc Theo số liệu thống kê của Hội phòng chống ung thư Việt Nam, mỗi năm ở nước ta

có khoảng 100.000-150.000 người bị mắc mới bệnh ung thư và 70.000 người chết

vì ung thư[7] Hầu hết các loại thuốc điều trị ung thư đều phải nhập ngoại nên giá thành cao không phù hợp với điều kiện kinh tế của người bệnh Vì vậy việc nghiên cứu, sàng lọc tìm kiếm các chất mới hướng tới ứng dụng trong điều trị ung thư là một hướng nghiên cứu đang được nhiều nhà khoa học quan tâm

Trong những năm gần đây, triazol và các dẫn chất là một dãy chất hữu cơ đã được nghiên cứu một cách có hệ thống về mặt hóa học cũng như tác dụng sinh học Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã công bố cho thấy các dẫn chất triazol có các tác dụng đáng quan tâm như: kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus và chống ung thư [2],[4],[6],[19],[38] Một số dẫn chất triazol đã được đưa vào ứng dụng trong Y học đề điều trị ung thư như Anastrozol, Letrozol, Guanazol [4] Trong số các dẫn chất triazol thì các dẫn chất azomethin của 4-

amino-4-H-1,2,4-triazol với các aldehyd thơm đã được nghiên cứu cả về tổng hợp

hóa học và tác dụng sinh học, kết quả cho thấy các dẫn chất này có tác dụng sinh học đáng quan tâm Bên cạnh đó, các công trình nghiên cứu đã công bố cho thấy

các dẫn chất 4-thiazolidinon cũng thể hiện tác dụng kháng tế bào ung thư rất đáng

quan tâm Thử nghiệm kháng ung thư in vitro của hơn 1000 dẫn chất loại này cho

thấy có 167 chất có hoạt tính kháng ung thư tốt [38]

Tiếp tục các hướng nghiên cứu trên đây về tổng hợp hóa học và tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất triazol có chứa hợp phần thiazolidinon chúng

tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 2-aryl-3-[1,2,4]triazol-4-ylthiazolidin-4-on” với các mục

tiêu nghiên cứu sau đây:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất 2-aryl-3-[1,2,4]triazol-4-ylthiazolidin-4-on

2 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số chất tổng hợp được

Guanazol có công thức cấu tạo:

1.1.1 Tác dụng kháng tế bào ung thư

Để chứng minh tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất triazol, đầu tiên phải kể đến công bố của Hahn M A., Adanson R H vào năm 1972 [31] về

guanazol (3,5-diamino-1H-1,2,4-triazol) có tác dụng kháng tế bào ung thư Hoạt

chất này hiện nay đang được sử dụng trong điều trị bệnh tăng bạch cầu

Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sâu về tổng hợp hóa học

và tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất chứa hợp phần 1,2,4-triazol trong phân tử

Một số hợp chất chứa hợp phần 1,2,4-triazol đã được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong Y học để điều trị các loại ung thư khác nhau như anastrozol,

letrozol [4] được liệt kê trong bảng 1.1

Anastrozol là kết quả sàng lọc thành công của quá trình nghiên cứu tổng hợp

và sàng lọc tác dụng kháng ung thư của các dẫn chất 1H-1,2,4-triazol hướng ứng

dụng điều trị ung thư từ năm 1990 của Phillip N E và Michael S L [47] Tác giả

đã tổng hợp và thử tác dụng sinh học ức chế enzym aromatase của một số dẫn chất

1H-1,2,4-triazol có công thức tổng quát:

Kết quả cho thấy các chất thử nghiệm có tác dụng ở nồng độ ≤ 10mg/ml

Trong số các chất này đáng chú ý có hợp chất anastrozol (bảng 1.1), hiện nay đang

được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư vú ở nữ giới

Anastrozol được tổng hợp theo sơ đồ 1.1

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ quy trình tổng hợp Anastrozol

Bảng 1.1: Một số thuốc điều trị ung thư có nhân triazol

STT Tên thuốc Công thức cấu tạo Chỉ định

1 Anastrozol

Hỗ trợ cho Phụ nữ sau mãn kinh mắc bệnh ung thư vú ở giai đoạn sớm, có thụ thể eostrogen dương tính

2 Letrozol

Tiền phẫu thuật và trị liệu trong ung thư vú di căn ở nữ giới đã mãn kinh nhưng vẫn đáp ứng với receptor eostrogen hoặc progesteron dương tính

3 Guanazol Điều trị bệnh tăng bạch cầu

Cũng vào năm 1990, các nhà khoa học Robert M B và cộng sự [49] đã tổng hợp và thử tác dụng kháng enzym aromatase của một số dẫn chất 1,2,4-triazol có công thức tổng quát như sau:

Nghiên cứu này góp phần tìm ra dẫn chất letrozol (bảng 1.1), thuốc hiện nay

đang được sử dụng để điều trị ung thư vú ở nữ giới do khả năng kháng enzym aromatase, là một trong số các dẫn chất được Robert M B và cộng sự [49] tổng hợp ở trên

Hoạt chất này tiếp tục được nghiên cứu bởi Bhatnagar A.S và cộng sự [21] vào năm 1990, Demers L M vào năm 1994 [26] và Haynes B P [32] năm 2003

Các nghiên cứu nói trên đã góp phần để đưa ra được quy trình tổng hợp hóa học hoàn chỉnh của letrozol như sau:

CN N

H N N Br

CN

N N N

NC

Letrozol

Sơ đồ 1.2: Sơ đồ quy trình tổng hợp Letrozol

Một nghiên cứu khác vào năm 2010 của Paul M W và cộng sự [46] đã tổng

hợp và thử tác dụng ức chế aromatase-sulfatase của một số dẫn chất

4-amino-4H-1,2,4-triazol Kết quả một số chất thể hiện hoạt tính ức chế enzym aromatase và

sulfatase ở mức độ nanomol Các dẫn chất 4-amino-4H-1,2,4-triazol được tổng hợp

và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư trong nghiên cứu này làm phong phú thêm số lượng các dẫn chất triazol có tác dụng chống ung thư

N N

N N

CN Năm 2012, mười sáu dẫn chất của triazol đã được nhóm nghiên cứu của Eman M F và cộng sự [29] tổng hợp và thử tác dụng sinh học kháng vi sinh vật, kháng ung thư, kết quả cho thấy 5 dẫn chất được tổng hợp có tác dụng chống khối u

tử cung và tế bào ung thư vú với IC50 (2,72-5,85µg/ml)

Một nghiên cứu khác năm 2012 của Ramaprasad G C và cộng sự [48] đã thu được kết quả đáng quan tâm khi thử hoạt tính của một số dẫn chất 1,2,4-triazol trên các dòng tế bào ung thư HT29, K293, MDA231 Kết quả cụ thể như trong

bảng 1.2

Bảng 1.2: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất

1,2,4-triazol trên các dòng tế bào ung thư HT29, K293, MDA231

Công thức cấu tạo

Các dẫn chất 4-thiazolidinon cũng thể hiện tác dụng kháng ung thư đáng chú

ý Thử nghiệm kháng ung thư in vitro với hơn 1000 dẫn chất loại này cho thấy có

167 chất có hoạt tính kháng ung thư tốt [38]

Một số dẫn chất indolin-2-on chứa hợp phần 4-thiazolidinon cũng được tổng

hợp và thử độc tính trên 3 dòng tế bào ung thư HT-29, H460 và MDA-MB-231 Kết quả thu được có một số chất có độc tính đáng kể trên các dòng tế bào thử nghiệm

IC50 = 0.016 µM/L (HT-29) và 0.0037 µM/L (H460) [59]

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn

Tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất triazol đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Các dẫn chất của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với 5-nitro-furfural có tác dụng

kháng khuẩn là furazonal và furacylin, trong đó furazonal là hoạt chất có phổ kháng

khuẩn rộng, tác dụng trên các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, Salmonella typhi, Proteus vulgaris và Streptococcus pneumonia, kể cả những chủng đã kháng sulfamid và kháng kháng sinh, đã được

dùng để điều trị lỵ trực trùng [50]

:

Tiếp theo đó, vào năm 1981, Bohm R và Karow C [24] đã công bố

3-amino-1H-1,2,4-triazol có tác dụng kháng vi khuẩn gram (-):

Ngoài ra, các dẫn chất của 4-amino-3H-1,2,3-triazol cũng có tác dụng sinh

học như kháng khuẩn, kháng nấm:

Công thức cấu tạo của

3-amino-1H-1,2,4-triazol:

Năm 1994, Ozkanli F và cộng sự [44] đã phát hiện một số dẫn chất của

1-H-1,2,4-triazol acetamid có tác dụng kháng khuẩn khá mạnh đối với các chủng vi

khuẩn: S aureus, P aeruginosa, E coli và một số vi nấm: C albicans, C parapsilosis, C pseudotro-picalis và C stellatoided.

Năm 2006, Sayyed M và cộng sự [52] đã tổng hợp và thử tác dụng kháng

khuẩn của một loạt các hợp chất 2,3-diaryl-1,3-thiazolidin-4-on trên các chủng E coli, B subtillis, S typhi Theo đó một số chất thử nghiệm đã có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể

N S

O Ar R R1

R2

R3

Các hợp chất 2,3-diaryl-1,3-thiazolidin-4-on Tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 3-[4H-(1,2,4)-triazolyl]-2-aryl-1,3-

thiazolidin-4-on cũng đã được Patel H S và Patel K B công bố trong nghiên cứu năm 2008 [45]

Theo đó các dẫn chất tổng hợp được thử nghiệm trên 2 chủng vi khuẩn Gr(+)

(B subtilis, S aureus) và 3 chủng vi khuẩn Gram (-) (K promioe, S typhi và E coli) Kết quả cho thấy một số chất thử nghiệm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt

hơn chất đối chứng tetracyclin

Một số dẫn chất thiazolidin-4-on khác cũng được thử hoạt tính kháng khuẩn [42], kết quả cho thấy một số chất có tác dụng tốt hơn so với ciprofloxacin trên các

chủng E coli, S enteritidis, P aeruginosa, S aureus và B subtilis

N

S C N

H R O

Các dẫn chất 5-benzyliden-3-(pyridin-2-yl)-2-(pyridin-

2-ylimino)-thiazolidin-4-on

Trong một nghiên cứu gần đây, các dẫn chất 4-thiazolidinon đã được thử

hoạt tính kháng khuẩn trên S aureus (ATCC 25923), E coli (ATCC 25922) và kháng nấm trên C albicans (ATCC 2091) với chất đối chứng tương ứng là

ciprofloxacin và ketoconazol Các chất tổng hợp được đều thể hiện hoạt tính có

triển vọng [56]

Các dẫn chất của 4-thiazolidinon

Năm 2009, Demirbas A và các cộng sự [27] đã tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 1,3,4-thiadiazol-2-ylmethyl-1,2,4-triazol

Kết thúc công trình nghiên cứu này, các tác giả đã chỉ ra rằng các dẫn chất của 1,3,4-thiadiazol-2-ylmethyl-1,2,4-triazol có tác dụng rất tốt trên các vi khuẩn

như: E coli, Y pseudotuberculosis, P aeruginosa, Enterococcus, S aureus, B cereus

Thêm vào đó, cũng vào năm 2009, Bayrak H và cộng sự [18] đã tổng hợp 1,2,4-triazol base manich và base Schiff của chất này, thử hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được trên một số chủng vi khuẩn

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy các dẫn chất 1,2,4-triazol tổng hợp

được có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn: E coli, Y pseudotuberculosis, P aeruginosa, E faecalis, S aureus, B cereus, C tropicalis

Để góp phần tìm kiếm thêm các hoạt chất có tính kháng khuẩn cao và dược động học ưu việt, Bektas H và cộng sự [19], tiếp tục tổng hợp thêm một số dẫn 1,2,4-triazol và thử tác dụng sinh học của các chất này trên một số chủng vi sinh vật

Kết quả cho thấy rằng các chất tổng hợp được có tác dụng kháng E Coli, K pneumonia, Y pseudotuberculosis, E aerogenes, P aeurogenosa, S aureus, E faecalis, B cereus, C tropicalis, C glabrata

Tác giả Nguyễn Quang Đạt và cộng sự [6] cũng đã tổng hợp và thử tác dụng sinh học của dẫn chất 4-amino-1,2,4-triazol thì thấy chất 4-(5’-nitro-2’-furfuryliden amino)-4H-1,2,4-triazol có tác dụng mạnh trên 10 chủng vi sinh vật thử nghiệm Năm 2006, tác giả Vũ Thị Mừng [8] đã tổng hợp một số dẫn chất 5-aryliden thiazolidin-2,4-dion, trong đó có 2 chất có tác dụng trên 4 chủng vi khuẩn kiểm định

(E coli, S aureus, P aeruginosa, B subtilis)

Kết quả nghiên cứu năm 2010 của tác giả Bùi Thị Thanh Châm [5] về các

dẫn chất 5-(p-florobenzyliden)thiazolidin-2,4-dion cũng cho thấy các dẫn chất này

thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm

1.1.3 Tác dụng kháng nấm

R: là các aryl khác nhau

N N N N O N

O N

OCH3

CH2

R S

1: R: N N CH3

Là tác dụng đáng chú ý của các dẫn chất triazol Các dẫn chất triazol và các dẫn chất imidazol đã tạo thành họ thuốc azol chống nấm Tác dụng chống nấm của các azol được phát hiện từ năm 1944 nhưng mãi tới năm 1970 mới được công nhận

và nghiên cứu sâu hơn về tổng hợp hóa học, dược động học, độc tính và thử lâm sàng

Trong những năm gần đây kết quả của các nghiên cứu này đã đưa ra các thuốc chống nấm mới thuộc họ triazol được áp dụng trong điều trị [2] Các thuốc

kháng nấm họ triazol được liệt kê trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Một số kháng sinh điều trị nấm chứa nhân 1,2,4-triazol

STT Tên chất CTCT Chỉ định

1 Fluconazol

Nhiễm nấm do

Crypyococcus và Aspergillus

2 Itraconazol

Nhiễm nấm do

Candida albican, Cryptococcus neoformans và Aspergilus fumigatus

3 Voriconazol

Nhiễm nấm do

Crypyococcus và Aspergillus

4 Posaconazol Aspergillus, Candida, Nhiễm nấm do

và Cryptococcus

5 Saperconazol Cryptococcus và Nhiếm nấm do

Aspegillus

Năm 1979, 16 dẫn chất 1H-1,2,4-triazol được Jan H và các cộng sự [34]

tổng hợp và thử tác dụng chống nấm Kết quả cho thấy 8 trong số 16 chất có tác dụng kháng nấm ở liều 1,25mg/kg hoặc 2,25mg/kg

Tiếp tục hướng nghiên cứu này, năm 1980-1981, Jan H và các cộng sự [35] tiếp tục tổng hợp và sàng lọc tác dụng chống nấm của các dẫn chất tổng hợp được,

với các gốc R khác nhau và đã lựa chọn được hoạt chất itraconazol (bảng 1.3),

được sử dụng có hiệu quả trong điều trị nhiễm nấm C albican, C neoformans và A fumigatus

Các tác giả Narayanaswami S và Richardson K [43], năm 1983, đã nghiên cứu và công bố tác dụng kháng nấm của các dẫn chất triazol

Trong đó R là các dẫn chất chứa vòng thơm như naphthyl, biphenylyl, chloro-pyrid-2-yl hoặc nhóm phenyl có các vị trí được thay thế bởi F, Cl, I, CF3, hoặc C1-C4 alkoxy và X có thể là F, Br, Cl hoặc OH Kết quả cho thấy hầu hết các

5-chất tổng hợp được đều có tác dụng ức chế C albicans, C neoformans, A fumigatus, Coccidioides, Paracoccidioides, Histoplasma, Blastomyces

Kết quả của nghiên cứu trên đã góp phần tìm ra dẫn chất fluconazol, hoạt

chất này hiện nay đang được sử dụng trong điều trị nấm Crypyococcus và Aspergillus Fluconazol có thể được tổng hợp theo quy trình sau:

Sơ đồ 1.3: Sơ đồ quy trình tổng hợp Fluconazol

Stephen J R và Richardson K [55] đã tổng hợp và công bố tác dụng kháng

nấm của một loạt dẫn chất 1H-1,2,4-triazol:

Từ kết quả của những công bố này các tác giả đã tiếp tục sàng lọc, thử tác dụng sinh học và độc tính, cuối cùng đã lựa chọn được voriconazol đưa vào sử dụng

trong điều trị nấm Candida abicans, Crypotococcus neoformans, Aspergillus

furmigatus (bảng 1.1)

Năm 2001, Konosu T và cộng sự [36] đã tổng hợp các dẫn chất triazol và tiến hành thử tác dụng chống nấm của các chất tổng hợp được Hầu hết các dẫn chất này có tác dụng kháng nấm cao với MIC ≤1µg/ml

dioxin-CH

OH CH3

S

( ) Ar n N

có tác dụng chống nấm hiệu quả với MIC < 32µg/ml Các chất này được xem như là một nhóm thuốc azol chống nấm mới

Năm 2009, Mali R K và cộng sự [40] đã tiến hành thêm một nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng chống nấm của một số chất thuộc nhóm các dẫn chất 1,2,4-triazol

Với R là các aryl, các chất tổng hợp được đều có tác dụng chống nấm C albicans và A.niger tại các nồng độ 50µg/ml và 100µg/ml

Trong một nghiên cứu của Arun K.W và Arti S năm 2011, các dẫn chất

N-(aryl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)methyl-N-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)benzamid có tác dụng

ức chế sự phát triển của một số chủng vi khuẩn và nấm kiểm định [17]

Có thể thấy rằng: các azol đã bổ sung một lượng lớn vào danh mục các thuốc chống nấm vì có độc tính thấp hơn amphotericin B, có tác dụng trên nhiều loại nấm khác nhau và có các tính chất dược động học ưu việt

Cơ chế tác dụng [2],[25],[30]: Các thuốc chống nấm azol đều hoạt động theo

cơ chế tác dụng chung là ức chế enzym cytocrom P450 của nấm, các enzym này cần thiết để demethyl hóa các 14-α-methylsterol thành ergosterol Ergosterol là sterol chủ yếu của màng tế bào nấm, khi ergosterol không được tạo thành, màng tế bào nấm bị tổn thương nên thay đổi chức năng và độ thấm của màng, dẫn đến làm mất các chất quan trọng trong tế bào nấm như ion K+, các acid amin và do đó nấm bị tiêu diệt

ribavirin (1-β-D-ribofura-nosyl-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamid) [2] có công thức

cấu tạo như sau:

Ribavirin là một nucleosid kháng virus phổ rộng, chống virus cúm B khá mạnh, kháng virus hợp bào đường hô hấp (RSV), nó cũng có một số tác dụng với các loại virus khác như: herpes, thủy đậu, viêm gan, sởi

1.1.4.2 Tác dụng khác

Ngoài các tác dụng đáng kể trên người ta còn thấy các dẫn chất triazol còn có một số tác dụng có thể ứng dụng trong điều trị như tác dụng chống sốt rét, chống trầm cảm Sau đây là một số chất đã được công bố công bố [10],[24]

Các kết quả kết quả nghiên cứu trên cho thấy các dẫn chất triazol có tác dụng phong phú và đa dạng Vì vậy việc nghiên cứu tìm kiếm các dẫn chất triazol có hoạt tính sinh học cần được tiếp tục và phát triển

1.2 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT AZOMETHIN CỦA

4-AMINO-4H-[1,2,4]TRIAZOL VÀ 2-ARYL-3-[1,2,4]TRIAZOL-4-YL- THIAZOLIDIN-4-ON

1.2.1 Phương pháp tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol

4-Amino-4H-1,2,4-triazol được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1949 do

Ruhemann S và Merriman W R [51] thực hiện bằng cách đun nóng formyl hydrazin ở nhiệt độ 150-2000C, đây là phương pháp khá đơn giản và thuận lợi Về sau nhiều nhà tổng hợp hữu cơ đã nghiên cứu sâu hơn về phương pháp tổng hợp 4-

amino-4H-1,2,4-triazol

Horning E C [33] đã thực hiện phản ứng này qua 2 giai đoạn từ ethylformiat và hydrazin hydrat, các phản ứng diễn ra như sau:

Sơ đồ 1.4: Sơ đồ quy trình tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol

theo Horning E C

Rubtsov M.V và Baichikov A.G [50] đã thực hiện phản ứng tổng hợp

4-amino-4H-1,2,4-triazol từ acid formic và hydrazin hydrat Phản ứng xảy ra theo hai

giai đoạn nhưng thực hiện liên tiếp trong 1 quá trình:

Sơ đồ 1.5: Sơ đồ quy trình tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol

theo Rubtsov M V và Baichikov A G

Thông qua các phương pháp trên, trong công trình nghiên cứu này chúng tôi

tiến hành tổng hợp hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol khảo sát theo 2 phương pháp của

Rubtsov M.V., Baichikov A.G [50] và E.C Horning [33]

1.2.2 Phương pháp tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol

1.2.2.1 Phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với amin bậc 1

Phương trình tổng quát:

Đây là phản ứng cộng hợp ái nhân (AN) vào nhóm carbonyl của aldehyd thơm và đồng thời tách loại một phân tử nước, tác nhân ái nhân là H2N-Ar1, phản ứng có thể sử dụng xúc tác acid, base hoặc không dùng xúc tác

Cơ chế phản ứng [1],[3],[11]:

Phản ứng xảy ra theo 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Tác nhân ái nhân tấn công vào nhóm carbonyl của aldehyd theo

cơ chế cộng hợp ái nhân AN:

Giai đoạn 2: Phản ứng tách loại một phân tử nước theo cơ chế tách loại E1

Như vậy khả năng và tốc độ của phản ứng phụ thuộc chủ yếu vào 2 yếu tố: + Sự phân cực của liên kết đôi carbonyl (C=O) của aldehyd (-CHO) Các nhóm thế hút điện tử (có hiệu ứng -M, -I) làm tăng tốc độ phản ứng vì làm tăng sự phân cực liên kết C=O

+ Tính ái nhân của phân tử amin Các amin có tính base càng lớn thì tốc độ phản ứng càng tăng

Cơ chế phản ứng như sau:

Tốc độ đạt được cực đại khi tất cả các nhóm carbonyl được proton hóa Nhưng khi dùng tác nhân ái nhân có khả năng bị proton hóa như amin, pH để phản ứng có vận tốc cực đại phụ thuộc vào bản chất nhóm carbonyl và tác nhân nucleophin Khi đó có thể tồn tại 2 cân bằng sau:

Sự proton hóa cặp điện tử tự do ở nguyên tử N của H2N-Ar1 làm giảm khả năng ái nhân của chất này, do đó làm giảm khả năng tấn công vào carbon của nhóm carbonyl Tuy nhiên nếu proton hóa nhóm carbonyl sẽ làm tăng khả năng phản ứng của nhóm này với tác nhân ái nhân Do đó pH tối ưu đạt được khi amin bị proton hóa tối thiểu và nhóm carbonyl được proton hóa tối đa

 Phản ứng với xúc tác base

Các amin bậc 1 (tác nhân ái nhân) có tính base, có thể cộng hợp vào nhóm carbonyl mà không đòi hỏi deproton hóa, song phản ứng vẫn có thể xảy ra tốt hơn với xúc tác base vì các ion imidid (được tạo thành từ các amin do sự deproton hóa)

là các base mạnh hơn do đó làm tăng khả năng phản ứng của tác nhân này

1.2.2.2 Tổng hợp các dẫn chất azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol

Nhiều nhà nghiên cứu trong và ngoài nước đã đi sâu nghiên cứu phương

pháp tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol

 Các nghiên cứu tại nước ngoài

Ruhemann S [51] đã thực hiện phản ứng tổng hợp hợp các azomethin của

4-amino-4H-1,2,4-triazol với các aldehyd thơm trong dung môi EtOH ở nhiệt độ

phòng với xúc tác piperidin:

Với Ar-CHO là các aldehyd thơm như: benzaldehyd; 3-nitrobenzaldehyd; hydroxybenzaldehyd; p-dimethylamino benzaldehyd; furfural

2-Còn khi tạo các azomethin với các ceton thơm thì các tác giả thực hiện phản ứng trong dung môi EtOH, xúc tác piperidin, đun ở nhiệt độ sôi cách thủy:

Với:

Rubtsov M V., Baichikov A G [50] đã thực hiện phản ứng tổng hợp chế phẩm furazonal trong môi trường nước ở 15oC với sự có mặt của acid sulfuric Phản ứng xảy ra qua 2 giai đoạn sau:

- Thủy phân 5-nitrofurfuraldiacetat với xúc tác acid sulfuric để tạo 5-nitrofurfural

- Ngưng tụ 5- nitrofurfural với 4-amino-4H-1,2,4-triazol trong môi trường nước với

xúc tác sulfuric, ở nhiệt độ 15oC

Sơ đồ 1.6: Sơ đồ Quy trình tổng hợp furazonal

 Các nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 1983, Nguyễn Văn Yên [16] thực hiện phản ứng tổng hợp các

azomethin giữa 4-amino-4H-1,2,4-triazol và các aldehyd thơm, isatin trong dung

môi EtOH, trong các điều kiện thực nghiệm ở nhiệt độ phòng và đun cách thủy với xúc tác là piperidin Kết quả cho thấy phản ứng diễn ra thuận lợi hơn khi tiến hành ngưng tụ trong điều kiện nhiệt độ sôi cách

Năm 1993, Vũ Thị Hải Vân [15] đã thực hiện phản ứng tổng hợp azomethin

giữa 4-amino-4H-1,2,4-triazol và các aldehyd thơm trong dung môi EtOH, đun hồi

lưu cách thủy và xúc tác là các acid H2SO4 và HCl

Năm 2005, Nguyễn Quang Đạt và cộng sự [6] đã thực hiện phản ứng tổng

hợp azomethin giữa 4-amino-4H-1,2,4-triazol và các aldehyd thơm trong dung môi

EtOH sử dụng xúc tác là acid HCl

Trong công trình nghiên cứu này chúng tôi thực hiện các phản ứng tổng hợp

các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với các aldehyd thơm trong dung môi

EtOH, xúc tác acid HCl, sử dụng kỹ thuật vi sóng

1.2.3 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất 2-aryl-3-[1,2,4]triazol -4-yl

thiazolidin-4-on từ các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol

Năm 2006, Sayyed M và cộng sự [52] đã tổng hợp được các dẫn chất của 2,3-diaryl-1,3-thiazolidin-4-on từ các dẫn chất thế benzyliden-anilin với acid thioglycolic với chất xúc tác là kẽm clorid Phản ứng được tiến hành trong dung môi dioxan khan Tỷ lệ mol các chất phản ứng benzyliden-anilin và acid thioglycolic từ 1:1,1 đến 1:1,15 Lượng kẽm clorid dùng cho xúc tác có khối lượng

từ 3-5% so với khối lượng chất phản ứng

Sơ đồ 1.7: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất của

2,3-diaryl-1,3-thiazolidin-4-on

Hỗn hợp sau phản ứng được cất loại dung môi, chất rắn thu được đem rửa lần lượt với natri bicarbonat 5% và nước Kết tinh lại sản phẩm trong ethanol Hiệu

suất của phản ứng khá cao (76 - 87%)

Tiếp theo, năm 2007, Turgut Z và cộng sự [57] tổng hợp các dẫn chất thiazolidin-4-on bằng cách cho cả 3 chất amin thơm, aldehyd và acid thioglycolic vào đồng thời trong bình phản ứng với tỷ lệ mol là 1:2:3 Phản ứng được tiến hành

ở nhiệt độ phòng trong dung môi THF và chất xúc tác là DCC Hiệu suất của phản ứng đạt 52-73%

H3CO

H3CO

H3CO

O H

OH

O +

X

O X: CH3, Cl, OC6H5, OCH3, OC2H5

Sơ đồ 1.8: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất của thiazolidin-4-on

theo Turgut Z và cộng sự

Năm 2008, Patel H S và Patel K B [45] sử dụng chất xúc tác cho phản ứng

là ZnCl2 trong dung môi DMF, đun hồi lưu 8-9 giờ Với các gốc R khác nhau, hiệu suất phản ứng đạt 50-60 %

R = C6H5 ; 4-OH-3-OCH3-C6H3 ; 4-OH-C6 H4 ; 4-Cl-C6H4

2-OH-C6H4 ; 2-NO2-C6H4 ; 4-OCH3-C6H4 ; 5-Br-2-OH-C6H3

Sơ đồ 1.9: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất của thiazolidin-4-on theo Patel H

Phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi cloroform:benzen (1:2) Hiệu suất tổng hợp các chất đạt 65-80%

Năm 2011, Shah P M và Patel M P [53] đã tổng hợp được các dẫn chất của thiazolidn-4-on với sự có mặt đồng thời của 3 chất phản ứng là amino benzothiazol, 2-cloro-3-formylquinolin và acid thioglycolic

Sơ đồ 1.11: Sơ đồ quy trình tổng hợp các dẫn chất của thiazolidin-4-on

theo Shah P M và cộng sự

Phản ứng trải qua hai giai đoạn:

- Giai đoạn đầu tiên của phản ứng tạo imin, sau đó nhóm SH tấn công ái nhân vào nguyên tử carbon của nhóm imin

- Giai đoạn tiếp theo là đóng vòng nội phân tử, trong đó việc loại nước là yếu tố quan trọng để thu được các dẫn chất thiazolidin-4-on với hiệu suất cao Trong quy trình này chất xúc tác kẽm clorid có vai trò hút nước để làm tăng hiệu suất

Sơ đồ 1.12: Các giai đoạn trong phản ứng tổng hợp các dẫn chất đóng vòng

thiazolidin-4-on

Phản ứng được thực hiện trong dung môi ethanol, hiệu suất của phản ứng

khá cao (81 - 88%)

1.3 TỔNG QUAN VỀ VI SÓNG VÀ CÁC ỨNG DỤNG TRONG TỔNG HỢP HỮU CƠ

Vi sóng (micro-onde, microwave) là sóng cực ngắn hay còn gọi là sóng siêu tần, sóng UHF (Ultra High Frequence wave) [23]

Trong phổ điện từ (electromagnetic spectrum), vi sóng nằm ở khoảng giữa phổ, từ tần số 0,3GHz đến 300GHz, tương ứng với bước sóng trong khoảng 100cm đến 1cm, do đó vi sóng còn gọi là sóng cm

E : điện trường

λ : bước sóng (12.2 cm for 2450 MHz)

H: từ trường C: tốc độ ánh sáng

Sóng điện từ

Trong lĩnh vực ISM (Industry, Science, Medicine) trên thế giới người ta qui ước sử dụng các loại vi sóng có tần số 915, 2450, 5800, 24125MHz Trong các tần

số trên, chỉ có tần số 2450 MHz là được sử dụng rộng rãi

Hầu hết các lò vi sóng gia dụng đều sử dụng tần số 2450MHz, tần số này còn được dùng trong công nghệ nông sản, thực phẩm Sự giới hạn tần số nhằm ngăn ngừa sự gây trở ngại những tần số dành cho truyền thông

Năng lượng của vi sóng là năng lượng điện từ

Năng lượng photon của vi sóng rất thấp Tại 2450MHz, năng lượng photon của vi sóng khoảng 0,0016eV (0,037 kcal/mol), trong khi năng lượng của một liên kết hóa học là 80-120 kcal/mol (H-OH là 4,8 eV, H3C-CH3 là 3,61 eV, liên kết hydro là 0,04-0,44 eV)

Do đó vi sóng không ảnh hưởng đến cơ cấu phân tử hợp chất hữu cơ Sự kích thích phân tử của vi sóng thuần túy là về động học

Vi sóng có thể xuyên qua được không khí, gốm sứ, thủy tinh, polimer, phản chiếu trên bề mặt kim loại, lan truyền trong chân không trong áp suất cao, vô hại đối với sinh vật Khi vi sóng chạm đến vật liệu, một phần năng lượng của nó bị phản xạ trở lại, một phần đáng kể hơn sẽ bị vật liệu hấp thu Năng lượng này chuyển hóa thành nhiệt lượng và giảm dần khi nó truyền đi trong vật liệu

Nguyên tắc làm nóng vật chất của Vi sóng

Sự đun nóng bằng vi sóng là một tiến trình làm tăng nhiệt độ của vật chất một cách đặc biệt Tiến trình này không phụ thuộc vào sự dẫn nhiệt của bình chứa

và vật chất Sự tăng nhiệt cục bộ tức thời của vật chất là do sự quay lưỡng cực (dipole rotation) và sự dẫn truyền ion (ionic conduction) Đó là 2 cơ chế cơ sở của

sự chuyển năng lượng từ vi sóng sang vật chất

Nhiệt sinh ra do sự dẫn truyền ion là kết quả của sự tăng trở kháng của môi trường

chống lại sự dịch chuyển của các ion trong trường điện từ Còn cơ chế quay lưỡng cực là quá trình đổi hướng của một phân tử phân cực theo chiều của điện trường Thí dụ tại tần số 2450MHz, điện trường E của vi sóng đổi chiều 4,9.109 lần/s Dưới tác động của điện trường, các phân tử lưỡng cực có khuynh hướng sắp xếp theo chiều điện trường Do đó trong điện trường xoay chiều tần số rất cao (MHz) sẽ gây ra sự xáo trộn ma sát với vận tốc rất lớn giữa các phân

tử, đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất Ưu điểm của sự đun nóng bằng

vi sóng: không có quán tính nhiệt, năng lượng sạch, dễ chế tạo và dễ kiểm soát, nhanh chóng và có tác dụng đặc biệt với các phân tử có cực vì vậy sự đun nóng

bằng vi sóng chọn lọc, trực tiếp

Những hợp chất càng phân cực càng mau nóng dưới sự chiếu vi sóng của vi sóng Vi sóng kích hoạt những phân tử phân cực, đặc biệt là nước Nước bị đun nóng bởi sự hấp thu vi sóng và bốc hơi, tạo ra áp suất cao tại nơi tác dụng, làm cho nước di chuyển từ tâm vật chất ra bề mặt của nó Nguyên tắc này được ứng dụng trong sự sấy chiếu vi sóng bằng vi sóng

Với kết cấu có độ bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cực mạnh, do

đó nước là một chất lý tưởng, dễ đun nóng bằng vi sóng Ngoài ra, các nhóm định chức phân cực như: -OH, -COOH, -NH2 trong các hợp chất hữu cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ

Ứng dụng của vi sóng:

 Tổng hợp hữu cơ (kích hoạt phản ứng):

 Giảm thời gian phản ứng

 Giảm phản ứng phụ

 Tăng hiệu suất

 Tăng độ chọn lọc

 Hỗ trợ quá trình chiết xuất các hợp chất tự nhiên

 Hỗ trợ công việc phòng thí nghiệm:

 Sấy khô các vật dụng thủy tinh

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

1 Hóa chất

1 Hydrazin hydrat 50%, 85% Merck (Đức)

Methanol, ethyl eter, aceton, DMF, toluen, dioxan, ethylenglycol, DMSO Trung Quốc

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

Các dụng cụ thí nghiệm thủy tinh thông thường và thủy tinh dành cho phản ứng vi sóng, máy khuấy từ gia nhiệt, tủ sấy Memmert, máy cất quay, tủ sấy hút chân không Shellab, ống nghiệm, pipet định mức, pipet Pasteur, cân điện tử Shimadzu EL - 300 Lò phản ứng vi sóng Sineo Microwave Chemistry Technology (Trung Quốc), Uwave-1000

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) được tiến hành trên bản mỏng silicagel Kieselgel

60 F254 (Merck)

Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Electrothermal Digital tại bộ môn Hoá Hữu

cơ - trường Đại học Dược Hà Nội

Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin - Elmer, tại phòng đo phổ IR (Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và tại phòng thí nghiệm Hóa vật liệu – khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phổ khối lượng (MS) được ghi trên các máy Varian MS, LC-MSD

Trap-SL tại phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H - NMR và 13C - NMR) ghi trên máy Bruker

- AV500 tại phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tổng hợp hóa học

1 Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol theo phương pháp Rubtsov M V.,

Baichikov A G [50] và Horning E C [33]

2 Tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với các aldehyd

thơm sử dụng kỹ thuật vi sóng theo tài liệu [23]

3 Thực hiện phản ứng đóng vòng của các azomethin của

4-amino-4H-1,2,4-triazol với acid thioglycolic

Các phản ứng được thực hiện theo sơ đồ tổng hợp chung dưới đây:

HCOOH

t0

N N N

H2N

CHO R

N N N

CH

N N

N

N S O

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng hợp tổng quát

Tiến hành đo phổ hồng ngoại (IR), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ NMR bao gồm 1H-NMR và 13C-NMR

2.2.2 Thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số chất đã tổng hợp được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.2 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư

2.3.2.1 Phương pháp thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất 3, 4, 6, 10 (Thực hiện tại phòng Dược lý, Viện Dược liệu - Bộ Y tế)

Nguyên vật liệu thí nghiệm:

 Mẫu thử: 4 mẫu, bao gồm: 3, 4, 6, 10

 Tế bào: gồm 4 dòng tế bào

- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan)

- Dòng tế bào Hela (tế bào ung thư tử cung)

- Dòng tế bào A549 (tế bào ung thư phổi)

- Dòng tế bào OVCAR-8 (tế bào ung thư buồng trứng)

 Hóa chất:

- MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide), môi trường nuôi cấy DMEM, huyết thanh thai bò (fetal bovine serum) của hãng

in vitrogen

- Adriamycin của hãng Sigma

- DMSO của hãng sigma

- Và các hóa chất khác

 Máy móc thiết bị: máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems, kính hiển

vi soi ngược, và các máy móc khác

Phương pháp:

Nguyên tắc:

- Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983)

để đánh giá độc tính trên tế bào [41] Nguyên tắc của phương pháp như sau: MTT là

thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào Tế bào được nuôi cấy

trong một đĩa 96 giếng, đáy bằng Hợp chất MTT diphenyltetrazolium bromid, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-ủ ở 37oC, 5% CO2 Màu vàng này bị biến đổi thành formazan tím trong ty thể của những tế bào sống Khả năng hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600 nm Sự biến đổi màu chỉ xảy

ra khi enzym reductase trong ty thể là hoạt động, và do đó sự chuyển đổi có thể liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của thuốc đối với tế bào

Cách tiến hành:

- Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức

và duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết thanh bê tươi 10%, dung dịch kháng sinh 1% (penicillin 50,000 units/L

và streptomycin 50 mg/L) Tế bào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch, tế bào này được dùng làm thí nghiệm

- Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao cho nồng độ gốc của các mẫu là 2 mg/ml Tiếp theo pha thuốc nghiên cứu thành thang nồng độ gồm 5 nồng độ 100, 50, 25, 12,5 và 6,25 μg/ml Nồng độ của thuốc thử được dùng theo tiêu chuẩn sàng lọc thuốc chống ung thư có nguồn gốc dược liệu của tác giả Teicher 1997 Adriamycin được sử dụng làm chứng dương và dung dịch DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng âm

- Quy trình nuôi cấy:

1 Pha loãng tế bào ở nồng độ khoảng 2X104 tế bào/ml môi trường nuôi cấy Thêm vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng 180μl huyền dịch tế bào Để 3 giếng trống chứa môi trường nuôi cấy làm chứng trắng (blank control)

2 Các tế bào được nuôi trong môi trường ở 37oC và 5% CO2 cho phép tế bào gắn vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy Giữ tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định

3 Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 20 μl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng Mỗi nồng độ được lặp lại ở 2 giếng Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy

để thuốc được tan hoàn toàn trong môi trường

4 Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ (37oC, 5% CO2) cho phép thuốc phát huy tác dụng Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi

5 Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml

6 Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy Lắc nhẹ cho MTT khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy

7 Ủ 37oC trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa

8 Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy

9 Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO Lắc

kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn

10 Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót

Tính kết quả:

- % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau:

% Tế bào sống sót = [OD540 của tế bào được xử lý] / [OD540 của tế bào

không được xử lý thuốc] x 100%

- Cách tính giá trị IC50: Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Exell

2.3.2.2 Phương pháp thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất 11, 14, 16

(Thực hiện tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện hóa học – Viện Hàn lâm khoa học

và công nghệ Việt Nam)

Nguyên tắc: Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư người được tiến hành theo

phương pháp của Likhiwitayawuid & CS [39] hiện đang được áp dụng tại Viện

nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI)

- Dòng tế bào nghiên cứu: Dòng Hep-G2 và Lu

- Chất chuẩn dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào Ellipticin pha trong DMSO

- Đọc trên máy ELISA ở bước song 495-515 nm

ủ trong tủ ấm CO2/370C để tế bào tiếp tục phát triển

+) Sau 48 - 72h lấy ra, cố định tế bào, rửa, nhuộm và hoà lại bằng dung dịch chuẩn Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 495 - 515nm