Nghiên cứu xác định một số phtalat trong bao bì dược phẩm làm từ chất dẻo bằng sắc ký khí khối phổ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội các nhà Hóa phân tích Association of Official Analytical Chemists CI Ion hóa hóa học Chemical Ionization DBP Dibutyl phthalate DEHP Di2-e

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THỊ LAN NGỌC

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHTALAT TRONG BAO BÌ DƯỢC PHẨM LÀM TỪ CHẤT DẺO BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THỊ LAN NGỌC

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHTALAT TRONG BAO BÌ DƯỢC PHẨM LÀM TỪ CHẤT DẺO BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

LỜI CẢM ƠN

Em xin được bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh – Phòng Quản lý khoa học – Đại học Dược

Hà Nội và TS Vũ Công Sáu – Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã tận

tình hướng dẫn, quan tâm và động viên em trong suốt quá trình thực nghiệm

và hoàn thiện luận văn này

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các cán bộ Phòng Hóa lý – Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã cộng tác và giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và khoa Dược - Trường Cao đẳng Y tế Phú Thọ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, cổ vũ tinh thần tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học, các thầy

cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời thương yêu nhất tới gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, khích lệ tôi có thêm động lực học tập và hoàn thiện luận văn này

Hà Nội, ngày 06 tháng 9 năm 2015

Học viên

Mai Thị Lan Ngọc

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.1 Tổng quan về phtalat 3

1.1.1 Công thức cấu tạo và tên gọi một số phtalat 3

1.1.2 Tính chất 4

1.1.3 Ứng dụng của các phtalat 4

1.1.4 Độc tính của phtalat 5

1.2 Một số nghiên cứu định lượng phtalat 5

1.3 Tổng quan về sắc ký khí khối phổ 12

1.3.1 Sắc ký khí 12

1.3.2 Dectector khối phổ trong sắc ký khí 15

1.3.3 Ứng dụng của sắc ký khí khối phổ 18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất, dung môi 20

2.2.1 Thiết bị 20

2.2.2 Dụng cụ 20

2.2.3 Chất chuẩn, hóa chất, dung môi 21

2.3 Nội dung nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ 22

2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích 22

2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 23

2.4.4 Ứng dụng phương pháp khảo sát một số mẫu bao bì dược phẩm làm từ

chất dẻo 25

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 27

3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 27

3.1.2 Khảo sát điều kiện làm việc của hệ GC – MS 27

3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 33

3.1.4 Quy trình phân tích 41

3.2 Thẩm định phương pháp 42

3.2.1 Tính phù hợp của hệ thống 42

3.2.2 Tính đặc hiệu 44

3.2.3 Khoảng tuyến tính 48

3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 51

3.2.5 Độ đúng và độ chính xác 53

3.3 Bước đầu ứng dụng phương pháp khảo sát một số mẫu bao bì dược phẩm làm từ chất dẻo 57

Chương 4 BÀN LUẬN 61

4.1 Về phương pháp GC-MS 61

4.2 Về quy trình phân tích 62

4.3 Kết quả thẩm định phương pháp 63

4.4 Ứng dụng của phương pháp phân tích 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà Hóa phân tích (Association of Official Analytical

Chemists)

CI Ion hóa hóa học (Chemical Ionization)

DBP Dibutyl phthalate

DEHP Di(2-ethylhexyl) phthalate

DEP Diethyl phthalate

DCM Dicloromethan

EI Ion hóa va chạm điện tử (Electron Impact)

FID Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ionisation Detector)

GC Sắc ký khí (Gas Chromatography)

GCL Sắc ký khí lỏng (Gas Chromatography Liquid)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

IS Chất chuẩn nội (Internal standard)

LC Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

MS Khối phổ (Mass spectrometry)

ppm Phần triệu (Parts per million)

SIM Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (Selected ion monitoring)

THF Tetrahydrofuran

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tên gọi, cấu tạo, khối lượng phân tử một số phtalat điển hình [21] 3

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng phtalat bằng phương pháp GC 5

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu định lượng phtalat bằng sắc ký lỏng 10

Bảng 1.4: Đặc điểm 2 loại cột sắc ký khí - lỏng 14

Bảng 2.1: Thông tin các chất chuẩn 21

Bảng 2.2: Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm 21

Bảng 3.1: Kết quả thời gian lưu (phút) của các phtalat khi phân tích theo các chương trình nhiệt độ khảo sát 30

Bảng 3.2: SIM group với các mảnh ion cho từng chất 33

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát dung môi chiết DEP và DBP 38

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát dung môi chiết DEHP 39

Bảng 3.5: Kết quả thẩm định tính phù hợp của hệ thống 43

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của DEP, DBP, DEHP…… 48

Bảng 3.7: Kết quả S/N của các mẫu thêm chuẩn 52

Bảng 3.8: Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác với mẫu trắng thêm chuẩn DEP tại các nồng độ khác nhau 54

Bảng 3.9: Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác với mẫu trắng thêm chuẩn DBP tại các nồng độ khác nhau 55

Bảng 3.10: Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác với mẫu trắng thêm chuẩn DEHP tại các nồng độ khác nhau 56

Bảng 3.11: Kết quả phân tích các mẫu thực 58

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của phtalat [17] 3

Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký khí 12

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ 16

Hình 3.1: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 1……….29

Hình 3.2: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 2……….29

Hình 3.3: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 3……….30

Hình 3.4: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 4……….30

Hình 3.5: Phổ khối DEP so với thư viện phổ chuẩn 32

Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu chiết DEP, DBP bằng dung môi DCM 35

Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu chiết DEP, DBP bằng dung môi toluen 35

Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu chiết DEP, DBP bằng dung môi n-hexan 36

Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu chiết DEP, DBP bằng dung môi THF 36

Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu chiết DEP, DBP bằng dung môi cloroform 37

Hình 3.11: Sắc ký đồ khảo sát chiết DEHP bằng dung môi cloroform 37

Hình 3.12: Sắc ký đồ khảo sát chiết DEHP bằng dung môi THF 38

Hình 3.13: Đồ thị so sánh khả năng chiết phtalat của 5 loại dung môi 40

Hình 3.14: Quy trình phân tích DEP, DBP và quy trình phân tích DEHP 41

Hình 3.15: Sắc ký đồ phân tích hỗn hợp chất chuẩn DEP, IS, DBP 44

Hình 3.16: Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng BP1 theo quy trình phân tích DEP và DBP 45

Hình 3.17: Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng BP1 thêm hỗn hợp chuẩn DEP, DBP và IS theo quy trình phân tích DEP và DBP 45

Hình 3.18: Sắc ký đồ phân tích hỗn hợp chuẩn DEHP và IS theo quy trình phân tích DEHP 46

Hình 3.19: Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng RG1 theo quy trình phân tích DEHP 46

Hình 3.20: Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng RG1 thêm hỗn hợp DEHP và IS 47

Hình 3.21: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và tỷ lệ S DEP /S IS 49

Hình 3.22: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và tỷ lệ S DBP /S IS 50

Hình 3.23: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và tỷ lệ S DEHP /S IS 50

Hình 3.24: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn (nồng độ DEP, DBP 0,05 µg/ml) 52

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong xã hội hiện đại ngày nay, dễ dàng nhận thấy chất dẻo giữ một vị trí quan trọng, được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau Lượng chất dẻo sử dụng trên toàn thế giới theo từng năm có sự tăng trưởng mạnh mẽ, từ 1,7 triệu tấn vào năm 1950 lên đến 288 triệu tấn vào năm 2012 [6] Do những đặc tính mềm dẻo, bền, nhẹ, không dẫn điện và đặc biệt là giá thành rẻ, chất dẻo được chọn lựa làm nguyên liệu cho các sản phẩm khác nhau: Bao bì, đồ gia dụng, dụng cụ chăm sóc sức khỏe, … [5] Để có được đặc tính mềm dẻo

đó, trong quá trình sản xuất người ta sử dụng nhóm chất hóa dẻo (plasticizers)

mà phổ biến là nhóm phtalat – các ester của acid ortho-phthalic [29] Một số phtalat điển hình sử dụng nhiều nhất xuất hiện trong chất dẻo là Di(2-ethylhexyl) phthalat (DEHP), Dibutyl phthalat (DBP), Diethyl phthalat (DEP)

và một số phtalat khác [21]

Tuy nhiên, do phtalat không tạo liên kết hóa học bền vững với chất dẻo, nên trong các điều kiện ánh sáng và nhiệt độ thường, theo thời gian phtalat có thể bị giải phóng thoát ra khỏi nền polymer chất dẻo, đặc biệt là các phtalat phân tử lượng thấp như DEP và DBP, và có thể gây hại cho môi trường cũng như sức khỏe con người [13] Thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu và báo cáo

về tính chất nguy hiểm của phtalat gây độc với hệ thần kinh, gan, thận, rối loạn hormon, trẻ em dậy thì sớm, vô sinh, ung thư [8], [10], [11], [23] Do những nguy cơ đó, Mỹ đã ban hành luật quy định cấm các sản phẩm đồ chơi trẻ em và đồ chăm sóc trẻ em làm từ chất dẻo có hàm lượng một số phtalat (DEHP, DBP, BBP, DINP, DIDP, DnOP) không được vượt quá 0,1% [16] Tại Việt Nam, phtalat là vấn đề mới mẻ hiện đang thu hút sự quan tâm của công chúng, đặc biệt là các nhà nghiên cứu tìm cách định tính, định lượng phtalat trong nhiều đối tượng khác nhau như đồ chơi, thực phẩm, bao bì thực phẩm, … Trong ngành Dược, bao bì chủ yếu được làm từ chất dẻo, nên nếu

2

phtalat trong bao bì có hàm lượng cao sẽ có thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe người sử dụng thuốc Trên thế giới, năm 2009 Dược điển Châu Âu đưa vào phương pháp định tính, định lượng DEHP trong bao bì chất dẻo với yêu cầu hàm lượng DEHP trong bao bì chất dẻo (bao bì dùng đựng máu và các chế phẩm từ máu; đựng thuốc tiêm truyền) không quá 40% [20] Tuy nhiên, trong bao bì chất dẻo không phải chỉ có riêng DEHP mà còn có thể có nhiều loại phtalat khác nhau như DBP, DEP, … Việt Nam tuy chưa có những quy định pháp lý yêu cầu định tính, định lượng nhiều loại phtalat khác nhau trong bao

bì dược phẩm làm từ chất dẻo, nhưng trước những mối nguy hại của các phtalat trong đồ nhựa, đồ chơi, bao bì,… đã được thế giới cảnh báo, giới hạn hàm lượng và vẫn đang tiếp tục theo dõi, thì tại Việt Nam việc nghiên cứu định tính và định lượng các phtalat trong bao bì dược phẩm làm từ chất dẻo là cần thiết

Xuất phát từ thực tiễn và tầm quan trọng đó, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài “Nghiên cứu xác định một số phtalat trong bao bì dược phẩm làm từ

chất dẻo bằng sắc ký khí khối phổ” với các mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng 3 phtalat DEHP, DBP, DEP trong bao bì dược phẩm làm từ chất dẻo bằng sắc ký khí khối phổ

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng xác định hàm lượng các phtalat đó trong một số loại bao bì chất dẻo đựng thuốc (túi đựng máu, lọ đựng dịch truyền; lọ đựng siro)

3

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về phtalat

1.1.1 Công thức cấu tạo và tên gọi một số phtalat

Phtalat là tên gọi chung một nhóm ester của acid ortho-phtalic

Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của phtalat [17]

Gốc R và R’ là 2 gốc của 2 rượu đã tác dụng với acid ortho-phtalic để thu được ester phtalat Hai nhóm R, R’

có thể giống nhau hoặc khác nhau Cấu trúc khác nhau của 2 nhánh này sẽ tạo ra những tính chất hóa học và vật

lý riêng của phân tử phtalat, làm thay đổi hoạt tính sinh học của chúng [17]

Một số phtalat thông dụng có tên gọi, cấu tạo được đưa ra trong bảng 1.1 dưới đây

Bảng 1.1: Tên gọi, cấu tạo, khối lượng phân tử một số phtalat điển hình [21] S

- Khi phân hủy bởi nhiệt độ cao, các phtalat tạo khí có mùi khét

- Các phtalat có nhiệt độ nóng chảy từ 5,5°C - 58°C

- Nhiệt độ hóa hơi: Khoảng từ 230°C - 486°C [12]

- Ngành công nghiệp sơn sử dụng phtalat làm dung môi

Chen F.P và Chien M.H (2014) đã nghiên cứu trên động vật thử nghiệm, thấy tại nồng độ rất thấp 10-10 – 10-4 mol/l, các phtalat đã có khả năng làm tăng nhanh sự phát triển các tế bào ung thư vú [14]

1.2 Một số nghiên cứu định lượng phtalat

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lượng phtalat trong các mẫu đối tượng khác nhau, sử dụng các phương pháp khác nhau Có thể tóm tắt một số nghiên cứu trong các bảng 1.2 và bảng 1.3:

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng phtalat bằng phương pháp GC Tài

liệu

Mẫu thử

- Chất

phân tích

Điều kiện sắc ký Chuẩn nội -

Dung môi hoặc phương pháp chiết

HP-dimethylpolysiloxan

- Pha động: Khí mang heli, tốc độ khí

- Chuẩn nội: 4,4´-

dibromobiphenyl

- Dung môi chiết: tetrahydrofuran

- Thể tích tiêm: 1 µl; chế độ tiêm: chia dòng 1:20

- Phát hiện: Detector MS; điều kiện khối phổ MS: Nguồn ion hóa EI, năng lượng bắn phá 70eV, nhiệt độ buồng ion 230°C Chế độ full scan với m/z =

40 – 350; Chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion m/z = 149

(THF) : ethanol (1:3, tt/tt)

Dung môi chiết: n-hexan

35 – 550; Chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion m/z = 149

- Pha động: Khí mang nitơ, tốc độ khí 1,7ml/phút

- Chương trình nhiệt độ:

Nhiệt độ ban đầu 150°C, duy trì 2 phút; tăng nhiệt với tốc độ 25°C/phút lên đến 285°C, duy trì trong 10 phút

Nhiệt độ buồng tiêm: 290°C

- Thể tích tiêm: 1 µl; chế độ tiêm: chia dòng 1:10

- Phát hiện: Detector FID

Dung môi chiết: methanol : carbontetraclorid (20:1, tt/tt)

Intercap-Dung môi chiết:

- Với mật ong, dùng nước:hexan

(1:1, tt/tt)

- Với thạch, dùng hexan:aceton (1:1, tt/tt)

- Pha động: Khí mang heli tinh khiết, tốc độ khí mang 1ml/phút

- Thể tích tiêm: 1µl; chế độ tiêm:

không chia dòng

- Phát hiện: Detector MS; điều kiện khối phổ: Nguồn ion hóa EI, năng lượng bắn phá 70eV, nhiệt độ buồng ion 230°C Chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion m/z = 149

- Pha động: Khí mang heli, tốc độ khí 1,2ml/phút

- Chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ đầu 70°C, duy trì 3 phút; tăng nhiệt với tốc

độ 20°C/phút lên 280°C, duy trì trong

5 phút Nhiệt độ buồng tiêm: 250°C

- thể tích tiêm 1 µl; chế độ tiêm:

không chia dòng

- Phát hiện: Detector MS: điều kiện khối phổ: Nguồn ion hóa EI, năng lượng bắn phá 70eV, nhiệt độ buồng ion 250°C Chế độ full scan với m/z =

50 – 400; chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion m/z = 149

- Chuẩn nội: dibutyl adipate

- Dung môi chiết, phương pháp chiết: n-hexan, chiết pha rắn SPE

- Pha động: hỗn hợp acetonitril : nước (65:35, tt/tt); tốc độ dòng:

2ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 20 µl

- Phương pháp, detector phát hiện:

HPLC – UV Bước sóng phát hiện

221 nm

- Chuẩn nội: benzyl butyl phtalat

- Dung môi chiết: THF:methanol (9:5, tt/tt)

- Phương pháp, detector phát hiện:

LC-MS/MS; điều kiện khối phổ:

Nguồn ion hóa EI, năng lượng bắn phá 70eV

- Chuẩn nội : đồng vị 13

C12

- Dung môi chiết: amoni acetat pH 5.0 : enzym β –glucuronidase (15:2, tt/tt)

[27] - Mẫu thử:

dung dịch

nướcmuối

- Pha tĩnh: Cột XR-ODS ( 75mm x 2,0 mm x 2,2µm)

- Pha động: hỗn hợp methanol :

Phương pháp chiết: chiết pha rắn SPE

11

Phương pháp HPLC-UV ít được sử dụng trong định lượng phtalat, do phổ hấp thụ của phtalat không đặc trưng, giống với nhiều chất khác cũng có một vòng benzen, bước sóng hấp thụ cũng không đặc trưng nên khả năng xác định kém

Các phtalat là ester của acid phtalic với 1 hoặc 2 rượu khác nhau, nên tính chất và cấu tạo của chúng có tính tương đồng Mặt khác, hàm lượng của chúng trong mẫu lại thấp Từ đó dẫn đến yêu cầu phương pháp phân tích phtalat phải có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, phương pháp không bị ảnh hưởng khi phân tích đồng thời các phtalat Phương pháp GC và LC đều đáp ứng được yêu cầu đó Để tăng thêm hiệu quả, sắc ký khí thường được kết nối với MS, còn các detector khác như FID kém nhạy hơn so với MS

Nhìn chung, trên thế giới với sự phát triển của kỹ thuật MS thì GC-MS đang được áp dụng nhiều nhất để phân tích các phtalat trong các mẫu đối tượng khác nhau GC-MS có ưu điểm cho độ chính xác cao và độ nhạy tốt, hơn nữa với thư viện phổ có thể xác định được các chất dễ dàng

Tại Việt Nam, phtalat là một vấn đề còn mới, chưa có nhiều nghiên cứu định lượng được công bố Các phòng thí nghiệm tuy có thực hiện nghiên cứu, nhưng mang tính chất áp dụng nội bộ tại phòng thí nghiệm, chưa thẩm định chặt chẽ phương pháp nên khó xác định được mức độ tin cậy, khó áp dụng

- Phương pháp, detector phát hiện:

LC-MS; điều kiện khối phổ: Nguồn ion hóa EI, năng lượng bắn phá 70eV

1.3.1.2 Nguyên tắc

Trong GCL, chất tan di chuyển theo pha động qua cột khi nó ở thể khí Quá trình tách phụ thuộc vào tính bay hơi của các chất tan – tức là điểm sôi của chúng Do áp suất hơi phụ thuộc vào tính bay hơi của chất tan, nên quá trình rửa giải theo thứ tự điểm sôi tăng dần, ngoại trừ trường hợp có tương tác đặc biệt giữa chất tan và pha tĩnh Pha động đưa chất tan ra khỏi cột đến detector Nhiệt độ cột dao động khoảng 50°C - 350°C đảm bảo chất tan bay hơi và đẩy nhanh quá trình rửa giải [1]

1.3.1.3 Hệ thống máy sắc kí khí

Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký khí

13

* Khí mang:

Các loại khí mang sử dụng trong GC-MS cần phải đảm bảo trơ và sạch Khí mang không được tương tác với các chất phân tích, do đó yêu cầu đầu tiên là phải trơ về mặt hóa học Thường thì heli, hydro, argon hoặc nitơ có thể đáp ứng yêu cầu Hiện nay, khí mang sử dụng phổ biến nhất là heli [1]

* Buồng tiêm mẫu:

Trước khi vào cột phân tích, thường mẫu ở dạng lỏng, cho vào buồng bay hơi rồi được dòng khí mang đưa vào cột Có 3 cách tiêm mẫu chính: [4]

- Tiêm mẫu chia dòng (split): Mẫu sau khi vào buồng bay hơi, được chia nhanh sao cho chỉ có một phần nhỏ của lượng mẫu ban đầu đi vào cột Các tỷ

lệ chia dòng phổ biến trong khoảng từ 1:50 đến 1:100 Cách tiêm mẫu này có

ưu điểm là giúp giảm lượng mẫu vào cột trong trường hợp mẫu bẩn hoặc có nồng độ cao Tuy nhiên, do lượng mẫu vào cột nhỏ nên có thể làm giảm độ nhạy

- Tiêm mẫu không chia dòng (splitless): Sau khi vào buồng bay hơi, mẫu được đưa toàn bộ vào đầu cột và ngưng tụ lại ở đây, sau đó tăng nhiệt độ để làm bay hơi dần các cấu tử Phương pháp này có thể làm tăng độ nhạy và phản ánh tương đối chính xác thành phần mẫu ban đầu, tuy nhiên có thể gây

ra pic bị rộng chân và làm hỏng cột phân tích

- Tiêm mẫu trực tiếp (on-column): Trong một số trường hợp đặc biệt, khi thành phần mẫu chứa các chất không bền với nhiệt, có nhiệt độ hóa hơi thấp nên không thể bơm vào buồng bay hơi Khi đó có thể tiêm thẳng vào đầu cột

và gia nhiệt từ từ để bay hơi mẫu Phương pháp này có ưu điểm là toàn bộ mẫu được đưa vào cột nên phản ánh trung thực thành phần ban đầu của mẫu Tuy nhiên, để thực hiện tiêm trực tiếp vào cột thì cần thiết kế đặc biệt của buồng tiêm mẫu Phương pháp này thường chỉ áp dụng cho các loại cột đường

Đặc điểm của hai loại cột được tóm tắt trong bảng 1.4

Bảng 1.4: Đặc điểm 2 loại cột sắc ký khí - lỏng

Nguyên liệu chế tạo cột

Silica nung chảy rất tinh khiết (tạp kim loại <

1ppm)

Thủy tinh, thép không gỉ

Kích thước cột

Dài 10 – 100m (cuộn tròn), đường kính trong 0,1 – 0,7mm, có áo bảo vệ bằng polyimid hoặc nhôm

Dài 1 – 3m (cuộn tròn), đường kính trong 2 – 3mm

Pha tĩnh

Lớp chất lỏng dày 0,1 - 5µm bao mặt trong của cột (WCOT) hoặc chất mang bao pha tĩnh (SCOT)

Kích thước hạt 150 - 250µm, được bao lớp mỏng (dày 0,05 - 1µm)

dòng, bơm thẳng vào cột

Bay hơi nhanh, tiêm thẳng vào cột

Hiệu lực cột Loại WCOT: 1000 – 4000 500 – 1000

15

Độ phân giải

Phân tích nhiều thành phần: 100 chất hoặc hơn, nhất là với cột đường kính trong ≤ 0,2 mm

Chất tan được rửa giải ở nhiệt độ thấp hơn so với cột nhồi

Thấp, tốt nhất chỉ có thể tách được 20 thành phần

Ghi chú:

WCOT: Cột với lớp bao ở mặt trong thành cột (Wall – coated open tubular column) SCOT: Cột với lớp chất mang pha tĩnh (Support – coated open tubular column)

* Các loại pha tĩnh trong sắc ký khí [4]

Trong sắc ký khí, pha tĩnh đóng vai trò chủ yếu trong việc tách các chất khỏi nhau Tùy thuộc vào bản chất của các chất phân tích mà lựa chọn loại pha tĩnh phù hợp Các loại pha tĩnh có thể được xếp vào 4 nhóm dựa vào tính phân cực của nó, bao gồm: Nhóm không phân cực, nhóm phân cực yếu, nhóm phân cực trung bình, nhóm phân cực cao

Một số loại pha tĩnh ngày nay hay sử dụng: Polydimethylsiloxan, 5% phenyl polydimethyl siloxan; 50% phenyl polydimethyl siloxan; Polyethylen glycol

1.3.2 Dectector khối phổ trong sắc ký khí

1.3.2.1 Khái niệm

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân

tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử hay các ion mảnh của phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z) [1]

16

Về bản chất, có thể coi khối phổ là một loại detector, nhưng là detector đặc biệt, vì ngoài vai trò phát hiện thì khối phổ còn có khả năng tách cách chất đồng rửa giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng của chúng

1.3.2.2 Nguyên tắc hoạt động

Mẫu từ máy sắc ký khí đưa vào khối phổ sẽ được ion hóa trong buồng ion để tạo các phần tử mang điện, sau đó được chuyển đến bộ phận lọc và phân tích khối để tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z Các ion được bộ phận phát hiện thu nhận, tín hiệu thu được chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ

1.3.2.3 Cấu tạo

Cấu tạo của máy khối phổ gồm có 3 phần chính là nguồn ion hóa, bộ phân tích khối và bộ phát hiện Hình 1.3 mô tả cấu tạo của một thiết bị khối phổ

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ

* Bộ nạp mẫu (Inlet): Đầu ra cột mao quản GC nối với bộ nguồn ion của

MS

* Nguồn ion hóa (Ion source): Có vai trò ion hóa các phân tử, nguyên tử của

mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi

Một số kỹ thuật ion hóa hay được sử dụng trong GC-MS:

17

- Ion hóa trên cơ sở va đập điện tử (EI): Mẫu sau khi qua cột GC ở dạng hơi,

đi vào buồng ion hóa Ở đây xảy ra tương tác với chùm electron có năng lượng thường là 70eV, tạo thành các electron thứ cấp và một số phân mảnh của phân tử

- Ion hóa hóa học (CI): Sử dụng chùm electron làm nguồn ion hóa, nhưng chùm electron ion hóa các phân tử khí và ít ion hóa các phân tử mẫu (tỷ lệ phân tử khí thường cao gấp 103, 104 lần so với phân tử mẫu) Một trong những tác nhân khí được sử dụng phổ biến nhất là khí metan

* Bộ phân tích khối (Mass analyzer):

Có vai trò tách các ion theo tỷ số m/z Một số thiết bị phân tích khối thường được dùng trong GC:

- Thiết bị phân tích tứ cực: Cấu tạo bởi 4 thanh điện cực đặt song song tạo thành một khoảng trống, trong đó một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều và điện thế tần số radio (RF) Trường tứ cực được xác định sao cho các ion có thể đi tới detector Các tứ cực đóng vai trò như bộ lọc khối Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong đó

sẽ dao động phụ thuộc vào tỷ số m/z và RF Chỉ những ion có tỷ số m/z phù hợp mới có thể đi qua bộ lọc này

- Bẫy ion: Gồm các điện cực hình trụ, điện cực hình mũ và điện cực vòng Mỗi điện cực này có các bề mặt hình hypebol ở bên trong Các điện cực hình

mũ tạo ra một điện thế, còn điện cực vòng áp thế 1 MHz và điện thế 1 chiều Các ion được tạo ra bằng cách đưa vào các electron phát ra từ một dây dẫn hoặc các ion có thể được đưa vào bẫy từ một nguồn bên ngoài Trên cơ sở tăng biên độ của thế RF, chuyển động của các ion tăng dần lên đến khi đường

đi của chúng không ổn định dọc theo hình trục của bẫy Kết quả, các ion này

bị phóng ra khỏi các khe hở của điện cực hình mũ bên trái và được thu thập lại ở bộ khuếch đại electron Quá trình phóng các ion này theo trình tự tăng giá trị m/z và tín hiệu thu được phản ánh phổ khối của các ion bị bẫy

18

- Phân tích thời gian bay: Dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng Các ion có cùng năng lượng nhưng khác nhau về khối lượng nên thời gian các ion đi tới detector sẽ khác nhau Do có năng lượng động học hay vận tốc, các ion này sẽ bay với khoảng cách xác định là d trong một khoảng thời gian t, trong đó t phụ thuộc vào tỉ số m/z

* Bộ phận phát hiện (Mass detection): Thường có hai loại nhân electron và

nhân quang, với chức năng chuyển các ion đã đến thành tín hiệu và khuếch đại để đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

1.3.2.4 Một số kỹ thuật phân tích MS

- Kỹ thuật phân tích toàn thang (Full scan): Hỗn hợp các chất phân tích sau khi được tách và đưa vào detector khối phổ, khối phổ ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ mỗi chất Chế độ Full scan cho đầy đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn [1]

- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM): Khối phổ kế chỉ nhận diện một số ion và ghi sắc đồ theo ion lựa chọn Kỹ thuật này làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy, tức làm tăng tỷ lệ tín hiệu (S) trên nhiễu đường nền (N) Kỹ thuật SIM nhạy hơn Full scan từ 10 đến 100 lần [1]

- Phương pháp thêm chuẩn: Phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu cùng điều kiện như phân tích mẫu bình thường Dựa trên lượng chuẩn thêm và tín hiệu các mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn, từ đó tính được nồng độ chất

có trong mẫu

- Phương pháp nội chuẩn: Trong phương pháp này, người ta chọn một chất chuẩn nội (IS) đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn

20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Diethyl phtalat (DEP), Dibutyl phtalat (DBP), ethylhexyl) phtalat (DEHP)

Di(2 Mẫu nghiên cứu: Bao bì chất dẻo đựng máu, bao bì chất dẻo đựng dịch truyền, bao bì chất dẻo đựng siro uống

- Mẫu trắng:

+ Lọ đựng siro (mã BP1) không phát hiện thấy DEP và DBP

+ Chai đựng dịch truyền (mã RG1) không phát hiện thấy DEHP

2.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất, dung môi

2.2.1 Thiết bị

- Máy sắc ký khí Agilent Technologies 6890N kết nối với khối phổ Mass Selective Detector Agilent 5973 (Mỹ)

- Cân phân tích Precisa độ chính xác 0,0001g (Thụy Sỹ)

- Máy siêu âm Power sonic 405 (Hàn Quốc)

- Máy lắc xoáy Minishaker IKA (Đức)

- Tủ lạnh bảo quản mẫu Sanyo MPR 514 (Nhật)

21

2.2.3 Chất chuẩn, hóa chất, dung môi

2.2.3.1 Chuẩn gốc và nội chuẩn

Bảng 2.1: Thông tin các chất chuẩn STT Chất chuẩn Hàm lƣợng

2.2.3.2 Hóa chất, dung môi

Bảng 2.2: Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm STT Tên Nguồn gốc Tiêu chuẩn

7 Nước cất 2 lần Việt Nam Tinh khiết phân tích

8 Khí Heli tinh khiết Việt Nam Dùng cho GC

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp phân tích các phtalat (DBP, DEP, DEHP) trong bao

bì chất dẻo bằng phương pháp GC-MS với các nội dung: Khảo sát điều kiện làm việc của GC – MS; khảo sát lựa chọn dung môi chiết; xây dựng quy trình phân tích phtalat (DEP, DBP, DEHP)

- Thẩm định phương pháp phân tích: Thẩm định các chỉ tiêu

+ Tính thích hợp của hệ thống

+ Tính đặc hiệu, chọn lọc

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ

Bao bì đựng máu được lấy tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, loại chưa qua sử dụng Bao bì chất dẻo đựng dịch truyền, bao bì đựng siro thuốc được lấy tại công ty sản xuất dược phẩm, loại chưa đựng sản phẩm

Các loại bao bì sau khi lấy được ghi lại thông tin Rửa sạch bao bì với nước cất, để ráo nước

Cắt bao bì thành các mảnh nhỏ sao cho không có mảnh nào kích thước quá 0,2 cm x 0,2 cm

2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích

2.4.2.1 Khảo sát điều kiện làm việc của hệ GC – MS

Dựa vào tính chất vật lý, hóa học của chất cần phân tích, tham khảo các tài liệu và dựa vào thực tế điều kiện thiết bị phòng thí nghiệm, từ đó khảo sát lựa chọn các điều kiện làm việc của hệ GC-MS:

- Pha tĩnh: Cột DB-1 (30,0m x 0,25mm; 0,25 µm), 100% dimethyl polysiloxan

- Loại khí mang: Heli

- Khảo sát chương trình nhiệt độ và tốc độ khí mang: Thay đổi các thông số nhiệt độ đầu vào, tốc độ gia nhiệt, thời gian duy trì nhiệt độ, tốc độ khí mang Phân tích, đánh giá khả năng tách dựa vào sắc ký đồ thu được, từ đó chọn lựa ra chương trình nhiệt độ và tốc độ khí mang phù hợp

23

- Điều kiện khối phổ: Tham khảo các tài liệu, lựa chọn điều kiện khối phổ sử dụng nguồn ion hóa EI với năng lượng bắn phá 70 eV

2.4.2.2 Khảo sát dung môi chiết

Khảo sát lựa chọn dung môi chiết tách DBP, DEP, DEHP ra khỏi nền mẫu chất dẻo: Căn cứ tính chất vật lý, hóa học của các chất để lựa chọn dung môi phù hợp chiết được các chất cần phân tích với hiệu suất cao hơn

Qua tham khảo tài liệu, lựa chọn một số dung môi khảo sát: tetrahydrofuran (THF); diclorometan (DCM); cloroform; n-hexan; toluen

So sánh đánh giá hiệu suất chiết của các dung môi bằng cách so sánh tỉ

lệ diện tích pic của chất cần phân tích/diện tích pic IS và khối lượng mẫu cân,

từ đó chọn ra dung môi phù hợp cho quy trình chiết

Xác định RSD của các thông số: Thời gian lưu (tR), tỷ số diện tích pic chất phân tích/diện tích pic IS

Yêu cầu: RSDtR ≤ 1%, RSD tỷ số Spic chất phân tích/Spic IS ≤ 2%

24

2.4.3.2 Khoảng tuyến tính

Tiến hành khảo sát khoảng nồng độ của DEP và DBP từ 0,2 – 25 µg/ml, khoảng nồng độ của DEHP từ 2,0 – 40 µg/ml Từ đáp ứng diện tích pic của chất chuẩn và IS ở các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi quy giữa tỷ lệ đáp ứng diện tích pic chất chuẩn phân tích/diện tích pic IS với nồng độ chất chuẩn khảo sát

Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,995

Đánh giá dựa vào so sánh thời gian lưu của chất cần phân tích trên phổ

đồ các mẫu

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của các chất chuẩn

2.4.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện LOD (Limit of Detection) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử, có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết có thể định lượng được

Giới hạn định lượng LOQ (Limit of Quantitation) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và

độ chính xác thích hợp

Cách xác định: chuẩn bị các mẫu trắng, thêm các dung dịch chuẩn pha loãng vào các mẫu trắng sao cho được các dung dịch có nồng độ DEP, DBP cuối cùng tiêm vào máy bằng nhau và bằng 0,1 µg/ml , 0,05 µg/ml; nồng độ DEHP cuối cùng tiêm vào máy là 1,0 µg/ml, 0,5 µg/ml, 0,25 µg/ml Tiến

25

hành sắc ký, xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu nền (S/N) S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền, bề rộng mỗi bên gấp 20 lần chiều rộng của pic tại ½ chiều cao LOD xác định tại nồng độ có tỷ lệ S/N = 3, LOQ tính bằng 3,3 lần LOD [3]

2.4.3.5 Độ đúng và độ chính xác

Tiến hành đánh giá độ đúng và độ chính xác trên các mẫu tự tạo (mẫu trắng thêm chuẩn) ở 3 mức nồng độ chuẩn được thêm vào khác nhau (mức nồng độ cao, trung bình, thấp trong khoảng nồng độ đã được xác định của quy trình phân tích) Ở mỗi mức nồng độ thêm chuẩn, định lượng ít nhất 6 mẫu độc lập

Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm tìm thấy của chất phân tích

so với nồng độ chất chuẩn thực đã biết Độ chính xác được đánh giá thông qua RSD giá trị nồng độ định lượng thu được

Cđo là nồng độ phtalat tính dựa vào đường chuẩn (µg/ml)

V = Thể tích dung môi chiết mẫu và định mức 20ml (ml)

K: Hệ số pha loãng

mcân là khối lượng mẫu cân (g)

27

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Pha chuẩn gốc DEP 1000 µg/ml: Cân chính xác khoảng 0,10 g chất DEP cho vào bình định mức 100,0ml Thêm ethanol vừa đủ tới vạch, lắc đều Bảo quản ở nhiệt độ 2-80C, sử dụng trong 1 tháng

- Pha chuẩn gốc DBP 1000 µg/ml: Cân chính xác khoảng 0,10 g chất DBP cho vào bình định mức 100,0ml Thêm ethanol vừa đủ tới vạch, lắc đều Bảo quản ở nhiệt độ 2-80C, sử dụng trong 1 tháng

- Pha chuẩn gốc DEHP 2%: Cân chính xác khoảng 1,00 g chất DEHP cho vào bình định mức 50,0ml Thêm ethanol vừa đủ tới vạch, lắc đều Bảo quản ở nhiệt độ 2-80C, sử dụng trong 1 tháng

- Pha nội chuẩn 100 µg/ml: Cân chính xác khoảng 0,01 g IS cho vào bình định mức 100,0ml Thêm ethanol vừa đủ tới vạch, lắc đều Bảo quản ở nhiệt

độ 2-80

C, sử dụng trong 1 tháng

- Pha nội chuẩn 4%: Cân chính xác khoảng 2,00 g IS cho vào bình định mức 50,0ml Thêm ethanol vừa đủ tới vạch, lắc đều Bảo quản ở nhiệt độ 2-80C, sử dụng trong 1 tháng

3.1.2 Khảo sát điều kiện làm việc của hệ GC – MS

3.1.2.1 Khảo sát chương trình nhiệt độ cột

Tiến hành khảo sát các chương trình nhiệt độ cột: Thay đổi các thông

số nhiệt độ đầu vào, tốc độ gia nhiệt, thời gian duy trì nhiệt độ Phân tích, đánh giá khả năng tách dựa vào sắc ký đồ thu được, từ đó chọn lựa ra chương trình nhiệt độ phù hợp tách được DEP, DBP, DEHP và IS Các chương trình đưa ra khảo sát như sau:

* Chương trình 1:

- Nhiệt độ ban đầu 120ºC, giữ trong 1 phút Sau đó gia nhiệt 40ºC/phút lên 200ºC, tiếp tục gia nhiệt với tốc độ 8ºC/phút lên 280ºC, duy trì trong 2 phút

28

- Thể tích tiêm: 1µl; chế độ tiêm: chia dòng 1:2

- Buồng tiêm mẫu: Nhiệt độ 290°C

- Nhiệt độ buồng ion: 230°C

- Thể tích tiêm: 1µl; chế độ tiêm: Chia dòng 1:2

- Khí mang: Heli, tốc độ khí 1ml/phút

* Chương trình 4:

- Nhiệt độ đầu 90°C, giữ trong 1 phút; tăng nhiệt với tốc độ 15°C/phút lên 210°C, duy trì trong 2 phút; tăng nhiệt 8°C/phút lên 250°C, duy trì trong 2 phút; tiếp tục tăng với tốc độ 25°C/phút lên 300°C, duy trì trong 2 phút

- Thể tích tiêm: 1µl; chế độ tiêm: không chia dòng

- Khí mang: Heli, tốc độ khí 2ml/phút

Kết quả sắc ký đồ các chương trình nhiệt độ khảo sát tương ứng khi chạy hỗn hợp các dung dịch chuẩn DEP, DBP, DEHP cùng với IS được thể hiện trong hình 3.1 đến 3.4; kết quả thời gian lưu của các chất chuẩn tương ứng với các chương trình đã khảo sát thể hiện ở bảng 3.1

29

Hình 3.1: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 1

Hình 3.2: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 2

30

Hình 3.3: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 3

Hình 3.4: Sắc ký đồ phân tích DEP, DBP, DEHP theo chương trình 4

Bảng 3.1: Kết quả thời gian lưu (phút) của các phtalat khi phân tích theo các

chương trình nhiệt độ khảo sát

- Chương trình 3 và 4 đều tách tốt các chất, và đảm bảo thời gian lưu phù hợp, không bị chồng các pic tạp vào pic chất phân tích và nội chuẩn khi

áp dụng phân tích mẫu thực So sánh chương trình 3 với chương trình 4, nhận thấy thời gian lưu của DEHP trong chương trình 3 (15,743 phút) sớm hơn trong chương trình 4 (17,890 phút), như vậy chương trình 3 cho thời gian rửa giải DEHP ra sớm hơn, rút ngắn được thời gian phân tích hơn so với chương trình 4 Do đó, chúng tôi thống nhất chọn chương trình 3 làm điều kiện chương trình nhiệt độ GC sử dụng cho những khảo sát tiếp theo

3.1.2.2 Điều kiện khối phổ

Qua tham khảo các tài liệu, lựa chọn nguồn ion hóa va chạm điện tử EI

và mức năng lượng bắn phá 70 eV Kết quả thu được phổ khối các chất DEP, DBP, DEHP, IS khi khối phổ làm việc ở chế độ Full Scan với dải m/z từ 40 –

500 và so sánh với thư viện phổ chuẩn đều có hệ số match MF > 990

32

Hình 3.5: Phổ khối DEP so với thư viện phổ chuẩn.