Nghiên cứu sinh tổng hợp magnesi lactat từ lactobacillus acidophilus

Với các ưu điểm của phương pháp sinh tổng hợp, sản xuất Magnesi lactate bằng kỹ thuật lên men chìm vẫn là những đòi hỏi thiết yếu của xã hội hiện đại [8].. Với mong muốn được góp phần và

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô

giáo TS Đàm Thanh Xuân đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức

quý báu, dành nhiều thời gian, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PSG TS Nguyễn Đình Luyện, TS Nguyễn Văn Hải đã cho tôi những bài học giá trị, nhiệt tình dạy bảo và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu nghiên cứu cho tới nay

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp dược đã nhiệt tình chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học cùng các thầy cô, cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, Ban Giám hiệu trường Cao đẳng Dược TW Hải Dương đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, cho tôi gửi lời biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, khích

lệ và giúp đỡ tôi trong mọi mặt để có kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, tháng 8 năm 2015

Học viên

Nguyễn Minh Ngọc

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Magnesi lactat 3

1.1.1 Đặc điểm 3

1.1.2 Công dụng 4

1.1.3 Một số sản phẩm lưu hành trên thị trường 6

1.2 Các phương pháp sản xuất Magnesi lactat 7

1.2.1 Phương pháp tổng hợp hóa học 7

1.2.2 Phương pháp sinh học 8

1.3 Vi khuẩn sinh acid lactic 10

1.3.1 Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic 10

1.3.2 Chi Lactobacillus 11

1.3.3 Loài Lactobacillus acidophilus 11

1.3.4 Acid lactic 13

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sản xuất acid lactic 15

1.4 Các nghiên cứu về điều chế Magnesi lactat bằng phương pháp sinh tổng hợp lên men vi sinh vật 15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 22

2.1.1 Nguyên vật liệu 22

2.1.2 Thiết bị sử dụng 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Phương pháp nhân giống và nuôi cấy 26

2.3.2 Phương pháp tách chiết Magnesi lactat từ dịch lên men 26

2.3.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi sinh vật 27

2.3.4 Phương pháp tính hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat 29

2.3.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của sản phẩm 30

2.3.6 Phương pháp kiểm nghiệm Magnesi lactat 31

2.3.7 Phương pháp định lượng acid lactic 33

2.3.8 Phương pháp Schoorl – Regenbogen định lượng đường 33

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương 3 KẾT QUẢ 35

3.1 Khảo sát và lựa chọn một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men L acidophilus sinh tổng hợp Magnesi lactat 35

3.1.1 Xây dựng phương trình tương quan tuyến tính giữa độ OD600 và mật độ tế bào 35

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion Mg2+ đối với quá trình nuôi cấy L acidophilus 36

3.1.3 Lựa chọn pH thích hợp cho quá trình nuôi cấy L acidophilus 39

3.1.4 Lựa chọn cách bổ sung Magnesi carbonat vào môi trường nuôi cấy L acidophilus 40

3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH duy trì môi trường nuôi cấy đến hiệu suất thu sản phẩm 41

3.1.6 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn hydratcacbon tới hiệu suất thu sản phẩm 43

3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hiệu suất thu sản phẩm 45

3.1.8 Lựa chọn thời điểm thu sản phẩm 47

3.2 Khảo sát và lựa chọn một số phương pháp và điều kiện kết tinh thu sản phẩm Magnesi lactat 50

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp kết tinh 50

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh 52

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian kết tinh 53

3.2.4 Đề xuất quy trình xử lý dịch lên men quy mô phòng thí nghiệm 54

3.3 Xác định cấu trúc và kiểm nghiệm sản phẩm thu được 57

3.3.1 Định tính Magnesi lactat bằng sắc ký lớp mỏng 57

3.3.2 Xác định cấu trúc 57

3.3.4 Kiểm nghiệm sản phẩm Magnesi lactat 58

Chương 4 BÀN LUẬN 59

4.1 Về phương pháp đo OD600 để xác định mật độ tế bào VSV 59

4.2 Về ảnh hưởng của ionMg2+ trong môi trường nuôi cấy 60

4.3 Về điều kiện lên men sinh tổng hợp Magnesi lactat 62

4.3.1 Về ảnh hưởng của pH 62

4.3.2 Về phương pháp bổ sung MgCO3 63

4.3.3 Về các loại hydratcarbon 64

4.3.4 Về nồng độ đường glucose 65

4.3.5 Về thời gian lên men 67

4.4 Bàn luận về phương pháp tinh chế 68

4.4.1 Về phương pháp kết tinh 68

4.4.2 Về nhiệt độ kết tinh 69

4.4.3 Về thời gian kết tinh 69

4.5 Về định tính, xác định cấu trúc và kiểm nghiệm sản phẩm Magnesi lactat sinh tổng hợp 70

4.5.1.Về định tính 70

4.5.2 Về cấu trúc của sản phẩm Magnesi lactat sinh tổng hợp 71

4.5.3 Về kiểm nghiệm 71

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture Collection

(Trung tâm giữ giống Quốc gia Mỹ)

BP Bristish Pharmacopoeia (Dược Điển Anh)

DĐVN Dược Điển Việt Nam

MRS de Man, Rogosa, Sharpe

(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic)

L.acidophilus Lactobacillus acidophilus

MS Mass spectrometry (Phổ khối lượng)

OD600 Optical density (Mật độ quang tại bước sóng 600 nm) PLA Poly acid lactic

tt Thể tích

USP United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số sản phẩm chứa Magnesi lactat trên thị trường 6

Bảng 1.2 Khả năng sinh acid L – lactic và D – L lactic sau 48 giờ lên men của chủng vi khuẩn L acidophilus DSM 20079 [41] 12

Bảng 2.1 Các nguyên liệu và hóa chất 22

Bảng 2.2 Môi trường nhân giống MRS và lên men 23

Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng 24

Bảng 2.4 Các nồng độ pha loãng để xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào 29

Bảng 3.1 Kết quả xác định mật độ tế bào VSV sống bằng phương pháp đo quang và đĩa thạch 35

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ionMg2+ đến OD600 và khả năng tạo acid lactic của vi sinh vật 37

Bảng 3.3 So sánh hai phương pháp bổ sung MgCO3 vào môi trường nuôi cấy 40 Bảng 3.4 Hiệu suất thu Magnesi lactat khi nuôi cấy L acidophilus ở các pH khác nhau 42

Bảng 3.5 Hiệu suất tạo Magnesi lactat khi lên men với các loại hydratcacbon khác nhau 43

Bảng 3.6 Kết quả hiệu suất Magnesi lactat khi lên men với các nồng độ glucose khác nhau 45

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát lượng sản phẩm Magnesi lactat thu được theo thời gian 47

Bảng 3.8 So sánh các điều kiện của phản ứng hóa học và phản ứng trong điều kiện lên men tạo sản phẩm Magnesi lactat 49

Bảng 3.9 So sánh các điều kiện kết tinh khác nhau 51

Bảng 3.10 Lượng sản phẩm Magnesi lactat thu được trong các điều kiện nhiệt độ kết tinh khác nhau 53

Bảng 3.11 Lƣợng sản phẩm Magnesi lactat thu đƣợc trong các điều kiện thời gian kết tinh khác nhau 54

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Magnesi đóng một vai trò thiết yếu trong cơ thể, thiếu Magnesi có thể dẫn đến những thay đổi sinh hóa nghiêm trọng [57], [71], [72] liên quan đến các bệnh tim mạch, loãng xương và bệnh hen suyễn [39] Ngày nay, việc cung cấp Magnesi từ thức ăn hằng ngày đã giảm nhiều [60], [62] Tăng tiêu thụ các loại rau và các sản phẩm ngũ cốc góp phần cải thiện lượng Magnesi [24], [46] Tuy nhiên, đối với một số bệnh cần phải bổ sung Magnesi dưới dạng thuốc Hiệu quả của các dạng thuốc còn phụ thuộc nhiều vào sinh khả dụng của các dạng muối Magnesi [20], [52] Các dạng muối Magnesi vô cơ có sinh khả dụng dao động từ 2% (Magnesi oxyd) đến 20% (Magnesi clorua) [29], [47], [53], Magnesi hữu cơ như Magnesi L lactat có sinh khả dụng cao hơn (41%) [58] Ngoài tác dụng chữa bệnh, Magnesi lactat còn là nguyên liệu sản xuất Calci lactat, acid lactic, polylactid (nhựa sinh học PLA) là những sản phẩm thông dụng ứng dụng rộng rãi trong các ngành: dược, thực phẩm, chất dẻo

Phương pháp tổng hợp hóa học Magnesi lactat thường tạo ra dạng racemic Trong khi đó, phương pháp vi sinh có thể tạo sản phẩm dạng L với hiệu suất cao và thân thiện với môi trường Với các ưu điểm của phương pháp sinh tổng hợp, sản xuất Magnesi lactate bằng kỹ thuật lên men chìm vẫn là những đòi hỏi thiết yếu của xã hội hiện đại [8] Thị trường Việt Nam hiện nay có nhiều chế phẩm chứa Magnesi lactat, tuy nhiên nguyên liệu hoàn toàn nhập khẩu từ nước ngoài Với mong muốn được góp phần vào các nghiên cứu sản xuất

nguyên liệu trong nước, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu sinh tổng hợp

Magnesi lactat từ Lactobacillus acidophilus”, với các mục tiêu sau:

- Khảo sát và lựa chọn một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp Magnesi lactat khi nuôi cấy Lactobacillus acidophilus ở quy mô phòng thí nghiệm

3

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Magnesi lactat

1.1.1 Đặc điểm

Công thức tổng quát: C6H10MgO6

Tên khoa học: Magnesi 2 – hydroxyl propanoat

Thành phần: C 35,60%, H 4,98%, Mg 12,01%, O 47,42%

Khối lượng phân tử: 202,45g/mol

Công thức cấu tạo: gồm cation Mg2+ và 2 anion L – lactat hoặc D - lactat

Magnesi lactat là muối kết tinh của acid lactic với ion Mg2+, tồn tại trong tự nhiên dạng dihydrat (C6H10MgO6.2H2O) và trihydrat (C6H10MgO6.3H2O)

Cấu trúc không gian

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của Magnesi L - lactat

Tính chất: Magnesi lactat tồn tại dạng kết tinh màu trắng, không mùi, vị cay đắng, khó tan trong nước lạnh, tan tốt trong nước nóng (1g Magnesi lactat dạng bột tan trong 25ml nước lạnh; 3,5ml nước nóng) và hơi tan trong cồn 960[35]

4

1.1.2 Công dụng

Magnesi lactat được sử dụng trong nhiều lĩnh vực:

a Trong Y học:

- Magnesi lactat tác động lên quá trình tăng trưởng, giống như vitamin

D, nó giúp Calci và Phospho cố định trên xương Trung bình, cơ thể người lớn chứa 25 đến 30g Magnesi, trong đó khoảng 70% được cố định ở xương, 29% ở mô mềm, 1% trong huyết tương Magnesi là cation nhiều thứ hai của nội bào, tham dự vào các chuyển hóa đặc biệt của nội bào glucid, lipid, protid, cân bằng kiềm toan, ôxy hóa khử, và đóng vai trò sinh lý quan trọng, được

xác định bởi những rối loạn do thiếu hụt [11], [64]

- Magnesi lactat điều trị đau tử cung trong thai kỳ [26]

- Magnesi lactat có khả năng bảo vệ tim mạch, chỉ định dùng trong bệnh nhồi máu cơ tim [12], [16], [49]

- Magnesi lactat có vai trò quan trọng trong việc chống lão hóa [15],

c Trong công nghiệp dược phẩm:

- Magnesi lactat được sử dụng làm tá dược điều chỉnh pH

- Làm tá dược trong dập viên: Magnesi lactat sản xuất bằng phương pháp sấy phun có nhiệt độ nóng chảy cao hơn, ít dính bụi, độ trơn chảy cao, góc nghỉ thấp, cải thiện độ rã nên được sử dụng làm tá dược dập viên, tá dược

5

trong sản phẩm mĩ phẩm: sản phẩm chăm sóc da, chăm sóc răng miệng… [48]

d Trong công nghiệp khác:

- Magnesi lactat là tiền sản phẩm trong công nghiệp lên men sản xuất acid lactic, các muối lactat khác, tiêu biểu nhƣ Calci lactat acid lactic và các dẫn

xuất của nó (polylactid - nhựa sinh học PLA) đƣợc dùng rộng rãi trong công

nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm, công nghiệp dệt, tổng hợp vecni, chất dẻo, nhựa gia công bằng nhiệt

- Magnesi lactat còn đƣợc sử dụng để tham gia vào chế tạo các linh kiện điện tử, thiết bị kĩ thuật (máy tính xách tay, máy tính bảng…) [48]

6

1.1.3 Một số sản phẩm lưu hành trên thị trường

Bảng 1.1 Một số sản phẩm ch a Magnesi lactat trên thị trường

Nyche Pharmaceutical, Southlake

3 Magne B6

Stada

Ống dung dịch uống

10 ml

Magnesi lactat dihydrat

180 mg Magnesi pidolat

936 mg Pyridoxin hydroclorid

10,0 mg

Stada

4 Magnesi B6

Viên nén bao phim Magnesi lactat dihydrat

470 mg Pyridoxin hydroclorid

5 mg

Công Ty Cổ Phần Dƣợc Hậu Giang

Calci lactobionat 6,40 g Magnesi lactat dihydrat

5,00 g

Hasco

Phương pháp tổng hợp hóa học có ưu điểm là: Dễ thu được Magnesi lactat từ acid lactic, trong đó acid lactic lại được tổng hợp nhiều nguồn khác nhau [7], [6]; Chi phí sản xuất thấp; Thời gian ngắn tổng hợp ngắn

 Cộng hợp ái nhân với tác nhân HCN từ nguồn acetaldehyd

Acetaldehyd hydrogen cyanid lactonitril

 Thủy phân bằng acid sulfuric

CH3CHOHCN + H2O + 1/2H2SO4 CH3CHOHCOOH + (NH4)2SO4

 Ester hóa

CH3CHOHCOOH + CH3OH CH3CHOHCOOCH3 + H2O Acid lactic methanol methyl lactat

 Thủy phân bằng nước

CH3CHOHCOO CH3 + H2O CH3CHOHCOOCH3 + CH3OH

Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm: Tổng hợp Magnesi lactat theo phương pháp này thường tạo dạng muối của Magnesi với acid D (-) lactic và acid racemic D,L lactic Đây là các dạng gây hại với sức khỏe con người nên ít dùng Việc cải tiến kỹ thuật để tạo sản phẩm tự nhiên muối của Magnesi với acid L (+) lactic vẫn luôn được tích cực nghiên cứu [13], [23], [54], [56], [74]

8

1.2.2 Phương pháp sinh học

Hình 1.1 Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) và dị hình

(heterolactic) [7]

9

Cơ sở của phương pháp sinh học là tiến hành lên men trong điều kiện

kị khí hoặc vi hiếu khí với các chủng vi sinh vật sinh acid lactic Acid lactic được tạo thành từ sự chuyển hóa mono hoặc disaccharid bước đầu đi theo con đường Embden – Mayerhoff (hình 1.1) Sau đó, dưới điều kiện kỵ khí, acid piruvic sinh ra sẽ được khử hóa thành acid lactic dưới tác dụng của enzym lactat dehydrodenase Lactat dehydrogenase (LDH) của các vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành L(+) hay D(-) acid lactic do khả

năng lập thể hóa của sản phẩm (do gen ldhD hay ldhL quy định), tùy theo

chủng vi khuẩn lactic có loại gen nào thì sẽ cho sản phẩm tương ứng Gen mã

hóa enzym L(+) lactat dehydrogenase được nghiên cứu trên Lactobacilus platarum Gen mã hóa enzym D(-) lactat dehydrogenase được nghiên cứu trên Lactobacilus johnsonii [7]

Cả hai dạng lên men tạo acid lactic từ hydratcarbon là đồng hình (homolactic) hay dị hình (heterolactic) Lên men lactic đồng hình khi lượng acid lactic chiếm đại đa số do vi khuẩn lactic loại này có enzym aldolase nhưng không có enzym phosphoketolase Lên men dị hình khi lượng acid lactic chiếm tỷ lệ thấp, đi kèm với hỗn hợp các chất khác như acid lactic, acid formic hoặc CO2, do vi khuẩn lactic không có enzym aldolase nhưng có enzym phosphoketolase [7] Việc bổ sung các hợp chất Magnesi vào môi trường lên men sẽ tạo ra muối Magnesi lactat tan trong môi trường lên men Sau khoảng thời gian thích hợp tiến hành thu dịch lên men, xử lý dịch lên men, kết tinh và tinh chế để thu sản phẩm Thực chất phương pháp lên men vi sinh vật tạo Magnesi lactat là quá trình lên men tạo acid lactic [14], [18], [19], [38], [42], [54]

Phương pháp sinh tổng hợp Magnesi lactat từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp tổng hợp hóa học [36], [51]:

- An toàn với môi trường do các dư phẩm của quá trình được tận dụng để làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc hoặc phân bón

- Có khả năng tạo được sản phẩm tinh khiết dạng Magnesi L - lactat

1.3 Vi khuẩn sinh acid lactic

1.3.1 Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic

Vi khuẩn sinh Lactic gồm các trực khuẩn hay cầu khuẩn Gram (+), tỉ lệ

GC (guanin và cystein) thấp, chịu được acid, thường không sinh nha bào, kị khí hoặc vi hiếu khí, được phân nhóm dựa vào đặc điểm chung trong quá trình trao đổi chất và các đặc tính sinh lý Ban đầu, các vi khuẩn này được tìm thấy trong thực vật đã phân hủy và các sản phẩm của acid lactic Điểm chung lớn nhất của vi khuẩn nhóm này là sự lên men hydratcarbon sinh ra acid lactic là sản phẩm trao đổi chất cuối cùng [5], [43]

Vi khuẩn sinh Lactic chủ yếu thuộc 4 chi: Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Leuconostoc; ngoài ra có một số loài nấm thuộc chi Rhizopus [1] Hình dạng và kích thước của vi khuẩn sinh Lactic rất đa dạng và phức

tạp: hình cầu, hình oval, hình que, mọc đơn, mọc đôi hoặc mọc thành chuỗi Sinh lý của vi khuẩn Lactic khá giống nhau, chúng là các vi khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, hầu như không di động, ưa nhiệt, là vi khuẩn yếm khí hoặc

vi hiếu khí, sử dụng năng lượng từ phân giải glucid và tiết ra acid lactic Chúng phát triển và tồn tại tốt ở pH thấp (4,5 – 6,8), nhiệt độ khoảng 10 –

500C [1], [5] Vi khuẩn Lactic là vi khuẩn dị dưỡng nên môi trường dinh dưỡng tương đối phức tạp, giàu chất dinh dưỡng, gồm: các vitamin, các acid amin, các peptid ngắn… Chúng có khả năng đồng hóa nhiều loại đường: glucose, saccarose, lactose, mantose… một vài loài cũng có khả năng sử dụng đường cao phân tử [1]

11

1.3.2 Chi Lactobacillus

Là chi lớn nhất trong các vi khuẩn sinh Lactic với đặc điểm: là trực khuẩn, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc, catalase (-), không sinh

H2S, aminoacid chủ yếu của peptidoglycan là L–Lysin, m–DAP hay ormitin,

có thể sinh trưởng ở pH 4,5, lên men glucose sinh L(+), D(-) và DL lactic Chi

Lactobacillus được phát hiện với hơn 125 loài, dựa vào sự chuyển hóa glucid

trong tế bào và sản phẩm tạo ra trong quá trình lên men, có 3 nhóm chính [5]:

 Nhóm 1: Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men chủ yếu là acid lactic (90 - 98%), các sản phẩm khác chỉ tồn

tại dạng vết nhỏ Đại diện: L acidophilus, L bulgaricus, L delbrueckii…

 Nhóm 2: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình không bắt buộc, sản phẩm của quá trình lên men có thể là acid lactic, acid acetic, acid formic, ethanol

Đại diện: L plantarum, L casei, L leichmannii…

 Nhóm 3: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc, sản phẩm cuối cùng

là acid lactic, acid acetic, carbonic, ethanol Đại diện: L brevis, L fermentum,

L buchneri…

1.3.3 Loài Lactobacillus acidophilus

Loài L acidophilus thuộc giới vi khuẩn, ngành Fermicutes, lớp bacilli,

bộ lactobacilliales, họ lactobacillaceae, giống Lactobacillus [5]

Hình 1.2 L acidophilus dưới kính hiển vi quang học (a), kính hiển vi

điện tử (b)[5]

12

L acidophilus là trực khuẩn Gram (+), dạng hình que, hay hình cầu,

kích thước 0,6 – 0,9 x 1,5 – 6,0 μm , mọc đơn, mọc đôi hoặc tạo chuỗi ngắn, không có lông roi, không sinh bào tử, không di động, phản ứng catalase âm tính, không ưa muối, ưa acid, phát triển tốt trong điều kiện sức căng bề mặt

thấp và có khả năng kháng lysozym, hô hấp hiếu khí và kị khí nhưng chủ yếu

là kị khí; do đó môi trường nuôi cấy thường là kị khí hoặc là giảm áp oxy với

5 – 10 % CO2, là vi khuẩn có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao (ở 45oC), tuy nhiên nhiệt độ tối ưu để phát triển là 370C, không phát triển trong khoảng 20 – 22o

C Là đại diện chính của nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, nó có khả năng chịu được điều kiện môi trường acid trong khoảng pH 5 - 6 trong thời gian 24

– 36 giờ [1], [5] L acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lên men đồng hình có

khả năng chuyển hóa hydratcarbon: fructose, galactose, glucose, lactose, maltose, mannose, sucrose và trehalose cho sản phẩm là L (+) Lactic [5], [31], [32], [41] và chúng có thể lên men ở các nồng độ khác nhau của các loại đường đó [7], [33] Bảng 1.2 sau chỉ ra khả năng sinh dạng D/L phụ thuộc vào loại đường lên men

Bảng 1.2 Khả năng sinh acid L – lactic và D – L lactic sau 48 giờ lên men của chủng vi khuẩn L acidophilus DSM 20079 [41]

L - lactic giảm còn 58% nếu duy trì pH = 6 VSV phát triển tốt ở pH 6 đến

6,6 Tuy nhiên ở pH 6,6 lại cho nhiều dạng L - lactic hơn [31]

L acidophilus là “probiotic”, chúng là các vi khuẩn có lợi trong hệ

thống tiêu hóa giúp chống lại vi khuẩn có hại gây bệnh, góp phần duy trì hệ vi

khuẩn có lợi L acidophilus được phân lập từ dịch ruột trẻ em và dịch ruột bê Hiện nay, L acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm men tiêu

hóa như: Antibio, Lactomin… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa ở trẻ mới ăn dặm hoặc do dùng kháng sinh dài ngày [9]

1.3.4 Acid lactic

 Cấu trúc của acid lactic

+ Công thức tổng quát: C3H6O3

+ Khối lượng phân tử: 90,08

+ Công thức cấu tạo:

+ Các dạng của acid lactic: do trong phân tử của acid lactic có 1 carbon bất đối nên acid lactic có 1 cặp đối quang: acid D (-) Lactic, acid L (+) Lactic

Acid D (-) Lactic Acid L (+) Lactic

14

Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau

+ Cấu trúc không gian:

Acid D (-) lactic Acid L (+) lactic

Các acid lactic có tính quang hoạt khi bị ánh sáng phân cực đi qua, các dạng phân cực có thể chuyển thành dạng acid racemic dưới tác dụng của enzym racemase từ một vài loài vi khuẩn lactic Nếu D-acid lactic và L-acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50 người ta gọi là hỗn hợp racemic Hỗn hợp này được kí hiệu là DL-acid lactic Trong quá trình lên men không

có một hỗn hợp lý tưởng này mà chỉ có được khi tiến hành tổng hợp hữu cơ [44]

+ Tính chất của acid lactic:

Dạng dung dịch: acid lactic là chất lỏng trong suốt, không màu, không mùi, vị chua đặc trưng, tan tốt trong nước, không bay hơi

Dạng tinh thể: dễ tan ở áp suất khí quyển tạo chất lỏng

Ở pha lỏng: acid lactic dễ chuyển sang dạng dime mạch thẳng lactoyl lactat và polyme mạch thẳng cao hơn, khi đó nhóm hydroxyl của phân tử này liên kết ester với nhóm carbonyl của phân tử khác Dạng dimer mạch vòng lactic cũng có thể được hình thành nếu được thực hiện đun nóng kéo dài

Acid lactic là một chất có độ hút ẩm cao là chất lỏng sánh đặc có sẵn trên thị trường ở những dạng khác nhau về chất lượng; và phụ thuộc vào độ tinh sạch có nhiều tiêu chuẩn khác nhau: acid lactic kỹ thuật, thực phẩm, dược

15

phẩm và acid lactic plastic Ở dạng đồng phần D-acid lactic hoặc L-acid lactic lần lượt có nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ sôi là 28 và 1030

C Một tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của acid lactic tinh sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ: không màu tạo thành khi làm nóng dung dịch 80% acid lactic đến 180o

C[44]

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sản xuất acid lactic

Sản xuất công nghiệp acid lactic được bắt đầu từ cuối thế kỉ 19 Avery

là người đầu tiên tìm ra cách sản xuất acid lactic ở quy mô thương mại ở Littleton (Mỹ) vào năm 1881, nhưng không thành công Nhà máy đầu tiên thực sự mang lại thành công đã được Boehringer xây dựng vào năm 1895 ở Ingelheim thuộc nước Đức [2], [7],[44]

1.3.5.1 Chủng vi khuẩn lên men

Các chủng vi khuẩn lacitc đang được sử dụng nhiều trong công nghệ vi

sinh để sản xuất acid lactic, nhất là Lactobacillus delbrueckii Ngoài ra L acidophilus, L plantarum, L bulgarius, các giống Bacillus (B coagulans), Rhizopus (R oryzae) và Streptococcus cũng được sử dụng, có thể phối hợp các vi khuẩn lactic hoặc phối hợp với vi khuẩn khác như Streptococcus thermophilus trong quá trình lên men Việc lựa chọn loại vi khuẩn lactic tùy theo khả năng sử dụng hydratcarbon của chúng Lactobacillus delbrueckii có thể lên men cho acid lactic từ saccarose, L.bulgarius có thể lên men cho acid lactic từ lactose L helveticus, L amylophylus thì có thể sử dụng cả hai, R oryaze có thể sử dụng trực tiếp tinh bột Hiện nay, trong công nghiệp sử dụng

những chủng đột biến theo hướng sản xuất mạnh acid lactic nhưng không bị

ức chế bởi nồng độ cao chất này trong môi trường nuôi cấy so với chủng

hoang dại [7] Trong phạm vi luận văn, nghiên cứu chọn loài L acidophilus

để thực hiện quá trình lên men tổng hợp acid lactic và Magnesi lactat

1.3.5.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

Trong nghiên cứu vi khuẩn lactic, thường sử dụng các môi trường như: MRS, môi trường cao nấm men, nước chiết cà chua, môi trường sữa, huyết

16

thanh sữa… Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng Chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng chứa các thành phần: nguồn cacbon, nguồn nitơ, vitamin, muối khoáng và các nguyên tố vi lượng

- Nguồn Hydratcarbon: vi khuẩn lactic sử dụng nguồn năng lượng chính từ các nguồn đường mono- và disaccharid như glucose, lactose, sacarose, maltose và các acid hữu cơ như acid citric, malic, pyruvic, fumaric, làm nguồn năng lượng và trao đổi cấu trúc Khi không có mặt cơ chất nguồn cacbon vi khuẩn sẽ sử dụng nguồn năng lượng và vật liệu tế bào là các acid amin (acid glutamic, arginin, tirozin, ) và giải phóng CO2[2]

Trong lên men công nghiệp, nồng độ hydratcarbon thường dùng từ 5 – 20% Khi lên men liên lục thường sử dụng nồng độ cơ chất glucose 6g/100ml, saccrose là 1,82 g/100ml Việc sử dụng tinh bột giúp giảm giá thành nhưng cần xử lý trước enzym để biến đổi đến maltose và glucose [7]

- Dinh dưỡng nitơ: theo nhu cầu nguồn dinh dưỡng nitơ vi khuẩn lactic

Do L acidophilus không có khả năng tổng hợp được các dạng nitơ hữu

cơ phức tạp, vì vậy chúng cần hỗn hợp các acid amin, dịch thủy phân protein

từ casein, bột đậu tương Một số nghiên cứu thường sử dụng các nguồn chứa nitơ phổ biến như: cao nấm men và pepton Nguồn nitơ giúp vi khuẩn tăng trưởng đáng kể do vậy lượng acid lactic sinh ra cũng tăng theo [2], [7]

- Nguồn vitamin: vi khuẩn lactic nói chung, đặc biệt là trực khuẩn rất cần vitamin làm nguồn chất sinh trưởng [7]

17

- Các hợp chất khác: các chất vô cơ Cu, Fe, Na, P, I2, S, Mn, đặc biệt là

Mn có tác dụng phòng chống tế bào bị tự phân Khi vi khuẩn đã kém hoạt lực

có thể cho chúng hoạt hóa ở môi trường đã được bổ sung những ion K+

cùng

Mg2+ hoặc Mn2+ Mặt khác, khi nồng độ muối cao (> 6,5%) hoặc khi có mặt các chất kháng sinh (penicillin, chloramphenicol…) có thể ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Vì vậy, cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men [2]

Các nghiên cứu trước [6], thường chọn môi trường nuôi cấy chủng vi

khuẩn L acidophilus để sinh tổng hợp Magnesi lactat là MRS có bổ sung

2,5% sữa và chỉ chọn khảo sát các yếu tố: loại hydratcarbon, nồng độ glucose, nồng độ ion Mg2+

1.3.5.3 Ảnh hưởng của oxy không khí

Oxy quyết định chiều hướng lên men diễn ra theo kiểu yếm khí hay kỵ khí Quan hệ giữa các loài vi khuẩn với oxy ở mức độ hiếu khí của môi trường khác nhau là khác nhau Trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt chỉ làm cho trực khuẩn lên men dị hình chậm phát triển khi ban đầu, còn đối với trực khuẩn lên men đồng hình sinh trưởng bị giảm 10%, lên men giảm 23% [2] Các loài lên men dị hình sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện kị khí Vi khuẩn lactic thuộc nhóm đặc biệt Khi tế bào tiếp xúc với oxy không khí nó sẽ sinh

ra H2O2, một chất độc đối với tế bào Chất loại bỏ H2O2 hữu hiệu nhất là enzym catalase Tuy nhiên, rất ít loài vi khuẩn có khả năng tạo ra enzyme này,

chúng thường chỉ có enzym peroxydase nhưng hiệu quả kém hơn Do đó L acidophilus phát triển tốt nhất khi nồng độ oxy có mặt trong môi trường thấp

hoặc hoàn toàn không có O2 Trong quá trình lên men lactic cần thực hiện quá trình lên men yếm khí để thu nhận sản phẩm đạt hiệu quả cao nhất (nuôi cấy trong tủ ấm có 5% CO2)

18

1.3.5.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ của môi trường có ảnh hưởng sâu sắc đến hoạt động sống của

tế bào vi khuẩn Nếu nhiệt độ quá thấp sẽ gây ức chế đến sự sinh trưởng của

tế bào, thời gian lên men chậm, hiệu suất lên men thấp Nếu nhiệt độ quá cao ngoài việc gây ức chế còn có thể gây chết tế bào Đại bộ phận vi khuẩn lactic

bị chết từ 45oC trở lên [2], Lactobacillus acidophilus ở nhiệt độ 37o

C phát triển và hoạt động mạnh mẽ

1.3.5.5 pH môi trường

Các chủng vi khuẩn lactic chịu được pH thấp khác nhau, đối với vi khuẩn tách từ rượu vang có thể chịu được ph= 3 ÷ 3.5 hoặc thấp hơn, các chủng loại tách từ dưa, mắm chua chịu được pH= 3,7 trở lên Các cầu khuẩn lên men dị hình chịu được acid nhiều nhất, ít hơn là các trực khuẩn lên men dị hình Các trực khuẩn lên men đồng hình chiếm vị trí trung gian [2]

1.3.5.6 Ảnh hưởng của nồng độ acid

Acid lactic là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày càng nhiều sẽ làm ức chế sự phát triển của chúng Điều này giải thích được sự thay đổi hình thái của vi khuẩn lactic khi ủ chua thức ăn hay ủ chua rau quả Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường, không bị chính các sản phẩm do chính bản thân chúng tạo ra ức chế, người ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng vừa đủ để trung hoà lượng acid sinh ra [2] Trong sản xuất acid lactic, thường dùng chất đệm là CaCO3 để chuyển acid lactic sang dạng calci lactat [6], sau đó là quá trình xử lý với Magnesi hydroxid để thu Magnesi lactat [19] hoặc MgCO3 sử dụng trực tiếp làm chất trung hòa acid [14], [37], [38], [42], [54] MgCO3 thường được lựa chọn do là một nguyên liệu sẵn có và giá cả hợp lý

19

1.3.5.7 Giai đoạn nhân giống

Muốn thực hiện một quá trình lên men phải tiến hành nhân giống, đảm bảo số lượng tế bào với tuổi sinh lí đang ở thời kỳ hoạt động mạnh nhất để cấy vào môi trường lên men Nhân giống ở đây có thể phải qua 2-3 bước, ta thường gọi là nhân giống cấp 1, cấp 2, cấp 3 tuỳ thuộc vào quy mô sản xuất Việc nhân giống thường diễn ra bằng cách nuôi chìm Các điều kiện nuôi được lựa chọn sao cho chỉ xảy ra sự sinh trưởng chứ không xảy ra sự tạo thành sản phẩm Nếu tạo sản phẩm thì chất lượng giống khi đi vào quy mô công nghiệp sẽ giảm hoạt tính Canh trường nhân giống vi khuẩn là canh trường thuần khiết đi từ một tế bào ban đầu, đảm bảo các yêu cầu công nghệ như sau:

+ Dịch giống không được tạp nhiễm

+ Các tế bào đảm bảo ở độ tuổi sinh lí ở thời gian sinh trưởng tốt nhất,

có hoạt tính cao nhất, thường là nữa sau của pha log

+ Các thông số kĩ thuật như pH, màu sắc, mùi vị đúng như quy định của dây chuyền công nghệ

+ Khi lượng giống đảm bảo về số lượng tế bào: 106 tế bào/ml [2] 1.3.5.8 Các yếu tố khác

Sau khi lên men, thu sản phẩm đến giai đoạn tinh chế, còn rất nhiều yếu

tố ảnh hưởng: thời gian diệt tết bào, nhiệt độ bay hơi dung môi, thiết bị bay hơi dung môi, nhiệt độ kết tinh, thời gian kết tinh, đường kính lỗ lọc…

1.4 Các nghiên cứu về điều chế Magnesi lactat bằng phương pháp sinh tổng hợp lên men vi sinh vật

Peter Johannes Marie Baets và các cộng sự (2013) đã sản xuất Magnesi

lactat bằng cách lên men vi khuẩn sinh lactic B coagulans trong môi trường chứa nguồn nguyên liệu thực vật, lá cây Cọ dầu nhiệt đới (Elaeis guineen-sis

và Elaeis oleifera), có chứa 0,5% đến 9,5% carbohydrat và Magnesi hydroxyd

để thu được 9,5% Magnesi lactat [54]

20

Jan Van Krieken và các cộng sự (2007) đã điều chế Magnesi lactat bằng cách sử dụng một trong các hợp chất của Magnesi là Magnesi hydroxyd, Magnesi oxyd, Magnesi carbonat duy trì môi trường lên men các carbohydrat

ở pH 5 – 7 với chủng vi khuẩn thích hợp [38]

Jan Van Krieken và các cộng sự (2005) đã kết tinh được Magnesi lactat rất tinh khiết từ dịch lên men nguồn carbohydrat tương đối thô: sucrose, tinh bột (lỏng), rỉ đường Sử dụng Magnesi hydroxyd làm tác nhân trung hòa [37]

Ben - Yoseph Eliahu và các cộng sự (1999) sản xuất Magnesi lactat từ

vi sinh vật bằng phương pháp lên men đường, điều chỉnh pH về 6,5 bằng cách thêm Magnesi hydroxyd, nhiệt độ 50°C [18]

Aharon Meir Eyal, Rod Fisher (1998) sản xuất Magnesi lactat thông qua việc sinh tổng hợp acid lactic trong quá trình lên men của vi khuẩn thuộc

chi Lactobacillus, loài Lactobacillus delbrueckii, hoặc Lactobacillus acidophilus Nguyên liệu chính là các carbohydrat cùng với các nguồn dinh

dưỡng phù hợp Độ pH của dịch lên men thường được duy trì trên 4,5, tốt nhất khoảng 6,0 - 6,5 bằng các muối Magnesi carbonat, bicarbonat của các kim loại kiềm thổ (Calci hoặc Magnesi) [14]

Kolomaznik và các cộng sự (1995) nghiên cứu sản xuất Magnesi lactat bằng cách lên men vi khuẩn, bổ sung Magnesi hydroxyd, Magnesi oxyd, Magnesi carbonat trong quá trình lên men lactose tại pH 4,5 – 5,03 [42]

Bode Harold Eli và các cộng sự (1969) điều chế Magnesi lactat bằng phương pháp lên men rỉ đường, sữa, mía, mật đường củ cải, hoặc polyme monosaccharide thô khác nhau như tinh bột, dextrin, cellulose, sucrose và pentosans đã được thủy phân Tạo Magnesi lactat thông qua Calci lactat bằng cách thêm Magnesi hydroxyd vào giai đoạn kết thúc quá trình lên men [19]

Ngoài các nghiên cứu về sinh tổng hợp, Magnesi lactat còn được tổng hợp bằng phương pháp hóa học dùng làm nguyên liệu trong công nghệ thực phẩm, tổng hợp Magnesi lactat từ acid lactic và Mg(OH)2 [13], [23], [74]

21

Mặc dù Magnesi lactat đã và đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣng hiện tại Việt Nam chƣa có nghiên cứu quy trình sản xuất đã công bố nào liên quan đến sản xuất Magnesi lactat nên đây cũng là lý do mà chúng tôi thực hiện đề tài này

22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ P ƯƠNG P ÁP NG IÊN CỨU 2.1 Nguy n vật liệu, thiết ị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Chủng giống: Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 dạng đông khô

Nguyên liệu và hóa chất

Bảng 2.1 Các nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc

(NH4)2SO4 Trung Quốc

MnSO4.H2O Trung Quốc FeSO4.7H2O Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung Quốc

Bản mỏng silicagel Merck – Đức

NaK(C4H4O6) Trung Quốc

H2SO4 98% Trung Quốc

Na2S2O3 Trung Quốc

23

Môi trường nuôi cấy sử dụng:

Bảng 2.2 Môi trường nhân giống MRS và lên men

 Môi trường nhân giống MSR

MnSO4.H2O 0,001g FeSO4.7H2O 0,001g MgSO4.7H2O 0,03g Nước máy vđ 100ml Điều chỉnh pH = 6,3 – 6,5

Môi trường MRS đặc: Môi trường MRS lỏng + 2,0g thạch

Chất chuẩn sử dụng: Viên nén Magnesi B6 của công ty Mekophar, Việt Nam

Số lô: 13003AN, ngày sản xuất 04/07/2013

Các dung dịch sử dụng: được pha theo hướng dẫn của DĐVN IV:

 Dung dịch acid oxalic 10%: Hòa tan 10g acid oxalic trong nước và thêm nước vừa đủ 100 ml

 Dung dịch Schoorl A: Cân chính xác 34,66g CuSO4.5H2O, hòa tan trong nước đã acid hóa bằng 2-3 giọt H2SO4 loãng Thêm nước vừa đủ 500ml

 Dung dịch Schoorl B: Cân 173g muối kép Natri kali tactrat NaK(C4H4O6) và 50g NaOH, hòa tan trong 300ml H2O, để nguội, thêm H2O vừa đủ 500ml

24

 Dung dịch H2SO4 25%: Đong chính xác 71ml H2SO4 98% pha với chính xác 500ml H2O, làm nguội

 Dung dịch Na2S2O3 0,1N: Cân chính xác 25,0g Na2S2O3 và 0,2g

Na2CO3 hòa tan trong nước cất không có CO2, thêm H2O vừa đủ 1000ml

 Dung dịch HCl 0,01M: Pha loãng 2,4 ml axit hydrocloric với nước vừa

Máy đo pH Eutech instrument pH150 (Anh)

2.2 Nội ung nghi n ứu

2.2.1 Khảo sát và lựa chọn một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp Magnesi lactat quy mô phòng thí nghiệm

 Xây dựng phương trình tương quan tuyến tính giữa giá trị OD600 và mật

độ tế bào

 Khảo sát ảnh hưởng của ion Mg2+ đối với quá trình nuôi cấy L acidophilus

25

 Khảo sát và lựa chọn phương thức bổ sung Magnesi cacbonat

- Bắt đầu quá trình lên men

- Trong quá trình lên men

 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy: 5 - 7

 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon: glucose, lactose, saccarose, maltose

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose: 2% - 11%

 Lựa chọn thời điểm thích hợp thu sản phẩm

2.2.2 Khảo sát và lựa chọn một số phương pháp và điều kiện kết tinh thu sản phẩm Magnesi lactat

 Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp kết tinh: tự kết tinh, tạo mầm

 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh: 0 – 4oC, 25 – 30oC, 37oC

 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian kết tinh: 1 giờ, 6 giờ, 18 giờ, 24 giờ,

48 giờ

 Đề xuất quy trình xử lý dịch lên men quy mô phòng thí nghiệm

2.2.3 Xác định cấu trúc và kiểm nghiệm Magnesi lactat theo tiêu chuẩn Dược Điển Anh 2010

 Xác định cấu trúc hóa học: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân

tử (MS), cộng hưởng từ proton (1H-NMR) và xác định công thức muối ngậm nước

 Kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dược Điển Anh 2010

26

2.3 Phương pháp nghi n ứu

2.3.1 Phương pháp nhân giống và nuôi cấy

2.3.1.1 Phương pháp nhân giống:

Môi trường nhân giống (bảng 2.2) sau khi được tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút, để nguội xuống 40 – 450C cấy chủng L acidophilus Ủ trong tủ

ấm CO2 5%, ở nhiệt độ 370C Sau 24 giờ nuôi cấy được giống cần thiết

Trường hợp giống được giữ ở nhiệt độ thấp (trong tủ lạnh) lâu ngày thì phải đưa giống về trạng thái hoạt động bằng cách ủ trong tủ ấm nhiệt độ 370C trong 2 - 3 ngày rồi tiến hành các bước như trên [6]

2.3.1.2 Phương pháp lên men thu Magnesi lactat:

Chuẩn bị 100ml môi trường lên men (bảng 2.2) với các thành phần và tỉ

lệ nghiên cứu vào các bình nón 250ml Các thành phần yêu cầu tiệt trùng

riêng biệt thì pha riêng Tiệt trùng môi trường ở 0,6 atm trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ khoảng 40 – 450C, trộn lẫn các thành phần tiệt trùng riêng Sau đó cấy giống vào các bình này trong tủ cấy vô trùng với tỉ lệ giống là 10% [6]

Sau khi cấy giống, để lên men tĩnh trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C, thỉnh thoảng lắc Bổ sung MgCO3 ngay thời điểm ban đầu hoặc sau mỗi 24 giờ Sau

96 giờ, thu lấy dịch lên men để kết tinh Magnesi lactat

2.3.2 Phương pháp tách chiết Magnesi lactat từ dịch lên men

Dịch lên men được đun cách thủy ở nhiệt độ 800C trong 20 phút Ly tâm

4000 vòng/phút trong vòng 15 phút Lọc nóng, loại tủa và các thành phần không tan Bổ sung 2% (kl/tt) than hoạt vào dịch lọc để tẩy màu, đun cách thủy 10 phút sau đó lọc nóng bằng phễu Buchner loại bỏ than hoạt Cô cách thủy dịch lọc đến còn 30% thể tích Kết tinh, lọc, thu tinh thể, rửa 2 lần bằng nước cất đã để lạnh Sản phẩm màu trắng, được sấy khô ở nhiệt độ 400

C trong

24 giờ Cân lượng sản phẩm thu được [19]

27

2.3.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi sinh vật

2.3.3.1 Phương pháp đếm đếm khuẩn lạc định mật độ tế bào vi sinh vật Nguyên tắc: Xác định số lượng vi sinh vật còn sống có trong mẫu Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc [21]

Tiến hành:

Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS đặc (nêu trong bảng 2.2) Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp Đậy kín bằng nút bông Hấp tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng, để nguội, chờ đông rắn rồi đậy nắp kín

Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý, đậy kín bằng nút bông Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 115oC trong 20 phút, để nguội Lắc đều bình lên men Dùng pipet hút chính xác 1ml dịch cần định lượng vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, sau đó từ ống nghiệm thứ nhất lại hút chính xác 1ml cho vào ống nghiệm thứ tiếp theo Mẫu tế bào cần đo đem pha loãng mẫu theo dãy thập phân 10-6

đến 10-11 Hút 0,5ml tương ứng ở mỗi nồng độ pha loãng vào mỗi đĩa (lặp lại 3 lần đối với mỗi độ pha loãng) và

đổ môi trường dinh dưỡng tương ứng vào mỗi đĩa (môi trường đã được khử trùng, để nguội 37oC) Ủ các đĩa này trong tủ CO2 5%, ở nhiệt độ 37oC Tiến hành định lượng số vi sinh vật trên các mẫu, sau 48 giờ đọc kết quả Số lượng VSV có trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy ban đầu được tính theo công thức:

28

Trong đó:

X: số vi sinh vật có trong 1 ml mẫu

An: số khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có cấy các nồng độ pha loãng thứ n 2.3.3.2 Phương pháp đo độ đục OD định mật độ tế bào vi sinh vật

Nguyên tắc: dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử không tan lơ lửng trong qua lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiện diện của chúng làm chúng phân tán chùm ánh sáng tới Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Trong giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào có thể xác lập quan hệ tuyến tính giữa chúng Mật độ vi sinh vật có thể được đo trực

tiếp thông qua máy đo độ đục (máy quang phổ đo ở bước sóng 600nm) [30]

Tiến hành:

- Xác định độ đục OD: Lấy 10ml dịch lên men sau 24 giờ, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Trong trường hợp, dịch lên men có chứa MgCO3, không tan, thêm H2SO4 0,1N để tạo thành dạng muối MgSO4 tan trong nước, không ảnh hưởng đển độ đục của dịch đem đo Bỏ dịch lên men thu sinh khối Rửa sinh khối bằng nước muối sinh lý Bổ sung nước muối sinh lý vào sinh khối cho đủ 10ml trong ống ly tâm Tiến hành pha loãng mẫu với hệ số pha loãng khác nhau và đo OD600 ứng với các hệ số pha loãng đó

- Định lượng số tế bào vi khuẩn ban đầu trong dịch nuôi cấy tăng sinh sau 24 giờ bằng phương pháp như mục: 2.3.3.1 đếm khuẩn lạc trên môi trường đĩa thạch

- Từ các giá trị OD600 tương ứng và các giá trị mật độ tế bào pha loãng (cách pha loãng như trong bảng 2.4) tiến hành lập phương trình biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa mật độ tế bào (số tế bào/ml) và độ hấp thu OD600

- Xác định mật độ tế bào theo trị số OD600 của các mẫu có mật độ tế bào

vi sinh vật tương ứng cần đo được (pha loãng mẫu cầu đo sao cho trị số OD600

nằm trong khoảng tuyến tính), kết hợp với đồ thị vừa lập cho phép ta xác định mật độ tế bào trong dịch nuôi

2.3.4 Phương pháp tính hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat

Nguyên tắc: Dựa trên nồng độ đường tiêu thụ để tính hiệu suất tạo sản phẩm

C6H12O6 2CH3–CHOH–COOH (CH3–CHOH–COO)2Mg.2H2O

Mglucose = 180 MMagnesi lactat dihydrat = 238

Từ kết quả định lượng đường trong mẫu khởi điểm và kết thúc, tra bảng ta được nồng độ % đường trong 2 mẫu, từ đó tính được lượng đường tiêu thụ Dựa trên hiệu suất tiêu thụ đường, tính hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat theo công thức:

Trong đó:

H: hiệu suất (%)

m: số gam Magnesi lactat/100ml dịch lên men

a: C% glucose khởi điểm b: C% glucose kết thúc

30

2.3.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của sản phẩm

Sản phẩm Magenesi lactat được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) và xác định công thức muối ngậm nước bằng cách đo khối lượng mất do nước bay hơi

- Phổ hồng ngoại (IR): phổ IR được ghi trên máy Shimadzu trong vùng

4000 – 400 cm-1 của Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [4], [10]

- Phổ khối lượng (MS): phổ MS được ghi theo phương pháp ESI (ion âm) trong dung môi Methanol, được ghi trên máy LCMS – 2010EV (Shimadzu) tại phòng Thí nghiệm Hoá vật liệu - Khoa Hoá học - Trường ĐHKHTN – ĐHQGHN [4], [10]

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR): phổ 1H-NMR được ghi trong

D2O trên máy Brucker Av – 500 MHz, chất chuẩn tetramethylsilan tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dùng D2O làm dung môi [4], [10]

- Xác định công thức muối ngậm nước: xác định khối lượng nước mất do bay hơi bề mặt: dùng máy đo hàm ẩm Cân khoảng 0,5 g bột, cho vào đĩa cân, đặt nhiệt độ 1050C, theo dõi và đọc kết quả

Xác định khối lượng nước mất do bay hơi phân tử nước đã ngậm: Lấy khoảng 0,5g bột đã làm bay hơi nước bề mặt, cho vào đĩa cân phân tích, đọc kết quả Sau đó sấy trong tủ sấy ở 125oC trong khoảng 24 giờ đến khi khối lượng không đổi, theo dõi và đọc kết quả [25]

Sản phẩm Magnesi L - lactat là muối kết tinh của acid lactic với ion Mg2+, tồn tại dạng hydrat C6H10MgO6.nH2O Tính số phân tử nước ngậm theo công thức sau:

n= H/m x Msp/Mnc