Bước đầu xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu và sản phẩm bột đông khô chứa tetrodotoxin 0,1% từ cá nóc

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT APCI Atmospheric pressure chemical ionization Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển CI Chemical Ionization Ion hóa hóa học ESI Electron spray ionizatio

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHU THỊ NHƯ QUỲNH

BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM BỘT ĐÔNG KHÔ CHỨA TETRODOTOXIN 0,1%

TỪ CÁ NÓC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHU THỊ NHƯ QUỲNH

BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM BỘT ĐÔNG KHÔ CHỨA TETRODOTOXIN 0,1%

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết sơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Việt Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển - Trường đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ tôi với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình triển khai nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn hóa phân tích và các bộ môn khác của Trường đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và cán bộ Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, cán bộ Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam, Viện Pháp y Quốc gia và các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2015

Học viên

DS Chu Thị Nhƣ Quỳnh

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 23

2.3.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng TTX 27 2.3.3 Xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu TTX thô và sản phẩm

3.2.1 Kết quả xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu TTX thô 44 3.2.2 Kết quả xác định một số chỉ tiêu chất lượng bột đông khô TTX 0,1% 51

4.1 VỀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG TTX 55 4.2 VỀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

APCI Atmospheric pressure chemical

ionization

Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển

CI Chemical Ionization Ion hóa hóa học

ESI Electron spray ionization Ion hóa phun sương điện FAB Fast atom bombardment Bắn phá nhanh nguyên tử

GC-MS Gas chromatography - Mass

spectrometry Sắc ký khí khối phổ

HILIC Hydrophilic interaction liquid

chromatography

Sắc ký lỏng tương tác thân nước

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HR FTICR

MS

High resolution fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry

Phổ khối phân giải cao

ICP-MS Inductively coupled plasma Phổ khối phân tích nguyên tử

LC-MS Liquid chromatography–mass

spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ

LD50 Lethal dose 50 Liều gây chết 50% động vật

thí nghiệm LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng

MALDI Matrix assisted laser

desorption ionization

Phản hấp thụ và ion hóa bằng laser

MLD Median lethal dose Liều chết trung bình

NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân SRM Selected reaction monitoring Chế độ chọn lọc ion TTX Tetrodotoxin

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phẳng (A) và cấu trúc 3-D (B) của phân tử TTX 3

Hình 2.7 Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo Finigan LCQ Advantage Max 24

Hình 2.8 Hệ thống LC-MS ba tứ cực nối tiếp Thermo TSQ Quantum Ultra 25

Hình 2.9 Hệ thống phổ khối phân giải cao Varian 900-MS Series FTMS 25

Hình 2.10 Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500FT- NMR

Hình 3.18 Sắc ký đồ phân tích TTX theo điều kiện sắc ký A, B, C, D 39

Hình 3.19 Sắc ký đồ dung dịch mẫu placebo (a), mẫu TTX chuẩn 2,5µg/ml (b),

Hình 3.20 Đồ thị biểu hiện mối tương quan nồng độ TTX và diện tích píc 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tetrodotoxin (TTX) là một chất độc thần kinh mạnh và hiện nay chưa

có thuốc giải độc [12] Là một chất độc nhưng TTX lại có những tác dụng có

ý nghĩa lớn trong y học: giảm đau trong ung thư; phòng tan huyết trong nhồi máu cơ tim; dùng làm thuốc cai nghiện, thuốc gây tê; dùng trong nghiên cứu sinh lý màng tế bào…[4], [22], [27] TTX cho hiệu quả điều trị chỉ với mức liều thấp thấp cỡ microgam/kg [4], [29] Đặc biệt, TTX có tác dụng giảm đau mạnh hơn morphin nhưng không gây nghiện [19] Rõ ràng, TTX có nhiều ưu điểm hơn so với các thuốc hiện sử dụng

Với nhiều tác dụng ý nghĩa nhưng là chất độc mạnh nên những năm gần đây TTX mới được nghiên cứu và phát triển thành sản phẩm thuốc Hiện nay, công ty WEX Pharmaceticals Inc Canada đang phát triển các sản phẩm chứa TTX làm thuốc giảm đau trong điều trị ung thư, thuốc gây tê [4], [9] Tại Việt Nam, Bùi Quang Huấn và cộng sự cũng đã sử dụng chiết xuất từ cá nóc chứa TTX trong chế phẩm Bahudo dùng làm thuốc điều trị cai nghiện [7] Các sản phẩm đã được nghiên cứu thử nghiệm trên lâm sàng cho hiệu quả điều trị tốt với độc tính của TTX được kiểm soát Như vậy, tiềm năng sử dụng TTX trong bào chế các sản phẩm làm thuốc rất lớn

Hiện nay, TTX chủ yếu là chiết xuất, phân lập từ các nguồn tự nhiên, trong đó cá nóc vẫn là nguồn cung cấp chính [4], [18], [30] Tại Việt Nam, cá nóc mới được quan tâm là một thực phẩm có giá trị thương mại lớn [1] nhưng chưa được quan tâm khai thác phục vụ y học Trong khi đó, biển Việt Nam cho có tiềm năng khai thác TTX từ cá nóc lớn với khoảng 21 loài đã được xác định có mang độc tố [13]

Với nhiều tác dụng có ý nghĩa cho chăm sóc sức khỏe cộng đồng và sử dụng nguồn nguyên liệu sẵn có Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

(VKNTTW) đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình

phân lập tetrodotoxin (TTX) và một số độc tố thần kinh từ họ cá nóc

(Tetradontidae) ở biển Việt Nam có khả năng ứng dụng trong y học” Một

trong các nội dung của đề tài này là bào chế sản phẩm bột đông khô chứa TTX 0,1% dùng làm nguyên liệu phục vụ cho sản xuất thuốc Nhằm kiểm soát tốt việc bào chế sản phẩm bột đông khô TTX 0,1%, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài “Bước đầu xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu và sản phẩm bột đông khô chứa tetrodotoxin 0,1% từ cá nóc” với các

mục tiêu chính như sau:

1 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng TTX

2 Xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu và sản phẩm bột đông khô TTX 0,1%

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 TETRODOTOXIN

1.1.1 Danh pháp, công thức và tính chất hóa lý của TTX

1.1.1.1 Danh pháp, công thức của TTX

Tên IUPAC: (4 R, 4a R, 5 R, 6 S, 7 S, 8 S, 8a R, 10 S, 12 azaniumylidene - 4, 6, 8, 12 - tetrahydroxy - 6 - (hydroxymethyl) - 2, 3, 4, 4a,

S)-2-5, 6, 7, 8 – octahydro - 1 H - 8a, 10 – methano - S)-2-5, 7 - (epoxymethanooxy) quinazolin – 10 - olate

dung dịch axít do có chứa nhóm guanidin perhydroquinazolin có tính kiềm TTX cũng có cấu trúc nội este, nên dễ bị các dung dịch axít mạnh hoặc kiềm mạnh phân hủy Do tính tan đặc biệt nên cách duy nhất giữ TTX bền vững trong dung dịch là hòa tan trong axít hữu cơ yếu [42]

TTX có pKa (H2O) = 8,76; pKa (50% alcol) = 9,4 [51]

Hàng năm, có nhiều vụ ngộ độc TTX do ăn cá nóc Tại Nhật bản, trung bình hàng năm có khoảng 200 ca ngộ độc với tỉ lệ chết ước tính là 50% Ngoài ra, rải rác một số trường hợp ngộ độc TTX do ăn cá nóc cũng được ghi nhận tại Mỹ và các nước nằm ngoài vùng Ấn Độ – Thái Bình Dương [55], [57] Ở Việt Nam, từ năm 1999 – 2003 có tổng số 176 vụ ngộ độc thực phẩm liên quan đến cá nóc Năm 2002, Bộ Y tế đã ra Quyết định 354/2002/QĐ-BYT [3] ban hành bản hướng dẫn chuẩn đoán, xử trí và phòng ngộ độc cá nóc

để nhằm giảm bớt nguy cơ tử vong do ngộ độc cá nóc

1.1.2.2 Tác dụng của TTX

TTX phong tỏa đặc hiệu kênh Na+ trên bề mặt màng tế bào thần kinh ở bên ngoài kênh, làm ức chế ức chế dẫn truyền ion Na+ đi vào trong tế bào nên

làm mất sự dẫn truyền thần kinh và phản xạ co cơ Do đó gây ra tác dụng giảm đau của TTX [26]

Tác dụng giảm đau, gây tê của TTX rất mạnh [26], [48] Chỉ với một liều nhỏ cỡ microgam TTX được sử dụng có thể đem đến kết quả giảm đau ít nhất 2-3 tuần [45] Để kìm hãm hoạt động của hệ thần kinh bằng cocain phải cần đến hàm lượng 500g nhưng TTX thì chỉ cần khoảng 0,03g Như vậy, hiệu quả tác dụng của TTX mạnh gấp 60.000 lần cocain [48]

Dù ức chế dẫn truyền thần kinh và thần kinh cơ thông qua kênh Na+nhưng lại không làm thay đổi tính thấm của ion K+

[26] TTX tác động lên cả thần kinh trung ương lẫn ngoại vi liên quan các hệ thông thần kinh cơ, tim mạch, hô hấp gây ra các tác dụng: mạch nhanh, huyết áp hạ, rối loạn nhịp tim, khó thở, choáng váng, đau đầu, rối loạn cảm giác, yếu cơ, liệt chi dưới, mất phản xạ tủy và phản xạ gân xương, …

TTX cũng có tác động lên vi khuẩn HIV typ 1 (HIV-1) thông qua tác động vào hoạt động của gp-120 trên lớp vỏ HIV-1 Gp120 đóng vai trò có ý nghĩa trong việc gây độc tế bào thần kinh Do TTX khóa kênh Na+

, gây ảnh hưởng tới việc khử cực màng tế bào nên ngăn sự giải phóng các chất độc như cytokin gây độc tế bào thần kinh ở những bệnh nhân HIV/AIDS [25]

1.1.3 Liên quan cấu trúc tác dụng của TTX và các analog

TTX được đặt bởi Yoshizumi Tahara năm 1909 sau khi được phân lập

từ buồng trứng của cá nóc Cấu trúc của TTX được tính toán bởi R B Woodward năm 1964 [55] Analog của TTX được hiểu là dẫn xuất của TTX

có hoạt tính sinh học tương tự TTX, liên kết cùng vị trí trên đơn vị alpha của kênh Na+ như là TTX [30]

Có 26 analog tự nhiên được tìm thấy của TTX [55] Một số analog là dạng cân bằng hóa học với TTX thường có trong chiết xuất TTX như 4-epi TTX, 4,9-anhydro TTX Các deoxy analog (5-deoxy TTX, 11-deoxy TTX,

6,11-dideoxy TTX và 5,6,11-trideoxy TTX), 11-oxo TTX, 4-S-cysteinyl TTX) không phải là dạng cân bằng với TTX [38], [47], [55]

Hình 1.2 Cấu trúc một số analog của TTX

Tuy có hoạt tính sinh học tương tự nhau, nhưng hoạt lực giữa TTX và các analog khác nhau rất nhiều: độc tố của TTX là 4.500 MU, 4-epi TTX là

kênh Na+, tác động như phân tử cho tạo liên kết hydro Trong nghiên cứu gần đây, Yang và Kao chỉ ra rằng hydroxyl tại C-4, C-6, C-9, C-10, C-11 cũng đóng vai trong liên kết với kênh Na+

Thêm nhóm hydroxyl vào C-11 trong 11-oxo TTX tạo liên kết chắc chắn với kênh Na+ bằng liên kết hydro mạnh hơn TTX nên làm cho 11-oxo TTX là độc hơn TTX khoảng 4-5 lần [52] 5-deoxy TTX, 5,6,11-trideoxy TTX, 4-Cys TTX và anhydro TTX là có độc tính không đáng kể Độc tính của 5,6,11-trideoxy TTX là ít hơn TTX vì nó có ít nhóm hydroxyl Một số nhóm hydroxyl khác đóng vai trò làm giảm liên kết của 5,6,11-trideoxy TTX với kênh Na+ Jang và Yotsu Yamashita đã tìm thấy độc tính của 6,11-dideoxy TTX là cao hơn analog tổng hợp 8,11-dideoxy TTX [55]

Bảng 1.1 Một số thông tin về độ độc của TTX và analog [60]

TTX liều trung bình gây chết ở người 8,7 µg/kg

MLD của TTX người 10000 MU (≈2mg) hay 2mg/50kg thể

trọng

LD99 của 5,6,11-trideoxy TTX 750 µg/kg

LD50 của TTX 10 µg/kg (tiêm màng bụng chuột)

LD50 của 11-deoxy TTX 70 µg/kg (tiêm màng bụng chuột)

IC50 6,11-dideoxy TTX 420 µg/kg (tiêm màng bụng chuột)

MU (mouse unit): MU là một lượng chất độc cần để giết chết một loài chuột 20g ICR trong 30 phút sau khi tiêm màng bụng

1.1.4 Ứng dụng của TTX trong y học

Do đặc tính chọn lọc tác dụng lên kênh Na+

nhưng không ảnh hưởng tới kênh K+ [7] nên TTX và các analog ngày càng được dùng nhiều trong các nghiên cứu về hoạt động tế bào và trong thăm dò tác dụng để sử dụng làm thuốc Một số ứng dụng của TTX trong y học như sau:

Thứ nhất, TTX được dùng làm thuốc giảm đau Đặc biệt, TTX đem lại hiệu quả cắt cơn đau cho bệnh nhân ung thư với liều rất nhỏ nhưng kéo dài [27], [45] So với morphin, TTX có hoạt lực mạnh hơn gấp 3000 lần, ít tác dụng phụ hơn và đặc biệt là không gây nghiện [19] Một kết quả thử nghiệm lâm sàng khi sử dụng TTX giảm đau cho bệnh nhân ung thư cho kết quả tốt:

31 phác đồ điều trị với đường tiêm bắp liều 15-90µg/4 ngày trên 24 bệnh nhân Trong đó, 17 phác đồ đã mang lại hiệu quả giảm đau trên lâm sàng, với tác dụng giảm đau duy trì liên tục trong 2 tuần Nhóm nghiên cứu kết luận với liều 30µg/4 ngày dùng 2 lần/ngày có mức độ độc chấp nhận được và đem lại hiệu quả giảm đau [29] Hiện nay, TTX đang được Công ty International Wex Technologies (Canada) nghiên cứu và phát triển các sản phẩm để sử dụng trong y học như: Tectin (thuốc giảm đau), Tocudin (thuốc gây tê) và Tetrodin (thuốc cai nghiện ma túy) [4], [9]

Thứ hai, TTX được dùng làm thuốc gây tê, gây mê trong phẫu thuật [5], [7] Ngoài những tác dụng gây tê giống thuốc novocain, procain, cocain, TTX có nhiều ưu điểm hơn ở khả năng gây mê tại chỗ và tác dụng mạnh hơn nhiều so với thuốc gây tê khác: TTX hiệu quả hơn thuốc gây mê cục bộ cocain và procain khoảng 160.000 lần [50]

Thứ ba, TTX có thể sử dụng trong điều trị để chống loạn nhịp tim, co giật [26] Sử dụng TTX với liều lượng 1,3µg/kg có hiệu quả trong việc phòng ngừa các trạng thái xơ cứng động mạch và bào chế các loại thuốc đặc trị chữa bệnh huyết áp, rối loạn nhịp tim [4], [49]

Thứ tư, TTX được sử dụng trong nghiên cứu sinh lý màng tế bào, đặc biệt trong nghiên cứu tế bào thần kinh [26], [29], [45] TTX đã được dùng để tính toán mật độ kênh Na+ và sự phân bố của nó trong màng tế bào [26], [45]

Thứ năm, phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị HIV/AIDS có chứa TTX [5] Nghiên cứu của Jie Shi và cộng sự cho thấy TTX dùng điều trị cho bệnh nhân có sử dụng heroin có hiệu quả giảm sự ham muốn và lo lắng liên

quan tới nghiện heroin Cho thấy TTX có hiệu quả trong phòng ngừa nghiện ở người đang điều trị nghiện heroin [39] Tại việt Nam cũng đã nghiên cứu thành công của một số chế phẩm chứa TTX dùng cai nghiện như: Thiên Thanh Hoàn có chứa TTX và một số vị thuốc Đông y, chế phẩm Bahudo chứa TTX và một số thảo dược [8]

Thứ sáu, triển vọng sử dụng TTX trong điều trị ung thư: có nghiên cứu

đã cho thấy TTX còn cho thấy khả năng giảm và ức chế hoạt động của tế bào ung thư Một nghiên cứu cho thấy TTX ức chế hoạt động của khối u ở chuột

bị gây ung thư, làm tăng thời gian sống cho chuột bị ung thư là 46% và làm giảm số lượng tế bào khối u [27]

Như vậy, TTX tuy là một chất cực độc nhưng lại có thể đem lại nhiều giá trị trong các bệnh xã hội với nhiều ưu điểm hơn các loại thuốc giảm đau khác ở chỗ không gây nghiện như morphine, không xung đột với các loại thuốc khác, liều lượng sử dụng rất thấp Khả năng khai thác và phát triển các sản phẩm từ TTX rất lớn

1.1.5 Nguồn cung cấp TTX

Có thể thu được TTX qua nhiều cách như tổng hợp hóa học [31], bán tổng hợp [44], sinh tổng hợp bằng phương pháp vi sinh vật [4] Tuy nhiên, TTX chủ yếu thu được qua chiết xuất phân lập từ tự nhiên

Năm 1909, TTX được phát hiện ở Nhật Bản khi được phân lập từ buồng trứng cá nóc [22], [55] Độc tố TTX được tìm thấy nhiều nhất ở các

loài cá nóc thuộc họ Tetraodontidae Ngoài cá nóc, TTX cũng có ở những

loài sinh vật biển khác nhau như: bạch tuộc tua xanh Australian

(Hapooloclaena maculosa); cá mỏ vẹt, cá thần tiên (Ostracion spp); cá mặt tròn đại dương; một số loài ghẹ như ghẹ Philippin, ghẹ mắt đỏ (Eriphia spp,

Carcinoscorpius rotudicauda…); một số loài ốc sên biển; hai loài ếch độc

(Harlequin) Tuy nhiên, cá nóc vẫn là nguyên liệu chính để tách chiết và

nghiên cứu về TTX (Mosher, 1986) [14], [55]

Hình 1.3 Một số loài chứa độc tố TTX trong tự nhiên [46]

1.2 CÁ NÓC

1.2.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của cá nóc

Cá nóc là thuộc bộ Tetrodontiformes Bộ này chứa 10 họ còn sinh tồn

với khoảng 430 loài và khoảng 9 họ đã tuyệt chủng [28] Đặc điểm quan trọng

để nhận biết và phân biệt với các loài cá khác là cá nóc không có vây bụng và các vây đều không có gai cứng Tùy loài mà cá nóc có hình dạng và cách phòng vệ khác nhau: làm phồng tròn bụng lên như quả bóng hay có nhiều gai nhọn, tiết độc tố, …

Trên thế giới có khoảng 246 loài cá nóc, bao gồm cả cá nóc nước mặn

và nước ngọt Cá nóc sống ở các khu vực biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới của Thái Bình dương, Ấn Độ dương và Đại Tây dương [2], [41] Việt Nam có

khoảng 67 loài cá nóc, chủ yếu thuộc họ cá nóc (Tetraodontidae) Chúng

phân bố khá rộng và được bắt gặp gần như ở toàn vùng biển Việt Nam [2], [10]

Trữ lượng cá nóc ở biển Việt Nam năm 2005 ước tính khoảng 37.387

tấn, trong đó họ Tetraodontidae chiếm khoảng 84,7% tổng trữ lượng [17] Dự

kiến triển vọng khai thác có nói có thể đến 1200 tấn/năm tại một số vùng [1],

[10] Trữ lượng cá nóc lớn, lại có giá trị kinh tế nên việc khai thác cá nóc trên vùng biển nước ta đang ngày được quan tâm qua các dự án, chương trình [1]

Tại Việt Nam, người ta đã tiến hành phân tích độc tố của 35 loài Trong đó: 10 loài có độc tính rất mạnh, 7 loài có độc tính mạnh, 4 loài có độc tính nhẹ, có 14 loài chưa phát hiện thấy độc tố [13], [14]

1.2.2 Độc tố trong cá nóc

Cá nóc được coi là loài độc thứ hai trong thế giới động vật có xương sống, chỉ đứng sau cóc độc vàng [4], [43] Tuy nhiên, không phải loài cá nóc nào cũng độc Độc tố trong cá nóc khác nhau theo loài Hàm lượng độc tố cũng có thể thay đổi theo mùa, vùng địa lý, giai đoạn phát triển của cá thể và thay đổi giữa các bộ phận trong cá nóc [10] Mức độ độc các bộ phận của đa

số các loài cá nóc có thể được sắp xếp theo trật tự giảm dần như sau: trứng, tinh hoàn, gan, ruột, da, thịt [13], [14] Độc tính của cá nóc thường tăng cao vào các tháng 2-3 và 7-9 trong năm, đây cũng là mùa sinh sản của cá nóc [10], [13] Một số nghiên cứu và đánh giá hàm lượng TTX trong một số loài

cá nóc ở Việt Nam thời điểm tích lũy cao nhất có thể trên 100μg/g [6], [14]

Cá nóc là nguồn nguyên liệu tiềm tàng để chiết tách TTX, hứa hẹn một tiềm năng mới cho ngành y dược Việt Nam

1.2.3 Thành phần độc tố trong cá nóc

Độc tố chiết xuất từ cá nóc là hỗn hợp gồm nhiều chất độc thuộc nhóm TTXs và nhóm PSPs (Paralytic Shellfish Poisons – độc tố gây liệt) [11], [40] Phần lớn thành phần độc tố trong các loài cá nóc là thuốc nhóm TTXs gồm TTX và khoảng 10 analog TTX có thể đến trên 90% lượng chiết xuất TTXs

từ cá nóc [57] Ngoài TTX, 3 analog chính của TTX có trong dịch chiết là acid tetrodonic, 4-epi TTX và 4-epi anhydro TTX So với TTX, ba chất này không khác nhiều về đặc tính hóa học, nhưng khác nhau đáng kể về hoạt tính sinh học [12]

Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hoàng (Viện Nghiên cứu Hải sản)

trên 5 loài cá nóc (Takifugu oblongus, Arothron stellatus, Arothron hispidus,

Torquigener brevipinnis, Lagocephalus sceleratus) được thu thập ở các tỉnh

ven biển Việt Nam năm 2005 – 2006: thành phần độc tố cá nóc là hỗn hợp nhiều độc tố Trong đó, nhóm độc tố TTXs (TTX và các dẫn xuất 4,9-anhydro TTX, 4-epi TTX) là thành phần chính, chiếm tỷ lệ 97,47% Các độc tố thuộc nhóm chất độc PSPs là saxitoxin (STX) và các dẫn xuất (neoSTX, dcSTX, GTX6 và GTX5) chỉ chiếm tỷ lệ rất nhỏ, khoảng 2,53% Tỷ lệ của các độc tố

cũng biến động theo từng loài, từng bộ phận, từng giới tính Ở các loài T

brevipinnis và L sceleratus, TTX là thành phần độc tố chính Ở các loài còn

lại, thành phần độc tố chiếm tỷ lệ cao nhất là dẫn xuất 4,9-anhydro TTX [11]

Nhìn chung, các thành phần độc tố thường có hàm lượng cao hơn ở cá thể cái Theo nghiên cứu của Chih-Yu Chen và Hong-Nong Chou (1998) định

lượng TTX và các dẫn chất trong hai loài cá nóc Diodon holocanthus và

Takifugu rubripes ở hòn đảo phía bắc Đài Loan được kết quả TTX chiếm

77%, 4-epi-TTX 11%, còn lại anhydro-TTX 12% [21]

1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG TTX

1.2.1 Phương pháp sinh hóa trên chuột (MBA)

Phương pháp MBA sử dụng chuột để thử độc tính của các chiết xuất chứa TTX (TTX chiết xuất): Chuột thử nghiệm khỏe mạnh, cùng loài, cùng giới tính, cùng trọng lượng, cùng điều kiện và chế độ nuôi TTX chiết xuất được hoàn tan và pha loãng thích hợp bằng acid acetic 0,02% để tiêm vào chuột sao cho thời gian chết của chuột thử nghiệm trong vòng 30 phút Song song, tiêm dung môi pha loãng 1 ml acid acetic 0,02% vào khoang bụng của 3 con chuột để đối chứng Kết quả sẽ không được chấp nhận nếu 2/3 số chuột đối chứng bị chết [23], [53]

Phương pháp này đã được chấp nhận rộng rãi trên toàn thế giới và được

sử dụng nhiều trong phân tích TTX [62] Tại Việt Nam, các nghiên cứu khảo

sát độc tố hay định lượng chiết xuất chứa TTX đều sử dụng phương pháp sinh hoá trên chuột như nhóm nghiên cứu thuộc Viện Hải Dương học Nha Trang [14] Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là độ nhạy thấp, không đặc hiệu do chiết xuất thu được có thể gồm TTX và nhiều analog cũng mang độc tính

1.2.2 Phương pháp ELISA

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone, … Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme Immuno Assay)

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng

nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng

thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải

phóng oxy nguyên tử từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu Do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Phản ứng ELISA đã được sử dụng phân tích nồng độ TTX trong nước tiểu và máu của các bệnh nhân ngộ độ cá nóc thông qua sử dụng một kháng thể đơn dòng chống TTX được phát triển bởi Kawatsu và cộng sự [36]

Phương pháp này có độ nhạy khá cao, độ đặc hiệu tương đối tốt, thời gian phân tích nhanh (khoảng 30 phút) nhưng giá của các kháng thể đơn dòng rất đắt, nên chi phí phân tích cao, khả năng ứng dụng sẽ bị hạn chế

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng với các detector UV, FLD

Sắc kí lỏng hiệu năng cao là phương pháp dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các hạt chất mang hoặc được gắn hóa học với chất mang Pha động cùng với mẫu phân tích được bơm qua cột với tốc độ phù hợp tùy theo ái lực của chúng với hai pha và dẫn tới sự tách các chất Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được truyền qua bộ

xử lý kết quả

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đặc trưng sự phân tách giữa pha động và pha tĩnh, có thể ứng dụng để phân tích TTX [62] Tuy nhiên, với các detector khác nhau thì phương pháp phân tích khác nhau, qua

đó độ nhạy cũng khác nhau, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng cũng khác nhau

- Với Detector UV: không đặc hiệu do TTX không hấp thụ UV, cần phải sử dụng điều kiện pha động thường phức tạp, độ chọn lọc thường không

cao bởi trong cá nóc có rất nhiều dẫn xuất của TTX [61]

- Với Detector huỳnh quang (FLD): phương pháp này được Yasumoto

và Mitishita ứng dụng để phân tích TTX [58] Phương pháp này sử dụng NaOH đặc, nóng tạo thành C9-base để phát huỳnh quang Điều này làm quy trình định lượng phức tạp, hạn chế sự phục hồi TTX và giới hạn định lượng của phương pháp kém

1.2.4 Phương pháp khối phổ

Phổ khối lượng (Mass Spectrometry, MS) được dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Phổ khối được coi là “vân tay hóa học” của các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là trong tổng hợp hóa dược và nhận dạng hợp chất thiên nhiên, giúp phát hiện nhanh chất và khẳng định cấu trúc

Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân

tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) bằng các phần tử mang năng lượng cao

Sự phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích tuân theo định luật bảo toàn khối lượng Năng lượng bắn phá (năng lượng ion hoá) là một yếu tố quyết định sự phân mảnh các hợp chất Khi năng lượng bắn phá mẫu (khoảng 10eV) bằng với năng lượng ion hóa phân tử sẽ gây nên sự ion hóa phân tử Nếu năng lượng ion hóa tăng lên (30-50eV) sẽ bẻ gẫy một số liên kết trong phân tử, tạo ra nhiều mảnh Đó là các ion hoặc phân

tử trung hòa có khối lượng bé hơn

Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có mặt của những nhóm chức đặc thù, cung cấp cho người phân tích những thông tin hữu ích về cấu tạo hoặc nhận dạng của chất phân tích Quá trình phân mảnh là cơ sở giúp ta biện giải phổ, nhận dạng hoặc khẳng định cấu trúc của chất phân tích Nó đặc trưng cho từng chất, nên độ chọn lọc cao [32]

Các thiết bị MS có thể sơ bộ liệt kê từ kỹ thuật ion hóa: ion hóa bằng va chạm điện tử (EI), bắn phá nguyên tử nhanh (FAB), ion hóa bằng hóa học (CI), ghép nối với sắc ký khí (GC – MS), ion hoa bằng phun sương điện tử (ESI), ion hóa ở áp suất thường (APCI)…

EI-MS là phổ va chạm điện, dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm điện tử hoặc ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV Phổ ESI-MS là phổ tạo ra bởi ion hóa bằng phun điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là píc ion phân tử và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ phá vỡ ESI – MS đem lại hiệu quả trong phân tích các chất có hàm lượng thấp ESI – MS được sử dụng rộng hơn EI-MS do giữ được các mảnh đặc trưng của chất phân tích [18]

Hình 1.4 Kỹ thuật ESI-MS

Tiếp sau bộ phận ion hóa, bộ phân tích khối phổ cũng được phát triển:

bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực (bộ tứ cực, bẫy ion tứ cực iontrap), bộ phân tích thời gian bay (TOF), bộ phân tích cộng hưởng ion (FT ICR)…

Kỹ thuật phân tích khối phổ FT ICR MS, ESI-Orbitrap cho phổ khối phân giải cao, chính xác Bằng cách đo được ion phân tử có độ chính xác khối cao, việc xác định các cấu trúc đã biết trở lên vô cùng nhanh chóng dựa vào thư viện phổ và kỹ thuật phân tích các mảnh khối cơ bản (H, C, O, N, S…), xác xuất sai lầm (hai chất khác nhau có số khối giống nhau) được đánh giá là

vô cùng nhỏ (một phần triệu) [34]

GC-MS cũng được ứng dụng để phân tích xác định TTX Nhưng do TTX chỉ tan được trong các acid hữu cơ yếu, không bay hơi, nên không thể phân tích trực tiếp bằng GC-MS TTX phải được chuyển về dạng C9-base (2-amino-6-hydroxymethyl-8-hydroxy quinazoline) rồi tạo dẫn xuất với BSTFA (N,O-bis-trimethylsilyl-trifluoroacetamide) [18] hoặc MSTFA (N-methyl-N-TMS-trifluoroacetamide) [20] Điểm bất lợi của phương pháp này là cần một lưỡng mẫu lớn [18], [55], tính lặp lại kém và cùng cần tiến hành phân tích nhiều lần [55]

1.2.6 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Sự kết hợp của sắc ký lỏng hiệu năng cao với khối phổ lần đầu tiên được chứng minh trong những năm 1970 (Dass 2007) Tuy nhiên, nó đã được với sự phát triển và thương mại hóa các nguồn ion hóa áp suất khí quyển (ESI, APCI) rằng lần đầu tiên kết hợp của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

và bước vào lĩnh vực phân tích thường quy phòng thí nghiệm Sắc ký lỏng kết nối khối phổ (LC-MS tandem) với bộ phân tích khối tứ cực (quadrupole) là những hệ thống phân tích (định tính, định lượng) chính xác cao Các hệ thống

sắc ký lỏng khối phổ loại 3 tứ cực nối tiếp (Triple Quadrupoles) cho phép phân tích định tính và định lượng chất ở mức độ vết và siêu vết (giới hạn định lượng ở cỡ fentogam, 10-15

g) [56] Đây là phương pháp hiện đại, có khả năng ứng dụng cao và đang dần trở nên phổ biến trong phân tích

Do đặc điểm ghép nối LC và MS, dòng sắc ký lỏng không được kết nối trực tiếp vào MS mà thông qua bộ giao diện và nguồn ion hóa Do vậy, việc

sử dụng điều kiện sắc ký và nguồn ion hóa phù hợp cho hiệu suất ion hóa cao, vừa có tác dụng loại bỏ tạp chất, không làm pha loãng mẫu cũng như chuyển lượng mẫu tối đa vào MS sẽ quyết định rất nhiều đến độ đặc hiệu, đặc biệt là

độ nhạy của thiết bị và phương pháp phân tích

Khi xây dựng phương pháp LC-MS cần chú ý các điều kiện LC của phương pháp như: Dung môi pha động không chứa các thành phần đệm vô

cơ, chỉ chứa các thành phần đệm dễ bay hơi, có sức căng bề mặt thấp; Tốc độ dòng để ở mức tối ưu nhỏ nhất có thể vì tốc độ dòng càng cao thì tốc độ khí cấp cho nguồn ion hóa để bay hơi dung môi càng lớn, ảnh hưởng việc chuyển mẫu vào bộ phận MS

Đặc tính nổi bật là chọn lọc cao và đặc hiệu, phương pháp LC-MS hoặc LC-MS/MS ngày càng được sử dụng nhiều hơn trong nghiên cứu phân tích

TTX và các analog của TTX [35], [55]

1.2.7 Xác định cấu trúc bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Cùng với các phương pháp khác, NMR cũng được phát triển và thường dùng để nhận biết TTX trong nhiều nghiên cứu NMR có thể giúp xác định TTX và các analog của TTX Khó khăn với NMR là sự cản trở mạnh của các chất có trong thành phần chiết xuất TTX từ mẫu thực gây ảnh hưởng tới chất lượng phổ [55]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu

cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng Với việc sử dụng kết hợp các

kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, người ta có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng của các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H, 13C) dưới tác dụng của từ trường Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học Ngoài ra đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau [15], [37]

Phổ 13 C-NMR

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon, mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo phổ 13

C-NMR cũng được tính bằng μg/ml và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 240μg/ml)

Phổ HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Các tương tác trực tiếp C-H được xác định nhờ vào các píc giao nhau trên phổ HSQC Trên phổ này, một trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR

Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của C và H trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc [15], [37]

Phương pháp HNMR được sử dụng để định tính TTX và các analog của TTX Tuy nhiên, xử lý mẫu phức tạp do mẫu cần được làm sạch tốt để tiến hành phân tích

1.3 BỘT ĐÔNG KHÔ TTTX 0,1%

 Mục đích bào chế và sử dụng

TTX là một chất độc nhưng có nhiều giá trị to lớn trong y học với nguồn cung chủ yếu là chiết xuất từ cá nóc Trong khi đó, biển Việt Nam có thể cung cấp một nguồn cá nóc dồi dào nhưng lại chưa được khai thác

Nhằm tăng cường sử dụng nguồn tài nguyên biển sẵn có, ứng dụng các tác dụng của TTX, nhóm nghiên cứu của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung

ương đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình phân

lập tetrodotoxin (TTX) và một số độc tố thần kinh từ họ cá nóc (Tetradontidae) ở biển Việt Nam có khả năng ứng dụng trong y học” với

nhiều nội dung nghiên cứu (hình 1.5) [16]

Hình 1.5 Sơ đồ khái quát các nội dung nghiên cứu dự án

Một trong các mục đích của nghiên cứu hướng tới là sử dụng chiết xuất TTX từ cá nóc để bào chế các sản phẩm điều trị cai nghiện, giảm đau có chứa TTX ngay tại Việt Nam: chế phẩm BAHUDO, DENA đã được Viện Hàn lâm

Nghiên cứu dược lý

Đánh giá độc tính

Phân lập, phân tích TTX và các analog

Phủ tạng cá nóc

TTX thô ≥ 80%

Khoa học công nghệ Việt Nam nghiên cứu có chứa TTX dùng để cai nghiện, giảm đau

Tuy nhiên, TTX bền với nhiệt nhưng cũng dễ bị biến đổi trong bởi tác động của acid hoặc base mạnh, không ổn định trong dạng dịch Do đó, nghiên cứu không dừng lại ở dạng dịch chiết xuất toàn phần chứa TTX mà chiết xuất đến dạng bột TTX thô hàm lượng ≥ 80%

TTX có hoạt lực rất cao, liều có tác dụng dược lý trên động vật thí nghiệm và trên người chỉ cỡ microgam Nếu sử dụng dạng bột TTX thô ≥ 80% hay dạng TTX tinh khiết ≥ 99% để bào chế thuốc chứa TTX sẽ khó khăn trong phân liều chính xác Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành pha loãng TTX thô được chiết xuất từ cá nóc bằng tá dược trơ khoảng 1,000 lần, gọi là bột nồng độ Nghiên cứu tiến hành bào chế bột có nồng độ TTX 0,1% và được bào chế theo phương pháp đông khô nên gọi sản phẩm là bột đông khô TTX 0,1%

Bào bột nồng độ TTX 0,1% được lựa chọn sản xuất theo kỹ thuật đông khô do nhiều kỹ thuật này có nhiều ưu điểm:

Quá trình làm khô được tiến hành ở nhiệt độ thấp nên hạn chế được tốc

độ phản ứng hoá học phân hủy dược chất ở mức rất thấp

Sản phẩm khô thu được có diện tích bề mặt riêng lớn nên sẽ hoà tan rất nhanh khi cần hoà tan trở lại

Thuốc được phân liều vào lọ ở dạng dung dịch trước khi đông khô nên

dễ dàng đạt được yêu cầu đồng nhất về hàm lượng dược chất trong từng đơn

vị sản phẩm, đồng thời giảm thiểu được sự nhiễm chéo so với thuốc được đóng vào lọ ở dạng bột

Giảm thiểu sự oxy hoá dược chất do hạn chế sự có mặt của oxy trong quá trình sản xuất do sản phẩm được làm khô trong môi trường chân không

và việc đóng lọ cũng được thực hiện trong chân không hoặc dưới áp lực của khí trơ đưa vào khi đóng nắp lọ

TTX là một chất độc rất mạnh và chưa có thuốc giải độc Do đó, trong qui trình bào chế bột đông khô TTX 0,1% cần phải được kiểm soát chất lượng

từ nguyên liệu đầu vào và sản phẩm đầu ra

 Tiêu chuẩn chất lượng bột đông khô TTX 0,1%

Bột đông khô TTX 0,1% được bào chế từ TTX thô chiết xuất từ cá nóc thường bao gồm TTX và các analog đều có độc tính Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng TTX, xác định sự có mặt của một số analog của TTX trong TTX thô dùng bào chế bột đông khô

Bột đông khô TTX 0,1% được bào chế với quy mô nhỏ, nên nghiên cứu chưa tiến hành đánh giá độ đồng đều hàm lượng của sản phẩm Trong nghiên cứu này chỉ tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hình thức, độ ẩm, định tính, hàm lượng TTX trong bột đông khô TTX0,1%

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, ĐỐI

TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu TTX thô chiết xuất từ cá nóc và sản phẩm bột đông khô TTX 0,1%

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nguyên liệu

Sử dụng phủ tạng (gan, trứng) của các loài cá nóc được đánh bắt tại vùng biển Khánh Hòa và Vũng Tàu, Việt Nam Các loài cá nóc sử dụng trong nghiên cứu được định danh và lưu tiêu bản, gồm có: (1) cá nóc chuột vân

bụng (Arothron hispidus), (2) cá nóc chuột chấm sao (Arothron stellatus), (3)

cá nóc tro (Lagocephalus lunaris), (4) cá nóc vằn mặt (Torquigener

brevipinnis), (5) cá nóc thu (Lagocephalus sceleratus), (6) cá nóc viền đuôi

đen (Arothron immaculatus), (7) cá nóc chấm cam (Torquigener gloerfelti), (8) cá nóc vàng (Lagocephalus spadiceus), (9) cá nóc răng mỏ chim (Lagocephalus inermis) và (10) cá nóc vằn (Takifugu oblongus)

Cá nóc vàng Cá nóc chuột vân bụng

Hình 2.6 Hình ảnh 2 mẫu cá nóc

- Máy đông khô – Modulyod, Thermo, Mỹ (hình 2.11)

- Cân phân tích Mettler MS 105 có độ nhạy 0,01 mg

- Các Micro pipette Eppendorf 100µl – 1000µl, 50µl, 100µl, 20-200µl

- Bản mỏng sắc ký Silicagel GF 254, máy soi UV Caution M01 4005

- Cột trao đổi cation Bio-Gel-P2 và Bio-Rex 70 (Bio Rad), cột thủy tinh dùng cho sắc ký cột với các kích thước khác nhau (20cm x 10cm, 50cm x 10cm, 50cm x 4cm, 60 x 3cm)

- Dụng cụ thủy tinh các loại: ống mao quản, ống đong, cốc có mỏ, bình định mức…

Hình 2.7 Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo Finigan LCQ Advantage Max

Hình 2.8 Hệ thống LC-MS ba tứ cực nối tiếp Thermo TSQ Quantum Ultra

Hình 2.9 Hệ thống phổ khối phân giải cao Varian 900-MS Series FTMS

2.2.3 Hóa chất

- Chất chuẩn: Ống chuẩn chứa 1,0ml dung dịch chứa 0,1mg tetrodotoxin hòa tan trong đệm citrat pH 4,8, hàm lượng: 99,9% C11H17N3O8,

Lô sản xuất: TTX.DTDL.2015, VKNTTW (dung dịch C0)

- Một số hóa chất được sử dụng: amoni citrat, PA; acid acetic, PA; methanol, LC; natri citrat, PA; acid citric, PA; natri hydroxid, AR; Pyridin, AR; Butanol, AR; dikali hydrophosphat, PA; kali dihydrophosphat, PA; lactose; nước khử ion (VKNTTW); thuốc thử Karl Fischer

- Một số dung dịch sử dụng: acid aceticloãng 1%, 3%, 5%, 10% (tt/tt); dung dịch acid acetic 0,2% (tt/tt) trong methanol; amoniac 10% (tt/tt); dung dịch lactose 20% (kl/tt)…

- Dung dịch đệm:

+ Dung dịch đệm acetat pH 4,8: dung dịch trong nước chứa 15mM amoni acetat và 15mM acid acetic, điều chỉnh bằng acid acetic hoặc amoniac + Dung dịch đệm phosphat pH 7: 0,5g kali dihydrophosphat và 1,1g dikali hydrophosphat trong 900ml nước, điều chỉnh bằng dung dịch acid phosphoric 1M hoặc dung dịch natri hydroxyd 1M

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chuẩn bị mẫu

Dãy dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc C0 (100µg/ml) pha dãy

các dung dịch chuẩn: 10,0µg/ml, 5,0µg/ml, 2,5µg/ml, 1,0µg/ml, 0,5µg/ml và 0,05µg/ml trong pha động, trong quá trình thực nghiệm, các dung dịch chuẩn này được bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ ≤ 4o

C

Mẫu thử TTX thô (dung dịch A): cân chính xác 1,25mg bột TTX thô

vào bình định mức 50,0ml, thêm 30ml dung dịch acid acetic 20% trong methanol, lắc siêu âm 15 phút, thêm dung dịch acid acetic 20% trong

methanol vừa đủ 50ml

Mẫu thử bột đông khô TTX 0,1% (dung dịch B): cân chính xác khoảng

25mg bột đông khô TTX 0,1% vào bình định mức 10,0ml, thêm 7ml pha động, lắc siêu âm 15 phút, thêm pha động vừa đủ 10,0ml, lọc qua màng lọc 0,45µm

Mẫu placebo (dung dịch C): Mẫu placebo là bột đông khô tá dược

dùng bào chế bột đông khô TTX 0,1% nhưng không chứa TTX Cân chính xác khoảng 25,0mg mẫu placebo vào bình định mức 10,0ml, thêm 7ml pha động, lắc siêu âm 15 phút, thêm pha động vừa đủ 10,0ml, lọc qua màng lọc

0,45µm

Mẫu trắng: dung môi pha mẫu

Mẫu thêm chuẩn: sử dụng một lượng mẫu thử bột đông khô TTX 0,1%,

thêm chính xác một lượng mẫu chuẩn đã biết để tạo thành mẫu đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng

- Dung dịch thêm chuẩn TC1: Cân chính xác khoảng 12,5mg mẫu

palcebo vào bình định mức 5,0ml, thêm khoảng 3ml pha động, lắc siêu

âm trong 15 phút, thêm chính xác 0,100ml dung dịch chuẩn C0, lắc đều, thêm pha động vừa đủ 5,0ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm

- Dung dịch thêm chuẩn TC2: Cân chính xác khoảng 12,5mg mẫu

palcebo vào bình định mức 5,0ml, thêm khoảng 3ml pha động, lắc siêu

âm trong 15 phút, thêm chính xác 0,125ml dung dịch chuẩn C0, lắc đều, thêm pha động vừa đủ 5,0ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm

- Dung dịch thêm chuẩn TC3: Cân chính xác khoảng 12,5mg mẫu

palcebo vào bình định mức 5,0ml, thêm khoảng 3ml pha động, lắc siêu

âm trong 15 phút, thêm chính xác 0,150ml dung dịch chuẩn C0, lắc

đều, thêm pha động vừa đủ 5,0ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm

2.3.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng TTX

2.3.2.1 Xây dựng phương pháp định tính TTX bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

a Khảo sát thuốc thử

Các thuốc thử khảo sát: KOH 10%, KOH 20%, KOH 30%, NaOH 10%, NaOH 20%, NaOH 30%

Dung dịch đối chiếu: dung dịch TTX chuẩn 20µg/ml trong dung dịch acid acetic 0,2% (tt/tt) trong methanol

Đưa 10µl dung dịch đối chiếu lên bản mỏng silica gel 60 GF254 tráng sẵn đã được hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút (bản mỏng đã hoạt hóa)

Triển khai trong hệ dung môi pha động (H2): hỗn hợp pyridin : ethyl acetate : acid acetic : nước (15:5:3:6)

Phun thuốc thử khảo sát Sấy bản mỏng ở 1000C trong 30 phút, cứ cách

5 phút quan sát bản mỏng ở bước sóng 365nm

b Khảo sát hai pha động

- Đưa 10µl riêng rẽ các dung dịch sau lên bản mỏng đã hoạt hóa:

Mẫu chuẩn: dung dịch TTX chuẩn 20µg/ml trong dung dịch acid acetic 0,2% (tt/tt) trong methanol

Mẫu thử TTX thô: dung dịch A

- Triển khai bản mỏng trong hai hệ dung môi sau:

Hệ dung môi H1: n-butanol : acid acetic khan : nước (2:1:1)

Hệ dung môi H2: pyridin : ethyl acetate : acid acetic : nước (15:5:3:6)

- Sau khi triển khai triển, phun thuốc thử Sấy bản mỏng và quan sát ở bước sóng 365nm

c Khảo sát giới hạn phát hiện:

Pha dãy dung dịch chuẩn TTX với các nồng độ: 5µg/ml, 10µg/ml, 15µg/ml, 20µg/ml Đưa lên bản mỏng 10µl riêng rẽ các dung dịch chuẩn đã chuẩn bị Triển khai trong hệ dung môi pha động H2 Sau khai triển, phun thuốc thử, sấy bản mỏng và quan sát ở bước sóng 365nm

2.3.2.2 Xây dựng phương pháp định tính TTX bằng khối phổ

 Tìm mảnh mẹ và mảnh con đặc trưng

Mẫu TTX chuẩn 1µg/ml (C4): Tiến hành tiêm trực tiếp một lƣợng mẫu

vào detector khối phổ ESI iontrap của máy LC-MS (Thermo Finnigan LCQ Avantage Max) Lựa chọn chế độ quét toàn thang để xác định mảnh mẹ đặc trƣng (phổ MS) Lựa chọn chế độ SRM lấy mảnh mẹ và thực hiện bắn phá với các mức năng lƣợng khác nhau, chế độ quét full scan để xác định các mảnh con đặc trƣng (phổ MS/MS) Từ các phân mảnh đặc trƣng, lựa chọn mảnh con

để định lƣợng bằng LC-MS/MS

 Phân tích mẫu thử

Mẫu thử TTX thô: pha loãng dịch dung dịch A tới nồng độ thích hợp rồi

tến hành tiêm trực tiếp vào detector khối phổ ESI iontrap Ghi dữ liệu phổ

MS, MS/MS

Mẫu bột đông khô TTX 0,1%: cân chính xác khoảng 25mg bột đông

khô TTX 0,1% vào bình định mức 10,0ml, thêm 7ml dung dịch acid acetic 20% trong methanol, lắc siêu âm 15 phút, thêm ung dịch acid acetic 20% trong methanol vừa đủ 10,0ml; lọc qua màng lọc 0,45µm rồi tiêm trực tiếp vào detector khối phổ ESI iontrap MS Ghi dữ liệu phổ MS, MS/MS

2.3.2.3 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng TTX trong bột đông khô TTX 0,1% bằng sắc ký lỏng khối phổ

a Khảo sát điều kiện sắc ký

Tiến hành trên máy LC-MS ba tứ cực nối tiếp Thermo TSQ Quantum Ultra Khảo sát để tìm điều kiện sắc ký sau:

ion hóa (+ESI), khí thổi Sheath Gas (SG), khí bổ trợ Auxiliary Gas (AG), nhiệt độ hóa hơi, nhiệt độ mao quản, thế ion hóa) để tín hiệu thu được tốt, đảm bảo độ nhạy, độ ổn định trong quá trình định lượng

b Thẩm định lại phương pháp được xây dựng:

- Độ đặc hiệu: Được tiến hành so sánh tương ứng giữa mẫu chuẩn, mẫu

thử bột đông khô và mẫu placebo

- Độ thích hợp hệ thống: Xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

diện tích pic cùng mẫu chuẩn tiêm 6 lần

- Độ tuyến tính: Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi qui giữa diện

tích pic và nồng độ chất phân tích

Phân tích mẫu, xác định phương trình hồi qui y=ax+b giữa diện tích píc

và nồng độ TTX Xác định hệ số tương quan r

- Độ lặp lại: Tiến hành định lượng 6 lần mẫu thử bột đông khô TTX

0,1% Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hàm lượng TTX

- Độ đúng: Xác định bằng phương pháp thêm chất chuẩn, định lượng

hàm lượng TTX mẫu thêm chuẩn, xác định tỷ lệ thu hồi Tiến hành xác định ở

3 mức nồng độ trong khoảng 80% -100% - 120%

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

+ Giới hạn phát hiện (LOD): Xác định dựa vào nhiễu đường nền Việc xác định tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng

đo được trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích thấp đã biết với đáp ứng của mẫu trắng Từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được Tỷ lệ đáp ứng trên nhiễu (S/N) nằm giữa 3 – 2 thì có thể được chấp nhận để thiết lập gới hạn phát hiện

+ Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận được LOQ chấp nhận được nếu đạt các điều kiện: 1) đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng (tỷ lệ nhiễu S/N = 10); 2) píc của chất

cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng lặp lại với độ chính xác 20% Giới hạn định lƣợng (LOQ) có thể đƣợc tính bằng 3 lần giới hạn phát hiện (LOD)

2.3.3 Xác định một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu TTX thô và sản phẩm bột đông khô TTX 0,1%

2.3.3.1 Kiểm tra một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu TTX thô

 Chiết xuất TTX thô từ cá nóc theo quy trình sau:

Hình 2.12 Quy trình chiết xuất TTX thô

 TTX thô được tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng sau: